linfomi lezione dr
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I Linfomi
Dott. Renato Franco
SC di Anatomia Patologica
Direttore prof. Gerardo Botti
Istituto dei Tumori Fondazione G. Pascale, Napoli
• 1mm<>2cm
•
linfonodi cervicali, ascellari, inguinali
più frequentemente palpabili nel bambino.
•
linfonodi preauricolari, epitrocleari
, sopraclaveari, poplitei, addominali, mediastinici
aumentati di volume sempre patologici.
• Stazioni linfonodali: Testa-collo:
PreauricolariRetronucaliSottomandibolariLaterocervicali
Torace:SovraclaveareAscellariMediastinici
Addome:Addomio-pelviciIliaciInguinali
Arti:EpitrocleariPoplitei
LinfonodoStruttura
Organizzati in gruppi C. linfoidiC. immunologicamente attiveC. stromali
Foto?
Foto?
LinfonodoParenchima: Corticale
Popolato da linfociti B entrati nel LND attraverso le VEA
Follicoli primari
Follicoli secondari con centro germinativo
Il contatto con cellule vergini adeguate induce alla proliferazione del linfocita nel centro germinativo, da cui cellule attivate e cellule della memoria.
I linfociti non adeguati lasciano il linfonodo verso il circolo ematico
Cellule accessorie:Macrofagi sinusaliTingible bodiesMacrofagi della zona marginaleCellule dendritiche nei CG
Foto?
Parenchima: Paracorticale
Popolato da linfociti T entrati nel LND
attraverso le VEA
Attivati proliferano determinando espansione
della paracorticale
Cellule accessorie: cellule interdigitate, tipo di APC
Linfonodo
Foto?
LinfonodoSinusoidi linfonodali
Seno sottocorticale
Seno corticale, difficile da visualizzare
Seno midollare
Foto?
Parenchima: Midollare
Vasi ematici di grandi dimensione
Cordoni midollari ricchi di cellule (plasmacellule e
macrofagi)
Ampi seni midollari
Linfonodo
Foto?
HomingDopo la maturazione inizialenegli organo immunitari, cellule B e T vergini, --> sangueperiferico--> LND e altriorgani secondariLe sedi B dipendenti includono:
Follicoli primari e secondariPresentazione antigenicaProliferazione e differenziazione
Cordon midollariRilascio
di
Ig
da
parte
delle
plasmacellule
Sedi T dipendenti sono le paracorticliLa separazione da cellule B e T non è assoluta
MECCANISMI PATOGENETICI DELLA LINFOADENOMEGALIA
INTRINSECO ESTRINSECO
Proliferazione dei linfociti o degli istiociti
normalmente presenti nel linfonodo
Infiltrazione di cellule estrinseche nel linfonodo
MECCANISMO PATOGENETICO INTRINSECO DELLA
LINFOADENOMEGALIA
•Proliferazione dei linfociti e/o istiociti
•ingorgo linfatico per aumentato flusso afferente e rallentamento del tempo di transito dei linfociti
•attivazione e proliferazione antigene-dipendente dei linfociti: espansione aree B e T cellulari
•iperplasia ed alterazione delle cellule istiocitarie
MECCANISMO PATOGENETICO ESTRINSECO DELLA
LINFOADENOMEGALIA
•polimorfonucleati
in corso di linfoadeniti
batteriche
•cellule leucemiche o di tumori solidi metastatizzati.
