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LESÕES, ISOLAMENTO E EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO Mycobacterium bovis NO GRANULOMA DA TUBERCULOSE EM
BOVINOS DO NORTE FLUMINENSE
ALESSA SIQUEIRA DE OLIVEIRA DOS SANTOS
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ JULHO - 2004
LESÕES, ISOLAMENTO E EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO Mycobacterium bovis NO GRANULOMA DA TUBERCULOSE EM
BOVINOS DO NORTE FLUMINENSE
ALESSA SIQUEIRA DE OLIVEIRA DOS SANTOS
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal
Orientador: Prof. Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho
CAMPOS DOS GOYTACAZES-RJ JULHO - 2004
LESÕES, ISOLAMENTO E EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO Mycobacterium bovis NO GRANULOMA DA TUBERCULOSE EM
BOVINOS DO NORTE FLUMINENSE
ALESSA SIQUEIRA DE OLIVEIRA DOS SANTOS
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal
Aprovada em 14 de julho de 2004
Comissão examinadora:
Prof a. Gisele Braziliano de Andrade (Doutora - Anatomia Patológica) - UFRRJ
Prof. Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira (Doutor - Parasitologia) - UENF
Prof. Márcio Manhães Folly (Doutor - Medicina Veterinária) - UENF
Prof. Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho (Doutor - Anatomia Patológica) - UENF (Orientador)
ii
“Só existem dois dias no ano que nada pode ser feito. Um se chama ontem e o outro
amanhã. Portanto, HOJE é o dia certo para AMAR, ACREDITAR, FAZER e,
principalmente, VIVER”. (Dalai-Lama)
iii
A
minha amável mãe, Zerci Siqueira, que me permitiu uma educação vitoriosa, acreditando ser o melhor caminho.
A
minha sempre amada Virgínia Celvia, em quem procurei me espelhar
sempre no tocante à sabedoria, sinceridade e honestidade, pela importante
participação na minha vida acadêmico-profissional e emocional.
Ao
meu marido Aldir, por estar ao meu lado me incentivando, admirando o meu trabalho, compartilhando os momentos alegres e agradáveis como também,
os tristes e de impaciência.
Dedico
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por nos permitir a vida, as conquistas e as vitórias e, nos
momentos tristes, angustiantes e perigosos, sua presença nos determinou força e
coragem.
Ao meu irmão Alexandre Luiz, que me serviu de exemplo para a realização
deste trabalho, mostrando-me que a dedicação e o esforço resultam na nossa
própria satisfação.
Ao meu orientador Prof Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho, um exemplo de
profissional da educação, que me ensinou com paciência e dedicação a admirar a
Anatomia Patológica.
À Profª. Leila de Souza Fonseca, do Laboratório de Micobactérias-UFRJ,
pelo apoio e co-orientação na área de microbiologia.
À Profª Eliene Carvalho Fonseca, do Laboratório de Imuno-
histoquímica/Hospital Antônio Pedro/UFF, pela parceria e orientação na realização
da técnica imuno-histoquímica.
À Dulce Cordeiro, que me recebeu nesta cidade no início desta caminhada,
confiando a mim seu lar, seu carinho materno e sua amizade.
À admirável amiga Ana Bárbara, quem me acompanhou em todas as etapas
deste trabalho, sempre paciente, extrovertida e perseverante.
Aos amigos do Setor de Anatomia Patológica, que me permitiram a
realização deste trabalho em um ambiente descontraído e alegre.
v
À técnica e amiga Luciana da Silva Lemos, pelas diversas orientações, não
somente científicas como também pessoais, que muito me serviram e foram
aplicadas com êxito.
Ao técnico Rodrigo Barros Crespo, que sempre se mostrou dedicado e
cuidadoso na realização do seu trabalho.
A toda a equipe do LSA, professores, alunos e técnicos, pela troca de
informações que contribuiu para o desenvolvimento deste trabalho.
A toda equipe do Laboratório de Micobactérias da UFRJ, em especial, ao
Marlei Gomes que me ajudou e me ensinou com muita dedicação.
Ao amigo Médico Veterinário Moacir Bogado, pela participação e interesse
na coleta de material.
Aos companheiros e amigos Médicos Veterinários, Paulo Barros, Anna
Cássia Corbia, Liliane, e aos técnicos, Rafael e Leonardo, do Serviço de Inspeção
de Carnes pela contribuição na coleta de material.
A Giovana e Magda da biblioteca, por serem sempre solidárias na orientação
à busca de trabalhos científicos.
A Elenita e a Etiene, pelo educado e atencioso atendimento na Pós-
graduação.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro - FAPERJ,
pelo auxílio financeiro.
À Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF, por
permitir o ensino e a educação.
A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a conclusão deste
trabalho.
vi
BIOGRAFIA
Alessa Siqueira de Oliveira dos Santos, filha de Zerci Siqueira de Oliveira e
Luiz Celso Soares de Oliveira, nasceu em 08 de novembro de 1977, na cidade do
Rio de Janeiro - RJ.
Em 1997, foi admitida no curso de Medicina Veterinária pela então
Universidade Estadual do Norte Fluminense.
No período de 1998 a 2002, na graduação em Medicina Veterinária na
Universidade Estadual do Norte Fluminense, foi aluna de iniciação científica.
Foi admitida, em agosto de 2002, no Curso de Pós-graduação em Produção
Animal, Mestrado, Sanidade Animal, da Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro - UENF, em Campos dos Goytacazes - RJ, submetendo-se à defesa
de tese para conclusão do referido curso em julho de 2004.
vii
CONTEÚDO
RESUMO.................................................................................................................ix
ABSTRACT .............................................................................................................xi
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 4
2.1. Definição ....................................................................................................... 4
2.2. História da doença ........................................................................................ 5
2.3. Tuberculose como uma importante zoonose................................................. 7
2.4. Agente etiológico........................................................................................... 8
2.5. Patogenia ...................................................................................................... 9
2.6. Lesões......................................................................................................... 11
2.7. Epidemiologia.............................................................................................. 12
2.8. Métodos de diagnósticos............................................................................. 16
2.8.1. Prova de tuberculina................................................................................. 16
2.8.2. Provas sorológicas....................................................................................17
2.8.3. Necropsia..................................................................................................18
2.8.4. Exame microscópico.................................................................................18
2.8.5. Exame bacteriológico................................................................................19
2.8.6. Imuno-histoquímica...................................................................................19
2.8.7. Métodos de reconhecimento de ácido nucléico........................................21
2.9. Controle e tratamento..................................................................................21
viii
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................. 24
3.1. Desenho do estudo ..................................................................................... 24
3.2. Colheita das amostras................................................................................. 25
3.3. Metodologia utilizada................................................................................... 25
3.3.1. Caracterização macroscópica da lesão.................................................... 25
3.3.2. Histopatologia........................................................................................... 25
3.3.2.1. Análise estatística..................................................................................26
3.3.3. Imuno-histoquímica .................................................................................. 26
3.3.4. Cultura...................................................................................................... 27
3.3.4.1. Digestão do tecido................................................................................. 27
3.3.4.2. Descontaminação do inóculo.................................................................28
3.3.4.3. Inoculação em meio de cultura e incubação..........................................28
3.3.4.4. Provas bioquímicas ...............................................................................28
3.3.4.4.1. Teste de sensibilidade ao TCH........................................................... 29
3.3.4.4.2. Urease................................................................................................ 29
3.3.4.4.3. Pirazinamidase................................................................................... 29
3.3.4.4.4. Produção de niacina........................................................................... 30
3.3.4.4.5. Reduçâo de nitrato ............................................................................. 31
3.3.4.4.6. Preferência por piruvato ..................................................................... 31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................... 32
4.1. Estudo macroscópico .................................................................................. 32
4.2. Estudo microscópico ................................................................................... 34
4.3. Imuno-histoquímica ..................................................................................... 36
4.4. Estudo microbiológico..................................................................................37
5. CONCLUSÕES ................................................................................................. 40
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 41
8. APÊNDICES...................................................................................................... 51
8.1. Apêndice A (Pranchas e Figura) ................................................................. 52
8.2. Apêndice B (Protocolos)...............................................................................56
ix
RESUMO
SANTOS, Alessa, S.O., M. S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; Julho de 2004; Lesões, isolamento e expressão imuno-histoquímica do Mycobacterium bovis no granuloma da tuberculose em bovinos do Norte Fluminense; Professor Orientador: Prof. Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho. Professoras Conselheiras: Gisele Braziliano de Andrade, Márcio Manhães Folly e Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira.
A tuberculose bovina é uma enfermidade infectocontagiosa crônica
granulomatosa causada pela bactéria Mycobacterium bovis e está associada a
importantes agravos para a saúde pública e econômicos. As perdas econômicas são
decorrentes da morte dos animais, perda do potencial produtivo, condenação de
carcaças com lesão e descréditos das propriedades afetadas. O exame
anatomopatológico é um importante recurso diagnóstico no post-mortem, tanto na
necropsia convencional quanto na inspeção sanitária de animais de abate. Visou-se
relacionar lesões macro e microscópicas com a espécie de Mycobacterium isolada,
de forma a estabelecer padrões morfológicos que sirvam de apoio aos inspetores
sanitários de carnes, além de consolidar a técnica de imuno-histoquímica no Setor
de Morfologia e Anatomia Patológica do LSA/UENF. Dos 123 animais estudados, 90
foram positivos para a prova de tuberculina intradérmica (PPD). No abate sanitário,
foram colhidas amostras de todos os animais, inclusive dos PPD positivos sem
lesões, principalmente dos pulmões e seus linfonodos. Realizou-se a histopatologia
pela coloração de hematoxilina e eosina (HE) e Ziehl-Neelsen (ZN) e o isolamento e
identificação do M. bovis. Macroscopicamente, lesões granulomatosas compatíveis
x
com tuberculose foram observadas em 72% dos animais, sendo que, nos positivos
para o PPD, 61,8% apresentaram lesão. Dentre aquelas, 63% estavam localizadas
nos pulmões e seus linfonodos, caracterizando a via aerógena como a principal via
de infecção. Nas lesões macroscopicamente sugestivas, a microscopia/HE revelou
um granuloma epitelióide completo, algumas vezes, com mineralização. Pelo método
de ZN, foram demonstrados escassos bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) nas
lesões, enquanto a técnica LSAB+ (L-streptoavidina-biotina) de imuno-histoquímica
demonstrou grânulos ou círculos acastanhados maiores do que os BAAR corados
pelo ZN. Em ambos os métodos, os bacilos marcados estavam no citoplasma de
células epitelióides, gigantes e livres na área de necrose. O isolamento e
identificação do M. bovis foi possível em 14 (56%) amostras das 25 testadas. Apesar
da cultura ser considerada um diagnóstico “ouro”, a histopatologia demonstrou mais
amostras positivas do que o bacteriológico. Isto, provavelmente, devido à escassez
do bacilo viável na lesão e do processamento laborioso exigido para a cultura. Na
região estudada, a tuberculose é enzoótica, que faz com que o exame
histopatológico, nestas condições, seja considerado conclusivo nas necropsias e
inspeção sanitária post-mortem.
Palavras-chave: bovino, imuno-histoquímica, inspeção sanitária, patologia,
tuberculose.
xi
ABSTRACT
SANTOS, Alessa, S.O., M.S., Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro; July, 2004; Lesions, isolation and immunohistochemical expression of Mycobacterium bovis in granuloma of tuberculosis in cattle of Fluminense North. Adviser: Eulógio Carlos Queiróz de Carvalho. Counselor: Gisele Braziliano de Andrade, Márcio Manhães Folly e Francisco Carlos Rodrigues de Oliveira.
Bovine tuberculosis is a granulomatous chronic infectious disease caused by a
bacteria Mycobacterium bovis, and is associated with animal and public health and
economic problems. Economic losses are caused by death of infected animals, lower
productivity, problems associated with carcasses condemned and discredit of the
affect farms. Anatomopathological exam is an important diagnostic test during post-
mortem, such as conventional necropsy as well as on sanitary inspection of
slaughtered animals. The aim of this investigation was to relate gross and
microscopic lesions with the species of isolated Mycobacterium to establish
morphologic standards, and to use and consolidate the immunohistochemical
technique in our Sector. The study was carried out with one hundred and twenty-
three cattle with ninety positive by the intradermic tuberculin test (PPD). Samples
were collected from all animals including those positive to the PPD without
suggestive macroscopic lesions, mainly samples of lungs and lymph nodes. Samples
were submitted to histopathology by haematoxylin and eosin (HE) and Ziehl-Neelsen
(ZN) staining and to the isolation and identification of the M. bovis. Macroscopically,
suggestive granulomatous lesions of tuberculosis were observed in 72% of the
xii
animals considering that 61,8% of lesions had been observed in positive to PPD.
