le gout moisi-terreux du vin
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Le goût moisi-terreux du vin : contribution à lacaractérisation cinétique et métabolique des moisissures
associées à ce défaut organoleptiqueDaniela Correia
To cite this version:Daniela Correia. Le goût moisi-terreux du vin : contribution à la caractérisation cinétique etmétabolique des moisissures associées à ce défaut organoleptique. Alimentation et Nutrition. Univer-sité de Bourgogne, 2011. Français. <NNT : 2011DIJOS012>. <tel-00668171>
1
Université de Bourgogne
AgroSup Dijon
Thèse
Pour obtenir le grade de Docteur de l’Université de Bourgogne
Discipline : Sciences des aliments
LE GOUT MOISI-TERREUX DU VIN : CONTRIBUTION A LA CARACTERISATION CINETIQUE ET METABOLIQUE DES
MOISISSURES ASSOCIEES A CE DEFAUT ORGANOLEPTIQUE
Par
CORREIA Daniela
Date
9 juin 2011 Devant la commission d’examen :
Pr. Maurice Bensoussan, GTR Myco SMAE, AgroSup Dijon, Uté de Bourgogne Directeur de thèse Pr. Claudine Charpentier, Œnologie, UMR INRA 1131, Université de Bourgogne Examinateur Dr. Philippe Dantigny, MCF H.C., HDR, AgroSup Dijon, Uté Claude Bernard, Lyon I Co-directeur de thèse Pr. Sabine Galindo, Microbiologie, Polytech'Montpellier, Uté de Montpellier II Rapporteur Dr. Florentina Radoi-Matei, Uté. Sc. Agronomiques Medecine Vétérinaire, Bucarest Examinateur Dr. Sébastien Roussos, Directeur de Recherche IRD Uté. Paul Cézanne, Marseille III Rapporteur
2
Je dédie ce travail à mon mari Jean-Baptiste, à ma famille et mes amis.
3
Remerciements
Tout d’abord, je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à Monsieur Maurice
Bensoussan pour l’accueil dans le laboratoire, pour la confiance, le soutien, la patience et les
conseils.
Je tiens également à remercier Monsieur Philippe Dantigny pour les longues
discussions sur la mycologie prévisionnelle.
Je remercie Madame Claudine Charpentier de m’avoir initié au monde de l’œnologie.
Je remercie Madame Sabine Galindo et Monsieur Sévastianos Roussos pour avoir
accepté d’être les rapporteurs de ce travail.
J’exprime également toute ma reconnaissance à monsieur Philippe Cayot de m’avoir
accepté au sein du laboratoire EMMA.
Un grand merci à Madame Florentina Radoi Matei de m’avoir choisie et encouragée
à effectuer un premier stage à l’Université de Bourgogne en 2005.
Merci aussi à toutes les personnes du laboratoire, à savoir, Tatiana, Marina, Safaa,
Christine, Claire, Fabien, Alison, Sophie, Pauline, Quan, Hélène, Dominique, pour leur aide
et leur conseils.
Merci à l’ONIVINS et à FRANCE AGRIMER pour le soutien financier.
4
Le goût moisi-terreux du vin : Contribution à la caractérisation
cinétique et métabolique des moisissures associées à ce défaut
organoleptique
Résumé
Certains microorganismes qui coexistent sur la vigne, peuvent avoir des effets
bénéfiques sur la qualité du vin alors que d'autres peuvent être à l'origine de déviations
organoleptiques. Dans la dernière décennie, dans diverses régions viticoles de France,
plusieurs odeurs de moisi ou de terre ont été mises en évidence. La (-)-géosmine a été
considérée comme étant le principal composé responsable de ce défaut. Des moisissures
comme Botrytis cinerea et d’autres appartenant au genre Penicillium ont été souvent isolées à
partir des raisins présentant l’odeur « moisi-terreuse ». Les effets de cette molécule sur la
qualité des vins a motivé notre étude sur la caractérisation des moisissures responsables de ce
défaut organoleptique.
A partir d'échantillons prélevés en 2007 en Bourgogne, on a identifié, par des
méthodes morphologiques et moléculaires, les moisissures présentes sur les raisins, Une
souche de Penicilium expansum (25.03) et deux souches de Botrytis cinerea (BC1 et BC2)
ont été sélectionnées. Sur baies de raisin, la validation d’un modèle prédictif des effets
combinés de la température et de l'activité de l’eau, sur la croissance des champignons, a pu
être mise en œuvre. Elle a montré, sur de larges gammes de T°C et d’aw, que les modèles
cardinaux avec inflexion peuvent être validés sur les produits agro-alimentaires en utilisant le
gamma concept. L’étude de l’effet du cuivre sur le taux de croissance radiale et le temps de
latence des moisissures, a été entreprise afin de mieux comprendre les mécanismes de
résistance au cuivre des champignons et d’en déduire des résultats pour une meilleure
efficacité des fongicides. Les moisissures testées ont montré une grande tolérance au cuivre,
jusqu’à 4,7 mM pour P. expansum et jusqu’à 8, 2 mM et 7,3 mM respectivement pour B.
cinerea, BC1 et BC2. L’étude des effets combinés des facteurs environnementaux et
nutritionnels (T°C, CO2; Cu+2) sur la production de géosmine par P. expansum, a conduit à
définir les conditions minimisant la production de géosmine. Ainsi, on a pu déterminer que le
cuivre (composant actif de nombreux fongicides) est un facteur clé dans la production de
géosmine par P. expansum.
Mots clés : Botrytis cinerea, Penicillium expansum, moisissure, cuivre, raisins, mycologie prévisionnelle.
5
Earthy-musty taste of wine : Contribution to kinetic and
metabolic caracterisation of fungal flora of grapes associated to
this organoleptic deviation
Abstract Some microorganisms that co-exist on the grapevine may have beneficial effects on
the quality of wine whereas others may be at the origin of organoleptic deviations. In the last
decade, several mouldy or earthy odors have been highlighted in various wine regions from
France. (-)-geosmin was found to be the major compound responsible for this deviation, along
with Botrytis cinerea and fungi belonging to the genus Penicillium, since they were frequently
isolated from “earthy-musty” odor grapes. The extent of damage on the quality of wines,
motivated our study on the caracterisation of grape rot fungi.
First of all, the microflora of grapes from Burgundy vineyards was identified
(morphological and molecular methods), from samples prelevated in 2007. A Penicilium
expansum strain (25.03) and two Botrytis cinerea strains (BC1 and BC2) were chosen for
further experiments. The validation of a predictive model for the combined effect of
temperature and water activity, on the growth of fungi on grape berries, demonstrated that
cardinal models with inflexion can be validated on agri-food products, over a wide range of
T°C and aw, using the gamma concept. Further we were focused on the influence of copper on
the lag time and radial growth rate of moulds in order to better understand copper resistance
mechanisms of the fungi and the efficacity of fongicides. The moulds tested showed a great
copper tolerance, 4.7 mM for P. expansum and 8.2 and 7.3 mM for B. cinerea strains, BC1
and BC2 respectively. These results motivated our study on the influence of environmental
and nutritional factors (T°C, CO2; Cu2+), using a Doehlert matrix, on geosmin production of
the fungi tested. Copper (the active component of the “Bordeaux mixture”) showed to be a
key factor in the increase of geosmin production by P. expansum.
Keywords: Botrytis cinerea, Penicillium expansum, moulds, copper, wine grapes, predictive
mycology.
6
SOMMAIRE INTRODUCTION GENERALE 11 PARTIE 1 SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 14 1. I. Généralités sur les mycètes 15 1. I. 1. Le genre Penicillium 16 1. I. 1. 1. Penicillium expansum - modèle d'étude 17 1. I. 1. 1. 1. Description morphologique 17 1. I. 1. 1. 2. Physiologie, Habitat, Ecologie 18 1. I. 2. Botrytis cinerea - modèle d'étude 18 1. I. 2. 1. Description morphologique 19 1. I. 2. 2. Physiologie, Habitat, Ecologie 19 1. II. Métabolites volatils produits par les moisissures 20 1. II. 1. Composés d’origine fongique retrouvés dans les vins 20 1. II. 1. 1. Composés à odeur de champignon 22 1. II. 1. 2. Composés à odeur moisie et/ou terreuse 23 1. II. 2. La géosmine 25 1. II. 2. 1. Caractéristiques générales 25 1. II. 2. 2. Voie de biosynthèse de la géosmine 27 1. II. 2. 2. 1. Les terpènes synthases chez les bactéries 28 1. II. 2. 2. 2. Les terpènes synthases chez les moisissures 30 1. II. 3. Microorganismes producteurs de géosmine 32 1. II. 4. Facteurs influençant la production de géosmine 33 1. II. 5. La microflore de la baie de raisin 35 1. III. Méthodes d’identification des moisissures 37 1. III. 1. Méthodes d’identification conventionnelles 37 1. III. 2. Méthodes d’identification par biologie moléculaire 37 1. III. 2. 1. Généralités sur les tubulines 38 1. III. 2. 1. 1. Identification des moisissures par les β-tubulines 39 1. IV. Le cuivre 41 1. IV. 1. Le cuivre dans la vigne et le sol 41 1. IV. 2. Utilisation du cuivre contre les microorganismes 44 1. IV. 3. Facteurs qui peuvent influencer la biodisponibilité du cuivre 45 1. IV. 4. Mécanismes de toxicité du cuivre 47 1. IV. 5. Mécanismes de résistance au cuivre 48 1. IV. 5. 1. Généralités 48 1. IV. 5. 2. La résistance au cuivre des bactéries 49 1. IV. 5. 3. La résistance au cuivre des champignons 50 1. IV. 5. 4. Quelques données sur la résistance des moisissures aux métaux 54 1. V. Modélisation de la croissance fongique 56 1. V. 1. Modèles primaires 56 1. V. 1. 1. Modèles de germination 57 1. V. 1. 2. Modèles de croissance 58 1. V. 2. Modèles secondaires 58 1. V. 2. 1. Modèles cardinaux 58 1. V. 2. 2. Modèles d’inactivation 59 1. V. 2. 3. Modèles polynomiaux 59 1. V. 3. Validation des modèles prévisionnels 61 PARTIE 2 MATERIELS ET METHODES 62 2. I. Microorganismes et milieux de culture 63 2. I. 1. Echantillonnage et dénombrement des moisissures 63
7
2. I. 2. Milieux de culture, inoculation et dispositif d’incubation 63 2. I. 3. Dénombrement des spores 65 2. I. 4. Détection et dosage de la géosmine 65 2. I. 5. Modélisation et traitement des données 66 2. II. Identification des moisissures 69 2. II. 1. Extraction d’ADN 69 2. II. 2. Dosage de l’ADN 70 2. II. 3. Amplification par PCR 70 2. II. 4. Electrophorèse 71 2. II. 5. Séquençage et analyse des séquences 71 PARTIE 3 RESULTATS ET DISCUSSION 72 3. I. IDENTIFICATION DE LA MICROFLORE DES BAIES DE RAISINS 73 3. I. 1. Introduction 73 3. I. 2. Analyse de la microflore fongique des vignobles de Morey 73 3. I. 3. Regroupements taxonomiques des espèces du genre Penicillium 74 3. I. 3. 1. Analyse hiérarchique ascendante des critères morphologiques 74 3. I. 3. 2. Intérêt taxonomique du milieu CREA 75 3. I. 3. 3. Identification moléculaire des souches de Penicillium isolées 76 3. I. 3. 3. 1. Analyse des séquences par comparaison à une base de données 76 3. I. 3. 3. 2. Construction de l’arbre phylogénétique 78 3. I. 4. Recherche des souches de Penicillium productrices de géosmine 80 3. I. 5. Conclusions
80
3. II. Validation des effets combinés de la température et de l’activité de l’eau sur la croissance de Botrytis cinerea et de Penicillium expansum sur baies de raisins.
81
3. II. 1. Présentation 81 Publication 1. Correia-Judet, D., Bollaert, S., Duquenne, A., Charpentier, C., Bensoussan, M., Dantigny, P., (2010). Validation of a predictive model for the combined effect of temperature and aw on growth of Botrytis cinerea and Penicillium expansum on grape berries, International Journal of Food Microbiology, 142, 106-113.
82
3. II. 2. Conclusions
90
3. III. Influence du cuivre sur le temps de latence et le taux de croissance radiale de Penicillium expansum et de Botrytis cinerea.
91
3. III. 1. Présentation 91 Publication 2. Correia-Judet, D., Charpentier, C., Bensoussan, M., Dantigny, P., (2011). Modelling the inhibitory effect of copper sulphate on the growth of Penicillium expansum and Botrytis cinerea. Food Research International, soumis.
92
3. III. 2. Conclusions 117 3. IV. Effets combinés de la température, du dioxyde de carbone et du cuivre sur la production de géosmine par Penicillium expansum.
118
3. IV. 1. Présentation 118 Publication 3. Correia-Judet, D., Bensoussan, M., Charpentier, C., Dantigny, P., (2010). Combined effects of temperature, copper and CO2 on geosmin production by Penicillium expansum. Journal of Applied Microbiology, soumis.
119
3. IV. 2. Conclusions
140
CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES 141 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 144
8
ANNEXE 1 Judet, D., Bensoussan, M., Perrier - Cornet, J.M., Dantigny, P., 2008. Distributions of the growth rate of the germ tubes and germination time of Penicillium chrysogenum conidia depend on water activity, Food Microbiology, 25, 902 - 907.
155
ANNEXE 2 Dantigny, P., Nanguy, M., Correia-Judet, D., Bensoussan, M., 2011. A new model for germination of fungi, International Journal of Food Microbiology, 146, 176-181.
162
ANNEXE 3 Charpentier, C., Correia, D., Dantigny, P., Bensoussan, M., 2011. Nouvelles données expérimentales concernant les effets du cuivre et de la température sur la croissance de moisissures d’altération de la vigne et la production de géosmine - responsable du goût moisi - terreux du vin, Revue des œnologues, 139.