LINFOADENOMEGALIE
NeoplasticheNeoplastiche
Classificazione eziologica
ReattiveReattive -
infettive
-
autoimmunitarie- metaboliche-
tossico-medicamentose
- aspecifiche
LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico
• mononucleosi
infettiva (EBV)• CMV• adenovirus• coxsachie• HHV-6• morbillo• rosolia• varicella• infezioni vie respiratorie• AIDS
Cause virali
Infettive
LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico
• Staphilococcus
aureus• Streptococco b-emolitico gr.A• Haemophilus
influenzae
tipo B
• Micobatteri
T e NT•
Bartonella
henselae
(M. graffio di
gatto)• Corynebacterium
diphtherie
(difterite)
• Brucella melitensis• Treponema pallidum
(lue secondaria)
• Leptospira
interrogans
(leptospirosi)• Francisella
tularensis
(tularemia)
Cause batteriche
Infettive
LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico
• Histoplasma
capsulatum• Candida albicans• Sporothrix
schenckii
Cause micotiche
• Toxoplasma
gondii• Leishmania• Plasmodi malarici• Trypanosoma
brucei
Cause parassitarie
Infettive
Iperplasia linfoide
zone T e B dipendenti:toxoplasmosimononucleosi
infettivalinfoadeniti
dermatopaticheIperplasia follicolare e plasmocitosi
(cellule B):iperplasia follicolare artrite reumatoidelinfoadenite
lueticaAIDS stadio precoce
Iperplasia paracorticale (cellule T):adeniti
viraliadeniti
postvaccinicheadeniti
iatrogene (idantoina)
Iperplasia corticaleMZ
LZ
DZ
Espansione della paracorticale
LINFOADENOMEGALIEinquadramento eziologico
Neoplastiche
•M. di Hodgkin•Linfoma non Hodgkin•Leucemie acute•Metastasi da tumori solidi
Linfoma di Hodgkin
Meno comune di NHL ~ 10,000 casi per anno
Età di incidenza bimodale, con primo picco nella tardaadolescenza e secondo piccointorno ai 60 anni
Diversamente dai NHL la componente neoplastica èminima. La diagnosi si basasulla presenza della cellula diHodgkin e delle sue varianti
Classificazione dei linfomi di HodgkinRye Classification REAL/WHO Classification
Lymphocyte predominant-5% Lymphocyte predominance, nodular
Nodular sclerosis-70%
Mixed cellularity-20% Classical HL
Lymphocyte depleted-5% Lymphocyte rich classical HL
Nodular sclerosis
Mixed cellularity
Lymphocyte depletion
Unclassifiable classical HL
Linfoma di Hodgkin sottotipo istologico
Sclerosi nodulareL’istotipo più comuneMediastino, colloCapsula fibrotica con bandesepimentanti la neoplasiaVarainte lacunare dellacellula di Reed Sternberg
Cellularità mistaMalattia più avanzataPazienti anzianiPiù cellule R-S, eosinofili, plasmacelluleVarianti mononucleari di cellule di R-S
Deplezione linfocitariaRetroperitoneo, pazieti anzianiPerdita di linfocitiPiù aggressiva
Predominanza linfocitariaGeneralmente malattialimitata (collo di giovaniadulti)Cellule L&H o cellula“popcorn”
Studi ancillari
Pattern di diffusioneIl linfoma di Hodgkin si diffonde per
continuità
PrognosiTasso
di
cura
oltre
80%
PatobiologiaEziologia ancora ignotaCellula B alterata30% EBV è riscontrato nella cellulaRS
Linfoma di Hodgkin: un problema biologico
High-throughput tissue microarray analysis of G1-cyclin alterations in classical Hodgkin's lymphoma indicates overexpression of cyclin E1. Tzankov A, Zimpfer A, Lugli A, Krugmann J, Went P, Schraml P, Maurer R, Ascani S, Pileri S, Geley S, Dirnhofer S.J Pathol. 2003 Feb;199(2):201-7.
Microarrays tissutali: analisi di una popolazione eterogenea (Hodgkin’s)
Reed Sternberg cells
Linfomi
Non HodgkinNeoplasie linfoidi che interessanoprimariamente le sedi dell’ “homing”linfoide normale
LNDMILZAM.A.L.T.
40.000 casi/anno, 20000 morti/anno
Aspetti cliniciMassa senza doloreCompressione ed infiltrazione di organi viciniInterferenza con le funzioni normali, nel caso diinfiltrazione di altri organiSintomi sitemici
FebbreSudorazione notturnaPerdita di pero
Quadro leucemico se c’è infiltrazione midollare
Precedenti classificazioni
RapaportKielWF
R.E.A.L./W.H.O. Classification
REAL/WHO è una classificazione clinico-patologica complessaCell lineage: B v T v NK v Histiocytic
Stadio di maturazione della presuntacontroparte normale. Include caratteristiche immunologiche e molecolari e non solo morfologicheInclude anche leucemie linfoidi
LINFOMI B
•Leucemia/linfoma da precursori B- linfocitari Leucemia linfatica cronica a cellule B/linfoma a piccoli linfociti Leucemia prolinfocitica B Linfoma linfoplasmocitoide Linfoma a cellule mantellari Linfoma centrofollicolare: a piccole cellule, a grandi cellule, diffuso a piccole cellule Linfoma B della zona marginale: extranodale (MALT), a cellule monocitoidi, splenico (con o senza linfociti villosi) Leucemia a cellule capellute Mieloma multiplo Linfoma B diffuso a grandi cellule Linfoma B a grandi cellule primitivo del mediastino Linfoma di Burkitt Linfoma B ad alto grado simil-Burkitt
LINFOMI T
Leucemia/linfoma da precursori T- linfocitari Leucemia linfatica cronica a cellule T Leucemia prolinfocitica T Leucemia a grandi linfociti granulari: a linfociti T, o tipo NK Micosi fungoide/sindrome di Sezary Linfomi periferici a cellule T: cellule medie, misto (medie e grandi), grandi; cellule linfoepiteliodi; linfoma T associato a panniculite sottocutanea Linfoma epatosplenico a linfociti T g/d Linfoma T angioimmunoblastico Linfoma angiocentrico Linfoma T intestinale (associato o meno a enteropatia) Leucemia/linfoma a cellule T dell’adulto Linfoma anaplastico Ki+ a grandi cellule: a cellule T, null, tipo “non Hodgkin
WHO 2000.