63% of those lesions were in lungs and lymph nodes, determining the aerogenous
route as the main infection. From typical macroscopic lesions, the microscopic/HE
revealed complete epitheliod granuloma and sometimes calcification. Using ZN stain,
few of acid-fast bacilli (BAAR) were observed in lesions. When the LSAB+
immunohistochemical technique was used, positives were seen as brownish granules
or circles with a greater size than BAAR stained by the ZN method. By both methods
BAAR the expression was located in cytoplasm of epithelioid and giant cells and in
areas of necrosis. By culture, 14 samples were positive out of the 25 samples
studied. The isolates of M. bovis were identified by biochemical tests, colony
morphology and staining characteristics. Despite the culture had been considered the
“Gold standard”, definitive diagnosis, histopathology detected more positive samples
than cultivation. This difference could be attributed to scarcity of the available bacilli
on lesions and to the laborious processing for the culture. In studied region,
tuberculosis is enzootic, however the histopathology was conclusive diagnosis in
necropsy and the post-mortem inspection.
Keywords: bovine, immunohistochemical, sanitary inspection, patology, tuberculosis.
1
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose bovina (TbB) é uma zoonose de caráter inflamatório e
infectocontagioso, cujo agente micobacteriano mais importante é o Mycobacterium
bovis, que produz uma lesão granulomatosa típica. Em estágios iniciais da doença
ou quando o agente é Mycobacterium avium, as lesões podem não estar presentes à
necropsia.
Os bacilos clássicos da tuberculose são Mycobacterium tuberculosis
(homem), M. bovis (bovinos) e M. avium (aves), podendo, no entanto, ocorrer a
infecção cruzada entre estes e várias outras espécies, tais como: mamíferos e aves
domésticos e silvestres. Mycobacterium bovis é cosmopolita e bastante virulento,
podendo afetar os diferentes tecidos e espécies animais.
A tuberculose nos bovinos possui distribuição mundial, concentrando-se,
principalmente, em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, notadamente,
naqueles com criações intensivas de bovinos leiteiros. Esta enfermidade determina
prejuízos à pecuária e riscos à saúde da população que consome produtos de
origem animal.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) elegeu a tuberculose,
principalmente, a determinada pelo M. bovis, como importante zoonose profissional
nos grupos como magarefes, tratadores de animais e veterinários. O aumento no
número de casos de tuberculose humana vem tendo como principal causa do seu
advento a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida - AIDS, em que os bacilos M.
2
tuberculosis e M. bovis se instalam oportunisticamente no organismo debilitado pela
virose.
A TbB é primordialmente respiratória e sua transmissão, basicamente,
aerógena. A introdução da enfermidade nos rebanhos se dá comumente pela
aquisição de animais infectados, que contaminam os sadios por eliminação do bacilo
pela respiração, corrimento nasal, leite, fezes, urina, secreções vaginais e uterinas e
pelo sêmen. A ingestão de leite é a principal via de transmissão para os animais
jovens, enquanto a transmissão pelas vias intra-uterinas, pelo coito e pelo sêmen,
não é comum. É possível o contágio de bovinos, por M. bovis, a partir de pacientes
bacilíferos pelo ar, ou ainda pela urina de pacientes com tuberculose urogenital que
excretam nos cochos e bebedouros.
A doença, embora crônica, pode assumir caráter agudo progressivo.
Qualquer tecido pode ser afetado, mas as lesões de aspecto caseoso são mais
comumente observadas nos linfonodos da cabeça, do pescoço, nos mediastínicos e
mesentéricos, pulmões, intestinos, fígado, baço, pleura e peritônio. Em animais com
infecções recentes, os sinais clínicos possam não estar presentes. Entretanto, com a
evolução do quadro, após vários anos, os sinais incluem emaciação progressiva,
aumento de volume dos linfonodos e, em alguns casos, tosse, dispnéia e episódios
de diarréia intercalados com constipação.
Para o diagnóstico da TbB no animal vivo, é aplicado o teste alérgico
intradérmico, que pode ser associado às manifestações clínicas, testes sorológicos
(Elisa - Enzyme Linked Immunosorbent Assay e γ - IFN - gama interferon) e a
técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). No animal morto, a necropsia
baseada nas lesões macro e microscópicas é o método mais comum para
comprovar a doença. As amostras processadas para exames histopatológicos
podem ser submetidas aos métodos de colorações de rotina pela hematoxilina e
eosina (HE) e especiais, como: Ziehl Neelsen (ZN), Kinyoun-Fite e Imuno-
histoquímica (método ABC-P, DAKO). Esta última altamente sensível, capaz de
detectar os antígenos do Mycobacterium bovis e até mesmo seus fragmentos nas
lesões. É recomendável o diagnóstico bacteriológico por cultivo do agente, a partir
de amostras teciduais congeladas, associado ao exame histopatológico, que permite
a confirmação do diagnóstico.
As lesões da tuberculose animal podem se apresentar com vários padrões
de acordo com as espécies de Mycobacterium e hospedeiros envolvidos.
3
Mycobaterium bovis acomete principalmente bovinos, homem, suíno e,
ocasionalmente, cavalos, cães, gatos e ovinos. Mycobacterium avium causa a
doença em aves e, ocasionalmente, em gatos, bovinos, suínos, ovinos, cavalos e
macacos em cativeiro. Mycobacterium tuberculosis de ocorrência mais comum no
homem, ocasionalmente, infecta suínos, macacos de cativeiro, cães, gatos, bovinos
e aves.
Em áreas de alta incidência, a doença é causada, quase exclusivamente,
pelo M. bovis. As infecções causadas pelo M. avium, geralmente, têm curso benigno
e auto-limitante e, freqüentemente, as lesões não são observadas. Quando
presentes, estão geralmente nos linfonodos mesentéricos e retrofaríngeos,
raramente, com 2 cm de diâmetro. A lesão pelo M. avium, mais proliferativa que a
pelo M. bovis, exibe menos caseum (necrose), com pouca ou nenhuma calcificação
e com células gigantes mais numerosas. Mycobacterium tuberculosis raramente
infecta bovinos e, quando o faz, a doença tem cura espontânea.
Nesta investigação, objetivou-se relacionar e discutir as lesões macro e
microscópicas com a espécie de Mycobacterium isolada, de forma a estabelecer
padrões morfológicos que sirvam de apoio aos inspetores sanitário de carnes, além
de consolidar a técnica de imuno-histoquímica no Setor de Morfologia e Anatomia
Patológica do LSA na UENF para o diagnóstico da tuberculose bovina.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Definição A tuberculose bovina (TbB) é uma enfermidade infectocontagiosa, de caráter
zoonótico, causada pelo Mycobacterium bovis. A doença é predominantemente
subclínica, inicialmente, evoluindo para a cronicidade, com lesões granulomatosas.
O granuloma, que originou o termo tubérculo, é típico e completo, constituído por
uma zona central de necrose caseosa, na qual podem-se observar mineralizações
circundadas por macrófagos que se modulam em células epitelióides e células
gigantes multinucleadas de Langhans e por linfócitos, plasmócitos e neutrófilos,
podendo ainda desenvolver uma fibroplasia periférica (NEILL et al., 2001).
A tuberculose bovina é classificada como uma doença da lista B pela
Organização Internacional de Epizootias (OIE, 2000), com importantes efeitos
socioeconômicos e em saúde pública nos países afetados, com um impacto
potencial significante no comércio internacional de animais vivos e seus produtos
(WEDLOCK et al., 2002).
2.2. História da doença
5
A história revela que a tuberculose é conhecida desde a Antiguidade, com
referências à doença em múmias egípcias e nos escritos dos filósofos Hipócrates,
Celsus e Avicena. A denominação tuberculose apareceu pela primeira vez em 1840.
Múmias da dinastia de Ramsés reinante há 3.000 anos apresentavam lesões de
tuberculose óssea. As primeiras descrições desta micobacteriose em animais se
devem a Aristóteles (384-322 a.C.), sendo que, na época, as lesões em bovinos
eram atribuídas a outras infecções. A orientação da conduta para sacrifício
ritualístico e de matadouro sugere que os judeus antigos conheciam as lesões da
tuberculose em ruminantes (CORRÊA e CORRÊA, 1992).
Na Europa, do século XVI até o final do XVIII, acreditava-se que o “mal
perláceo das serosas” dos bovinos, era sífilis, transmitida aos animais por pessoas
doentes que mantinham relações sodômicas com vacas. Hoje, se conhece como
tuberculose perlada (MATTHIAS, 1988).
Em 1797, Klencke informou sobre a relação entre o consumo de leite de
vaca e o aparecimento das denominadas escrófulas (linfadenopatia cervical
tuberculosa), observadas com maior freqüência entre crianças alimentadas com leite
de vaca do que aquelas alimentadas com leite materno (MATTHIAS, 1988;
GRANGE, 2001).
Em meados do século XIX, aproximadamente, metade da população
tuberculosa inglesa tinha tuberculose nodular ou escrofulose, e de ossos e
articulações, cuja origem era bovina (CORRÊA e CORRÊA, 1992).
Villemin, em 1868, após uma série de experimentos, demonstrou que a
tuberculose humana e a dos bovinos podiam ser transmitidas a coelhos e cobaias
por inoculação de material (Villemin, 1868, apud GRANGE, 2001).
Robert Koch, em 1882, descobriu o agente infeccioso, corando-o pela
fucsina-anilina e, finalmente, em 1884, isolou M. tuberculosis. E em sua primeira
comunicação, concluiu que a doença perlada bovina tinha a mesma etiologia da
tuberculose humana e que, conseqüentemente, para o bem da saúde pública, o
homem deveria ser protegido da tuberculose bovina (CORRÊA e CORRÊA, 1992;
ROXO, 1997).
Em 1891, Strauss e Gamaléia demonstraram que o bacilo aviário era
diferente do bacilo do tipo humano e bovino, contradizendo Paulicki que observou
semelhança entre a tuberculose humana, bovina e aviária. Theobald Smith, nos
EUA, em 1896, verificou que havia diferenças culturais e patogênicas entre os
6
agentes de tuberculose bovina e humana e, no ano de 1898, isolou M. bovis
(CORRÊA e CORRÊA, 1992; ROXO, 1997; SOUZA et al., 1999).
A primeira prova definitiva da transmissão da tuberculose bovina ao homem,
decorrente da ingestão de alimentos, ficou evidente quando Ravenel, em 1902,
isolou, em uma cultura pura, os bacilos presentes em gânglios mesentéricos de uma
criança falecida de meningite tuberculosa, no Hospital Infantil da Filadélfia, EUA.
Tais bacilos foram inoculados em três bovinos, os quais em menos de 30 dias
vieram a óbito. Os resultados da necropsia destes animais demonstraram que a
causa da morte foi tuberculose (SOUZA et al., 1999). Kuhnaus, em 1931, verificou
que a carne poderia transmitir a doença ao homem, quando o animal era afetado por
uma tuberculose generalizada e, neste caso, a carcaça seria condenada durante a
inspeção realizada nos matadouros. Alguns fabricantes de salsichas utilizavam este
material condenado para o preparo de seu produto que, quando consumidas sem o
tratamento térmico prévio, oferecia um grande risco às pessoas (Feldman, 1955
apud SOUZA et al., 1999).
Tendo em vista a dimensão do problema e sua importância para a saúde
pública, muitos países adotaram programas de controle da doença, tais como: rotina
de inspeção de carnes, pasteurização do leite e medidas de controle da doença nas
populações animais (KANTOR e RITTACCO, 1994).
Torres e Pacheco, em 1938, informaram sobre o isolamento do bacilo do tipo
bovino de lesões humanas, tratando-se da primeira publicação da literatura médica
nacional. De 1988 a 1992, houve um aumento no número de notificações de
tuberculose no Brasil, chegando a 85.955 casos. Nestes casos, não foi possível a
identificação da espécie de Mycobacterium envolvida (SOUZA et al., 1999).
Até 1970, o bacilo bovino foi considerado uma variante do M. tuberculosis e
denominado M. tuberculosis variante bovis ou M. tuberculosis subespécie bovis.
Neste mesmo ano, Karlson e Lessel propuseram sua classificação como espécie
individual, denominada M. bovis (FERREIRA NETO e BERNARDI, 1997).
2.3. Tuberculose como uma importante zoonose
As zoonoses são enfermidades comuns ao homem e aos animais que,
atualmente, representam uma importante ameaça para a saúde humana e animal
em todo o mundo, (Macedo, 1986 apud BUBNIAK, 2000). Dentre estas, destaca-se
7
a tuberculose com distribuição mundial, cuja ocorrência sofre variação por região e
país, sendo considerada uma antropozoonose e também uma zooantroponose
(BUBNIAK, 2000).