170
ANNEXE 4 Liste des travaux de recherche 187
9
LISTE DES TABLEAUX Tableau Titre Page
1 Différents types de métabolites volatils produits par Penicillium 21 2 Les défauts organoleptiques dans le domaine vinicole et les molécules impliquées 22 3 Propriétés physico-chimiques de la géosmine 25 4 Caractérisation de la géosmine dans les vins 27 5 Concentration en cuivre dans les sols de vigne 43 6 Cuivre retrouvé dans les fractions cellulaires de Mucor rouxii 52 7 Concentrations inhibitrices des différents métaux 55 8 Charge fongique des raisins contaminés, des vignobles de Morey 74 9 BLAST des gènes de la β tubuline 77
Tableaux publications
Publication 1 1 Estimation des températures cardinales et taux de croissance optimales sur PDA à 0,99
aw 84
2 Estimations des activités de l’eau cardinales et taux de croissance optimales sur PDA à 25°C
85
3 Indices mathématiques utilisées pour valider les gamma-fonctions 86 4 Détermination des taux de croissance optimales des moisissures sur raisin « Red Globe » 87 5 Valeurs cardinales reportées dans la littérature pour B. cinerea et P. expansum 88
Publication 2 1 Paramètres estimés lors de la modélisation de l’influence du cuivre sur la croissance 111 2 Paramètres estimés lors de la modélisation de l’influence du cuivre sur le temps de
latence 112
Publication 3 1 Plan d’expériences pour l’influence de la température, cuivre et CO2 sur la production de
géosmine par P. expansum 139
2 Liste des coefficients du modèle 139 Annexe 1
1 Influence de l’activité de l’eau pour la sporulation et la germination sur la distribution des taux de croissance des tubes germinatifs et sur le temps de germination des spores de P. chrysogenum
158
2 Estimation des paramètres obtenus lors de la germination des spores de P. chrysogenum sous différentes conditions d’activité de l’eau avec le modèle Logistique et le modèle de Gompertz
160
Annexe 2 1 Estimations du pourcentage des spores viables de P. chrysogenum exposés aux vapeurs
d’éthanol 165
2 Estimation des temps de germination des spores de P. chrysogenum déterminés par trois modèles de germination
165
3 Détermination des valeurs RMSE pour différentes données de germination dans la littérature
166
4 Estimation des paramètres obtenus lors de la modélisation de la germination de F. verticillioides avec le modèle asymétrique
166
5 Estimation du paramètre de conception pour différentes données de germination de la littérature
167
Annexe 3 1 Le défaut moisi-terreux dans le domaine vinicole et les molécules impliquées 170 2 Charge fongique des raisins contaminés des vignobles de Morey-St-Denis 172
10
LISTE DES FIGURES Figure Titre Page
1 Cycle de vie de Penicillium chrysogenum 17 2 Penicillium expansum aspect micro- et macroscopique 18 3 Botrytis cinerea aspect micro- et macroscopique 19 4 Composés volatils à odeur de champignon 23 5 Composés volatils à odeur moisie et/ou terreuse 24 6 Structures énantiomères de la géosmine 26 7 Voie de biosynthèse de la géosmine 28 8 Cyclisation du FPP catalysée par la sesquiterpène synthase de S. coelicolor 29 9 Aristolochène - mécanisme chez P. roqueforti 30 10 Différents types de pourritures retrouvées sur les raisins 35 11 Structure d’un microtubule 38 12 Structure du gène de la β-tubuline de Neurospora crassa 40 13 Feuille de vigne parasitée par le mildiou 44 14 Les mécanismes de toxicité du cuivre, au niveau de la cellule 47 15 Les mécanismes de résistance au cuivre, développés par la cellule 49 16 Images au microscope électronique des cellules de Trichoderma viride 52 17 Dispositif expérimental d’incubation 65 18 Cuboctaèdre avec 13 points expérimentaux pour trois facteurs 68 19 Relations taxonomiques entre les souches de Penicillium isolées en Bourgogne 75 20 Arbre phylogénétique des souches de Penicillium isolées en Bourgogne et des espèces
de la base de données 79
Figures publications
Publication 1 1 Dispositif expérimental 84 2 Effet de la température et de l’activité de l’eau sur le taux de croissance radial de B.
cinerea et P. expansum 85
3 Validation du modèle prédictif pour l’effet de la température et de l’activité de l’eau sur la croissance de B. cinerea et P. expansum
86
4 Croissance de P. expansum sur raisins « Red Globe » 87 Publication 2
1 Effet du cuivre sur le taux de croissance et le temps de latence de P. expansum 114 2 Effet du cuivre sur le taux de croissance et le temps de latence de B. cinerea BC1 115 3 Effet du cuivre sur le taux de croissance et le temps de latence de B. cinerea BC2 116
Publication 3 1 Influence du cuivre et de la température sur la production de géosmine par P.
expansum 136
2 Influence du CO2 et de la température sur la production de géosmine par P. expansum 137 3 Influence du CO2 et du cuivre sur la production de géosmine par P. expansum 138
Annexe 1 1 Relation entre le taux de croissance des tubes germinatifs et le temps de germination
des spores de P. chrysogenum 158
2 Distributions des taux de croissance des tubes germinatifs des spores de P. chrysogenum
159
3 Distributions des temps de germination des spores de P. chrysogenum 159 4 Courbes de germination de P. chrysogenum pour différentes activités de l’eau 160
Annexe 2 1 L’effet du paramètre de conception sur la forme de la courbe du modèle asymétrique 164 2 Courbes de germination obtenues pour P. chrysogenum avec le modèle asymétrique 166 3 Courbes de germination obtenues pour F. verticillioides avec le modèle asymétrique 167
Annexe 3 1 Dispositif expérimental 171 2 Le cuivre au niveau de la vigne 172 3 Effets de la température et du cuivre sur la croissance de B. cinerea 173 4 Effets de la température et du cuivre sur la production de géosmine par P. expansum 174 5 Effets de la température et du cuivre sur la croissance et la production de géosmine par
P. expansum 174
6 Voie hypothétique de la synthèse de géosmine chez P. expansum 174
11
INTRODUCTION GENERALE
Un grand intérêt est porté aujourd’hui à la maîtrise de la contamination des produits
alimentaires par les moisissures. Cela est consécutif à l'apparition continue de nouveaux
produits et procédés de fabrication et de conservation. Pour assurer une sécurité alimentaire
qui réponde aux attentes des consommateurs, les matières premières et les produits
alimentaires qui en sont issus, doivent alors présenter le plus faible niveau de ce type de
risque microbiologique.
Le développement des moisissures est engagé au moment où l’on commence à voir
des hyphes, c’est à dire lorsque la phase de germination des spores fongiques est dépassée.
Afin de mieux appréhender le développement des moisissures et ses conséquences, les études
doivent alors se centrer sur le contrôle de la phase de germination des spores et ensuite sur la
maîtrise de la phase de croissance mycélienne, responsable de la production de métabolites
secondaires. Chacune de ces phases reste sous la dépendance des effets de facteurs
environnementaux comme l’activité de l’eau, la température et le pH.
La mycologie prévisionnelle a pour but de prédire le développement des moisissures
dans les produits alimentaires susceptibles d’être colonisés (Dantigny et al., 2003). La
cinétique de développement de ces microorganismes est évaluée par l’élaboration de modèles
mathématiques.
Lorsque les moisissures se développent dans des conditions favorables, elles
produisent une gamme large de métabolites secondaires, parmi lesquels des métabolites
volatils (Turner et Aldridge, 1983). Les facteurs environnementaux et la composition du
substrat de culture (température : Richard-Molard et al., 1976 ; activité de l’eau : Gervais,
1990 ; nature des sources de carbone et d’azote : Yong, 1992 ; traces de métaux : Bjurman et
Kristensson, 1992 ; …) qui influencent de manière qualitative et/ou quantitative le
développement des moisissures, ont en conséquence des effets sur la production de
métabolites volatils (Larsen et Frisvad, 1995).
Ces métabolites volatils peuvent être assimilés à des arômes « naturels » utilisés
comme additifs alimentaires (Janssens et al., 1992), mais à l’inverse, ils peuvent être sources
de déviations organoleptiques comme celles perçues dans l’eau (Gerber et Lechevalier, 1965)
ou dans le vin (La Guerche, 2004).
12
Dans la dernière décennie, plusieurs odeurs de moisi ou de terre ont été mises en
évidence dans diverses régions viticoles de France (Bordelais, Beaujolais, Val de Loire,
Bourgogne) et se sont traduites par des pertes économiques. Plusieurs molécules responsables
de cette déviation organoleptique ont pu être identifiées (fenchol, fenchone, 2-
méthylisobornéol, géosmine, …) (La Guerche et al., 2006).
La (-)-géosmine est connue depuis longtemps comme polluant de l’eau, issue de la
prolifération de bactéries filamenteuses (Gerber et Lechevalier, 1965) ou de Penicillium
expansum (Mattheis et Roberts, 1992). Dans les vins, l’origine fongique des molécules
associées au goût moisi-terreux a été démontrée (Darriet et al., 2000), mais seule la géosmine
s’est révélée non dégradée lors de la fermentation alcoolique.
Parmi les moisissures retrouvées dans le vignoble, Botrytis cinerea est l’une des plus
fréquentes. C’est un contaminant recherché (« pourriture noble ») pour l’élaboration de raisins
« rôtis » destinés à la production des vins liquoreux, mais c’est aussi un agent pathogène de la
vigne, responsable de la « pourriture grise » et producteur de 2-méthylisoborneol. La
dégradation des baies de raisins par ce champignon, favorise l’installation secondaire d’autres
formes de pourriture, à l’origine de nouvelles déviations organoleptiques (La Guerche, 2004).
L'activité biocide du cuivre est connue depuis longtemps. La « Bouille Bordelaise »
(CuSO4 + Ca(OH)2), dans laquelle l’acidité du sulfate de cuivre est neutralisée par de la chaux
éteinte, est un fongicide mis au point au début des années 1880 par Ulysse Gayon et Alexis
Millardet lors de leur collaboration pour protéger les vignes du « mildiou » (Plasmopara
viticola) ; il contient 20 % (m/m) de cuivre. Depuis cette date, le cuivre est entré dans la
composition de fongicides appartenant aux diverses familles chimiques (sulfates, hydroxydes,
oxychlorures, ...).
Suite aux traitements préventifs de la vigne, les niveaux de cuivre peuvent atteindre de
fortes concentrations dans l’environnement des ceps (Brun et al., 2001). Paradoxalement, cet
état favorise la prolifération et la persistance de spores du genre Penicillium. Yamamoto et al.
(1985), ont ainsi montré que le genre Penicillium était prédominant dans des sols pollués par
le cuivre. Or, il a été démontré que la production de géosmine par P. expansum est stimulée
par la présence de cuivre (Dionigi et Ingram, 1994).
Des études préliminaires sur milieu modèle, en cultures pures et en co-cultures de B.
cinerea et P. expansum, ont confirmé que le 2-méthylisobornéol est produit par les
moisissures du genre Botrytis et que la géosmine est produite, entre autres, par P. expansum
(Charpentier et al., 2006). Ces deux composés qui dérivent de la voie du mévalonate, sont des
13
terpénoides. Ils sont considérés comme des métabolites secondaires, car leur niveau de
biosynthèse n’est pas constant et varie selon les effets de facteurs biotiques ou abiotiques
conditionnant la croissance des moisissures impliquées.
De ces constatations, a découlé l’étude des aspects cinétiques et métaboliques du
développement fongique de deux moisissures d’altération de la vigne appartenant aux genres
Penicillium (P. expansum) et Botrytis (B. cinerea), soumises aux effets de différents facteurs
(température, activité de l’eau, teneur en cuivre ou en CO2 dans l’ambiance.
Les résultats de ce travail sont présentés en quatre parties :
Tout d'abord on a identifié, par des critères morphologiques, les moisissures présentes
sur les raisins en Bourgogne. Une attention particulière a été attribuée aux espèces du genre
Penicillium, pour lequelles on a effectué une identification moléculaire (β tubuline). Une
souche de P. expansum (25.3) et deux souches de B. cinerea (BC1 et BC2) ont été retenues
pour nos travaux de recherche.
Dans un deuxième temps on a déterminé les valeurs cardinales de température et
d'activité de l'eau de P. expansum 25.3 et B. cinerea, BC1 et BC2. Grâce au gamma concept,
on a validé le modèle prédictif pour l'effet combiné de la température et de l'activité de l’eau
sur la croissance de ces champignons sur baies de raisin.
La troisième partie de cette thèse décrit l'influence du cuivre sur le taux de croissance
radiale et le temps de latence de P. expansum et B. cinerea. Cela, dans le but de mieux
comprendre les mécanismes de résistance au cuivre des champignons et l'efficacité des
fongicides.
Les résultats obtenus ont motivé, par la suite, une étude des effets combinés des
facteurs environnementaux et nutritionnels (T°C, CO2; Cu+2) sur la croissance, la sporulation
et la production de géosmine par P. expansum. Une matrice d’optimisation de Doehlert a été
choisie afin de déterminer les conditions minimales de production de géosmine.
14
PARTIE 1 SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
15
1. I. GENERALITES SUR LES MYCETES
Les Mycota ou vrais champignons se répartissent en trois groupes (Whittaker, 1969).
Le premier groupe, les Eumycètes, à nutrition par absorption, comprend selon la nature de
leur reproduction sexuée les classes des Ascomycètes, Basidiomycètes et Zygomycètes,
auxquelles sont associés les Deutéromycètes, des espèces dépourvues de phase sexuée connue
et ne se multipliant que de manière végétative. Ce groupe englobe la totalité des espèces
filamenteuses contenant de la chitine dans leur paroi, ainsi que toutes les espèces
levuriformes. Le deuxième groupe, les Straménopiles, comprend des organismes
photosynthétiques et la classe des Oomycètes, non photosynthétiques ; ces derniers
rassemblent des espèces filamenteuses dont la paroi contient principalement de la cellulose.
Le dernier groupe, les Myxomycètes, à nutrition par phagocytose, plus hétérogène, est
constitué d'espèces caractérisées par une phase végétative dépourvue de paroi squelettique.
Les champignons ne correspondent pas à un ensemble monophylétique. Le groupe des
champignons à chitine, proche des Métazoaires, aurait donné naissance aux plantes
vasculaires. Les champignons à cellulose seraient apparentés aux Chromophytes (algues
brunes) et aux Diatomées (Giraud, 1998).