Origine delle malattie linfoproliferative: la visione morfologica
REAL/WHO classification- ossaturaNeoplasie B cellulari
Precursori B cellulari- correlati a leucemieacuteLinfomi B cellulari periferici- la maggior partedei linfomi
Neoplasie T/NK cellulariPrecursori T cellulariLinfomi T/NK periferici
Linfoma di Hodgkin
Frequenza
NHL Composti da cellule che hanno perso la capacità dicompletare il progetto di differenziazione. Ricapitolano la biologia e l’immunofenotipo della cellulanormale da cui derivaAi diversi aspetti citologici ed immunofenotipidiriconoscibili nei diversi stadi di maturazione dellamaturazione della normale cellula linfoide corrispondonodiversi tipi di linfomaDue prinicipali tipi clinici
Linfomi IndolentiLinfomi Aggressivi
Linfomi IndolentiCaratterizzati da processi di apoptosi difettiviDeriavanti da stadi di maturazione cellulare, caratterizzati da lenta crescitaSpesso già diffusi alla diagnosiStoria naturale lunga, sopravvivenza mediana >5 anniRispondono generalmente a chemio e radio-terapiaGeneralemte ricadono, ma rispondono ad altre terapieAllo stato sono considerati incurabili, tranne che in casodi
Malattia localizzataTrapianto di midollo
Linfomi AggressiviCaratterizzati da processi difettivi di controllo del ciclo cellulareDerivanti da stadi d maturazione cellulare, caratterizzati da rapido accrescimento cellularePiù spesso localizzatiPiù spesso extranodaliBreve storia naturale; sopravvienza mediana </= 2 anniRichiede terapie aggressive per la remissioneCurabile in alcuni casi
Approssimativamente 30-40% tra gli adulti50-80% tra i bambini/adolescenti
IndolentiSLL/CLLLinfoma follicolare, Gradi 1/2Linfoma MALT-typeLinfoma nodale dellazona marginaleLinfoma splenico dellazona marginaleHairy cell leukemiaLinfomaLinfoplasmaciticoMielomaPlasmacitomaLinfoma cutaneo TLinfoma cutaneoCD30+
AggressiviLeucemia B prolinfociticaLinfoma diffuso a grandi cellule BLinfoma di BurkittLinfoma mantellareLinfoma anaplasticot/nullLinfomi T periferici
StadiazioneDefinisce l’estensione, determinando la scelta terapeuticaEsame clinico, esami strumentali e biopsia midollareSistema di staging di Ann ArborSintomi B - febbre, perdita di peso > 10% , sudorazonenotturna
Staging table
PrognosiInternational prognostic index
International Prognostic Index 1
Survival curves
Neoplasie dei precursori B cellulari
Linfoma/leucemia dei Precursori B cellulariDeriva da celule allo stadio linfoblastico didifferenziazione, antigene- independente dellacellula B (normalmente midollare) Leucemia con o senza coinvolgimento linfonodaleTrattate come leucemie acute
80% il tasso di cura tra I bambini20-30% il tasso di cura tra gli adulti, per la presenza di alterazioni citogentiche correlate con maggiore aggressività (es. CromosomaPhiladelfia)
Linfomi
B perifericiDerivano dai diversi stadi di maturazione e differenziazione antigene- dependente
della cellula B
Neoplasie
Periferiche
B-cellulariSLL/CLL- cellula B vergineLeucemia prolinfocitica- una variante clinica più aggressiva dellaprecedenteLinfoma linfoplasmacitico- cellula della risposta immune primariaLinfoma della zona mantellare- cellule della zona mantellare intorno aifollicoliLinfoma foliclare-cellule del follicoloLinfoma della zona marginale extranodale- cellule del MALTLinfoma della zona mantellare nodale- zona mantellare nel linfonodoLinfoma della zona mantellare nodale- zona mantellare nella milzaLeucemia a cellule capellute- cellula pre-plasmacellulalLinfoma diffuso a grandi cellule-cellule post-germinaleiLinfoma di BurkittMieloma- plasmacellule midollariPlasmacitoma- plasmacellule extramidollari