Uma importante razão para o interesse na tuberculose bovina é a
susceptibilidade do homem à doença pelo mesmo agente etiológico, Mycobacterium
bovis. Desta forma, a tuberculose intestinal pode estar relacionada à ingestão de
leite cru, sendo considerada a principal causa de manifestação da doença não-
pulmonar em regiões rurais (GRANGE e YATES, 1994). Mycobacterium bovis
também tem sido isolado de pacientes imunodeprimidos, infectados pelo vírus HIV.
A comprovação dessa relação foi observada nos países industrializados diante do
grande número de seres humanos infectados pelo vírus HIV e M. bovis, constituindo
uma significativa causa dos altos índices de morbidade e mortalidade no homem
(COSIVI et al., 1998). No Brasil, estima-se que existam 150.000 coinfectados pelo
HIV e pelo bacilo da tuberculose (O GLOBO, 1998).
Na primeira metade do século XX, a tuberculose pulmonar humana causada
pelo M. bovis tinha uma baixa prevalência, entre 0,5 e 5%, porém, nas últimas
décadas, os registros mostraram tendências de elevação do número de casos de
tuberculose pulmonar por M. bovis, em comparação a outros órgãos. Cerca de 40-
60% das lesões tuberculosas causadas por M. bovis se manifestam nos pulmões.
(GRANGE e YATES, 1994). A tuberculose humana causada pelo M. bovis é clínica,
radiológica e patologicamente indistinguível da causada pelo M. tuberculosis
(COSIVI et al., 1998; Hedvall, 1942 apud WEDLOCK, 2002).
Estimativas indicam que a incidência da tuberculose humana por M. bovis
poderá atingir um patamar mais elevado a partir do momento que investimentos na
infra-estrutura laboratorial da rede pública forem efetuados, possibilitando, desta
maneira, a realização de isolamento e identificação das espécies de micobactérias
(LILENBAUM, 1998).
Embora a doença nos bovinos seja causada principalmente pelo M. bovis, o
M. tuberculosis pode causar a infecção nesta espécie em menor proporção e,
freqüentemente, subclínica (Pritchard, 1988, apud SHIRIMA et al., 2003).
As implicações da tuberculose bovina para a saúde humana e animal em
associação com os regulamentos do comércio internacional têm resultado na adoção
de programas de erradicação para o controle da doença por todo o mundo
(DOHERTY e CASSIDY, 2002).
8
2.4. Agente etiológico
As micobactérias são bastonetes fracamente gram-positivos, às vezes,
filamentosas, imóveis, sem cápsula nem esporos, amplamente distribuídos na
natureza, sendo muitos saprófitas e alguns patogênicos oportunistas
(DUNGWORTH, 1991). Pertencem ao reino Procaryotae, divisão Firmicutes, classe
Thallobacteria, ordem Actinomycetales, família Mycobacteriaceae e gênero
Mycobacterium (GOMES, 2000). As diferentes espécies de micobactérias se
caracterizam por reter a coloração vermelha da fucsina fenicada e, por isso,
denominadas bacilo álcool-ácido resistente (BAAR). Esta expressão significa que
estes germes, quando corados pela fucsina, não se deixam descorar por uma
mistura de álcool e ácido clorídrico (TRABULSI, 1999). Tal característica se deve à
complexidade da sua parede celular, composta por uma espessa camada de
lipídeos e ácidos micólicos (CORRÊA e CORRÊA, 1992).
Mycobacterium bovis tem sido descrito como o organismo responsável por
causar a tuberculose bovina, por mais de um século. O agente é infeccioso não só
para o bovino, mas também para o homem, cão, gato, porco, ovelha, cabra e cavalo
(MATTHIAS, 1988). Tal espécie de micobactéria está inserida no complexo M.
tuberculosis, incluindo ainda o M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti
(WEDLOCK et al., 2002), M. caprae e o mais recentemente inserido no complexo, o
M. pinnipeddi (COUSINS et al., 2003).
A demonstração do M. bovis em material patológico pode ser conseguida
mediante cultura bacteriológica (MATTHIAS, 1988). Quanto ao isolamento, crescem
em meios especiais, compostos por gema de ovo e amido, enriquecidos por
asparagina e contendo verde malaquita para inibir contaminantes. O Löwenstein-
Jensen (LJ) com piruvato é o meio sólido mais utilizado (CORRÊA e CORRÊA,
1992). Ao contrário do M. tuberculosis, o M. bovis apresenta um crescimento
escasso em meios sólidos num período de 3-4 semanas, sobre os quais formam
colônias úmidas, brilhantes, lisas, achatadas, com coloração amarelada ou com uma
camada contínua como um véu (MATTHIAS, 1988). Na etiologia da tuberculose animal, são importantes as espécies M. bovis, M.
tuberculosis e o M. avium (CORRÊA e CORRÊA, 1992). Estas espécies ocorrem
com mais freqüência em seus respectivos hospedeiros, entretanto, pode ocorrer
9
infecção cruzada (DUNGWORTH, 1991). As outras espécies de micobactérias
causam doenças que podem ser denominadas como micobacterioses ou recebem
nomes próprios, como a paratuberculose ou doença de Johne (CORRÊA e
CORRÊA, 1992).
Mesmo com as evidências da resistência das micobactérias nas fezes
bovinas nos pastos e no esterco dessecado nos estábulos escuros, as mesmas se
mostram sensíveis quando submetidas ao calor (pasteurização) e frente à ação da
luz solar direta. Resistem por muitas horas ou dias aos desinfetantes comuns, sendo
a formalina, o ácido cresolsufônico e soluções cloradas a 3-4% os meios químicos
mais ativos contra a bactéria (MATTHIAS, 1988). Genov (1965) apud MORRIS et al.
(1994) inoculou M. avium, M. bovis e M. tuberculosis nas fezes, sangue e urina e
observou que todos permaneceram viáveis no período máximo de 332 dias a 24ºC,
quando protegidos da luz solar direta. Segundo Soparcker (1917) apud PHILLIPS et
al. (2003), o M. bovis parece ser mais resistente à luz solar do que o M. tuberculosis.
2.5. Patogenia
Conforme NEILL et al. (2001), para uma melhor compreensão da completa
patogênese da tuberculose bovina é importante relacionar as fontes de
contaminação, o início da infecção e as respostas imunológica e patológica.
Embora o gado bovino doente seja a principal fonte de infecção no rebanho,
os animais silvestres como texugos, veados, gambás e furões podem atuar como
importantes reservatórios, mais comum nos países como o Reino Unido, Irlanda do
Norte e Nova Zelândia (PHILLIPS et al., 2003).
A infecção pelo M. bovis pode ser iniciada, principalmente, pela via
respiratória, mas é possível a contaminação pela via digestiva, através da ingestão
do agente nas pastagens, água, fômites e leites contaminados, sendo esta última
fonte de maior relevância nos bezerros, os quais se infectam ao mamar. Outras
vias, como genital e cutânea, embora raras, são possíveis (NEILL et al., 2001).
Quanto à resposta imunológica relacionada à infecção, admite-se que a
tuberculose bovina pode exibir diferentes respostas imunes, dependendo do estágio
da doença e da interação entre o agente e o hospedeiro. A resposta imune bovina
ao M. bovis parece ser complexa e dinâmica durante a infecção e envolve uma série
de eventos celulares. A resposta mediada por células é dominante, com pouca ou
10
nenhuma detecção de anticorpos, com exceção de lesões disseminadas e extensas
vistas em animais anérgicos. Esta resposta é iniciada após o reconhecimento por um
linfócito do tipo T de um antígeno micobacteriano processado e associado ao major
histocompatibility complex (MHC) de células apresentadoras, como os macrófagos.
Todo este conjunto de eventos desencadeia a liberação de citocinas, gama
interferon (IFN-γ) e interleucina (IL), que são cruciais na ativação e atração dos
macrófagos ao foco infeccioso. No estágio inicial, a resposta imunológica deverá
destruir ou inibir o microorganismo mas, posteriormente, podem ocorrer reações de
hipersensibilidade do tipo retardada que tendem à formação de granulomas e
necrose caseosa tecidual, resultando em redução funcional do órgão afetado (NEILL
et al., 2001; WEDLOCK et al., 2002).
Quando o M. bovis ingressa no organismo, seja pela via respiratória ou
digestiva, multiplica-se no local de entrada, comumente nos pulmões ou intestino. O
conjunto de lesão do local de entrada e do linfonodo regional denomina-se complexo
primário. Essa lesão, nos bovinos, pode persistir, com ou sem progressão, ou pode
cicatrizar completamente. Nos focos de infecção, há acúmulo de linfócitos e
macrófagos, que se modulam em células epitelióides e gigantócitos de Langhans,
formadas pela fusão dos macrófagos. Inicialmente, as lesões consistem de
pequenos tubérculos caracterizados como formações nodulares firmes, de cor
branca a amarelada, constituídas de células epitelióides e gigantes de Langhans,
rodeadas por uma camada de linfócitos, de células plasmáticas e de monócitos.
Com a evolução da lesão, o granuloma tuberculoso desenvolve uma fibroplasia
periférica e necrose caseosa central, na qual podem-se observar áreas de
mineralizações por precipitações de sais de cálcio (DUNGWORTH, 1991; NEILL et
al., 2001).
A manifestação da doença é dependente da via de infecção, da resposta
imune do hospedeiro e da virulência do organismo infectante. Nos bovinos, as curas
clínica e bacteriológica são raras, sendo comum o estabelecimento da doença
progressiva (CORRÊA e CORRÊA, 1992).
2.6. Lesões Na infecção aerógena, que é a mais comum, as alterações macroscópicas
iniciais são pequenos granulomas tuberculosos, vistos com freqüência no terço distal
11
do lobo caudal dos pulmões, mas os bacilos podem disseminar-se pelas vias
linfática e hematógena e, neste caso, as lesões podem se estabelecer no fígado,
rins, intestinos e serosas (LÓPEZ, 1998).
A lesão patognomônica da tuberculose é o tubérculo, um granuloma clássico
composto de uma infiltração de células epitelióides e algumas células gigantes de
Langhans que, no caso da bovina, se caracterizam comumente pela presença de
material caseocalcário. Freqüentemente, o centro do granuloma se apresenta
necrosado e calcificado. A necrose está cercada por um infiltrado inflamatório com
predomínio de linfócitos e por fibrose na periferia. A necrose é resultado da
hipersensibilidade mediada por células e é de caráter caseoso. A calcificação é
característica de algumas espécies animais, não sendo observada na tuberculose
aviária (DUNGWORTH, 1991; JONES et al., 1997; LÓPEZ, 1998).
Com a progressão da doença, os tubérculos coalescem e as lesões
aumentam de tamanho, formando grandes áreas de necrose caseosa,
caracterizando a tuberculose dita caseosa (LÓPEZ, 1998). Tubérculos solitários ou
em aglomerados podem ocorrer nas serosas, mais comum na pleura e peritônio. As
áreas afetadas da pleura, visceral e parietal, são engrossadas pelo tecido de
granulação (fibroso) que, como regra do processo tuberculoso em serosas, não
invade o parênquima. A característica das lesões é nodular, podendo essa ser séssil
ou pedunculada, denominada tuberculose perolada ou perlácea (DUNGWORTH,
1991). Quando a lesão é maciça, os tubérculos caseosos expandidos podem romper
um vaso sangüíneo e os bacilos alcançarem a circulação, estabelecendo a
disseminação hematógena. O curso da doença, depois de generalizada, é rápido e
denominado como tuberculose miliar, devido ao grande número de tubérculos do
tamanho de sementes de milho que se desenvolvem em muitos tecidos e órgãos
(DUNGWORTH, 1991; LÓPEZ, 1998), sendo rara no útero, conforme MATTHIAS
(1988) e LILENBAUM (1998).
As lesões da tuberculose bovina são denominadas paucibacilar, devido ao
escasso número de bacilos álcool-ácido resistentes observados em cortes
histológicos. A escassez ou ausência de micobactérias, em análises de lesões
anatomopatológicas sugestivas de tuberculose, pode estar associada a três
hipóteses: 1. deficiência do método de isolamento com morte na descontaminação
ou dificuldade de se multiplicar no cultivo; 2. morte da micobactéria após promover a
lesão, pela defesa do próprio organismo e 3. lesão causada por outro tipo de
12
microorganismo (BROWN e NEUMAN, 1979; BALIAN et al., 1997). RIDLEY (1983) e
YOUNG et al. (1990) acreditam que a escassez de bacilos é devido à ativa resposta
imune presente nas inflamações granulomatosas causadas por micobactérias.
2.7. Epidemiologia A tuberculose bovina é uma enfermidade que afeta diferentes espécies de
ruminantes, principalmente, bovinos e, menos freqüentemente, ovinos e caprinos,
podendo raramente acometer os eqüídeos (CORRÊA e CORRÊA, 1992). Algumas
espécies silvestres, como texugos do Reino Unido e veados do Norte da Irlanda,
representam uma fonte mantenedora da infecção (MORRIS et al., 1994; COSIVI et
al., 1998).