Les champignons sont constitués d'un thalle filamenteux ou unicellulaire
(levuriforme). Ceux qui exhibent une forme sexuée sont considérés comme « parfaits », alors
que les autres sont dits « imparfaits ». Certaines espèces pratiquent une reproduction sexuée
occasionnelle, ce qui signifie que des périodes de multiplication asexuée sont interrompues
par des événements de recombinaison peu nombreux. Chez les espèces levuriformes, la
multiplication végétative passe par un bourgeonnement, chez les espèces filamenteuses, c'est
principalement par la production de spores asexuées. La découverte tardive du caractère sexué
de certains champignons a parfois conduit, en raison de contingences historiques, à une
double nomenclature correspondant à la forme parfaite et imparfaite de la moisissure
(Chereyathmanjiyil, 2001). Cependant, parmi les champignons se retrouvent un nombre
important d'agents phytopathogènes.
16
1. I. 1. Le genre Penicillium
Les Penicillium sont très communs dans l’environnement ; ils ont pour habitat le sol
les denrées alimentaires, les matières organiques en décomposition, le compost, les céréales,
etc. Ce genre comprend entre 100 et 250 espèces. Le nom de Penicillium est donné par la
forme de pinceau du conidiophore (du latin penicillus) (Pitt et Hocking, 1999).
Diverses espèces présentent un intérêt économique, elles sont cultivées au niveau
industriel : pour la fabrication de fromages (Penicillium roquefortii, Penicillium camemberti),
la production d’antibiotiques de type pénicillines (Penicillium notatum, Penicillium
chrysogenum), de griséofulvine (Penicillium griseofulvum) ou d’acide gluconique
(Penicillium purpurogenum). Certaines espèces peuvent produire des mycotoxines.
Les Penicillium, groupe de moisissures mitotiques (absence de reproduction sexuée),
appartiennent à la classe des Hyphomycètes (thalle entièrement mycélien), et sont considérés
comme Deutéromycètes ou fungi imperfecti. De manière inopinée, une reproduction sexuée
avec formation de spores différentes (ascospores) est parfois découverte chez certaines
espèces: ces Penicillium sont alors re-classées dans les genres Talaromyces ou Eupenicillium,
suivant les caractères de la paroi ascocarpique (Pitt, 1979).
Ces moisissures se multiplient généralement de manière végétative (conidiogénèse) en
produisant sur des parties aériennes (conidiophores) des spores non sexuées (conidies) et
constituant, chez la plupart des espèces, un thalle vert (Dantigny et al., 2005a) (Figure 1).
Aspects des conidies et modalités de branchement des conidiophores sont des critères
morphologiques utilisés en taxonomie. La propagation des conidies, produites en chaînes à
partir de cellules appelées phialides est réalisée dans l’atmosphère ambiante (Botton et al.,
1990). Dans des conditions favorables d'humidité et de température, les conidies gonflent,
émettent des tubes germinatifs et ensuite du mycélium visible.
Le genre Penicillium comprend quatre sous-genres, principalement en fonction du
type de branchement du conidiophore : Aspergilloides, Penicillium, Biverticillium et
Furcatum (Pitt et Hocking, 1999). La majorité des Penicillium isolés à partir des raisins font
partie du sous genre Penicillium, donc ce groupe sera particulièrement décrit.
Les espèces du sous-genre Penicillium sont caractérisées par des moisissures au
conidiophore terverticillé et des colonies avec une forte sporulation. Elles se développent à
des températures basses, sont résistantes à des activités de l'eau et des valeurs de pH basses
(Pitt et Hocking, 1999) et 37 °C semble marquer une limite à la croissance.
17
Ce sous genre est constitué de plusieurs sections en fonction de leurs caractères
phénotypiques : Section Coronata – série Olsonii ; Section Roqueforti – série Roqueforti ;
Section Chrysogena – série Chrysogena, Mononematosa, Aethiopica, Persicina ; Section
Penicillium – série Expansa, Urticicolae, Claviformia, Italica, Gladioli ; Section Digitata –
série Digitata ; Section Viridicata – série Viridicata, Corymbifera, Verrucosa, Camemberti,
Solita.
Figure 1. Cycle de vie de P. chrysogenum, d’après Dantigny et al. (2005a)
1. I. 1. 1. Penicillium expansum - modèle d'étude
Penicillium expansum est connu en tant que producteur de la pourriture poste-récolte
des pommes et cerises (Mattheis et Roberts, 1992).
1. I. 1. 1. 1. Description morphologique
- colonies sur milieu CYA : 30-40 mm de diamètre ; mycélium blanc légèrement plissé, avec
des aires adjacentes floconneuses à veloutées ; conidiogenèse modérée, spores de couleur vert
foncé ; exsudat clair à brun-orange pâle, pigment soluble couleur caramel ; revers pâle à brun
foncé, souvent avec des aires orange-brunâtre ;
- colonies sur milieu MEA : 20-40 mm de diamètre ; mycélium généralement lisse ;
conidiogenèse habituellement intense, spores de même couleur que sur CYA ou légèrement
plus grises ; pigment soluble orange-brun ; revers pâle coloré par le pigment (Figure 2) ;
- les spores ont environ 5 µm de diamètre (Pitt et Hocking, 1999).
18
1. I. 1. 1. 2. Physiologie, Habitat, Ecologie
- Aw : aw min = 0,82 - 0,83 (Mislivec et Tuite, 1970) ;
- T °C : Tmin = ± 3 °C, Topt = ± 25 °C, Tmax = ± 35 °C (Panasenko, 1967).
- niche écologique : les fruits du verger ; isolé aussi sur fraises et tomates et d'autres espèces
végétales, indiquant qu'il a un spectre large ;
- production de mycotoxines : dont la patuline (Pitt, 1985 ; Pitt et Hocking, 1999).
Non libre de droit de diffusion
Figure 2. Penicillium expansum, A-sur milieu PDA, B-sur milieu MEA et CYA, C-conidiophore avec conidies, D-aspect de la contamination sur pomme (source personnelle ; www.mycobank.org)
1. I. 2. Botrytis cinerea - modèle d'étude
Botrytis cinerea est un champignon phytopathogène responsable de la « pourriture
grise », une maladie cryptogamique qui pose des problèmes aux viticulteurs. Ce champignon
est également responsable de la « pourriture noble » qui permet d'obtenir certains vins
liquoreux. Le nom Botrytis cinerea Persoon désigne la forme asexuée (anamorphe)
Deutéromycète du champignon, tandis que la forme sexuée (téléomorphe) Ascomycéte est
appelée Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel. Botrytis cinerea appartient à la classe des
Hyphomycètes (thalle entièrement mycélien), à l'ordre des Moniliales, et à la famille des
Moniliacées, et se développe sous la forme conidienne sur de très nombreux végétaux.
Comparativement au genre Penicillium sp., dans le genre Botrytis, le conidiophore se présente
sous forme d’un arbre.
19
1. I. 2. 1. Description morphologique
- colonies sur milieu CYA et MEA : le mycélium couvre toute la boîte de Petri, aspect
floconneux, mycélium blanc au départ devient gris à gris foncé au fur et à mesure qu’il y a
production de spores ; revers gris ; les spores mesurent entre 8 et 10 µm de diamètre ;
- les spores ont entre 8 et 10 µm de diamètre ;
- les sclérotes : formés à partir du mycélium compact pour survivre aux conditions
hivernales ; petits, arrondis ou de forme ovale, 2 à 4 mm de longueur, 1 à 3 mm de largeur ;
d'abord blancs, ils brunissent puis noircissent par la suite ; leur surface est très brillante et
marquée de fines ponctuations régulières ; ils évoluent en production de conidiophores et
conidies (Pitt et Hocking, 1999) (Figure 3).
1. I. 2. 2. Physiologie, Habitat, Ecologie
- Aw : awmin = 0,90 sur milieu à base de sucrose (Jarvis, 1977) ;
- T °C : Tmin = -2 à 5 °C, Topt = 22 à 25 °C, Tmax = 28 à 35 °C (Domsch et al., 1980).
- niche écologique : il représente la cause la plus importante de la pourriture des raisins avant
vendanges et pendant le stockage ; il produit aussi la pourriture des fruits du verger ;
- pas de production de mycotoxines (Pitt et Hocking, 1999).
Non libre de droit de diffusion
Figure 3. Botrytis cinerea, A, B-mycélium et sclérotes, C-conidiophore avec conidies, D-aspect de la contamination sur raisins (www.mycobank.org)
20
1. II. METABOLITES VOLATILS PRODUITS PAR LES MOISIS SURES
Les moisissures sont connues comme productrices d’une gamme large de métabolites
secondaires parmi lesquels des métabolites volatils (Turner et Aldridge, 1983). Ces
métabolites peuvent avoir des effets plus ou moins désirés, dans les aliments ou
l’environnement.
La production des métabolites peut servir à :
- l’identification des moisissures par chimiotaxonomie (Verscheure et al., 2002) ;
- la détection de la croissance fongique (Abramson et al., 1980) ;
- l’étude sur les déviations organoleptiques aperçues dans l’eau (Gerber et Lechevalier,
1965) ou dans le vin (La Guerche, 2004) ;
- la production des arômes naturels comme additifs alimentaires (Janssens et al., 1992) ;
- l’étude des effets de métabolites sur d’autres microorganismes (Lanciotti et Guerzoni,
1993).
Les facteurs environnementaux et la composition du substrat semblent avoir une
grande influence sur la nature qualitative et quantitative des métabolites volatils et donc sur
l’odeur (Larsen et Frisvad, 1995). L’activité de l’eau (Gervais, 1990), la température
(Richard-Molard et al., 1976), les sources de carbone et azote (Yong, 1992), les différentes
traces des métaux (Bjurman et Kristensson, 1992), ce sont des facteurs qui jouent un rôle
important dans la production des métabolites volatils.
Les principaux métabolites volatils produits par les moisissures du genre Penicillium
ce sont des alcools, des cétones, des esters, et des monoterpènes et sesquiterpènes (Larsen et
Frisvad, 1995) (Tableau 1).
1. II. 1. Composés organiques volatils (COV) à odeur fongique, moisie et/ou terreuse
dans les vins
Depuis plusieurs années, les producteurs de vin ont observé des déviations
organoleptiques qui correspondent aux odeurs de champignon, de moisi, de camphré ou de
terre. Ce phénomène n’est pas dû à un problème de bouchons contaminés par divers
microorganismes, ou à une hygiène déficiente dans les chais. Il est lié à la présence de
microorganismes sur les raisins et à leur production de métabolites volatils.
21
Tableau 1. Différents types de métabolites volatils produits par Penicillium, d’après Larsen et Frisvad (1995), Mattheis et Roberts (1992)
En fonction des situations géographiques ou des millésimes, certaines molécules
peuvent être produites de façon majoritaire. Il y a des composés qui sont perçus dans les
moûts mais leur intensité peut être affectée pendant la fermentation alcoolique (Tableau 2).
Alcools et Cétones Fungi
l-octèn-3-ol
3-octèn-2-one
3-octanone
6-méthyl-5-heptène-2-one
2-octanone
3-octanol
3,4-diméthyl-2-héxanone
2-nonanone
P. camemberti, P. chrysogenum, P. commune, P. tricolor
P. decumbens
P. aurantiogriseum, P. discolour, P. echinulatum, P. freii
P. vulpinum
P. coprophilum
P. camemberti, P. chrysogenum, P. commune, P. tricolor
P. coprophilum
P. olsonii
Esters Fungi
acétate d’éthyle
acétate d’isopropyle
isobutanoate de méthyle
propanoate d’éthyle
acétate d’isobutyle
isopentanoate de méthyle
P. aethiopicum, P. atramentosum, P. brasilianum, P. camemberti
P. brevicompactum, P. digitatum
P. atramentosum
P. crustosum, P. digitatum, P. griseofulvum
P. aethiopicum, P. atramentosum, P. brasilianum, P. camemberti
P. coprobium, P. coprophilum, P. glandicola, P. purpurogenum
Monoterpènes Fungi
citronellène
β-myrcène
limonène
linalool
2-méthylisoborneol
P. clavigerum, P. formosanum, P. italicum, P. panamense
P. roqueforti, P. vulpinum, P. brasilianum
P. brasilianum, P. hirsutum var. venetum, P. olsonii
P. italicum, P. roqueforti, P. decumbens
P. camemberti, P. commune, P. crustosum, P. discolour, P. polonicum
Sesquiterpènes Fungi
géosmine
cyperène
germacrène B
patchoulène
β-cubébène
eremophilène
β-bisabolène
P. expansum, P. roqueforti, P. clavigerum, P. echinulatum,
P. glabrum, P. brasilianum
P. glabrum
P. roqueforti
P. hirsutum var. albocoremium, P. allii
P. roqueforti
P. expansum, P. vulpinum
22
Tableau 2. Les défauts organoleptiques dans le domaine vinicole et les molécules impliquées
Molécule Odeur Seuil olfactif
dans le vin (ng/l)
Rémanence au cours de la vinification
Références
1-octèn-3-ol Champignon de Paris
20 000 Peu dégradé durant la *FA La Guerche, 2004
1-nonène-3-one Champignon de Paris
20 Apparition durant la FA La Guerche, 2004
1-octèn-3-one Champignon frais
30 Potentiellement dégradée durant la FA
La Guerche, 2004
Géosmine Moisi, Terreux 50 Après la FA Darriet et al., 2000 2-méthylisoborneol Moisi, Terreux 55 Eliminé durant la FA La Guerche et al.,
2003 (+)-Fenchol Terreux 50 000
(dans l’eau) A un niveau inférieur au seuil olfactif
La Guerche et al., 2006
(+)-Fenchone Terreux 500 000 (dans l’eau)
A un niveau inférieur au seuil olfactif
La Guerche et al., 2006
2-méthoxy-3-isopropyl-pyrazine
Moisi 5 Rémanence partielle après la FA
Allen et al., 1991
2,4,6-trichloroanisole Moisi 3 Après la FA Alvarez-Rodriguez et al., 2002
*FA-Fermentation alcoolique
1. II. 1. 1. Composés à odeur de champignon
Plusieurs alcools et cétones sont à l’origine d’odeurs fongiques : octane-1-ol, octane-2-
ol, octane-3-ol, 1-octène-3-ol, octane-3-one, 5-octadiène-3-ol, etc., (Husson et al., 2002 ; La
Guerche et al., 2006) (Figure 4).
Le composé à odeur fongique le plus connu est un alcool avec huit atomes de carbone,
le 1-octène-3-ol, qui possède l’odeur caractéristique du champignon de Paris. Ce composé est
formé à partir du clivage de l’acide linoléique par la lipoxygenase (Husson et al., 2002).