Linfoma FollicolareClinica
Tra I più frequenti linfomi>40 anni (età mediana 59 anni)Generalmente diffuso alladiagnosiRisponde alla terapiaRicade frequentementeOAS a 5 anni=72%Possibile trasformazione in tipi più aggressivi (DLBCL)G3 ha una prognosi sovrapponibilea quella dei DLBCL
Patogenesi: t(14;18)(q32, q21)
Overespressione dellaproteina antiapoptoticaanti-apoptotic protein Bcl2
Linfoma follicolareDiagnosi
Pattern follicolarePiccole e grandi cellule, clivate e nonPositive:Monoclonal light chain, CD19, CD10, bcl6, Bcl2
Negativi: CD5, CyclinD1/Bcl1
PCR e FISH per t(14;18)
Table X: Indolent B cell lymphomas
Follicular Lymphoma (Grade I)
Marginal zone Lymphoma
Small lymphocytic lymphoma/CLL
Frequency (% all lymphomas
22% 8 7
Age of onset median
59 61 65
Stage at Presentation
Stage III/IV Disseminated
Stage I Stage IV
Response to Therapy
Good to most treatments, but incurable short of transplant
Frequently curable
Similar to Follicular lymphoma
5 yr survival 72% 74% 51%
Predominant site presentation
Nodal Extranodal Marrow/nodal
Pattern of nodal Infiltration
Follicular Diffuse Diffuse
Benign cell Equivalent
Germinal center small cleaved cell
Marginal zone Lymphocyte
Virgin B cell
Dominant cell type
Small cleaved cell in most cases, but can be large cell
Mix of small lymphocytes, plasma cells
Small lymphocytes with round nucleus
Immunopheno -type
Positive: CD19 CD10, Bcl2+ Negative: CD5-
Positive: CD19, Bcl2 Negative: CD10, CD5
Positive: CD19, CD5 CD23 Negative: CD10
Molecular Pathogenesis
t(14;18) Bcl2/JH
t(11;18), Trisomy 3
Trisomy 12
Linfoma
Diffuso
a grandi
cellule BClinica
30% NHLEtà mediana 64 anniFrequentemente localizzataRapida crescita della massa neoplastica40% curabile con terapie aggressive/ trapianto delle
cellule staminali
PatogenesiDiverse anomalie citogenetiche, ma nessuna specifica
Diffuse Large B cell lymphoma
DiagnosiPatern diffusoGrandi cellule, con nucleo ovale o inciso, cromatina dispersa e 1-3 nucleoliImmunofenotipo dlela cellula B
Linfoma di BurkittClinica
3% dei linfomiEtà mediana 31 anniIdentificato in Africa daThomas Burkitt
Associato a EBV Localizzazione allammandibola
N paesi occidentali sipresenta nella regioneileocecal~70-80% dei bambini sono curabili così come il40% degli adulti
Patogenesi:t(8;14), con overespressionedell’oncogene myc, un regolatoredel ciclo cellulare
Origine delle malattie linfoproliferative: il correlato molecolare
Nature 403, 503 - 511 (03 February 2000); doi:10.1038/35000501
Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profilingASH A. ALIZADEH*†, MICHAEL B. EISEN†‡, R. ERIC DAVIS CHI MA , IZIDORE S. LOSSOS¶, ANDREAS ROSENWALD, JENNIFER C. BOLDRICK*, HAJEER SABET, TRUC TRAN, XIN YU , JOHN I. POWELL#, LIMING YANG#, GERALD E. MARTI§, TROY MOORE , JAMES HUDSON JR , LISHENG LU**, DAVID B. LEWIS**, ROBERT TIBSHIRANI††, GAVIN SHERLOCK‡, WING C. CHAN, TIMOTHY C. GREINER , ENNIS D. WEISENBURGER , JAMES O. ARMITAGE‡‡, ROGER WARNKE¶¶, RONALD LEVY, WYNDHAM WILSON, MICHAEL R. GREVER, JOHN C. BYRD, DAVID BOTSTEIN‡, PATRICK O. BROWN*,18 & LOUIS M. STAUDT
Biologia Molecolare. Il profilo di espressione genica identifica sottotipi prognostici di linfoma diffuso a grandi
cellule
Linfoma di BurkittDiagnosi
L’equivalente benigno è la piccola cellula non clivatareplicante del centrogerminalePattern diffusoAlto indice mitotico; Enorme numero di macrofagi(aspetto a cielo stellato) Citologia: nucleorotondeggianteImmunophenotype:
Positive: CD20, CD10Negative: CD5
Linfoma mantellareClinica
6% dei linfomiEtà mediana 63 anniGeneralmente disseminatoalla diagnosiScarsa risposta allaterpiaOAS 27% a 5 anni
Patogenesit(11;14)overespressione diciclina d1, regolatore del ciclo cellulare
Linfoma
della
zona
mantellareDiagnosi
Controparte benignazona mantellareCellula rotondeggiantePattern diffusoImmunofenotipope:
Positivi: CD20, CD5, Ciclina d1and Bcl2Negativi CD10, CD23
The proliferation gene expression signature is a quantitative integrator of oncogenic events that predicts survival in mantle cell lymphomaA. Rosenwald, et. al. CANCER CELL : 2003. 3:185-197
Una selezione di 20 geni costituisce una “Proliferation Signature” di valore prognostico nei linfomi mantellari
Linfoma dei precursori T cellulari
ClinicaadolescentiSi presenta come una leucemia o con massamediastinica +/- coinvolgimento midollarecurabile: ~70%
diagnosiContropartebenigna cellule T vergini del timoPattern diffusoCitologia blasticacon nucleoovalareMarkers T
Linfoma
dei
precursori
T cellulari
Linfomi TPrevalentementeleucemici/disseminati
Leucemia dei prolinfociti TLeucemia a grandi cellule granulariLeucemia a cellule NKLeucemia/linfoma a cellule T dell’adulto
Prevalentemente nodaliLinfoma T angioimmunoblasticoLinfoma T periferico, non specificatoLinfoma T/Null anaplastico
Prevalentementeextranodale
Micosi fungoideSindrome di SezaryLinfoma cutaneo CD30+Linfoma T panniculiticoLinfoma NK/T, nasale e nasal-typeLinfoma intestinale TLinfoma T epatosplenico
Aspetti chiave dei linfomi TClinica
20% di tutti I linfomiSpesso extranodaliLa maggior parte a scarsaprognosi
Patogenesi:Anaplastic large cell lymphoma- t(2;5): gene ALK1 Linfom T epatosplenicoIsocromosoma 7
DiagnosiAnaplastic large cell lymphoma --> OAS 77% 5 year survival Micosis fungoide, indolente
ImmunofenotipoVariabile espressione deimarkers T cellulari
Studi ancillariStudi immunologici
CitofluorimetriaImmunoistochimica
Metodiche di biologia molecolarePCRFISH
Strategia
I linfomi
riproducono
l’immunobiologia
della
controparte
normaleTale riproduzione
può
essere
aberrante
L’espressione
normal o aberrante
può
essere
usata
per :Determinare lineage, B versus T versus NKDetectare la clonalitàIdentificare la malignità in caso di perdita o aberranteespressione di determinati antigeniIdentificare il sottotipo di linfoma
Antigeni di superficieLa risposta immunitaria richiede il contributo dinumerosi fattori che si trovano sulla mambrnaplasmatica delle cellule immunocompetentiSono classificati in B associati, T associati, associatiall’attivazione e recettori di chemochineL’espressione è variabile in rapporto alla sequenza dimaturazione linfoideCatalogati in CD - clusters of differentiation – seguitoda un numero
B cell antigen expression
T cell antigen expression
Tecniche immunologiche
Flow cytometryImmunoistochimica
IMMUNOISTOCHIMICA
Lymphoma Surface immuno-globulin
CD5 CD10 CD20 CD23 CD43 CD103 Cyclin D1
Chronic lymphocytic leukaemia or small lymphocytic lymphoma
+ + – + + + – +/–
Hairy–cell leukaemia + – – + – + ++ +/–
Follicular lymphoma + – + + +/– – – –
Mantle–cell lymphoma + + – + – + – +
Diffuse large B–cell lymphoma
+/– – +/– + NA +/– NA –
Burkitt's lymphoma + – + + – – NA –
MALT lymphoma + – – + +/– +/– – – ++, More than 95% positive; +, More than 90% positive; +/–, 10–90% positive; –, less than 10% positive; NA, not applicable; MALT, mucosa-associated lymphoid tissue.