A doença pode ser introduzida no rebanho, principalmente, pela aquisição
de animais infectados, podendo propagar-se nos bovinos sadios independentemente
do sexo, raça e idade (SOUZA et al., 1999), porém animais adultos são mais
suscetíveis devido à maior possibilidade de contágio no decorrer dos anos. Entre as
raças, os zebuínos são mais resistentes que os taurinos e bubalinos (ACHA e
SZYFRES, 1989; CORRÊA e CORRÊA, 1992).
Há evidências de que tanto a resistência genética do hospedeiro a uma
infecção por M. bovis quanto a influencia de fatores fisiológicos e imunológicos, em
animais e em pessoas, interferem grandemente no curso da tuberculose (MORRIS
et al., 1994). Estudos em coelhos revelaram que aqueles muito resistentes ao M.
bovis apresentavam lesões pulmonares localizadas, após inalarem o bacilo,
enquanto os coelhos susceptíveis desenvolviam a doença rapidamente progressiva
e disseminada pela inalação de pequenas quantidades de M. bovis (LURIE, 1964).
A prevalência da doença nos países é variável de acordo com o sistema de
exploração animal. A alta incidência da tuberculose é mais evidente nos rebanhos
leiteiros estabulados, enquanto, para os rebanhos de corte criados extensivamente,
a tuberculose é de menor importância epidemiológica (ACHA e SZYFRES, 1989;
SOUZA et al., 1999). MORRIS et al. (1994), demonstraram que, quando novilhas
sadias pastavam juntamente com vacas altamente infectadas, a incidência da
infecção permanecia baixa, ao contrário do que acontecia quando as mesmas
novilhas eram estabuladas com vacas doentes. SHIRIMA et al. (2003) na Tanzânia
Oriental, usando o teste intradérmico comparativo, mostraram que a prevalência da
13
tuberculose bovina foi significativamente mais alta na criação de sistema intensivo
quando comparada com a criação extensiva. Nos países em que não são adotadas
medidas adequadas de profilaxia, a morbidade média varia de 8-10%, sendo maior
em bovinos leiteiros que nos de corte.
Esta enfermidade apresenta distribuição mundial, mas nos EUA, Canadá e
países da Europa sua incidência foi controlada pela preconização das campanhas
de erradicação e controle, através do teste de tuberculina e abate dos animais
infectados (JONES et al., 1997).
Com a implementação dos programas de controle de tuberculose bovina,
alguns países da América do Sul, como Uruguai, Venezuela e Paraguai, tiveram
uma redução na prevalência da doença de 4,5 para 0,01%, de 1963-1984; 3,48 para
0,37%, de 1954-1964 e de 1,40 para 0,24%, de 1981-1990, respectivamente
(KANTOR e RITTACCO, 1994).
Dados do Ministério da Agricultura referentes à prevalência da tuberculose
bovina no Brasil, realizados entre 1974 e 1984, apresentaram um índice de 1,82%,
representados por 6.491 focos da doença (BUBNIAK, 2000). O rebanho bovino do
Brasil está estimado em mais de 165 milhões de cabeça. Dados de 1986 mostraram
que o nível de infecção estava entre 0,9-2,9%, com 6,2-26,3% dos rebanhos
possuindo animais infectados, sem que essas taxas mostrassem tendências de
diminuição (KANTOR e RITTACCO, 1994).
No Brasil, pouco enfoque é dado à prevalência da infecção nos rebanhos
bovinos. Alguns pesquisadores, utilizando o teste de hipersensibilidade, estimaram a
prevalência individual em diferentes regiões do País. LANGENEGGER et al. (1981)
trabalharam com 24 rebanhos leiteiros da região Sudeste do Brasil, entre os estados
de São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais, e verificaram índice de reatividade de
9,7%. No Sul do Brasil, RICCETTI et al. (1989) diagnosticaram a doença em 60%
dos municípios. No estado de São Paulo, SAMARA et al. (1996) testaram 748
bovinos e identificaram índices de prevalência de 6,8%, enquanto SOERENSEN et
al. (1992) estudaram um rebanho estabulado com 331 vacas de aptidão leiteira e
verificaram 32% de reatividade às provas intradérmicas, confirmando com a
necropsia e cultura.
No Rio de Janeiro, LILENBAUM (1998) testou 1632 bovinos de aptidão
leiteira em diversas propriedades com histórico sugestivo de tuberculose e verificou
que 12,7% de animais foram reativos ao teste intradérmico cervical simples. Os mais
14
altos índices de positividade foram relatados nos estados do Nordeste, e os
menores, nos estados do Sul e Sudeste.
SCHENK et al. (1982) concluíram que a prevalência (0,20%) encontrada
para a tuberculose bovina no estado do Mato Grosso do Sul foi baixa se comparada
à taxa estimada (2,62%) para o Brasil. A justificativa desse resultado foi que os
animais utilizados nesse estudo eram de corte, normalmente, submetidos à
exploração extensiva, enquanto que a tuberculose é mais freqüente em gado leiteiro
com tipo de criação intensiva, em condições de estabulação favorecendo a
propagação da doença.
Embora a transmissão do M. bovis possa ocorrer por várias vias, a forma
mais freqüente da doença é a pulmonar, pela via aerógena, através da inalação de
gotículas contaminadas. A infecção pela via digestiva é possível, através da ingestão
de fezes, água, pastagens, leite e fômites contaminados. Logo nos primeiros dias de
vida, os bezerros podem infectar-se por meio da ingestão do colostro contaminado,
ou até mesmo por fômites ou muco, pelo hábito da mãe lamber o filhote (PHILLIPS
et al., 2003). Resultados de infecções experimentais, simultaneamente por via
aerógena e alimentar, demonstraram que 80 a 90% dos bovinos são infectados por
via aerógena, através da inalação de aerossóis contaminados com o bacilo; e 10 a
20% por via digestiva (CORRÊA e CORRÊA, 1992; SOUZA et al., 1999). Existem
vias menos comuns, como a via cutânea, que requer inicialmente uma porta de
entrada para a instalação do processo infeccioso. Ou ainda a via genital, pelo coito,
onde são produzidas infecções por contato resultando no aparecimento de lesões no
pênis, na vulva e na vagina. Na tuberculose uterina, a transmissão congênita,
embora rara, pode ocorrer via cordão umbilical (MATTHIAS, 1988; NEILL et al.,
2001).
Existem relatos da possível transmissão da tuberculose dos seres humanos
para os bovinos. Nesses casos, a infecção é principalmente pela via respiratória,
mas existem ocorrências de humanos com tuberculose genito-urinária, que infectam
os bovinos ao urinarem nos cochos. Em primeira instância, a tuberculose genito-
urinária é de interesse limitado para os epidemiologistas que estudam a transmissão
da doença, no entanto, essa prática bizarra é um hábito comum entre os
trabalhadores rurais. Na Alemanha, a tuberculose bovina é rara, porém, quando
ocorre, o homem é tido como o principal transmissor da doença para o gado. Desta
forma, uma maior atenção dos médicos e veterinários deve ser requerida em relação
15
à atuação do homem, como importante fonte de infecção (GRANGE e YATES, 1994;
GRANGE, 2001).
Em bovinos adultos, 95% dos casos de tuberculose são causados pelo M.
bovis. Há relatos de raros casos de tuberculose bovina progressiva causada pelo M.
tuberculosis, determinando uma doença que pode regredir ou curar
espontaneamente. O M. avium também tem sido considerado como patogênico para
os bovinos, causando a doença progressiva generalizada, com localização nos
linfonodos mesentéricos (CORRÊA e CORRÊA, 1992).
Em relação aos prejuízos econômicos na pecuária de leite e de corte,
estima-se uma redução de 10% na produção de leite, 20% na produção de carne,
devido à condenação de carcaças, e a um aumento do índice de infertilidade do
rebanho (FERREIRA NETO e BERNARDI, 1997). Na Argentina, o atraso na 1ª
lactação, a diminuição no número e duração das lactações resultaram no
decréscimo de 18% na produção de leite de vacas tuberculosas quando comparadas
com o rebanho leiteiro sadio (Nader e Husberg, 1988 apud KANTOR e RITTACCO,
1994).
Embora incomum, a tuberculose humana causada pelo M. bovis é um
problema de saúde pública. A infecção nos seres humanos pelo M. bovis quase
sempre ocorre pela inalação de aerossóis ou pelo consumo do leite contaminado.
Esse problema é minimizado quando o leite é submetido ao processo de
pasteurização. Muitos pesquisadores têm voltado a atenção para o fato de que a
tuberculose pulmonar pelo M. bovis é mais comum nos moradores rurais do que nos
urbanos. Os médicos veterinários e magarefes estão sujeitos à infecção através da
inalação de aerossóis gerados durante o manuseio das carcaças contaminadas. Na
maioria dos casos, os humanos se contaminam ainda quando jovens e podem
apresentar linfoadenopatia cervical (escrofulose), lesões intestinais, tuberculose
cutânea crônica (lupus vulgaris) e outras formas não-pulmonares (GRANGE e
YATES, 1994; COSIVI et al., 1998; GRANGE, 2001).
Trabalhos realizados na Nigéria consideraram a ingestão de carne
contaminada como responsável por cerca de 45% dos casos de tuberculose em
humanos causada pelo M. bovis (SOUZA et al., 1999).
Informações em relação à tuberculose humana pelo M. bovis, nos países
desenvolvidos e subdesenvolvidos, são escassas. Na América Latina, estima-se que
o M. bovis seja o responsável pela ocorrência de 2% dos casos de tuberculose
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pulmonar e 8% da forma não-pulmonar, sendo a porcentagem mais alta em regiões
de criação intensiva de gado leiteiro (GRANGE, 2001).
2.8. Métodos de Diagnóstico 2.8.1. Prova de tuberculina O método-padrão para o estudo da tuberculose bovina é o teste de
tuberculina (OIE, 2000). Este teste se baseia na resposta do animal à injeção de
tuberculina descrita com uma resposta de hipersensibilidade do tipo tardia.
Atualmente, existem dois tipos de testes em uso. O teste intradérmico simples, que
consiste na injeção intradérmica de 0,1 ml de purified protein derivative (PPD) bovino
(produzido do M.bovis - cepas AN5 ou Vallee) na região do pescoço ou na prega
ano-caudal do animal. E o teste intradérmico comparado, que consiste na injeção
intradérmica simultânea de 0,1 ml da tuberculina bovina e 0,1 ml da aviária
(produzida do M. avium - cepas D4ER ou TB56) no mesmo lado do pescoço, com
uma distância de 15 cm entre as aplicações. O último teste é utilizado para
diferenciar animais infectados com M. bovis daqueles sensibilizados devido à
exposição a outras micobactérias, ou seja, reação cruzada. A diferença nas reações
de ambos PPDs indica que nenhum animal está infectado com M.bovis ou mostra
uma reação não-específica de hipersensibilidade retardada (MONAGHAN et al.,
1994; WEDLOCK et al., 2002). Tais testes avaliam respostas de hipersensibilidade
retardada, 72 horas após uma injeção intradérmica de tuberculina ou PPD. A
intensidade da reação independe do grau das lesões tuberculosas e é determinada
pelo edemaciamento e espessura sofrida pela pele, que será medida com um
cutímetro antes e depois da injeção intradérmica da tuberculina. Podem ser obtidos
resultados falso-negativos nas infecções recentes (30-50 dias); nos casos de
animais anérgicos decorrentes do acometimento generalizado (tuberculose miliar);
no período entre testes de 42 a 60 dias; durante quatro a seis semanas pós-parto
(imunossupressão transitória); em situações de desnutrição; e no uso inescrupuloso
e consciente de certas drogas; e ainda por fatores relacionados ao teste PPD, como
validade do produto, variações na leitura e interpretação do teste. Reações falso-
positivas ou duvidosas podem aparecer em bovinos que foram sensibilizados por
outras micobactérias como M. paratuberculosis, M. avium, tuberculose cutânea e
micobactérias atípicas, e em animais tuberculinizados. Neste caso, é necessária a
17
realização minuciosa da inspeção post-mortem (MONAGHAN et al., 1994; ROXO,
1997).
A sensibilidade do teste refere-se à habilidade para identificar animais
doentes, enquanto a especificidade refere-se à identificação de animais não-
doentes. Estima-se que a sensibilidade do teste de tuberculina varia de 68-95%,
enquanto a especificidade é estimada ser de 96-99% (MONAGHAN et al., 1994).