Des champignons appartenant aux genres Botrytis, Aspergillus ou Penicillium sont
capables de produire cette odeur (Schnürer et al., 1999). Parmi les espèces isolées des raisins
pourris appartenant aux différentes régions viticoles de France, A. nigri, B. cinerea,
Coniothyrium sp., P. brevicompactum et P. thomii ont produit l’odeur de champignon
(présence de 1-octène-3-ol et 2-octène-3-one) sur milieu Malt Agar ou Jus de raisin (La
Guerche et al., 2006).
Ces composés présentent des seuils de perception très variables situés entre le ng/L et
le µg/L (La Guerche, 2004).
23
Figure 4. Composés volatils à odeur de champignon, d’après La Guerche (2004)
1. II. 1. 2. Composés à odeur moisie et/ou terreuse
Plusieurs molécules responsables d’odeurs moisies et/ou terreuses ont été décrites dans
la littérature. Parmi ces composés on peut citer des dérivés des pyrazines - 2-isobutyl-3-
methoxy pyrazine, des dérivés du fenchol - 2-éthylfenchol ou des dérivés terpéniques tels que
la géosmine et le 2-méthylisobornéol (2-MIB) (Sung et al., 2005 ; Polak et al., 1978) (Figure
5). Ces composés peuvent se retrouver dans les aliments ou peuvent participer, d’une manière
positive ou non, au goût des différents produits. La géosmine apporte une note négative au
sucre et une contribution positive à la betterave (La Guerche, 2004).
Parmi plusieurs moisissures isolées sur des raisins pourris provenant des diverses
régions viticoles de France (Bordeaux, Beaujolais, Champagne et Bourgogne) aucune n’a été
détectée comme productrice de fenchol ou fenchone (La Guerche et al., 2006).
Des composés tels que le 2, 4, 6-trichloroanisole (TCA) et le 2,3,4,6-tétrachloroanisole
(TeCA) présentent une odeur moisie. Le TCA a été retrouvé dans des bouchons de liège et
dans les vins obturés avec ces bouchons (Amon et al., 1989).
Les principaux composés à odeur de terre sont le 2-méthylisoborneol (2-MIB) et la
géosmine. Ces composés ont fait l’objet de nombreuses études car ce sont des métabolites
produits par des bactéries (actinomycètes), des algues (cyanobactéries) ou des champignons.
24
Ils ont été identifiés dans les lacs et lors de défauts organoleptiques de l’eau potable (Durrer et
al., 1999). Des études ont montré que le blé ou la betterave peuvent aussi être pollués par le 2-
MIB ou la géosmine (Jelen et al., 2003 ; Lu et al., 2003).
Figure 5. Composés volatils à odeur moisie et/ou terreuse d’après La Guerche (2004)
Ces composés résistent à la plupart des traitements effectués sur des eaux
contaminées, notamment aux oxydations chimiques (Lalezary et al., 1986). Le 2-MIB est
caractérisé par une odeur moisie, terreuse et camphrée avec un seuil de perception assez bas
(10-15 ng/L dans l’eau, 55 ng/L dans le vin rouge). Botrytis cinerea est connue comme
productrice de 2-MIB (Harris et al., 1986). Dans une solution modèle, le 2-MIB est dégradé à
80 % après seulement 7 jours à 20 °C. Après deux semaines de fermentation alcoolique, dans
un moût de Sémillon botrytisé, seulement 10 % de la concentration initiale de 2-MIB est
retrouvée . Ce composé disparaît pendant la fermentation alcoolique et donc il n’a pas d’effet
négatif sur la qualité aromatique du vin (La Guerche, 2004 ; La Guerche et al., 2006).
25
1. II. 2. LA GEOSMINE
1. II. 2. 1. Caractéristiques générales
L’odeur terreuse, produite par Streptomyces sp., a été identifiée pour la première fois à
la géosmine par Gerber et Lechevalier (1965). Le goût moisi-terreux (GMT) des vins dû à la
géosmine est une déviation organoleptique rencontrée depuis plusieurs années dans des
cépages tels que le Sauvignon, le Cabernet, le Pinot noir ou le Sémillon. Le défaut terreux est
perçu dès le niveau de la grappe de raisins. On retrouve la géosmine aussi dans des moûts
avant fermentation et sa présence est toujours associée à la récolte de vendanges partiellement
touchées par la pourriture grise (Darriet et al., 2000).
D’un point de vue chimique, il s’agit d’un sesquiterpène avec un poids moléculaire de
182 g/mol (Tableau 3). La molécule possède trois carbones asymétriques et existe ainsi sous
deux formes énantiomères : (+)-géosmine et (-)-géosmine (Figure 6). La forme (-)-géosmine
est beaucoup plus odorante (La Guerche, 2004).
Tableau 3. Propriétés physico-chimiques de la géosmine
La (-)-géosmine présente un seuil de perception variable en fonction de la solution
dans laquelle elle se trouve : 10 ng/L dans l’eau, 50 ng/L dans un vin blanc et 60 ng/L dans un
vin rouge. Ce composé a été retrouvé dans le vin de Bordeaux jusqu’à 250 ng/L (Darriet et
al., 2000).
Propriétés chimiques Formule brute C12H22O
trans-1, 10-dimethyl-9-cis-decalol Masse molaire 182,3025 ± 0,0114 g/mol
C : 79,06 %, H : 12,16 %, O : 8,78 %, Propriétés physiques
T° fusion 78 °C
T° ébullition 270 °C
Solubilité 0,55 g/L, (25 °C)
Masse volumique 0,985 g/cm-3, (20 °C) Point d’éclair 104 °C
26
Non libre de droit de diffusion
Figure 6. Structures énantiomères de la géosmine
L’odeur de terre peut être masquée par d’autres composés volatils, donc le flairage des
cultures (ou « sniffing ») n’est pas toujours suffisant (Larsen et Frisvad, 1995). Une partie des
individus n’est pas sensible à cette molécule. L’intensité du défaut diminue rapidement au
niveau du nez, mais le mauvais goût persiste dans la bouche même après avoir craché le vin.
L’odeur de terre peut être masquée dans les vins aromatiques.
Pour détecter et doser la géosmine on utilise des méthodes analytiques telles que la
Micro Extraction en Phase Solide (SPME) couplée à une chromatographie en phase gazeuse
(GC) couplée à la spectrométrie de masse (MS) (Dumoulin et Riboulet, 2004). Cette méthode
(SPME + GC-MS) a des limites de détection et de quantification respectives de 5 et 10 ng/L.
La Guerche et al. (2006) ont étudié la dégradation des principaux composés
responsables de l’odeur de terre. Seulement 20 % de géosmine est dégradée dans un moût de
Sémillon botrytisé, après deux semaines de fermentation alcoolique. Dans une solution
modèle similaire au vin, 50 % de la géosmine a disparu : à 20°C après 2 mois et à 10°C après
10 mois (Tableau 4). La transformation chimique de la géosmine donne comme résultat
l’argosmine, un produit moins odorant.
Une note de synthèse du groupe de travail ONIVINS de juillet 2005, ainsi que la revue
publiée par l’Institut Français de la Vigne et du Vin « Goûts moisi-terreux : Origine et
moyens de lutte » récapitulent les principaux moyens de prévention et de traitement du défaut
moisi-terreux dans le vignoble.
L’origine fongique de la géosmine oriente les moyens de lutte préventive, vers les
techniques habituellement mises en œuvre contre la pourriture grise : la réduction de la
vigueur, l’aération des grappes, l’amélioration de l’intégrité des baies de raisins. Seule la
combinaison de plusieurs mesures prophylactiques apporte une efficacité suffisante.
En ce qui concerne la lutte chimique, certains programmes de traitements ont donné
des bons résultats contre Botrytis. L’emploi d’un seul produit chimique par famille et par an
est impératif. L’alternance pluriannuelle des familles chimiques est fortement recommandée.
Parmi les produits chimiques homologués contre la pourriture grise on peut énumérer le
Geoxe, Teldor, Cantus ou le Sekoya, avec des matières actives diverses (phénylpyrrole,
27
hydroxyanilide, carboxamide, phényl-pyridylamine). A l’heure actuelle, aucune matière
active n’est homologuée pour limiter le développement de Penicillium.
Une fois que la géosmine est présente dans le vin, l’élimination peut se faire seulement
par fixation sur charbon ou des matières grasses ; mais ces traitements ont des conséquences
sur la qualité du vin.
Tableau 4. Caractérisation de la géosmine dans les vins
La (-)-géosmine Seuil de perception de
la géosmine dans les
vins
Propriétés physico-chimiques de la
géosmine
Terre moisie,
betterave
~ 50 ng/L
- sensibilité à la chaleur ;
- solubilité dans les graisses ;
- dégradation en conditions acides : 50 %
de la géosmine est dégradée dans 8 mois
à 10 °C dans les vins
Après pressurage et fermentation alcoolique, le vin rouge peut faire l’objet du
traitement au lait entier ou à l’huile raffinée aux pépins de raisins. Ces traitements assurent
une diminution d’environ 70 % de la géosmine. En dehors de ces produits utilisés dans le
cadre expérimental, tout autre produit est interdit.
Sur les vins blancs, l’adjonction de charbon œnologique peut permettre une diminution
de 90 % de la géosmine. Cependant, l’utilisation du charbon pour les traitements des goûts
moisi-terreux, n’est autorisée par la DGCCRF que dans le cadre expérimental et doit être
déclarée. La géosmine peut résister aux traitements conventionnels des eaux, aux traitements
physiques tels que l’adsorption sur charbon actif, ou chimiques tels que la chloration et
l'ozonation. Les traitements par électrochimie deviennentt une alternative nouvelle pour le
traitement des eaux usées contaminées par la géosmine (Li et al., 2010).
1. II. 2. 2. Voie de biosynthèse de la géosmine
La géosmine est un sesquiterpène issu de la voie des isoprénoides (Figure 7). Plusieurs
microorganismes (bactéries, algues, champignons) sont capables de produire ce composé. Le
précurseur le plus important dans la biosynthèse des métabolites volatils est l’acétate, présent
28
dans les cellules sous forme d’acétyl coenzyme A (Verscheure et al., 2002). La voie de
biosynthèse de la géosmine ainsi que les facteurs qui interviennent, ne sont pas encore
parfaitement connus.
Les terpènes constituent un groupe d’environ 20 000 composés avec une gamme large
des fonctions biologiques : pigments, hormones, antibiotiques, etc., (Davis et Croteau, 2000).
Les terpènes synthases peuvent être classées en mono-, sesqui- ou diterpènes synthases, en
ayant comme rôle la catalyse de la cyclisation du géranyl diphosphate (GPP, C10), farnésyl
diphosphate (FPP, C15) ou géranyl géranyl diphosphate (GGPP, C20).
Les sesquiterpènes synthases impliquées dans la cyclisation du farnésyl diphosphate,
ont un poids moléculaire compris entre 40 et 65 kDa et utilisent le Mg2+ comme cofacteur
(Agger et al., 2008). La farnésyl diphosphate synthase (FPS) joue un rôle important dans les
cellules eucaryotes et procaryotes. Elle catalyse la condensation consécutive du dimethylallyl
diphosphate (DMAPP) ou du géranyl diphosphate (GPP) avec l’isopentényl diphosphate pour
produire le farnésyl diphosphate (FPP). Le FPP est le carrefour dans la voie de biosynthèse
des isoprénoides.
Figure 7. Voie de biosynthèse de la géosmine d’après Cane et Watt (2003), Lamb et al. (2003), Shulz et al. (2004)
1. II. 2. 2. 1. Les terpènes synthases chez les bactéries
La géosmine est produite par les bactéries filamenteuses du genre Streptomyces dans
l’eau. Depuis longtemps, de nombreuses études ont été effectuées, au niveau moléculaire, afin
de comprendre les mécanismes de production de géosmine par les bactéries.
Cytochrome P450
Cu2+, Mg2+
29
Chez Steptomyces coelicolor un gène appelé Sco6073 (cyc2) a été identifié. Ce gène
code pour une sesquiterpène synthase à deux domaines (726 aa) dont un seul (N-terminal, 366
aa) est nécessaire pour la biosynthèse de la géosmine par l’intermédiaire du germacra-1 (10)
E, 5E-dièn-11-ol (Cane et Watt, 2003, Gust et al., 2003).
La séquence protéique de cette sésquiterpène synthase (germacradiènol synthase)
présente des similitudes avec la pentalénène synthase de Streptomyces sp. UC5319, qui est
impliquée dans la cyclisation du FPP en 3-pentalénène en présence de Mg2+. Le 3-pentalénène
est le précurseur des antibiotiques de la classe des pentalénolactones.
Cane et Watt proposent en 2003 un mécanisme de conversion du germacradiènol en
géosmine, alors que les gènes impliqués dans cette conversion n’ont pas encore été
entièrement identifiés (Figure 8). Il semble que ces gènes ne se retrouvent pas proches du
gène Sco6073 mais qu’ils peuvent être dispersés sur le chromosome de S. coelicolor.
Figure 8. A-cyclisation du FPP catalysée par la sesquiterpène synthase de S. coelicolor; B-mécanisme de conversion du germacradiènol en géosmine, d’après Cane et Watt (2003)
Des études ont été menées pour étudier la transformation du germacradiènol en
géosmine dans des conditions « in vitro ». Seulement 8 à 15 % de géosmine est formée à
partir de la quantité totale des terpènes (Jiang et al., 2007). Cela nous fait supposer que
d’autres facteurs sont impliqués dans cette synthèse. Lin et Cane (2009) ont isolé à partir de S.
Géosmine
FPP Hedycaryol Germacradiènol A
B Germacradiènol Diène bicyclique
30
coelicolor et S. albidoflavus la sesquiterpène albaflavénone présentant une odeur de terre
camphrée.
1. II. 2. 2. 2. Les terpènes synthases chez les moisissures
En 1993, Proctor et Hohn ont mis en évidence chez Penicllium roqueforti, le gène ari1
qui code pour l’aristolochène synthase. Le produit de cyclisation, la (+)-aristolochène, est un
précurseur dans la voie de biosynthèse des sesquiterpènoides, notamment des toxines telles
que la PR-toxine produite par P. roqueforti. Dans le but de mieux connaître le fonctionnement
des terpènes synthases des moisissures, la structure cristalline de l’aristolochène synthase
ainsi que le mécanisme de production, ont été déterminés (Caruthers et al., 2000) (Figure 9).