Il fenotipo delle malattie linfoproliferative: classificazione diagnostica con significato terapeutico
Tecniche molecolariClonalitàRiarrangiamenti cromosomici
Tessuto linfoideSangue periférico
TdT TdT TdTmu
B progenitrice
Pre-pre-B Pre-B B immatura B matura B attivata Plasmacel.
IgH riarrangiato
IgL riarrangiato
Midolloosseo
Mantello Centro germinativo
TCR gamma riarrangiato
Céllula linfoide proecursore
Pro- timocito
Timocito immaturo
Timocito comúne
Timocito maturo
T maturoTdT TdTCD3
TdTCD3
TdTCD3
TdTCD3
TdTCD3
TCR delta riarrangiato TCR delta deleto
TCR beta riarrangiatoTCR alfa riarrangiato
Midolloosseo
Timo(corticale)
Timo (midollare)
Sangue periférico
Tessuto linfoide
LinfocitoTH
LinfocitoTS
Clonalità
dei processi linfoproliferativi
Tutte le neoplasia sono proliferazioni clonaliTutte le cellule B e T presentano riarrangiamento genico del recettore antigenico
CH CH
COO¯COO¯
COO¯COO¯
+H3
N +H3
N
+H3
N +H3
N
-S-S-
-S-S-
-S-S- -S-S-CL C L
VL V L
C LCL
Vα
Cβ
Vβ
Cα
Ig TCR
Recettore antigenicoCellule B: Immunoglobulina
Cellule T: Recettore della Cellula T (TCR)
• 2 catene leggere: kappa o lambda• 2 catene pesanti:μ
(IgM) δ
(IgD) γ
(IgG) α
(IgA) ε
(IgE)
• Regioni
variabili
(V) e
constanti
(C) CH CH
COO¯COO¯
COO¯COO¯
+H3
N +H3
N
+H3
N +H3
N
-S-S-
-S-S-
-S-S- -S-S-CL C L
VL V L
C LCL
• Proteina
di
membrana• Eterodímeri:
• Catene
α/β
(95 %)• Catene
γ/δ
(5 %)
• Regioni
variabili
(V) e
constanti
(C) • Si associa
alla
molecola CD3
Vα
Cβ
Vβ
Cα
TCR CD3
γ δ ε
Organizzazione genomica dei geni delle Ig e TCROrganizzazione genomica dei geni delle Ig e TCR
IgH14q32
VH1 VH2 .... VHn DH1-15 JH1-6 Cμ
Cδ
Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε
Cα2
VK1 VK2 .... VKn JK1-5 CKIgκ
2p11Vλ1 Vλ2 .... Vλn J C1 J C2 J C3 J C4 J C5 J C6
Igλ22q11
Vα1 Vα2 ...Vαn Vδ1 Vδ2 ...Vδn Dδ
Jδ
Cδ
Jαn CαTCR α/δ14q11
Vβ1 Vβ2 ....Vβn Dβ
1 Jβ1 C β1 Dβ
2 Jβ2 Cβ2TCR β7q34
V1 V2 ..... V8 VA V9 V10 VB V11 V12 Jγ1 C γ1 Jγ2 C γ2
1 2 3 1 2
TCR γ7p15
Riarrangiamento di TCRγ
: primersRegión Secuencia
TCR V2 5’ CTTCCTGCAGATGACTCCTACAACTCCAAGGTTG 3’
TCR V3 5’ CTTCCTGCAGATGACGTCTCCACCGCAAGGGATG 3’
TCR V4 5’ TCCCCTGCAGATGACTCCTACACCTCCAGCGTTG 3’
TCR V5 5’ TTCCTGCAGATGACGTCTCCAACTCAAAGGATG 3’
TCR V8 5’ CTTCCTCGAGATGACTCCTACAACTCCAGGGTTG 3’
TCR V9 5’ GGNACTGCAGGAAAGGAATCTGGCATTCCG 3’
TCR V10 5’ CTCTGCAGAATCCGCAGCTCGACGCAGCA 3’
TCR V11 5’ CACTGCAGGCTCAAGATTGCTCAGGTGGG 3’