2.8.2. Provas sorológicas
O teste do gama interferon (IFN-γ) baseia-se na titulação de gama-interferon,
em amostras sanguíneas de animais infectados, produzido por linfócitos
sensibilizados durante 16-24 horas do período de incubação com o antígeno
específico - PPD bovino. Esta técnica visa à avaliação de respostas celulares in
vitro, dias depois de realizado o teste de tuberculinização simples (OIE, 2000).
Segundo DOMINGO et al. (1995), na Espanha, e LILENBAUM et al. (1999), no
Brasil, este teste se mostrou mais sensível e mais rápido do que o teste intradérmico
simples, quando testado em rebanhos leiteiros. A proliferação de linfócitos T e de
gama-interferon corresponde à imunidade celular, enquanto a prova de ELISA
(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), à imunidade humoral. A técnica de ELISA
mede a ligação do anticorpo ao antígeno, sendo um teste complementar ao teste
baseado na imunidade celular (OIE, 2000).
2.8.3. Necropsia As possibilidades de diagnóstico da TbB, a partir da necropsia de casos
clínicos e de inspeção de carnes, seguem com a detecção de lesões típicas macro e
microscópicas, aceitas para o diagnóstico anatomopatológico conclusivo em áreas
enzoóticas. Mas, afora essa condição epidemiológica, a necropsia deve ser seguida
do isolamento bacteriológico para o diagnóstico definitivo (CORRÊA e CORRÊA,
1992; CORNER, 1994; SEVA et al., 2002). A inspeção sanitária de carnes em
bovinos, que é um ato necroscópico, corresponde a um exame meticuloso de pelo
menos 6 pares de linfonodos entre os da cabeça, torácicos, mesentéricos e da
carcaça, bem como dos pulmões, fígado, baço, rim, úbere e órgãos genitais,
podendo identificar até 95% dos animais com lesões macroscópicas. Esse
18
procedimento é empregado, muitas vezes, em animais reagentes à tuberculina,
permitindo uma avaliação criteriosa das lesões macroscópicas dos tecidos e a
colheita asséptica de tecidos intactos para exames mais detalhados no laboratório
(CORNER, 1994).
2.8.4. Exame microscópico Este método de diagnóstico pode ser aplicado em animais vivos ou no post -
mortem. As amostras em “swab” nasal ou tecidos preparados para a histopatologia
podem ser submetidos à clássica coloração de ZN, corando as micobactérias.
Também oferecem resultados satisfatórios a coloração de fluorescência e a técnica
de imuno-histoquímica. O diagnóstico é feito, se o tecido apresentar o conjunto de
lesões histológicas características de um granuloma, bem como o microorganismo
(OIE, 2000). A técnica de ZN pode revelar bacilos corados em vermelho em pequeno
número nos processos causados pelos agentes M. bovis ou M. tuberculosis e, em
grande número, naqueles relacionados com M. avium (MILLER et al., 1995).
MATTHIAS (1998) descreveu que a técnica de ZN pode ser considerada a mais
adequada para demonstrar tintorialmente as bactérias tuberculosas.
2.8.5. Exame bacteriológico O estudo bacteriológico envolve procedimentos e materiais, tais como,
meios de cultura, descontaminação e condições de incubação, os quais influenciam
no sucesso do isolamento. Uma vez isolado o agente, testes adicionais como a
técnica de análise de DNA e anticorpos monoclonais podem ser aplicados para
confirmar sua identidade (CORNER, 1994; OIE, 2000).
A cultura em meios de Löwenstein-Jensen e Stonebrink favorece o
crescimento de bactérias a partir de 10 bactérias/ml de espécime, mas requer
cuidados de colheita e remessa, a fim de manter a viabilidade do agente para
crescer nos meios de cultura (KANTOR, 1988). A ausência de micobactérias em
amostras de animais tuberculina positivos com lesões típicas ou sugestivas pode
estar associada ao baixo número encontrado nas lesões no momento da coleta das
amostras ou à dificuldade de isolamento de cepas de M. bovis (PINTO et al., 2002).
19
Um animal positivo para o teste de tuberculina pode não apresentar lesões
macroscópicas evidentes no post-mortem (OIE, 2000). Neste caso, o exame
bacteriológico tem sido apontado como a sinalização mais segura da presença de
micobactérias em animais com tuberculose e outras micobacterioses (CORNER,
1994; PINTO et al., 2002). Portanto, é recomendada a utilização simultânea de
técnicas histológicas e culturais no estudo de lesões granulomatosas similares à
tuberculose (ANDRADE et al., 1991). Apesar de o isolamento ser um diagnóstico
definitivo, pode requerer mais do que 12 semanas para a confirmação cultural da
infecção e a identificação da cepa por métodos bioquímicos (CORNER, 1994).
2.8.6. Imuno-histoquímica A imunoistoquímica é uma combinação de técnicas histológicas,
imunológicas e bioquímicas que possibilita a detecção de antígenos tissulares in situ,
por meio da utilização de anticorpos específicos e moléculas marcadoras (GIMENO,
1995). A localização de tais antígenos pode ser feita a partir de tecidos frescos
(cortes de congelação) ou tecidos já fixados e processados pelos métodos
histológicos convencionais (Oliveira, 1998 apud SILVA e NOGUEIRA, 2002), através
da conjugação das moléculas de imunoglobulina com moléculas marcadoras,
normalmente, de caráter enzimático, tais como, a peroxidase e a fosfatase alcalina
(GIMENO, 1995). A técnica quando direta, o anticorpo marcado com a enzima
(anticorpo primário) terá afinidade com o antígeno específico, enquanto, na indireta,
o anticorpo marcado com a enzima será secundário (anticorpo anti-Ig do animal
onde foi produzido o anticorpo primário), capaz de se ligar ao primário que está
conjugado com o antígeno específico presente no tecido. A enzima peroxidase,
atualmente, é aplicada nas seguintes técnicas imunoistoquímicas: peroxidase-
antiperoxidase (PAP), complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC) e estreptavidina-
biotina marcada. A técnica PAP compreende a utilização de um anticorpo primário,
que se conjuga com o antígeno específico nos tecidos, um anticorpo secundário e
um complexo de três moléculas de peroxidase e dois anticorpos antiperoxidase
(complexo PAP). A técnica ABC baseia-se na interação das moléculas de avidina e
biotina e inclui a utilização de um anticorpo primário não-conjugado, um anticorpo
secundário conjugado com biotina e um complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC).
A utilização da técnica estreptavidina-biotina compreende o emprego de um
20
anticorpo primário não conjugado, um anticorpo secundário biotinilado e uma
solução de estreptavidina marcada com peroxidase (GIMENO, 1995). A utilização da
estreptavidina, molécula protéica obtida do Streptomyces avidini, com afinidade
equivalente à avidina pela biotina e menor tendência a se unir a elementos celulares,
contorna a possibilidade de ligações inespecíficas (Oliveira, 1998 apud SILVA e
NOGUEIRA, 2002). A imunoistoquímica, segmento moderno da histoquímica, é um
conjunto de técnicas relativamente recente cuja crescente utilização tem provocado
grande impacto na patologia humana e veterinária, devido à sua elevada
sensibilidade e especificidade (Oliveira, 1998 apud SILVA e NOGUEIRA, 2002). Esta
técnica permite a avaliação da relação entre a presença de antígenos específicos
nos tecidos com as lesões por eles provocadas, com rapidez e precisão nos
diagnósticos, favorecendo a durabilidade do material corado e a realização de
estudos retrospectivos (SILVA e NOGUEIRA, 2002). Diante da alta especificidade,
esses métodos imunoistoquímicos podem ser usados para avaliar a precisão de
diferentes técnicas imunológicas e sorológicas (BREES et al., 2000).
2.8.7. Métodos de reconhecimento de ácido nucléico A técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR) é baseada na amplificação
de determinados segmentos do DNA. É um método rápido, simples e extremamente
sensível, capaz de detectar até 10 fg DNA de micobactéria, o equivalente a 5
organismos (COLLINS et al., 1994). O uso de PCR, em amostras clínicas de
pacientes humanos, é aplicado para a detecção do complexo M. tuberculosis, mas é
de pouco uso para o diagnóstico de tuberculose animal. A PCR tem sido usada
também em tecidos fixados em formalina, embebidos em parafina para detectar o
grupo do M. tuberculosis e distingui-lo do M. avium. O estudo de análise de DNA
pode ser mais rápido e seguro do que os métodos bioquímicos para a diferenciação
do M.bovis de outros membros do complexo M. tuberculosis (OIE, 2000). Apesar de
esta técnica detectar apenas uma micobactéria, necessita de cuidados para evitar a
contaminação da amostra com outro material de necropsia, podendo resultar em
falso-positivo (VITALE et al., 1998).
2.9. Controle e tratamento
21
O maior incentivo para o controle da tuberculose bovina é a prevenção da
doença nos humanos. Além disso, a doença é responsável por grandes perdas
econômicas em criações de animais (OIE, 2000).
O programa Nacional de controle da tuberculose bovina se baseia no
diagnóstico de animais reativos por meio da realização do teste de tuberculina em
todo o rebanho e da remoção dos animais infectados. Esta medida de teste-e-abate
tem resultado no sucesso da erradicação ou na redução da incidência da infecção
em países desenvolvidos, incluindo a Austrália, e aqueles na América do Norte e
Europa (WEDLOCK et al., 2002).
Esse programa de teste-e-abate deve ser associado com uma série de
outras medidas para o sucesso do controle da doença. É importante o controle do
trânsito de novos animais no rebanho (teste de tuberculina negativo, provenientes de
rebanhos livres, quarentenário e isolamento de animais suspeitos), e adoção de
medidas gerais de higiene, como limpeza e desinfecção das instalações, com o
objetivo de impedir a disseminação da doença pelo rebanho (ROXO, 1997;
WEDLOCK et al., 2002). Em alguns países, a presença de animais silvestres
infectados, tem sido a razão do fracasso desse programa. É necessário o controle
desses animais silvestres mantenedores do M. bovis para um eficaz controle da
doença nos rebanhos (WEDLOCK et al., 2002).
Nos países exportadores de carne, leite e seus derivados, os benefícios da
comercialização têm sido o maior incentivo para a implantação de tais programas.
Para muitos países desenvolvidos, o teste-e-abate é impraticável por razões
econômicas e políticas, e ainda, pela resistência dos proprietários à adesão do
sistema, já que não existe uma política para ressarci-los financeiramente. Uma outra
medida para tais países poderia incluir a observação dos animais infectados nos
abatedouros, seguido do rastreamento da propriedade de origem, com segregação
e, se necessário, a eliminação dos animais infectados (WEDLOCK et al., 2002).
No Brasil, o Ministério da Agricultura recomenda o método do teste-e-abate.
Menos da metade dos países da África, Ásia e América Latina adotou o sistema de
teste-e-abate e a notificação da doença para o controle da tuberculose bovina.
Embora não exista notificação oficial de prevalência para a enfermidade em muitos
desses países, sabe-se que a tuberculose bovina é enzoótica e persistente (MODA
et al., 1996). A distribuição da infecção para o homem pode ser prevenida por
melhorias na educação voltada para a saúde pública, adoção de práticas de higiene,
22
pasteurização do leite e vacinação dos neonatos com Bacilo de Calmette-Guérin
(BCG). (WEDLOCK et al., 2002).
O Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos de Origem
Animal (RIISPOA), do Serviço de Inspeção Federal (Lei 1253, art. 119 e 196),
estabelece a decisão sanitária oficial sobre a tuberculose em matadouros,
determinando critérios de rejeição parcial, aproveitamento condicional e condenação
de carcaças, segundo sua condição anatomopatológica, e ainda o abate dos animais
em separado, submetendo-os a uma inspeção mais rigorosa (BRASIL, 1997).
No que se refere ao tratamento de animais doentes, existe pouco benefício
proveniente do uso de antibióticos para o tratamento de animais com tuberculose
bovina. Assim, os animais tratados devem permanecer positivos para o teste de PPD
e, como o tratamento não deve ser totalmente eficaz, o uso de um único antibiótico
deve levar ao desenvolvimento de resistência ao mesmo, resultando na persistência
da doença e a disseminação da infecção no rebanho (WEDLOCK et al., 2002).
Embora não exista tratamento recomendado pelo Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento, LANGENEGGER et al. (1991) demonstraram a eficiência
do tratamento de animais tuberculosos com a droga isoniazida.
Considerando que OLIVEIRA e RAMOS (1978) realizaram a becegeização
de bezerros e novilhas e não obtiveram proteção ao M. bovis, o desenvolvimento de
uma vacina efetiva para o gado seria uma importante estratégia para o controle da
tuberculose bovina, inclusive para os países nos quais a economia não suporta a
implementação do teste-e-abate como programa de controle (WEDLOCK et al.,
2002).