L’expression du gène à lieu en phase stationnaire de croissance de P. roquefortii, dans
le même temps que la production de la PR-toxine et il semble que sa transcription est régulée.
Ce gène contient deux introns et il existe dans une seule copie dans le génome de P.
roquefortii. L’aristolochène synthase ne contient pas la région (I, V, L)XDDXXD présente
dans toutes les FPP synthases, mais une autre séquence LXDDXXE. Cette séquence semble
être impliquée dans la liaison catalytique des ions de Mg2+ (Proctor et Hohn, 1993).
Malgré le peu de similarité au niveau de la séquence nucléotidique, la structure
tridimensionnelle de l’aristolochène synthase de P. roquefortii présente beaucoup de
ressemblance avec la pentalénene synthase de Streptomyces sp. UC5319 et la epi-
aristolochène synthase de N. tabacum. Caruthers et al., (2000) suggèrent la divergence d’un
seul ancêtre commun dans l’évolution des terpènes synthases.
Figure 9. Aristolochène - mécanisme chez P. roqueforti, d’après Caruthers et al. (2000)
L’aristolochène synthase d’Aspergillus terreus (320 aa) a été identifiée comme
enzyme de cyclisation du FPP conduisant à la formation du germacrène A (Cane et Kang,
2000). L'enzyme nécessite le Mg2+ (5 mM) en tant que cofacteur. Au niveau de la séquence
Farnésyl diphosphate Germacrène A Eudesmane Aristolochène
31
protéique une région bien conservée (riche en aspartate) a été mise en évidence, la région
LIDDVLE, qui correspond à la séquence (I,L,V)XDDXX(D,E).
Entre les séquences protéiques de l’aristolochène synthase d’A. terreus et celle de P.
roqueforti il y a 70 % d’identité avec des différences notables dans la partie N-terminal. La
comparaison de ces deux séquences suggère qu’elles ont un ancêtre commun et les deux
introns ont été présents avant la divergence de ces deux gènes, pendant l’évolution
moléculaire (Cane et Kang, 2000).
Chez Trichoderma harzianum, le gène tri5 qui code pour la trichodiène synthase (388
aa) est impliquée dans la biosynthèse des trichothécènes (Gallo et al., 2004). Les
trichothécènes sont des sesquiterpènes, des métabolites secondaires toxiques, produits par
différentes moisissures. Cette enzyme cyclise le FPP pour former le trichodiène, le précurseur
des trichothécènes.
La structure cristalline de la trichodiène synthase de Fusarium sporotrichioides a aussi
été déterminée (Rynkiewicz et al., 2001). Dans ce cas, la voie de biosynthèse qui passe par la
cyclisation du FPP pour obtenir comme produit final la toxine T2 (Gallo et al., 2004).
Certainement la cyclisation du FPP, pour former la géosmine ou d'autres terpènes,
chez les moisissures est au moins aussi complexe que chez les bactéries. L'hypothèse de
l’existence de clusters avec des gènes clés intervenant dans la cyclisation du FPP et le
cytochrome P450 doit être prise en compte dans l’étude sur la voie de biosynthèse.
32
1. II. 3. Microorganismes producteurs de géosmine
Les Actinomycètes sont les bactéries le plus souvent décrites comme productrices de
géosmine. Ces bactéries sont de fréquents contaminants de l’eau potable, mais on les retrouve
aussi dans les sols. Plusieurs espèces de Streptomyces, productrices de géosmine, ont été
décrites : S. albidoflavus, S. rishiriensis, S. antibioticus, S. aureofaciens, S. coelicolor, S.
hirsutus, S. hygroscopicus, S. murinus, etc., (Dionigi, 1995 ; Scholler et al., 2002). Ces
mêmes bactéries sont aussi capables de produire du 2-méthyl-isoborneol (2-MIB).
Les champignons se sont aussi révélés producteurs de géosmine. Chaetomium
globosum fut une des premières espèces reconnue comme productrice de ce composé.
(Kikuchi et al., 1983)
Par la suite, on a dénombré plusieurs espèces fongiques capables de synthétiser des
composés à odeur terreuse. Penicillium est le genre le plus fréquement décrit comme capable
de générer de la géosmine : P. farinosum, P. citrinum, P. camemberti, P. chrysogenum
(Pisarnitskii et Egorov, 1988), P. expansum (Mattheis et Roberts, 1992), P. aethiopicum, P.
clavigerum, P. crustosum, P. diszcolor, P. echinulatum, P. formosanum, P. hirsutum var.
venetum, P. roqueforti var. carneum (Larsen et Frisvad, 1995).
P. camemberti, P. commune, P. polonicum, P. solitum et P. vulpinum peuvent produire
du 2-MIB (Larsen et Frisvad, 1995)
Lebrun-Doaré (2005), a mis en évidence par analyse TTGE, les microorganismes
présents sur différentes grappes altérées. La population de microorganismes diffère
légèrement d’une grappe à l’autre tandis que le défaut terreux est toujours perçu. Les souches
potentiellement productrices des défauts terreux sont systématiquement présentes au sein de
la microflore du raisin sans forcément donner lieu au défaut dans le vin. Il existe d’une part,
une concentration minimale en dessous de laquelle le défaut n’est pas perceptible et d’autre
part, un état physiologique particulier des microorganismes qui permet la production de ces
molécules. Il apparait aussi que certaines conditions environnementales favorisent d’une part
le développement des souches et d’autre part, la synthèse des molécules (Lebrun-Doaré,
2005).
33
1. II. 4. Facteurs influençant la production de géosmine
La présence des microorganismes ne suffit pas pour expliquer les défauts
organoleptiques dans les vins. Les facteurs environnementaux (activité de l’eau, pH,
composition atmosphérique, agitation et température) et la composition des substrats peuvent
avoir une influence sur la production des métabolites volatils. Généralement les conditions
favorisant la croissance mycélienne, influencent positivement la production de métabolites
volatils mais ce n’est pas toujours le cas. Les sources de carbone et d’azote jouent un rôle
important dans la production des métabolites (Verscheure et al., 2002).
Une étude sur les métabolites volatils produits par 47 souches de Penicillium à mis en
évidence le fait que chaque souche est caractérisée par un profil unique d’environ 10
composés volatils. Le milieu SYES (Yeast Extract Sucrose Agar) c’est avéré à être le milieu
le plus favorable à la production de ces métabolites par rapport au milieu MEA (Malt Extract
Agar) et CYA (Czapek Yeast Autolysate Agar) (Larsen et Frisvad, 1995).
Un des facteurs climatiques à prendre en compte dans la production de géosmine par
les moisissures sont les précipitations. Elles créent les conditions optimales du développement
de la moisissure (Lebrun-Doaré, 2005).
S. tendae produit plus de biomasse et de géosmine à 30 et 40 °C, sur milieu CZA, qu’à
10 ou 20 °C, ce qui indique dans ce cas une relation entre la production de biomasse et la
production de géosmine (Dionigi et Ingram, 1994). Chez cette même espèce et chez S.
albidoflavus la production de géosmine est stimulée lorsque le milieu est supplémenté avec du
sulfate de cuivre (Dionigi, 1995).
Penicillium expansum produit plus de géosmine et moins de biomasse à 40 °C tandis
qu'à 20 °C la relation entre la quantité de biomasse et de géosmine produite est inversée
(Dionigi et Ingram, 1994). Parmi plusieurs métaux ajoutés dans le milieu de culture
(magnésium, cobalt, nickel ou cuivre) seul le cuivre augmente la production de géosmine
(Dionigi et Champagne, 1996).
D’après La Guerche (2004), P. expansum produit l’odeur de terre sur milieu MA (Malt
Agar) et sur milieu CZA (Czapek Agar). Cette moisissure ne produit pas de géosmine sur baie
de raisin. Sur milieu MA, à 5 °C et après 11 jours de culture, il y a plus de géosmine, 35
ng/boîte, qu’aux autres températures testées, 15, 25 et 35 °C, respectivement 18, 9 et 2
ng/boîte. En faisant varier le pH de 3 à 7, P. expansum produit de la géosmine sur milieu MA
à tous les pH testés mais pas sur milieu jus de raisin. L’ajout des polyphénols ou des
34
anthocyanes, dans le jus de raisin, ne favorisent pas la production de géosmine tandis que
l’acide linoléique a une influence positive. L’ajout de 100 mg/L d’acide linoléique, favorise la
production de géosmine par P. expansum (environ 31 ng/boîte).
Si la source d’azote du milieu CZA est modifiée par le NH4+, P. expansum produit de
la géosmine. Les acides aminés tels que le glutamate et la glutamine, en tant que source
d’azote dans le milieu CZA, favorisent aussi la production de géosmine. Un jus de raisin élué
(élimination des polyphénoles ; dans lequel a été ajouté de l’ammonium représente un milieu
favorable à la production de géosmine par P. expansum (20 ng/boîte) en fonction de l’isolat.
Un mélange entre un jus de raisin témoin et un jus de raisin percolé a montré qu’il y a
production de géosmine quand la proportion de jus de raisin est inférieure ou égale à 10 %.
Dans le but de se rapprocher des conditions dans lesquelles le défaut est produit, La
Guerche effectue des co-inoculations de B. cinerea (retrouvé systématiquement sur les raisins
à défauts terreux) et P. expansum ; cela sur grappe entière, rafle et baie de raisin, avec des
délais variables entre les deux inoculations. Aucun des couples formés entre les souches et les
délais d’inoculation n’ont permis la synthèse de géosmine que ce soit sur grappe, rafle ou baie
de raisin. Les seules conditions qui ont permis la synthèse ont été représentés par le jus de
raisin preinoculé avec B. cinerea ; dès que 90% d’azote a été dégradé le jus est filtré, inoculé
avec P. expansum et supplémenté en NH4+. La même expérience effectuée sur broyat de baies
de raisins a permis la production de géosmine par P. expansum (La Guerche, 2004).
Les travaux effectués entre l’Ensat, l’Itv-France, le laboratoire Exact, la société
Intelli’oeno et Syngenta en 2005, ont mis en avant la production de géosmine (de 184 à 265
ng/L) par P. expansum seul, sur grappes de raisins blessées artificiellement. Le lot témoin
contaminé avec B. cinerea n’a pas présenté d’odeur de terre (www.vitisphere.com).
Vue la variété des souches présentes sur les raisins il est possible que la géosmine ne
soit synthétisée par la moisissure, qu’à partir d’une certaine quantité de mycélium. Lebrun-
Doaré (2005) a montré que la production de géosmine était plus ou moins concomitante avec
la sporulation, donc l’état physiologique de la moisissure peut jouer un rôle très important.
Les facteurs influençant la production d’aristolochène, le précurseur de la géosmine,
par P. roquefortii ont été étudiés par Demyttenaere et al. (2002). P. roquefortii a une
production maximale de ce composé (40 ng/L) après 4 jours de culture sur milieu SAB
(Sabouraud Dextrose Agar), par rapport au milieu MEA ou PDA (Potato Dextrose Agar), ou
la production est moindre. Il semblerait qu’une augmentation du pH du milieu pourrait
augmenter la production de (+)-aristolochène. Le pH du MEA et SAB se situe entre 5,4 et 5,6
mais l’enzyme à une activité maximale à un pH entre 6,3 et 7,5.
35
1. II. 5. La microflore de la baie de raisin
La pellicule du raisin présente une microflore variée (bactéries, levures et
moisissures). Les facteurs environnementaux ou géographiques peuvent faire varier les
quantités de ces micro-organismes sur la pellicule du raisin. Une partie de cette microflore
participe aux étapes fermentaires du vin, mais des microorganismes peuvent produire des
composés organiques volatils, générant pour certains, des arômes apprécies et pour d’autres
des déviations organoleptiques, avec des molécules à seuil de perception très bas.
Parmi les bactéries on peut citer des bactéries lactiques, acétiques ou filamenteuses.
Gluconobacter sp. se développe sur le raisin précédemment contaminé par Botrytis et conduit
à la pourriture aigre (Ribéreau-Gayon et al., 2004). La Guerche et al. (2006) montre qu’en
dessous d’un pH = 6, les Streptomyces ne se développent pas sur milieu malt ou jus de raisin.
Cela exclut donc leur croissance dans le moût ou le vin.
Les levures retrouvées sur les raisins appartiennent aux genres Saccharomyces,
Rhodotorula, Kloeckera, Candida, Pichia (Ribéreau-Gayon et al., 2004 ; Lebrun-Doaré,
2005).
Parmi les altérations dues aux moisissures, on remarque le genre Cladosporium
responsable d’une pourriture vert-olive (Nair, 1985). B. cinerea produit la pourriture grise des
raisins de cuve et de table. Suite à son développement sur les feuilles, des taches brunes
peuvent être observées (Ribéreau-Gayon et al., 2004) (Figure 10).
Figure 10. Différents types de pourritures retrouvées sur les raisins, d'après La Guerche (2004)
Pourriture grise Botrytis cinerea
Pourriture bleue Penicillium sp.
Pourriture verte-noire Cladosporium sp.
36
Botrytis cinerea représente un des principaux problèmes des viticulteurs, il contamine
les raisins donc le vin et il produit des défauts organoleptiques. Le genre Penicillium fait
partie aussi des espèces qui peuvent contaminer les raisins (La Guerche et al., 2006). B.
cinerea et P. expansum sont donc les moisissures les plus fréquemment retrouvées sur les
raisins.
En dehors des déviations organoleptiques qu’elles sont susceptibles de produire, une
attention particulière doit être accordée aux moisissures car elles peuvent aussi être
responsables de la production des mycotoxines. P. expansum peut produire de la patuline.
37
1. III. METHODES D’IDENTIFICATION DES MOISISSURES
1. III. 1. Méthodes d’identification conventionnelles
Traditionnellement, l’identification des moisissures repose sur l’observation de
critères morphologiques (aspect macroscopique du mycélium et observation microscopique
des structures reproductrices) (Pitt et Hocking, 1999). Parmi les critères macroscopiques, on
prend en compte la couleur, la texture et la taille de la colonie sur différents milieux de
culture. Les colonies peuvent être duveteuses, laineuses, cotonneuses, poudreuses ou
granuleuses. L’aspect peut être plat ou plissé (Penicillium sp.). La taille des colonies est aussi
un important critère de distinction ; les colonies peuvent être petites 5-6 cm de diamètre
(Aspergillus sp., Penicillium sp.) ou envahissantes, 7-8 cm de diamètre (Botrytis sp.). L’aspect
des colonies dépend du milieu de culture.