TCR V12 5’ ACTCTGCAGCCTCTTGGGCACTGCTCTAAA 3’
Jγ 1.3, 2.2 5’ AAGTGTTGTTCCACTGCCAAA 3’
Jγ 1.1, 2.1 5’ AGTTACTATGAGC(T/C)TAGTCCC 3’
Jγ 1.2 5’ TGTAATGATAAGCTTTGTTCC 3’
Mix I: V2, 8 + V3 + V4 + V9Mix II: V5 + V10 + V11 + V12Mix III: Jγ1 - Jγ2
PCR 1: Mix I + III : Tm 59ºCPCR 2: Mix II + III : Tm 55ºC170-200 pb
V1 V2 ..... V8 VA V9 V10 VB V11 V12 Jγ1 C γ1 Jγ2 C γ2
1 2 3 1 2
Mix I, Mix II Mix III5’ 3’ 3’ 5’
Organizzazione e riarrangiameno dei geni IgHOrganizzazione e riarrangiameno dei geni IgHVH1 VH2 .... VHn DH1-15 JH1-6 Cμ
Cδ
Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε
Cα2
VH1 VH2 .... VHn DJ Cμ
Cδ
Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε
Cα2
VDJVDJ Cμ
Cδ
Cγ3 Cγ1 Cε1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε
Cα2
1o riarrangiamento
2º riarrangiamento
VH DH JHDH
N N
Cμ
Struttura della regione variabile del gene IgH
Fr1 Fr2CDRI CDRII CDRIIIFr3 Fr4
VH DH JH
N N
•Zone
ipervariabili:
Regioni
Determinanti
la
Complementarietà
(CDR)•Zone
più
consevate:
Framework
(Fr)
•Inserzioni
“N”•Regioni
di
unione
(J)
Fr1 Fr2 Fr3
Primers per detectare il riarrangiamento monoclonale di IgH
CDRII: 230-300 pbCDRIII: 70-150 pb
CDRIII Fr4
VH N DH N JH CH
CDRII
5’ 3’
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
Regione Sequenza
CDRII (Fr2) 5’ TGG(A/G)TCCG(C/A)CAG(G/C)C(T/C)(T/C)CNGG 3’
CDRIII (Fr3) 5’ ACACGGC(C/T)(G/C)TGTATTACTGT 3’
JH 5’ TGAGGAGACGGTGACC 3’
PCR
Riarrangiamento di IgH
Pattern di clonalità:
Riarrangiamentopoliclonale
Riarrangiamentomonoclonale
Riarrangiamentooligoclonale
LYMPHOMA-
SPECIFIC GENETIC ALTERATIONS (GATEKEEPER GENE).
LYMPHOMA GEN TRANSLOC. FUNCTION
Follicular Bcl2 IgH Apoptosis Inhibitor
Mantle Cyclin D1 IgH Promotes G1/Stransition.
DLBCL Bcl6 IgH GC Formation
Lp Im Pax5 IgH Homeobox
MALT API2 11;18 Apoptosis reg
MALT Bcl10 IgH Apoptosis inhibitor
Burkitt c-myc Ig genes Transcription factor
La diagnosi morfologica
Linfoma di Burkitt Linfoma follicolare
L’immunoistochimica acquisisce un nuovo ruolo
Espressione di bcl-2 in un linfonodo
normale
Espressione di bcl- 2 in un linfoma
follicolare
Follicular lymphoma
Bcl2
CyclinD1
Mantle cell lymphoma
1976
t(8;14)nei
Burkitt
La morfologia guida l’indagine citogenetica e molecolare
Cloning of C-Myc
1982 1987
Cloning of bcl-2
FISH: Applicazioni in oncologia
Targetterapeutico
Valoreprognostico
Diagnosi
FISH
FISH in ematopatologiaDiagnosi
Valoreprognostico
ApplicazioniTerapeutiche??