23
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Desenho do Estudo Os 123 animais estudados, reagentes ou não à prova da tuberculina, foram
divididos em 3 grupos. Eram bovinos mestiços, com predomínio de fêmeas leiteiras,
abatidos em Matadouros sob Inspeção Estadual nos Municípios de Campos dos
Goytacazes e Conceição de Macabu, estado do Rio de Janeiro. O grupo 1 (G1) foi
composto por 89 bovinos reagentes à prova de tuberculina e foram destinados ao
abate sanitário em Matadouro sob Inspeção Estadual no Município de Conceição de
Macabu. O grupo 2 (G2) compreendeu 33 bovinos sem sinais clínicos de tuberculose
no ante-mortem e, quando submetidos ao abate em Matadouro sob Inspeção
Estadual no Município de Campos dos Goytacazes, apresentaram lesões sugestivas
de tuberculose. Além dos G1 e G2, foi estudado também, um caso isolado de um
bovino mestiço, fêmea, 5 anos de idade, anérgico ao teste de tuberculina e com
sinais clínicos de tosse, febre alta, intensa apatia e queda na produção de leite.
Todos os animais destinados ao abate nos Matadouros sob Inspeção Estadual foram
avaliados no exame ante-mortem. As amostras foram colhidas nas linhas de
inspeção no decorrer do abate. Já o animal do caso isolado, foi submetido à
eutanásia e necropsia.
3.2. Colheita das amostras
24
No período de março de 2003 a março de 2004, foram colhidas amostras de
pulmões e de seus linfonodos satélites (retrofaríngeos, mediastínicos e
traqueobrônquicos) e, excepcionalmente, outros linfonodos, fígado, intestinos, rins,
útero e serosas, todas as amostras com lesões granulomatosas sugestivas de
tuberculose.
No G1, foram colhidas amostras de pulmões e seus linfonodos satélites
mesmo sem lesão macroscópica.
3.3. Metodologia utilizada 3.3.1. Caracterização macroscópica da lesão O exame macroscópico foi realizado nas linhas de inspeção. As lesões
eleitas estavam representadas por granulomas caseocalcários sugestivas de
tuberculose, atentando para as variações de padrões anatomopatológicos que, ora
eram extensamente caseosos, com ou sem mineralização e, ora, pequenos
tubérculos típicos e solitários. A mensuração foi efetuada com régua milimetrada.
3.3.2. Histopatologia Para a realização do exame histopatológico, as amostras foram fixadas em
formol tamponado neutro a 10% (PROPHET et al., 1994) durante 24 a 48 horas e
encaminhadas ao Setor de Morfologia e Anatomia Patológica do Laboratório de
Sanidade Animal na Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Em
seguida, foram clivadas, armazenadas em cassetes e submetidas ao processador
automático da marca Leica/TP1020, para desidratação, em diferentes concentrações
de álcool etílico e clarificação em banhos de xilol. O material foi então incluído em
parafina e os blocos cortados em seções de 5 micras (µm) no micrótomo semi-
automático da marca Leica/RM2145, para posterior coloração de rotina pela HE. Em
todos os casos em que se observou o conjunto de lesões características de
tuberculose, realizou-se a coloração especial de ZN para a demonstração de bacilos
álcool-ácido resistentes. As lâminas foram examinadas em ocular de 10 e objetivas
de 40 (400X) e 100 (1000X) ao microscópio óptico para a visualização dos bacilos,
25
em campos previamente selecionados com objetivas 10, notadamente, naqueles
ricos em macrófagos epitelóides e/ou gigantócitos e necrose.
3.3.2.1. Análise estatística
Para obter uma estimativa do percentual de amostras com lesões
histológicas típicas de tuberculose e positivas para a técnica de ZN, foi utilizado o
teste Q-quadrado (SAS, 1990).
3.3.3. Imuno-histoquímica A técnica de imuno-histoquímica foi realizada no Laboratório de Imuno-
histoquímica e Hibridização do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital
Universitário Antônio Pedro, no Departamento de Patologia da Faculdade de
Medicina da Universidade Federal Fluminense, localizada em Niterói, estado do Rio
de Janeiro. Foi aplicada a técnica indireta da estreptavidina-biotina, utilizando o kit
LSAB+ (DAKO, USA) e o anticorpo primário policlonal anti-M. bovis produzido em
coelho (BCG - DAKO, USA), conforme descrito por GUTIÉRREZ CANCELA e
GARCÍA MARIN (1993). O anticorpo primário, anti-Mycobacterium bovis, foi
previamente diluído em 1:600, conforme a bula do fabricante, para um teste piloto.
Várias outras diluições foram tentadas até que se estabelecesse a ideal de 1:4500, a
qual foi aplicada em amostras de três animais com lesões típicas de tuberculose,
selecionadas ao acaso. Os cortes, dispostos nas lâminas silanizadas (DAKO, USA),
foram seqüencialmente desparafinados na estufa por 10 minutos, ainda na estufa,
dentro do xilol, por mais 10 minutos, e quatro banhos em diferentes soluções de xilol,
por 5 minutos. Em seguida, os cortes foram hidratados em diferentes concentrações
de álcool por 20 minutos e lavados em água destilada por 5 minutos. Para a inibição
da peroxidase endógena, as lâminas foram incubadas em um becker com solução
de peróxido de hidrogênio a 3%, sobre a placa agitadora, por 30 minutos à
temperatura ambiente. Após isso, os cortes foram tratados com tampão citrato em
banho-maria à temperatura de 96ºC, por 30 minutos, para a recuperação antigênica.
Passado esse tempo, as lâminas foram colocadas em temperatura ambiente por 20
minutos para esfriar e banhadas no tampão Tris buffered solution (TBS). Para
inibição de ligações inespecíficas, cobriram-se os cortes com uma solução de leite e
26
albumina de sangue bovino, deixando por 1 hora na estufa a 37ºC. Assim, estavam
preparados para a incubação com o anticorpo primário, na diluição de 1:4500 por 30
minutos, seguida da incubação com anticorpo secundário biotinilado por mais 30
minutos e, por fim, com a enzima estreptoavidina marcada com a peroxidase por 30
minutos. A incubação com o cromógeno à base de diaminobenzidina (DAB)
devidamente diluído permitiu a revelação de cor marrom-escura e, por fim, os cortes
foram contracorados com Hematoxilina por 30 segundos, desidratados em banhos
de álcool, clarificados em banhos de xilol e montados com lamínulas.
3.3.4. Cultura Para o estudo bacteriológico, 25 amostras foram colhidas e acondicionadas
individualmente em sacos plásticos, conservadas pelo frio e transportadas para o
Laboratório de Micobactérias da Universidade Federal do Rio de Janeiro, no Centro
de Ciências da Saúde (UFRJ/CCS), na Ilha do Governador, Rio de Janeiro - R.J.
O exame microbiológico consistiu do isolamento e caracterização
morfológica das colônias em meios de cultura específicos, da determinação de
BAAR nas amostras cultivadas e da identificação da espécie de Mycobacterium, por
meio das provas bioquímicas, seguindo o protocolo do Manual de Bacteriologia da
Tuberculose (BRASIL, 1994).
3.3.4.1. Digestão do tecido Foram retirados assepticamente, vários fragmentos da amostra individual
com cerca de 2-4 g. Em seguida, esta porção foi triturada em gral com auxílio de
areia estéril e um bastão de vidro. O macerado foi homogeneizado com 10 ml de
água destilada, ficando em repouso por 30 minutos.
O material reserva foi congelado em freezer a -20ºC até que o estudo
estivesse finalizado para, se necessário, ser reutilizado.
3.3.4.2. Descontaminação do inóculo O sobrenadante foi transferido para um tubo Falcon e tratado pelo Método
de Kubica, proposto por KENT e KUBICA (1985). Este método, usando N-
27
acetilcisteína como agente de liquefação, visou à redução da mortalidade de
micobactérias, prevenindo resultados falso-negativos em materiais paucibacilares. O
sobrenadante foi tratado com a solução NALC-NaOH a 4%, esterilizada em partes
iguais durante 15 minutos em temperatura ambiente, visando à descontaminação da
amostra. A seguir, a amostra foi neutralizada com solução tampão Sorensen pH 6,8
na proporção de 1:4. A suspensão foi então centrifugada a 3.000 g durante 30
minutos, sendo o sobrenadante descartado e o sedimento ressuspendido com 0,5 ml
de solução tampão Sorensen, para a semeadura de 0,1 ml em cada tubo com o
meio. Em seguida, foi realizada a baciloscopia, pela coloração de ZN, para a
demonstração de BAAR no sedimento ressuspendido.
3.3.4.3. Inoculação em meio de cultura e incubação Para o isolamento primário, foi semeado 0,1 ml do inóculo em dois tubos
contendo meio sólido Löwenstein-Jensen (LJ), à base de ovo, com piruvato e, em
outros dois tubos, contendo o meio LJ com glicerol. Os tubos, inicialmente, foram
levemente fechados, para a evaporação da umidade presente no meio. A partir daí,
os tubos foram bem fechados para evitar o ressecamento do meio. As amostras
foram incubadas a 37ºC durante 3 meses com observação semanal do crescimento.
Estando este era visível, foram feitas baciloscopia e coloração com a técnica de ZN
para a visualização dos BAAR.
3.3.4.4. Provas bioquímicas
Nos tubos que apresentaram crescimentos de colônias típicas de
micobactérias, realizou-se a baciloscopia pela coloração de ZN para a constatação
da presença de BAAR. As colônias foram repicadas e semeadas em duplicata nos
meios LJ com piruvato, LJ comum, 7H9 com piruvato e 7H9 com glicerol. As colônias
que exibiram caracterização morfológica sugestiva de M. bovis foram submetidas às
seguintes provas bioquímicas para a identificação da espécie: sensibilidade ao
thiophen-2-carboxylic acid hydrazine (TCH), urease, pirazinamidase, produção de
niacina, redução de nitrato e preferência de piruvato como fonte de carbono,
conforme proposto por GRANGE et al. (1996).
28
3.3.4.4.1. Teste de sensibilidade ao thiophen-2-carboxylic acid hydrazine (TCH) Para a realização do teste, foram utilizados dois tubos com o meio LJ,
contendo 5 mg/l de TCH. Para o inóculo desta prova, foi preparada uma suspensão
com turvação correspondente à escala de MacFarland tubo 1. Em seguida, foi
inoculada 0,1 ml da amostra em cada tubo, contendo LJ com o TCH e, em tubos-
controle, LJ comum e LJ com piruvato, e incubados por três semanas a 37ºC em
estufa bacteriológica. A leitura dos tubos foi efetuada semanalmente.
3.3.4.4.2. Urease
A partir do cultivo recente em meio LJ, uma alça cheia de crescimento foi
emulsionada num tubo contendo 1,0 ml de caldo de uréia esterilizado por filtração e
com o pH à 5.8+0.1 (1 g de peptona; 1 g de glicose; 5 g de NaCl; 0,4 g de KH2PO4;
20 g de uréia; 1ml de vermelho de fenol à 1%; 0,1 ml de Tween 80, água q.s.p.
1.000 ml). A seguir, incubou-se em estufa à 37ºC por 18 horas.
A leitura foi realizada com 2, 18, 42, 48 e 72 horas e, considerada positiva,
quando houve mudança de cor do caldo, de amarelo para rosa escuro ou vermelho.
Foram utilizados controle positivo (tubo inoculado com Mycobacterium aurum) e
controle negativo (tubo inoculado com Mycobacterium terrae ATCC 15755).
3.3.4.4.3. Pirazinamidase O teste detecta a desaminação da pirazinamida, produzindo ácido
pirazinóico e amônia. M. tuberculosis produz teste positivo após 4 dias de incubação
e M. bovis é negativo após 7 dias de incubação (WAYNE et al., 1964). Para a
realização do teste, foi preparado um substrato, adicionando, a um litro de água
destilada, 6,5 g de caldo Dubos, 0,1 g de pirazinamida, 2 g de ácido pirúvico e 15 g
de agar, o meio foi distribuído 5 ml em tubos 16x150 mm e esterilizado a 121ºC/15
minutos. A seguir, os tubos foram colocados na posição vertical para solidificação.
Para cada amostra, foram inoculados 2 tubos com alça bem cheia de modo que o
inóculo fosse visível a olho nu. Após 4 dias de incubação a 37ºC, foi adicionado, em
um dos tubos, 1ml de solução de sulfato ferroso amoniacal a 1%, recentemente
preparada. Os tubos foram deixados à temperatura ambiente por 30 minutos e
29
examinados contra um fundo branco para verificar a existência de uma banda rosa
nos tubos positivos. Os tubos negativos foram mantidos em geladeira por 4 horas e,
novamente, examinados. O segundo tubo inoculado, o das amostras com resultado
negativo, foi examinado da mesma maneira após 7 dias de incubação. Um padrão
da coloração desenvolvida foi preparado, substituindo-se a pirazinamida por ácido
pirazinóico na preparação do substrato. Foram utilizados controle positivo (tubo
inoculado com Mycobacterium avium) e controle negativo (tubo inoculado com
Mycobacterium kansasii).