Après étalement entre lame et lamelle, l’observation microscopique permet de mettre
en évidence le type et la taille des spores, les branchements du conidiophore. Les spores
peuvent être unicellulaires et de petite taille (Aspergillus sp., Penicillium sp.), bicellulaires
(Trichotecium sp.), pluricellulaires à cloisons transversales et longitudinales (Alternaria sp.)
ou incurvées et cloisonnées transversalement (Fusarium sp.) (Pitt et Hocking, 1999).
Cette identification nécessite une expérience confirmée dans la taxonomie des
champignons et s’avère longue et fastidieuse.
La production de métabolites est un test complémentaire à l’identification
morphologique. Les tests biochimiques en galeries API (BioMérieux) ou « FF Microplates »
(BIOLOG) avec différents substrats carbonés à métaboliser, peuvent aussi être utilisés pour la
discrimination des champignons. Ces méthodes ne permettent pas une différentiation
suffisante et nécessitent souvent la confirmation par d’autres méthodes. Ces dernières années,
de nombreuses méthodes moléculaires ont été développées afin d’obtenir des résultats fiables.
1. III. 2. Méthodes d’identification par biologie moléculaire
L’analyse directe de séquences de l’ADN a permis le développement de méthodes
d’identification faibles et spécifiques. Ces méthodes sont universellement applicables et
38
permettent d’explorer le polymorphisme aux différents niveaux (genre, espèce, souche). Ces
techniques sont rapides et présentent une bonne reproductibilité.
Afin d’être le plus discriminant possible, il est nécessaire de choisir des régions cibles
d’ADN, comportant des séquences conservées chez tous les micro-organismes, avec une
variabilité spécifique pour un genre ou une espèce. Bien que l’ADNr 18S présente ces
caractéristiques et permette de différencier des champignons de groupes taxonomiques
différents, cette région ne semble pas appropriée pour une bonne différenciation des espèces
au sein du même genre (Bruns et al., 1991). La région ITS (Internal Transcribed Spacer) est
préférentiellement utilisée par les taxonomistes pour l’identification des espèces fongiques
(Bruns et al., 1991 ; Hibbett et al., 2005).
Plus récemment, d’autres régions cibles ont été utilisées pour une discrimination au
sein de genres tels que Penicillium ou Aspergillus (Samson et al., 2004a) ; notamment des
séquences du gène de la β-tubuline, riches en introns ou le taux de variabilité semble
approprié.
1. III. 2. 1. Généralités sur les tubulines
Les tubulines constituent une famille des protéines : α (alpha)-, β (beta)-, γ (gamma)-,
δ (delta)-, ε (epsilon)-, ζ (zeta)- et η (eta)-tubulines (McKean et al., 2001). Les tubulines α et
β sont les plus répandues dans les cellules eucaryotes car elles entrent dans la composition des
microtubules. Ensemble, elles ont une masse moléculaire de 110 kDa. Les deux
hétérodimères sont alignés avec une alternance αβ pour former des protofilaments (structures
de base des microtubules) (Figure 11).
Non libre de droit de diffusion
Figure 11. Structure d’un microtubule
39
Les microtubules sont impliqués dans la mitose et participent à la structure des cils et
des flagelles. Dans le compartiment cellulaire il existe une série des fibres qui contribuent à la
forme et à la texture physique de la cellule, appelée cytosquelette. Parmi d’autres composés,
celui-ci contient des microtubules. Les tubulines, protéines ubiquitaires de la cellule
eucaryote, sont impliquées dans la division cellulaire, la motilité flagellaire et le transport
intracellulaire des vésicules et des organites.
L’intérêt porté à ces protéines est dû à leur hétérogénéité dans la cellule et dans
l’organisme, leur diversité étant liée aux différentes modifications post-traductionnelles.
1. III. 2. 1. 1. Identification des moisissures par les ββββ-tubulines
La tubuline est considérée un élément clé dans la transition des procaryotes vers les
eucaryotes (Wang et al., 1999). van den Ent et al. (2001), ont mis en évidence un homologue
de la tubuline chez les bactéries, ce qui place l’origine des tubulines avant la divergence des
procaryotes et eucaryotes. Cette ancienneté nous fait supposer que le gène de la tubuline
présente beaucoup de séquences divergentes, dû à une croissante variabilité sur une longue
période d’évolution. Mais cela n’est pas le cas pour les tubulines α et β car leur région N-
terminale est très bien conservée (Little et al., 1981). Les β-tubulines sont des marqueurs
d’espèce en bonne corrélation avec les caractères phénotypiques (Samson et al., 2004a).
Pour amplifier le gène de la β-tubuline, de nombreuses amorces sont disponibles dans
la littérature. Glass et Donaldson (1995), ont construit plusieurs sets d’amorces sur la base de
l’hybridation de l’ADN de Neurospora crassa et d’Aspergillus nidulans avec le génome de
différents Ascomycètes et Deutéromycètes. Les amorces ont pour but d’amplifier des
séquences qui contiennent plusieurs introns dans des gènes conservés. Parmi les couples
d’amorces construits, seulement ceux provenant de Neurospora crassa ont amplifié des
séquences d’ADN chez les Ascomycètes et les Deutéromycètes. Parmi les gènes cibles de
Neurospora crassa, choisis pour l’hybridation, on note le gène de la β-tubuline (Figure 12), à
partir du quel deux couples d’amorces ont été construits :
Bt1a 5’ TTCCCCCGTCTCCACTTCTTCATG 3’
Bt1b 5’ GACGAGATCGTTCATGTTGAACTC 3’
Bt2a 5’ GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 3’
Bt2b 5’ ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC 3’
40
Le couple d’amorces Bt2a et Bt2b a été choisi pour notre identification car il permet,
par analyse phylogénétique, une bonne discrimination du genre Penicillium, sous genre
Penicillium (Samson et al., 2004a).
Figure 12. Structure du gène de la β-tubuline de Neurosporra crassa utilisée pour la recherche des amorces. Les segments rayés représentent les introns. Le couple Bt1a et Bt1b amplifient un fragment de 537 pb ; Bt2a et Bt2b un fragment de 495 pb ; d’après Glass et Donaldson, (1995)
41
1. IV. LE CUIVRE
Le carbone, l’oxygène, l’hydrogène, l’azote et les métaux, en quantité beaucoup plus
faible que les éléments précédents, participent à la structuration des organismes vivants. Le
cuivre est un élément essentiel pour tout être vivant. Il est souvent présent dans les aliments.
1. IV. 1. Le cuivre dans la vigne et le sol
Le cuivre a été majoritairement utilisé dans l'agriculture. Les premières données sur
l'utilisation du cuivre en tant que fongicide datent de 1761 : la croissance des moisissures a été
inhibée sur des graines aspergées avec une solution contenant du cuivre (Borkow et Gabbay,
2005). Une grande découverte a été faite en 1880 quand Alexis Millardet a inventé la
« Bouillie Bordelaise » (Ca(OH)2 + CuSO4), contre le « mildiou » (Plasmopara viticola). Elle
contient 20 % de cuivre et on la dose généralement entre 10 et 20 g/L. L'innocuité de ce
procédé fut démontrée par Ulysse Gayon à la même période. Peu de temps après cette
découverte la « Bouillie de Bourgogne » (Na2CO3 + CuSO4) analogue à la « Bouillie
Bordelaise », a fait son apparition (Borkow et Gabay, 2005).
L’utilisation du cuivre pose des problèmes en ce qui concerne l’effet négatif sur
l’environnement. Des fortes concentrations en cuivre sont négatives pour le développement de
la vigne (Fleming et Trevors, 1989), pour le sol (Pietrzak et McPhail, 2004) ou pour l’eau
(Cane et Watt, 2003). L'effet négatif du cuivre s'est élargi aussi à la santé humaine (Araya et
al., 2003).
La culture de la vigne, en Europe centrale est issue d’une tradition de plus de 2000
ans. La vigne, dont les fruits ne constituent pas la nourriture de base, est une culture
essentielle, le pilier de la vie rurale. Le traitement au cuivre peut avoir une double action sur
la vigne issue de porte-greffes d’origine américaine. Il permet à la fois de préserver la
substance vitale en formation (synthèse des protéines à partir d’acides aminés libres et de
composés azotés) de la plante, tout en détruisant les spores de champignon (Lundsgaard et al.,
2004).
Après le traitement de la plante avec la « Bouillie Bordelaise », en fonction des
précipitations qui affectent les vignobles, une partie de cuivre est lessivé et peut s’accumuler
dans le sol. Même si dans la viticulture biologique européenne les fongicides chimiques ne
sont pas désirés, les produits à base de cuivre tels que le Cu(OH)2, 3Cu(OH)2·CuCl2, CuSO4
42
et Cu2O, sont indispensables et restent utilisés à des doses limitées, 8 kg Cu2+/ha, quantité qui
devrait diminuer à 6 kg Cu2+/ha après quatre ans de culture (EC 473/2002 ; Komárek et al.,
2010). Il semble que le transport du cuivre par les racines, aux parties supérieures de la plante,
ne soit pas important (Brun et al., 2001).
La quantité de cuivre que l’on peut retrouver sur les raisins ou sur les feuilles
représente le cuivre appliqué à une certaine période, qui n’a pas été lessivé par les
précipitations. Ces quantités dépendent surtout du nombre de traitements et de la fréquence
des précipitations. Les teneurs en cuivre, chez les plantes, sont en général comprises entre 2 et
20 mg/kg de matière sèche (Lundsgaard et al., 2004). Le cuivre est assimilé sous forme de
Cu2+.
Les baies de raisins contiennent moins de cuivre par rapport au reste de la plante. Cela
peut être dû à une plus petite surface de contact avec la « Bouillie Bordelaise ». Dans la
littérature, les données sur la quantité de cuivre retrouvée sur les raisins ne sont pas
nombreuses. Sur des raisins italiens blancs, la concentration en cuivre peut s’élever à 7,54
ppm (mg/kg), tandis que sur des raisins rouges la teneur en cuivre peut atteindre 11,32 ppm
(Garcìa-Esparza et al., 2006). Les mêmes expériences ont montré que les teneurs en cuivre de
vins italiens allaient de 0,71 mg/L pour les rouges à 1,01 mg/L pour les blancs.
En ce qui concerne le sol, l'efficacité des traitements au cuivre est de plus en plus
remise en question. Un des gros problèmes reste l’accumulation du cuivre dans le sol. S’il
faut tenir compte de la teneur en cuivre dans le sol, on doit néanmoins considérer le type de
composés qui y sont formés par le cuivre. Il apparaît que le cuivre est présent : pour 25 % à
75 % sous forme de liaisons organiques ; pour 15 % à 70 % sous forme de liaisons avec
l’oxyde de manganèse et l’oxyde de fer ; et pour 1 à 10 % sous forme de liaisons siliceuses
(Lundsgaard et al., 2004). La solubilité du cuivre dans le sol dépend du pH. A un pH inférieur
à 6, le cuivre est plus soluble et peut migrer plus facilement : ce qui peut poser des problèmes
au niveau des réseaux phréatiques (Adriano, 2001). A des pH supérieurs à 7, la matière
organique du sol est plus soluble, donc le cuivre peut former des complexes avec les
différents composés présents (Arias et al., 2006). La solubilité dans le sol, des composés à
base de cuivre, décroît dans l’ordre : CuCO3 > Cu3(OH)2(CO3)2 (azurite) > Cu(OH)2 >
Cu2(OH) > Cu2(OH)2CO3 (malachite) > CuO (tenorite) > CuFe2O4 (ferrite cuprique). Dans le
sol, le sulfate de cuivre est très soluble (Komárek et al., 2010). Parmi les formes chimiques du
cuivre, présentes dans le sol, l’ion Cu2+ est le plus toxique, comparativement aux formes
Cu(OH)+/Cu(OH)2 (Devez et al., 2005). La teneur en cuivre, dans les sols non pollués, est en
43
général de l’ordre de 30 mg/kg (Adriano, 2001). Mais cette teneur peut atteindre 1000 mg/kg
dans les sols pollués (Tableau 5).
Tableau 5. Concentration en cuivre dans les sols de vigne, d’après Komárek et al. (2010)
Pays Profondeur (cm) Cu (mg/kg) Méthode utilisée Australie 0–1 9–249 15.5 M HNO3
Australie 0–10 6–223 HNO3 + HCl Brésil 0–20 51–665 H2O2 + HClO4 + HF Brésil 0–5 37–3216 HNO3 + HClO4 + HF Brésil 0–5 433–517 HNO3 + HClO4 + HF
Bulgarie 0–10 72 HNO3 + HCl Canada 0–15 10–77 HNO3
Croatie 0–20 105–553 HClO4 + HNO3 + HCl + HF Croatie 0–10 30–700 HNO3 + HCl
République Tchèque 0–20 20–168 O2 + O3 + NOx 400 °C + HNO3 + HF France 0–10 248–378 HClO4 + HF France 0–15 14–251 HNO3 + HCl France 0–15 158 HNO3 + HCl France 2–15 144 HClO4 + HF France 0–30 22–398 HClO4 + HF France 5–10 232 HNO3 + HCl + HF France 0–10 17–34a HClO4 + HF France 0–2 323 HF France 0–10 15–430 HClO4 + HF France n.a. 32–184
(1030)b HClO4 + HF
France 0–20 57–332 LiBO2, 550 °C + HNO3
France 0–10 89–243 HNO3
France 0–25 55–115 HClO4 + HCl + HF Georgia AB horizons 137–398 HNO3 + HCl Grèce 0–30 < 157 HNO3 + HCl Italie 0–15 50–300c HNO3 + HClO4
Italie 0–30 183 n.a. Italie n.a. 215–372 HNO3 + HCl Italie 0–10 < 945 HNO3 + HCl Italie n.a. 125–155c HNO3 + HClO4
Moldovie Surface < 250 n.a. Nouvelle Zélande 0–10 4–259 (304)d HNO3 + HCl
Portugal 0–30 58–130 n.a. Slovénie 0–20 163 n.a. Slovénie 0–45 364 n.a. Slovénie 0–20 65–99 HNO3 + HCl Slovénie 0–20 87–120 HNO3 + HCl Espagne 0–20 40–301 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 179–549 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 60–560 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 35–550 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–5 42–583 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 79–130 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 25–272 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 61–434 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 55–112 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–10 125–603 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–5 42–583 HNO3 + HCl + HF Espagne 0–20 38–63 HNO3 + HCl Suisse n.a. 58–489 2 M HNO3
Thailande 0–10 115–238 Rayons X aun vignoble nouvellement planté ; bcontamination localisée aux déversements occasionnels de fongicides ; cvaleurs approximatives estimées à partir des figures ; dvigne dans l'ancien verger.