FISH
Traslocazioni: linfomi e leucemieLeucemie:
Linfomi:
BCR/ABL [t(9;22) M-BCR] BCR/ABL [t(9;22) m-BCRBCR/ABL [t(9;22) µ-BCR]AML1/ETO [t(8;21)]
PML/RAR [t(15;17)] CBFß/MYH11 [inv(16)] MLL/AF4 [t(4;11)] E2A/PBX1 [t(1;19)] TEL/AML1 [t(12;21)]DEK-CAN [t(6;9)]
ALK/NPM [t(2;5)] BCL2/IgH
[t(14;18) MBR] BCL2/IgH
[t(14;18) mcr] BCL1/IgH
[t(11;14) MTC] API2/MLT [t(11;18)]
FISH: leucemie
Traslocazioni• t (9;22) o bcr/abl nelle LMC (leucemie mieloidi croniche)• t (15;17) o PML/RARA nelle LE (leucemie acute)• t (12;21) o TEL/AML1 nelle LA (leucemie acute B)
Trisomie e monosomie•trisomia cr.8 : nelle leucemie mielocitiche acute•trisomia cr.12: nella leucemia linfocitica acuta•monosomia cr.7: nei disordini mieloproliferativi
Delezioni-20q nei disordini mieloproliferativi-5q nelle leucemie mieloidi
acute
FISH: linfomi
Traslocazioni
• t (14,18) linfoma follicolare
• t (11; 14) linfoma mantellare
•
t (11; 18)(q31;q31) & t(14;18)(q21;q31) linfoma marginale
extranodale tipo MALT
• t che coinvolgono il gene bcl6
• t(2;5) linfoma anaplastico
•T(8;14) linfoma di Burkitt
Differenziazione linfoide B
Tessuto linfoideSangue periferico
TdT TdT TdTmu
Cellula B progenitrice
Cellula Pre-pre-B
Cellula Pre-B
Cellula B immatura
Cellula B matura
Cellula B attivata
Plasma- cellula
HLA-DRCD34
HLA-DRCD34CD19CD22CD10
HLA-DRCD34CD19CD22CD10CD20CD79a
HLA-DRCD19CD22CD20CD21CD5SIgMCD79a
HLA-DRCD19CD22CD20CD21SIgM,DCD79a
HLA-DRCD19CD22CD20SIgM,G, ACD79a
HLA-DRCD38CD79a
IgH riarrangiato
IgL riarrangiato
Midolloosseo
Mantello Centro germinativo
Linfoma mantellare
T(11;14)
Linfoma follicolareT(14;18)DLBCLT(bcl6)
traslocazioni
Cromosomi normali
traslocazione
FISH
Diagnosi
• Dubbia diagnosi anatomopatologicaFenotipo ambiguo
IHC non convincente
• Follow-up
dei pazienti con diagnosi “molecolare”
certa
Caso 1
CD23 bcl2
Diagnosi:Linfoma follicolare
FISH t(14;18)
t (14;18)
Cro
18q21 (BCL2 SpectrumOrange*)
Cro
14q32 (IGH SpectrumGreen*)
* Sonde Vysis: LSI IGH SpectrumGreen
/ LSI BCL2 SpectrumOrange
Linfoma follicolare (LF): PCR
t(14;18) FISH t(14;18) PCR
Caso 1Cnt+
# # #
•Splenomegalia: CM 25X16X9
•MO: infiltrazione neoplastica
•Splenectomia diagnostica e terapeutica
Caso 2
Ciclina D1 CD5
Diagnosi:Linfoma Mantellare
FISH t(11;14)
t (11;14)(q13;q32,3)
Cro
11q13 (CCND1 SpectrumOrange*)
* Sonde Vysis: LSI IgH
SpectrumGreen
/ LSI CCND1 SpectrumOrange
Cro
14q32,3 (IgH
SpectrumGreen*)
Linfoma mantellare :PCR
Foto t(11;14) FISH
Foto t(11;14) PCR
Ctr+
Caso 2
FISH Prognosi
•Linfomi
t(11;18) associata a bcl10 nucleare MALT lymphoma
t(14;18) (q21,q31) MALT Lymphoma
17p del, 13q del, 11q del e trisomia 12 in SLL/LLC
T(11;18)(q21,q21)frequente in casi di MALTomi gastrici
localmente avanzati
Frequente associazione con BCl10 nucleare
Frequente associazione con MALTomi
H. pylori negativi
Non responder all’eradicazone di H. pylori
Liu
H, et
al. Blood
2001; 98:1182-1187
Ye
H, et
al, Blood
2003; 101:2547-2550
SLL/LLC
17p del (p53): pz con ridotti intervalli liberi da trattamento
13 q del (RB? E LAMP1): pz con aumentati intervalli liberi da
trattamento
11 q del (ATM): pazienti con avanzato stato di malattia
Dohner
H, N Engl
J Med
2000; 343:1910-6.
11q del
11q green17p orange
13 q orange(q14.3) e aqua (q34)12 cep green