3.3.4.4.4. Produção de niacina Este teste é capaz de demonstrar a habilidade de algumas micobactérias em
sintetizar o ácido nicotínico (COLLINS et al., 1985). Para a realização desta prova
foram utilizados tubos com o meio de cultura LJ comum com crescimento
bacteriano. Em cada tubo, foram adicionados 1,5 ml de água destilada e realizados
cortes longitudinais no meio para a liberação do ácido nicotínico produzido por
determinadas espécies de micobactérias. Em seguida, os tubos foram mantidos em
repouso por 30 minutos na posição horizontal. Após esse tempo, os mesmos foram
posicionados verticalmente por 5 minutos e transferiu-se 0,5 ml do volume de cada
tubo para outros tubos menores. Tiras de papel reagente (Difco) impregnadas com
anilina, cianeto e bromo foram inseridas nos tubos e observou-se por 5 minutos,
para a visualização da mudança de cor. A coloração verde-limão indica resultado
positivo, caso contrário, não há alteração na cor. Culturas controle de micobactéria
niacina positiva (M. tuberculosis - H37Rv) foram testadas.
3.3.4.4.5. Redução do nitrato Para esta prova, foi preparada uma solução de nitrato de sódio a 0,01 M em
tampão fosfato (solução substrato de nitrato), a qual foi adicionada a tubos contendo
um homogeneizado da amostra de crescimento bacteriano com 0,5 ml de água
destilada. Em seguida, os tubos foram agitados e incubados a 37ºC por 2 horas em
estufa bacteriológica. Na seqüência, foi adicionada à solução uma gota de ácido
clorídrico, duas gotas de sulfanamida e duas gotas de hidrocloridrato de N-
naftiletilenodiamina. A reação positiva é indicada pela coloração rosada, mostrando
30
a capacidade de produzir a enzima nitratase, a qual reduz o nitrato a nitrito. Culturas
de M. tuberculosis H37Rv foram utilizadas para o controle positivo.
3.3.4.4.6. Preferência de piruvato Inicialmente, a inoculação foi feita em meios LJ com piruvato e com glicerol
para uma prévia seleção, considerando que o M. bovis utiliza melhor o piruvato
como fonte de carbono (GRANGE et al., 1996). Após a observação do crescimento,
as colônias crescidas foram repicadas e inoculadas em dois tubos contendo LJ com
piruvato e, em outros dois tubos contendo LJ comum. Os tubos foram incubados a
37ºC e o crescimento foi comparado depois de quatro semanas.
31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Estudo macroscópico
As fêmeas leiteiras foram as mais acometidas, o que é compreensível e
amplamente relatado, considerando a maior exposição destas ao agente quando
confinadas no ato da ordenha. O exame macroscópico das alterações revelou o
predomínio de lesões granulomatosas caseosas nos pulmões (Prancha 1A) e
linfonodos mediastínicos e traqueobrônquicos (Prancha 1B). Mas, algumas vezes,
observou-se o desenvolvimento de tubérculos caseosos no parênquima e na
superfície de outros órgãos e de linfonodos, como no intestino, fígado (Prancha 1C),
medular renal bilateral (Prancha 1D), útero (Prancha 1E) e nas serosas pleurais
(Prancha 1F), peritoneal e pericárdica, determinando a tuberculose generalizada.
Macroscopicamente, lesões granulomatosas compatíveis com tuberculose foram
observadas em 72% dos animais, sendo que nos positivos para o PPD, 61,8%
apresentaram lesão. O elevado percentual (63%) de lesões estabelecidas no
aparelho respiratório, sobretudo, nos pulmões e nos respectivos linfonodos
demonstrou que, para os animais do presente estudo, a principal via de entrada do
agente foi a aerógena, coincidindo com o estudo de FREITAS et al. (2001) e MOTA
et al. (2002). CORNER et al. (1994) relataram que 86% das lesões de tuberculose
bovina podiam ser identificadas através do exame dos pulmões e dos linfonodos
mediastínicos, retrofaríngeos mediais e brônquicos.
32
Alguns poucos casos de abscessos múltiplos e diminutos do fígado
mereceram um diagnóstico diferencial por lembrarem, na macroscopia, a lesão miliar
da tuberculose. Isto é razoável apenas a olho nu, já que, microscopicamente, o
abscesso é facilmente caracterizado por uma cápsula fibrocelular, contendo o
exsudato purulento. Esta é uma situação que bem retrata as dificuldades por que
passam os inspetores, quando não dispõem de um apoio laboratorial.
As lesões estabelecidas pela tuberculose são predominantes em órgãos
ricos em tecidos reticuloendoteliais, podendo ser vistas em qualquer linfonodo do
corpo. Entretanto, 70 a 90% das lesões foram predominantes nos linfonodos da
cabeça e na cavidade torácica (CORNER et al., 1994).
Os tubérculos granulomatosos se diferenciavam no tamanho, número e
distribuição, variando de diminutos a extensos, solitários ou numerosos e localizados
ou difusos. O tamanho dos granulomas variava em faixas extremas de 0,3 cm até 10
cm no maior eixo (Prancha 1E e 1A). Em alguns casos, o conteúdo caseoso
exuberante dos granulomas acarretava na deformação dos órgãos que, nos casos
de linfonodos, não era possível a distinção entre as camadas cortical e medular
(Prancha 1B). O “caseum” com coloração amarelo-creme apresentava, algumas
vezes, consistência firme e endurecida (Prancha 1D) e, outras, consistência pastosa,
semelhante ao “queijo coalho” com ou sem mineralização (Prancha 1B). Os
tubérculos foram observados na intimidade e na superfície dos órgãos e, em
algumas situações, estavam dispostos focalmente, mas puderam ser vistos
disseminados. Nos poucos casos com alterações generalizadas, foram detectados
tubérculos perláceos solitários ou coalescidos nas serosas pleural, peritoneal e
pericárdica. Conforme DUNGWORTH (1991), este processo tuberculoso em
serosas, denominado tuberculose perlácea, não invade o parênquima do órgão
devido à sua limitação por um tecido de granulação (fibrocelular). Nesta condição de
processo generalizado, as lesões também se estabeleceram nos rins, fígado,
linfonodos mesentéricos e útero, cujas lesões, neste último, estavam caracterizadas
por numerosos pequenos tubérculos no endométrio (Prancha 1E). Segundo
LILENBAUM (1998), este raro achado de tuberculose uterina pode estar relacionado
com a infertilidade do animal.
Dentre os animais reativos para o teste de tuberculina, 61,8% apresentaram
lesões macroscópicas típicas, próximos do índice de 52% detectado por CORNER et
al. (1990). Para CORNER et al. (1994), esta proporção poderia aumentar
33
significativamente com o emprego de um exame anatomopatológico mais detalhado,
razão pela qual os animais reativos para o teste de tuberculina sem lesões visíveis
não podem ser caracterizados como falso-positvos ou reatores sem lesões visíveis,
considerando que o método de inspeção post-mortem aplicado e os locais
anatômicos examinados interferem na sensibilidade do exame macroscópico.
4.2. Estudo microscópico
No exame histopatológico pelo método de rotina, hematoxilina e eosina,
apenas 61,8% dos bovinos do G1 apresentaram as características histológicas de
uma reação granulomatosa típicas de tuberculose, do chamado “granuloma
completo” (Prancha 2A). Para os G2 e o caso isolado, todas as amostras testadas
resultaram em lesões histológicas tuberculóides. Os granulomas apresentaram
áreas de necrose caseosa central com freqüente deposição de material calcário
(Prancha 2B), rodeada por um infiltrado inflamatório de macrófagos, linfócitos,
neutrófilos, células epitelióides e células gigantes de Langhans (Prancha 2C e 2D), e
uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso na periferia, caracterizando um granuloma.
Em poucos casos, pôde-se observar uma extensa área de necrose caseosa sem
calcificação circundada pelo infiltrado inflamatório, mas com poucas ou nenhuma
reação gigantocitária. Esta variação histopatológica, entre caseificação e infiltrado
inflamatório e células gigantes inclusive, está de acordo com os resultados
encontrados por GUTIÉRREZ CANCELA e GARCÍA MARÍN (1993). A necrose é
resultado da hipersensibilidade mediada por células e é de caráter caseoso.
Acredita-se que a hipersensibilidade retardada em um nível elevado, devido a
grandes quantidades de antígeno bacteriano, pode ter um efeito destrutivo sobre os
tecidos (CARTER, 1998). A calcificação é uma característica de algumas espécies
animais, observada comumente na tuberculose bovina, o que não ocorre na
tuberculose aviária e de outros animais (DUNGWORTH, 1991; JONES et al., 1997;
LÓPEZ, 1998).
O exame histopatológico pela coloração especial de ZN permitiu a
visualização de bacilos isolados ou, raramente, em grupos no interior de células
epitelióides e gigantes de Langhans (Prancha 3A e 3B) e, algumas vezes, na
periferia da área de necrose. Mesmo adotando uma sistemática visando a aumentar
as possibilidades de demonstração dos agentes, conforme relatado no capítulo
34
Material e Métodos, do presente trabalho, estes se mostraram escassos. Achados
semelhantes também foram descritos por McILROY et al. (1986), que observaram o
pequeno número de micobactérias nas células gigantes ou em áreas de necrose nas
lesões dos bovinos, enquanto SEVA et al. (2002) descreveram estes achados nos
granulomas tuberculóides dos caprinos. Mesmo as lesões sendo extensas nos casos
positivos, o número de bacilos foi muito baixo, muitas vezes, era único. Diante
desses resultados, consideramos positivas todas as amostras que apresentaram
uma lesão granulomatosa tuberculóide típica da tuberculose, independente da
presença ou ausência do BAAR. Ainda assim, no tratamento estatístico pelo teste de
Q-quadrado, a técnica de ZN revelou-se altamente significativa, o que permite
considerar a coloração como importante método complementar de diagnóstico.
Em regiões em que a doença é enzoótica, é aceito o diagnóstico
histopatológico como conclusivo (ROXO, 1997). Isto nos respalda naqueles casos
em que a cultura não foi positiva.
A técnica de ZN não teve uma correspondência direta com a cultura de M.
bovis. Naqueles materiais submetidos à cultura com resultado positivo para M. bovis,
apenas 50% foi ZN positivo. Estudos registraram que em 35 materiais isolados de M.
bovis, apenas em 48% foram observados BAAR (Mota et al., 1977 apud ANDRADE,
1989)
Segundo ANDRADE et al. (1991), a não observação de BAAR em cortes
histológicos de lesões é um fato freqüente na tuberculose bovina, devido à presença
de escasso número de bactérias na lesão e, não, à sua ausência.
Acredita-se existir uma relação direta entre a gravidade da lesão e a espécie
de micobactéria (GUTIÉRREZ CANCELA e GARCIA MARÍN, 1993). Diante da
severa lesão com extensa área de caseificação e mineralização estabelecida nestes
casos estudados de tuberculose bovina, concordamos com RIDLEY (1983) e
YOUNG et al. (1990) que observaram a relação entre a ausência de bacilos na lesão
de tuberculose bovina e a morte da micobactéria após promover a lesão, decorrente
da defesa do próprio organismo (resposta imunológica). Para estes autores, a lesão
em bovinos de caráter paucibacilar mimetiza a forma tuberculóide da lepra humana,
a qual apresenta lesão exuberante com a demonstração de escassos bacilos.
Um excelente referendo para o exposto anteriormente são os achados de
uma outra micobacteriose, a paratuberculose, estudada na UENF. As lesões
impressionam pela riqueza em bacilos fucsinófilos ao lado de uma reação
35
granulomatosa relativamente pouco exuberante, ou seja, sem caseificação e
mineralização (RODRIGUES et al., 2004).
4.3. Imuno-histoquímica A imuno-histoquímica (IHQ), com a técnica indireta da estreptavidina-biotina,
permitiu a marcação do M. bovis em lesões granulomatosas tuberculóides, no
interior de macrófagos, em células epitelióides e gigantes de Langhans. Observou-se
uma imunomarcação difusa e clara nas áreas de necrose. Como os achados de
GUTIÉRREZ CANCELA e GARCÍA MARÍM (1993) e THORESEN et al. (1994), a
reação positiva pela IHQ se distinguiu da coloração de ZN, marcando os bacilos
como grânulos (não baciliformes) de coloração acastanhada e maiores do que os
BAAR. Quanto à visualização da marcação, a técnica de IHQ permitiu uma reação
diferente, reluzente e com mais clareza, de avaliação mais fácil do que a obtida pelo
ZN. Todas as amostras que foram positivas pela IHQ, também foram positivaspela
coloração de ZN e pela cultura. Neste estudo, a IHQ demonstrou ser um importante
método complementar para o diagnóstico da tuberculose bovina, sendo mais prático
e rápido quando comparado ao isolamento que se trata de um método meticuloso e
demorado. Desta forma, a IHQ pode ser útil no diagnóstico de doenças infecciosas
crônicas, principalmente, quando o isolamento é laborioso e demorado (AMANO et
al., 1994; THORESEN et al., 1994).