44
En Australie, sur 14 parcelles de sol de vigne testées, 8 ont présenté des concentrations
en cuivre supérieures aux concentrations autorisées (60 mg/kg), certaines allant même jusqu’à
250 mg/kg de cuivre (Pietrzak et McPhail, 2004).
Sur des échantillons de terre prélevés en Bourgogne en 2002, Parat et al. ont dosé le
cuivre jusqu’à 300 mg/kg de sol. La valeur maximale tolérée par l’Union Européenne, pour
les terres agricoles, est de 150 mg de cuivre/kg de matière sèche. Entre 50 et 150 mg/kg, la
situation est déjà délicate, mais encore acceptable (Lundsgaard et al., 2004).
Le cuivre qui s’accumule au niveau du sol a des effets sur la plante et sur la santé
humaine mais il ne faut pas oublier le but pour lequel il est utilisé ; son effet négatif sur le
développement des microorganismes et, plus particulièrement, sur les moisissures de la vigne.
1. IV. 2. L’utilisation du cuivre contre les microorganismes
Dans l’Antiquité les Egyptiens utilisaient déjà le cuivre pour « stériliser » l’eau et les
plaies. Dans plusieurs domaines, on retrouve l’addition de cuivre afin d'empêcher la
croissance microbienne.
La « Bouillie Bordelaise », produit phytosanitaire depuis 1880, est utilisée dans le but
de contrôler principalement la maladie fongique de la vigne due au ‘mildiou’ (Plasmopara
viticola) (Figure 13). Le ‘mildiou’ est le nom francisé de l'expression anglaise ‘ mildew’, nom
générique donné à une série de maladies cryptogamiques de nombreuses plantes. Sur les
feuilles tombées au sol, Plasmopara viticola se maintient principalement sous forme
d’oospores.
Ces oospores arrivent à maturité durant le printemps, germent et émettent des
zoospores qui vont aller contaminer les jeunes organes de la vigne.
Non libre de droit de diffusion
Figure 13. Feuille de vigne parasitée par le mildiou
45
Les données sur l’effet antifongique du cuivre sont nombreuses dans la littérature. A
des concentrations supérieures à 0,4 µg/mL, le cuivre-8-quinolinolate a une action fongicide
contre Aspergillus sp. qui cause des infections aux patients immunodépresseurs, d’où son
utilisation dans les hopitaux (Gershon et al., 1989). Le cuivre est efficace aussi contre une
infection fongique des pieds appelé « tinea pedis » (causé généralement par Tricophyton sp.).
Cette infection est résistante au traitement et peut se répandre sur d'autres parties du corps.
Des chaussettes imprégnées avec une solution de cuivre peuvent être utiles dans le traitement
de cette infection (Zatcoff et al., 2008).
Le cuivre est un des composés des surfaces de travail dans l'industrie agroalimentaire
car il empêche la croissance de Salmonella enterica et Campylobacter jejuni (Faundez et al.,
2004). Les systèmes de distribution d’eau potable qui contiennent du cuivre ont un plus grand
potentiel de limitation de la croissance de Legionnella pneumophila que les tubages systèmes
en alliage ferreux ou en plastique (Borkow et Gabbay, 2005). Si les composés antibactériens
sont mélangés avec du cuivre leur effet augmente (Sau et al., 2003).
Le cuivre, à des concentrations de 0,16 mM à 1,6 mM peut inactiver jusqu'à 50 %, le
virus de l'immunodéficience humaine (HIV-1). L’inactivation passe par la dégradation de
l’ARN. Afin que l'ARN du virus puisse être attaqué par le cuivre la capside doit d'abord être
coupée. Des agents oxydants sont impliqués dans la dégradation de la capside afin que l'ARN
soit dénaturé par le cuivre (Borkow et Gabbay, 2005).
Le sulfate de cuivre est également utilisé pour le contrôle des écumes d'algues dans les
étangs de ferme, les champs de riz, les canaux d'irrigation et de drainage, les rivières, les lacs
et les piscines. Depuis 1838 il est efficace pour préserver le bois. Le cuivre agit contre les
serpents dans les eaux à différents niveaux d'alcalinité (Borkow et Gabbay, 2005).
1. IV. 3. Facteurs qui peuvent influencer la biodisponibilité du cuivre
Avant de comprendre les mécanismes de toxicité du cuivre sur la cellule, il faut
d’abord mentionner les facteurs qui peuvent influencer la biodisponibilité du cuivre. Gadd et
Griffiths (1978) ont mis en évidence les facteurs qui peuvent influencer la toxicité des
46
métaux. Dans le sol, le métal peut être lié a différents composés tels que l’acide humique ou
l’argile. Cet état peut diminuer la toxicité du métal.
Des composés tels que le citrate, la cystéine, le glutamate ou l’EDTA peuvent aussi
diminuer les effets toxiques d’un métal, quand ils sont ajoutés à un milieu de culture. En
présence du citrate, Aerobacter aerogenes a pu se développer à 200 ppm de cadmium, tandis
qu’en présence de glucose, aucune croissance n’a été détectée (Pickett et Dean, 1976). La
liaison du cuivre avec ces composés est une explication à la diminution de la toxicité du
métal.
Le pH a un rôle important dans la biodisponibilité du métal. A un pH acide les métaux
sont à l’état de cations libres tandis qu’à un pH alcalin les cations précipitent sous la forme
d’oxydes ou d’hydroxydes insolubles. Le pH auquel les métaux précipitent dépend du métal
et de ses états d’oxydation. L’état oxydé du cuivre est favorisé par un pH élevé.
Généralement, un pH bas va augmenter la disponibilité des ions métalliques.
Autres conditions à prendre en compte, ce sont les interactions entre les ions. Paton et
Budd (1972) ont montré que l’assimilation du zinc par Neocosmospora vasinfecta est
influencée par les ions de magnésium qui agissent en tant qu’inhibiteurs compétitifs.
L’assimilation du cobalt par Neurospora crassa est aussi inhibée par le magnésium
(Venkateswerlu et Sastry, 1970).
Chez Trichoderma viride, la bioaccumulation du cuivre dépend fortement de la
température et du pH, les conditions optimales étant 30°C et pH 5. Les concentrations
inhibitrices différent d’un milieu à l’autre. La teneur en cuivre tolérée pour la croissance de
Trichoderma 5000 mg/L de Cu (II) sur un milieu solide tandis que sur un milieu liquide (plus
grande biodisponibilité du cuivre) la concentration maximale tolérée est de 200 mg/L (Anand
et al., 2006). La culture en milieu liquide d'Acremonium pinkertoniae, aux mêmes
concentrations en cuivre, conduit à une plus faible accumulation de cuivre par le mycélium
(Zapotoczny et al., 2007). Parmi différentes sources de cuivre utilisées (CuSO4·5H20, CuCl2,
Cu(NO3)2 et CuCO3) seul le CuSO4·5H20 a contribué à la production maximale d’acide
citrique par Aspergillus niger grâce au fait que le sulfate de cuivre libère le plus d’ions de
Cu(II) (Haq et al., 2002).
De tout cela, on peut déduire que la biodisponibilité du cuivre dépend de nombreux
facteurs, qu’elle est propre à chaque situation (ensemble des conditions environnementales :
composition du milieu, température, pH, aw, …) et varie suivant le type de microorganisme.
47
Parfois tous ces facteurs peuvent avoir l’effet inverse, augmenter la toxicité du métal
(Gadd et Griffiths, 1978).
1. IV. 4. Mécanismes de toxicité du cuivre
Les métaux, à des concentrations élevées, sont toxiques pour les organismes. Il existe
plusieurs types de mécanismes de toxicité du cuivre :
- le cuivre interagit avec les acides nucléiques et dénature leur structure hélicoïdale ;
- le potentiel d'oxydoréduction du cuivre (Cu+2 ↔ Cu+1) catalyse la production de
radicaux libres qui peuvent dénaturer protéines, lipides et autres bio-molécules ;
- le cuivre peut intervenir dans le déplacement des métaux essentiels de leurs sites
d'action, ce qui conduit à l'oxydation, la mutation ou la dénaturation des protéines
(Borkow et Gabbay, 2005) (Figure 14).
Figure 14. Les mécanismes de toxicité du cuivre au niveau de la cellule, d’après Borkow et Gabbay (2005)
La première structure sur laquelle le cuivre agit au niveau de la cellule, c’est la
membrane cellulaire. Il a été montré que l'exposition de moisissures et de levures à des
concentrations élevées en cuivre, dénature l'intégralité de leurs membranes cellulaires ce qui
entraîne la perte des solutés et la mort (Cervantes et Gutierrez-Corona, 1994). 100 µM de
CuCl2 peuvent causer une diminution de perméabilité de la membrane cellulaire de
Saccharomyces cerevisiae en moins de 2 min à 25 °C (Saitoh et al., 2009). Le cuivre peut
48
former des liaisons électrostatiques avec des régions chargées négativement de la membrane
cellulaire du microorganisme.
La composition en lipides semble jouer un rôle important dans le mécanisme de
toxicité du cuivre. Les membranes cellulaires des microorganismes différent par leurs
compositions en lipides. Cela implique donc un niveau de résistance différent pour chaque
microorganisme. Dans des cultures enrichies avec des acides gras polyinsaturés, la
perméabilité de la membrane cellulaire de Saccharomyces cerevisiae et la toxicité qui en
découle sont considérablement accrues en présence de cuivre, par rapport à des cellules
témoin (Avery et al., 1996).
Une fois que le cuivre est entré dans la cellule, il peut dénaturer l’ADN. Les études
montrent que la double hélice de l'ADN contient au moins deux types de sites de liaison pour
le cuivre. Le premier site est présent tous les quatre nucléotides et a une grande affinité pour
le cuivre, le deuxième, saturable avec une Kd = 41 µM de Cu2+, est un site intercalé présent
sur chaque nucléotide (Borkow et Gabbay, 2005). Le cuivre peut aussi altérer le
fonctionnement des enzymes.
1. IV. 5. Mécanismes de résistance au cuivre
1. IV. 5. 1. Généralités
La résistance est définie comme la capacité d’un microorganisme de survivre à une
certaine concentration d’un métal, par le biais d’un mécanisme développé comme réponse
directe à la toxicité.
A partir d'une certaine concentration (dite ‘toxique’), pour survivre, la cellule doit
absolument développer des mécanismes de résistance à certains métaux. Ces mécanismes sont
en relation avec un métal donné, mais ne sont pas automatiquement capables de permettre la
survie en présence d’un autre métal. Cela peut dépendre de facteurs environnementaux.
Néanmoins, d’un point de vue général, les métaux qui deviennent toxiques pour les
microorganismes constituent aussi une part de leurs micronutriments essentiels.
Les concentrations en cuivre nécessaires au developpement de microorganismes sont
ainsi de l'ordre de 1 à 10 µM (Cervantes et Gutierrez-Corona, 1994).
49
Figure 15. Les mécanismes de résistance au cuivre développés par la cellule, d’après Borkow et Gabbay (2005)
1. IV. 5. 2. La résistance au cuivre des bactéries
Les mécanismes de résistance au cuivre, connus chez les bactéries, incluent :
l'exclusion par la membrane cellulaire, la séquestration intra ou extracellulaire, l’efflux
membranaire actif, la détoxification enzymatique, la réduction de la sensibilité des composés
cellulaires aux ions métalliques (Borkow et Gabbay, 2005).
L'exclusion par la membrane cellulaire
Une fois entré dans la cellule, en fonction de sa concentration, le cuivre devient
toxique : des altérations de la membrane cellulaire augmentent sa perméabilité et, donc,
participent à l'exclusion du métal. Les bactéries sont aussi capables de former une enveloppe
de nature polysaccharidique pour se protéger de la toxicité du métal. Ce mécanisme a été mis
en évidence chez Klebsiella aerogenes pour se défendre des concentrations excessives de
cadmium (Scott et Palmer, 1990).
Les études génétiques menées sur les bactéries, ont mis en évidence l'existence d'un
opéron de quatre gènes copA, copB, copC et copD, chez Pseudomonas sp., qui intervient dans
la liaison du cuivre au périplasme (Cooksey, 1994).
50
La séquestration intra- et extracellulaire
Dans la cellule, des protéines spécifiques peuvent former des complexes avec le métal.
Dans le cas de Synechococcus sp., le gène smtA, présent chez cette bactérie, code pour une
métallothionéine (protéine riche en cystéine) qui se lie au métal, seulement en présence de
fortes quantités de cuivre, de cadmium ou de zinc (Rouch, 1995).
La séquestration extracellulaire a été plutôt décrite chez les levures et les moisissures.
Le transport actif à l'extérieur de la cellule
Les bactéries sont capables de développer des mécanismes de résistance qui
impliquent le transport actif du métal, du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule. Le transport
est mis en place grâce aux mécanismes d'efflux de l'ATPase (Saitoh et al., 2009).
La détoxification enzymatique
Chez Pseudomonas synxantha, en aérobiose ou en anaérobiose, le Cr+6 toxique est
réduit en Cr+3, un précipité insoluble, Une enzyme soluble contenue dans la cellule intervient
dans cette réduction (Borkow et Gabbay, 2005).
La réduction de la sensibilité au métal
Dans le bût de diminuer la sensibilité au métal, des mutations peuvent intervenir dans
la cellule bactérienne et cela n'altère pas les fonctions cellulaires. La cellule est aussi capable
d'alterner les différentes voies dans son métabolisme pour contourner les composants
sensibles. Le microorganisme peut se défendre par la production de composés résistants au
métal (Borkow et Gabbay, 2005).