A comparação entre a coloração de ZN e a técnica de IHQ em lesões de
tuberculose em bovinos e caprinos mostrou que os casos negativos para o método
de ZN foram positivos na IHQ. Acredita-se que essa sensibilidade possa ser devido
à técnica de ZN detectar somente organismos íntegros, enquanto a IHQ marca
antígenos micobacterianos, organismos vivos ou mortos e fragmentos, mesmo com
a parede celular defeituosa (GUTIÉRREZ CANCELA e GARCÍA MARÍM, 1993).
Estudos realizados em tecidos de caprinos com lesões compatíveis com a
tuberculose demonstraram que a técnica de IHQ revelou mais casos positivos,
sendo mais sensível do que a coloração de ZN. A IHQ também revelou fragmentos
positivos na forma de massas indefinidas na necrose (SEVA et al., 2002).
PAOLICCHI et al. (2001) estudaram lesões granulomatosas de paratuberculose em
veados vermelhos e concluíram que a IHQ foi muito eficaz na identificação do
Mycobacterium avium paratuberculosis (Map) no interior dos macrógafos, nas
36
células epitelióides e gigantes de Langhans, exceto nas áreas de necrose onde a
imunomarcação foi difusa e clara. Para estes estudiosos, o método pode ser
especialmente usado quando não existir material viável para o isolamento
bacteriano, ressaltando que os resultados são rápidos, contrastando com o longo
período requerido para o crescimento de certas micobactérias. Estudos
retrospectivos em lesões de paratuberculose bovina revelaram que a demonstração
do Map em amostras teciduais foi mais precisa com a técnica de IHQ do que com a
coloração de ZN e concluíram que aquela técnica pode ser um importante
complemento a métodos histopatológicos, principalmente quando o número de
bactérias nas lesões é baixo (MASSONE et al., 1990; THORESEN et al., 1994).
4.4. Estudo microbiológico
O exame microbiológico proporcionou o isolamento do Mycobacterium sp. e
a identificação, por provas bioquímicas, da espécie bovina (M. bovis). Das 25
amostras submetidas ao isolamento, foi observado em 14 (56%) amostras o
crescimento de colônias com a morfologia similar à das micobactérias (Tabela 1). A
baciloscopia das amostras em que houve o crescimento de colônias típicas permitiu
a visualização de BAAR, a partir de preparações coradas pelo ZN. Pôde-se observar
colônias brancas, pequenas, com superfície rugosa e crescimento lento e escasso,
após um período de 2-3 meses, típico do M. bovis (Figura 1). Ao contrário do M.
tuberculosis, o M. bovis apresenta um crescimento escasso em meios sólidos
(MATTHIAS, 1988). Em 50 amostras obtidas de bovinos, o isolamento foi possível
em apenas 12% (PINTO et al., 2002), enquanto ANDRADE (1989) analisou diversos
tecidos de bovinos com lesões e logrou o isolamento e tipificação como M. bovis em
40 das 59 amostras testadas. FREITAS et al. (2001), estudando bubalinos, tipificou o
M. bovis em 33 cepas de micobactérias das 49 identificadas, a partir de lesões
localizadas nos variados linfonodos e nos pulmões. O isolamento e identificação do
M. bovis a partir de lesões características de tuberculose nos linfonodos do aparelho
respiratório em bubalinos também foram relatados por MOTA et al. (2002).
Das 6 amostras teciduais sem lesões macroscópicas e microscópicas
aparentes, escolhidas aleatoriamente para a cultura, 3 foram positivas no isolamento
(Tabela 1), o que esta de acordo com os relatos sobre o isolamento de
micobactérias em bovinos e suínos sem lesões (BROWN e NEUMAN, 1979;
37
LILENBAUM et al., 2002). O exame microbiológico foi positivo diversas vezes em
casos sem lesões, confirmando a sua importância em situações especiais de
inspeção que demandem maior proteção à saúde pública (PINTO et al., 2002). Para
este resultado, deve-se considerar a possibilidade de contaminação das amostras no
ato da colheita e/ou no processamento das mesmas. Quando animais reatores ao
teste de tuberculina não apresentam lesões visíveis, esta situação deve ser
esclarecida pelo método bacteriológico, o qual poderá permitir uma prevalência tão
alta quanto 10% (CORNER et al., 1990).
O exame microbiológico foi negativo em 8 amostras com lesões
microscópicas típicas (Tabela 1). Esse resultado pode estar associado ao pequeno
número de micobactérias nas lesões no ato da coleta da amostra (PINTO et al.,
2002). Para RICHARDS e THOEN (1977), o processo de congelamento e
descongelamento das amostras contribui para a redução da viabilidade bacteriana. A
escassez ou ausência de bacilos em lesões sugestivas de tuberculose foi também
relatada por BROWN e NEUMAN (1979); ANDRADE et al. (1991); BALIAN et al.
(1997).
Apesar de a cultura ser considerada o diagnóstico “ouro” (CORNER, 1994),
no presente estudo a histopatologia identificou mais amostras positivas do que o
isolamento (Tabela 1).
Tabela 1. Comparação entre a histopatologia pelo HE e pelo ZN, em material com isolamento positivo e negativo para M. bovis.
Histopatologia/HE Histopatologia/ZN M. bovis
positivo negativo positivo negativo
Isolado 11 3 6 8
Não isolado 8 3 5 6
Total 19 6 11 14
38
Por meio das provas bioquímicas de sensibilidade ao TCH (thiophen-2-
carboxylic acid hydrazine), urease, pirazinamidase, produção de niacina, redução de
nitrato e preferência de piruvato como fonte de carbono, os resultados permitiram a
identificação do M. bovis em todas as amostras isoladas.
39
5. CONCLUSÕES
A tuberculose é um problema sanitário e de saúde pública importante na
região deste estudo.
A elevada casuística, no período considerado, permite enquadrar a
tuberculose bovina como uma enzootia, mesmo que só tenham sido computados
aqueles casos detectados em instituições de matança sob a Inspeção Oficial.
A IHQ revelou-se útil na demonstração do M.bovis.
O cultivo, mesmo que considerado “método ouro” e útil em estudos
epidemiológicos, não é adequado para o diagnóstico de rotina (casuística) por ser
meticuloso e requerer um período longo para a sua conclusão.
O diagnóstico anatomopatológico (macro e microscópico), considerando o
aspecto enzoótico, foi conclusivo, e se constitui num importante apoio laboratorial ao
Serviço de Inspeção de Carnes e na rotina de diagnóstico.
A tuberculose bovina teve como agente etiológico, o M. bovis, o principal
responsável pela enfermidade na região.
40
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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50
8. APÊNDICES 8.1. APÊNDICE A: Ilustrações 8.2. APÊNDICE B: Protocolos
APÊNDICE A
51
Prancha 1: Tuberculose bovina A) Pulmão - granuloma caseoso. Pneumonia tuberculosa caseosa. B) Linfonodo mediastínico - granuloma com extensa caseose. Linfadenite tuberculosa. C) Fígado - granulomas múltiplos e pequenos. Hepatite tuberculosa miliar. D) Rim - superfície de corte com granuloma com caseose densa na medular. Nefrite tuberculosa. E) Útero - múltiplos tubérculos (granuloma) no endométrio. Endometrite tuberculosa. F) Pleura parietal - pequenos granulomas recobertos por serosa. Pleurite tuberculosa perlácea.
52
Prancha 2: Tuberculose bovina. A) Granuloma tuberculóide completo. Endometrite tuberculosa. 40X, HE. B) Granuloma evidenciando área de mineralização. Linfadenite tuberculosa. 100X, HE. C) Células gigantes de Langhans imersas na zona de células epitelióides. Linfadenite tuberculosa. 400X, HE. D) Granuloma broncogênico com evidência do epitélio respiratório aparentemente preservado (seta). Bronquite tuberculosa. 100X, HE.
53
Prancha 3: Linfadenite tuberculosa bovina. A) Grumos de bacilos fucsinófilos (BAAR) em macrófagos epitelióides. 1000X, ZN. B) Escassos bacilos fucsinófilos na periferia de gigantócito de Langhans. 1000X, ZN. C) Imunomarcação acastanhada de M. bovis em macrófagos epitelióides e gigantócito de Langhans. 400X, IHQ. D) Imunomarcação de M. bovis na periferia de gigantócito de Langhans. 1000X, IHQ.
54
Figura 1: Escassas colônias brancas, pequenas e rugosas de M. bovis em meio LJ.
APÊNDICE B
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1. COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA
PROCEDIMENTO:
• Xilol I - 1 a 3 min
• Xilol II - 1 a 3 min
• Álcool etílico 1 - 1 min
• Álcool etílico 2 - 1 min
• Álcool etílico 3 - 1 min
• Água corrente - 1 min
• Água destilada - 1 min
• Hematoxilina - 4 a 6 min
• Água corrente - banho
• Água corrente - 15 min
• Água destilada - 1 min
• Álcool 70% - 1 min
• Eosina - 15 a 30 segundos
• Álcool etílico 1 - 1 min
• Álcool etílico 2 - 1 min
• Álcool etílico 3 - 1 min
• Álcool etílico 4 - 1 min
• Álcool etílico 5 - 1 min
• Xilol I - 1 a 3 min
• Xilol II - 1 a 3 min
• Montar a lâmina e lamínula com parmount
RESULTADO:
Núcleo = azul
Citoplasma = rosa
2. COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN
56
PROCEDIMENTO:
• Xilol I - 2 min
• Xilol II - 2 min
• Álcool etílico absoluto 1 - 1 min
• Álcool etílico absoluto 2 - 1 min
• Álcool etílico absoluto 3 - 1 min
• Água corrente - 1 min
• Água destilada - 1 min
• Carbo fucsina - 30 min
• Água corrente - lavar bem
• Gotejar o álcool ácido a 1% até que o corte fique rosa pálido
• Água corrente - 8 min
• Água destilada - 1 min
• Azul de metileno (solução de trabalho) - mergulhar
• Água corrente - lavar bem
• Água destilada - 1 min
• Álcool etílico a 95% 1 - 1 min
• Álcool etílico a 95% 2 - 1 min
• Álcool etílico absoluto 1 - 1 min
• Álcool etílico absoluto 2 - 1 min
• Xilol I - 2 min
• Xilol II - 2 min
• Montar a lâmina e lamínula com parmount
RESULTADO:
Bacilo = vermelho
Fundo = azul
3. TÉCNICA DE IMUNO-HISTOQUÍMICA
57
1. Colocar os cortes em lâminas silanizadas; 2. Desparafinização dos cortes:
• colocar as lâminas na estufa - 10 min
• colocar as lâminas dentro do xilol na estufa - 10 min
• 4 banhos no xilol - 5 min
3. Hidratação dos cortes:
• 2 banhos no álcool absoluto - 5 min
• 2 banhos no álcool a 96% - 5 min
• banhar as lâminas na água destilada - 5 min
4. Bloqueio da peroxidase endógena:
• colocar as lâminas no peróxido de hidrogênio sob agitação - 30 min
• tampão TBS (Tris-Buffered Saline) - banhar.
5. Recuperação antigênica:
• colocar as lâminas no tampão citrato em banho maria à 96ºC - 30 min
• esfriar em tºC ambiente - 20 min
• tampão TBS - banhar
6. Inibição das ligações inespecíficas:
• incubar com leite na estufa - 1 h
7. Incubação com o anticorpo primário
• cobrir todo o corte com o anticorpo primário previamente diluído
• incubar “overnight” na geladeira
• 2 banhos no TBS - 5 min.
8. Incubação com o anticorpo secundário e a enzima
• cobrir todo o corte com o anticorpo secundário e incubar a tºC ambiente - 30 min
• 2 banhos no TBS - 5 min
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• incubar com a enzima em tºC ambiente - 30 min
• 2 banhos no TBS - 5 min
9. Revelação o DAB (diaminobenzidina)
10. Contracorar com hematoxilina - 30 segundos
• 2 banhos na água destilada
• banhar na água amoniacal
• banhar na água destilada
• 2 banhos de álcool a 96% - 1 min
• 2 banhos de álcool absoluto - 1 min
• 4 banhos de xilol - 1 min
11. Montar as lâminas com Entelan
RESULTADO:
Bacilo = castanho