Les mécanismes de réparation de l'ADN peuvent aussi protéger la cellule de l'effet
négatif du métal. Cela a été montré dans le cas du cadmium, l'ADN d’Escherichia coli en
présence de ce métal a souffert d’altérations. Après subculture, toujours en présence de
cadmium, le microorganisme développe une résistance ; et l'augmentation de la phase de
latence pour la croissance est considérée comme une période nécessaire pour réparer l'ADN
endommagé (Borkow et Gabbay, 2005).
1. IV. 5. 3. La résistance au cuivre des champignons
Par rapport aux bactéries, les champignons présentent des similarités, mais aussi des
différences, au niveau des mécanismes de résistance au cuivre. En liaison avec la complexité
51
de la cellule eucaryote, des levures (Rhodotorula) et des moisissures (Penicillium,
Trichoderma, et Mucor), isolées de sites contaminés, sont résistantes au cuivre grâce à leurs
propriétés intrinsèques et non pas à l'adaptation (Arnebrant et al., 1987).
Les mécanismes de résistance au cuivre des moisissures incluent : la liaison par la
paroi cellulaire, l'assimilation du métal par la cellule, la chélation intra ou extracellulaire
(Cervantes et Gutierrez-Corona, 1994).
La liaison par la paroi cellulaire
Pour se protéger de l'effet toxique du cuivre, les moisissures peuvent adsorber le métal
à la paroi cellulaire. Cette paroi est constituée de polysaccharides tels que le chitosan et la
chitine. La liaison du cuivre aux composants de la paroi est un processus rapide (de l'ordre de
quelques minutes) qui a été mis en évidence chez Candida utilis (Khovrychev, 1973).
Rhizopus stolonifer et Cunninghamella blakesleeana sont des souches considérées
comme résistantes au cuivre, car, au niveau de leur mycélium, elles accumulent davantage de
cuivre que des souches sensibles (Garcia-Toledo et al., 1985). Cela est dû au fait que leur
paroi contient une plus forte proportion de chitosan (Bartnicki-Garcia, 1968).
Ce type de mécanisme a aussi été décrit chez Acremonium pinkertoniae (Zapotoczny
et al., 2007), espèce qui peut accumuler le cuivre, jusqu'à 20 % de son poids sec. Par
formation de liaisons avec les atomes d’azote et d’oxygène des amides et les radicaux
hydroxyles des polysaccharides, les ions cuivre sont incorporés dans le complexe glucane-
chitine de la paroi. Cette moisissure, cultivée dans des milieux à fortes concentrations en
cuivre, développe (dès 100 mg de cuivre/kg de milieu) une biomasse de couleur bleue. Le
mycélium, très condensé et peu cloisonné, devient bleu : les hyphes gonflent, la paroi voit son
épaisseur initiale multipliée jusqu'à 7 fois. Quand les hyphes atteignent 50 µm d'épaisseur, les
structures métallo-cristalloïdiques de la paroi d’Acremonium pinkertoniae deviennent visibles.
A partir de 150 mg de cuivre /kg de milieu solide, il n'y a plus de formation de conidies.
En présence d'une concentration en CuCl2·2H2O de 100 mg/L de milieu, la biomasse
de Trichoderma viride (3,4 g) accumule 81 % du cuivre en 72h. Les observations
microscopiques ont montré que le cuivre forme une couche à la surface de la paroi cellulaire
(Figure 16) (Anand et al., 2006).
52
Figure 16. Images au microscope électronique des cellules de Trichoderma viride, A-témoin, B-cuivre à la surface de la cellule, d'après Anand et al. (2006) Mucor rouxii accumule du cuivre sur la paroi cellulaire mais aussi à l’intérieur de la
cellule. Les souches résistantes au cuivre sont capables d’accumuler 10 fois plus de cuivre
que la souche témoin. Dans le cas de cette espèce, le cytosol joue un rôle important dans la
résistance au cuivre, mais quand la concentration du métal augmente fortement, c'est la paroi
cellulaire qui accumule le plus de cuivre (Ramirez-Salgado et al., 1996) (Tableau 6).
Tableau 6. Cuivre retrouvé dans les fractions cellulaires de la souche sensible (IM-80) et celles résistantes (P1 et P3) au cuivre, de Mucor rouxii, d'après Ramirez-Salgado et al. (1996)
Souche
Cuivre récupéré (nmol/mg poids sec)
Paroi cellulaire Cytosol et
membranes Culture dans 1,6 µM CuSO4
IM-80 P1 P3
Culture dans 3,2 µM CuSO4
IM-80 P1 P3
0,30±0,05 3,40±0,40 2,80±0,50
42,60±5,00 77,50±9,00 65,00±8,00
0,20±0,03 3,00±0,35 2,10±0,30
38,60±4,50 59,70±8,00 53,30±7,00
L'assimilation dans la cellule
Peu d'informations existent sur l'assimilation et le transport du cuivre à l'intérieur de la
cellule, en raison d’un manque de radio-isotope approprié du cuivre (Cervantes et Gutierrez-
Corona, 1994). L'assimilation du cuivre dans la cellule est plus lente que l’intégration à la
A B
53
paroi cellulaire. Les températures basses, les analogues du glucose ou le pH acide peuvent
inhiber ce processus d’internalisation du cuivre (Gadd, 1986). Une fois que le cuivre est
assimilé dans la cellule, il est possible qu’il se dépose aussi sur la paroi des organites
intracellulaires.
Chez Saccharomyces cerevisiae, l’assimilation du cuivre peut être inhibée par le
potassium dans un rapport stœchiométrique d’une mole de cuivre pour deux moles de
potassium (De Rome et Gadd, 1987).
Phelan et al. (1990) ont montré que la résistance au cuivre d’Aspergillus nidulans est
due à la mutation d’un gène dont deux loci différents ont été décrits, cupA et cupB. Le
mécanisme lié à ces gènes est expliqué par la restriction de l’assimilation du cuivre par la
cellule, car la germination ne semble pas affectée par le cuivre. Néanmoins, pour élucider le
mécanisme exact de l’assimilation, de fortes concentrations en cuivre doivent être testées, ce
qui n’a pas encore été le cas pour A. nidulans.
L’imperméabilité membranaire qui peut se traduire par une restriction de
l’assimilation du cuivre semble expliquer la résistance à ce métal pour le genre Penicillium
(Basu et al., 1955).
La formation des chélates intra- et extracellulaires
Pour résister aux fortes concentrations en cuivre, les moisissures peuvent former des
métallothionéines (protéines riches en cystéine). Ce type de mécanisme à été étudié, en
profondeur, par biologie moléculaire. Les études menées par Brenes-Pomales et al. (1955),
ont mis en évidence l’existence d’un gène appelé CUP1 associé à la résistance au cuivre chez
Saccharomyces cerevisiae. L’expression de ce gène dépend d’un facteur de transcription
ACE1 codé par le gène CUP2. La partie N-terminale du ACE1 contient des résidus de
cystéine qui forment des thiolates de cuivre. Mucor rouxii contient des séquences d’ADN
homologues à la séquence CUP de Saccharomyces cerevisiae, mais leur rôle dans la
résistance au cuivre n'a pas encore été élucidé (Ramírez-Salgado et al., 1996).
Les microorganismes peuvent produire du H2S qui peut former des composés
insolubles avec le métal (Gadd et Griffiths, 1978).
Les moisissures résistantes au cuivre produisent des oxalates qui peuvent précipiter le
métal par la formation des cristaux d’oxalate de cuivre (Borkow et Gabbay, 2005). Postia,
Wolfiporia, Meruliporia, Gloeophyllum, Laetiporus, Coniophora, Antrodia, Serpula et
Tyromyces produisent de l'acide oxalique, comme mécanisme de résistance au cuivre
54
(Borkow et Gabbay, 2005). La chélation du cuivre par l’acide oxalique pose un problème
pour la préservation du bois.
Autres mécanismes de résistances
La production d’acide citrique est aussi une réponse de la moisissure envers la toxicité
du cuivre. Le cuivre augmente la production d’acide citrique par Aspergillus niger (Haq et al.,
2002).
Chez Botrytis cinerea, des ATPases impliquées dans le transport intracellulaire du
cuivre, en particulier vers les protéines, ont été mises en évidence (Saitoh et al., 2009).
Par des mécanismes qui n'ont pas encore été élucidés, P. expansum produit plus de
biomasse, de spores et de géosmine, en présence du cuivre. Le cuivre n'est pas accumulé par
les cellules de P. expansum tandis que, parmi d'autres métaux testés, le cobalt est accumulé
par la moisissure, mais sans qu’il induise le même défaut organoleptique que le cuivre
(Dionigi et al., 1996). A la différence d’autres métaux, il est possible que le cuivre active
certains processus métaboliques chez P. expansum et que les mécanismes de résistance soient
développés seulement à partir d'une certaine concentration.
1. IV. 5. 4. Quelques données sur la résistance des moisissures aux métaux
En Inde, sur des sols contaminés par des métaux lourds véhiculés par des eaux usées,
des moisissures des genres Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Geotrichum, Penicillium,
Monilia, Rhizopus et Trichoderma ont été isolées. Elles peuvent faire partie des
microorganismes tolérants aux métaux lourds. Néanmoins, la tolérance aux métaux chez les
moisissures dépend de l’isolat, mais aussi du métal.
On note que les concentrations minimales inhibitrices de certains métaux peuvent
globalement se hiérarchiser de manière suivante : Cu > Cr > Cd > Co > Ni (Zafar et al., 2007)
(Tableau 7).
On en conclut alors que la variation de la tolérance à un métal ou à un autre peut être
due aux différents mécanismes de résistance développés et aussi aux nécessités de la cellule
(des protéines) pour un métal donné.
La résistance microbienne au cuivre est un phénomène complexe : il y a beaucoup
d'interactions à prendre en compte entre microorganisme et environnement. Il est évident que
55
la résistance observée dans les conditions du laboratoire n’est pas toujours comparable avec la
résistance « au champ » en raison de nombreux facteurs qui peuvent y intervenir.
Tableau 7. Concentrations inhibitrices des différents métaux, d'après Zafar et al. (2007)
L’étude des moisissures tolérantes au cuivre peut déboucher sur des applications : ces
moisissures peuvent être utilisées dans des systèmes de détoxification et donc de récupération
des métaux (par lixiviation) ou dans la sélection de nouveaux composés fongicides.
Souche
Concentration minimale inhibitrice (MIC)
(mg/mL)
Cobalt Chrome Cuivre Cadmium Nickel
Alternaria sp.
Aspergillus sp.1
Aspergillus sp.2
Fusarium sp.
Geotrichum sp.
Monilia sp.
Penicillium sp.
Rhizopus sp.
Trichoderma sp.
1,0
0,7
3,0
2,0
0,1
0,1
5,0
5,0
4,0
0,9
0,9
5,0
5,0
0,6
0,3
7,0
7,0
6,0
2,0
2,0
4,0
3,0
0,7
0,6
8,0
9,0
4,0
1,0
0,7
4,0
3,0
0,2
0,3
0,9
0,6
2,0
1,0
0,1
0,2
5,0
5,0
3,0
4,0
3,0
3,0
56
1. V. MODELISATION DE LA CROISSANCE FONGIQUE
Aujourd’hui, un grand intérêt est porté à la maîtrise de la contamination des produits
alimentaires par les moisissures. Cela est dû à l'apparition continue des nouveaux produits et
des procédés de fabrication et de conservation. Pour assurer une sécurité des aliments qui peut
répondre aux attentes des consommateurs, les matières premières et les produits alimentaires
obtenus doivent présenter le risque microbiologique le plus faible. Dans des conditions
favorables, les moisissures se développent et produisent un grand nombre des métabolites
secondaires. Le problème pour certaines, est la production des mycotoxines. Cela conduit
donc à des pertes économiques pour les agriculteurs et les industriels et représente un danger
pour la santé des consommateurs (Dantigny, 2004).
La mycologie prévisionnelle a pour but de prédire le développement des moisissures
dans les produits alimentaires contaminés (Dantigny et al., 2003). La vitesse de
développement des microorganismes est évaluée par l’élaboration des modèles
mathématiques.
Un produit alimentaire est contaminé au moment où l’on commence à voir les hyphes.
Pour empêcher le développement de la moisissure et l’altération des aliments, les études
doivent se centrer sur les effets de la variation des différents facteurs environnementaux,
comme l’activité de l’eau, la température et le pH, sur la germination et la croissance.
On distingue deux types de modèles : d’une part, les modèles primaires, qui décrivent
la cinétique d'évolution (y=f(t)) d'une population de microorganismes dans un environnement
donné ; d'autre part, les modèles secondaires, qui décrivent les effets de facteurs
environnementaux sur les paramètres des modèles primaires.
1. V. 1. Modèles primaires
Les paramètres biologiques tels que le temps de germination ou le taux de croissance
radiale, sont calculés à l’aide de différentes équations (Dantigny et al., 2006a, 2006b). La
distribution du taux de croissance radiale et du temps de latence des spores individuelles nous
apportent des informations sur le développement d’une moisissure (Simbarache, 2006).
57
1. V. 1. 1. Modèles de germination
Les spores doivent être examinées à des intervalles de temps réguliers afin de
construire une courbe de germination : P (%) = f (t) (Dantigny et al., 2003) :
Le modèle de Gompertz :
P = Aexp (-exp [(µme (1)/A) (λge -t) + 1]) (1)
où A (%) représente la valeur de P asymptotique pour t → +∞ ; µm (h-1) est la pente de la ligne tangente qui passe
par le point d’inflexion (ti) ; λge (h) est l’axe de t interceptée par la tangente et t (h) le temps. Le point d’inflexion
est défini par la formule : ti = δ + A/ (µme (1)).
Le modèle logistique :
P = Pmax/1+exp [k (τ - t)] (2)
où Pmax (%) est la valeur de P asymptotique pour t → +∞ ; k (h-1) est la pente de la ligne tangente qui passe par le
point d’inflexion ; τ (h) représente le point d’inflexion ou P est la moitié de Pmax et t (h) le temps.
Le modèle logistique est symétrique par rapport au point d’inflexion, contrairement au
modèle de Gompertz (Dantigny et al., 2006b).
Le modèle asymétrique :
P = Pmax (1-(1/(1+(t/τ)d))) (3)
où Pmax (%) est la valeur de P asymptotique pour t → +∞ ; τ (h) est le temps de germination et d, un paramètre de
conception.
Ce modèle est dérivé du modèle d’inhibition non-compétitive décrit par Yano et Koga
(1973) et permet de décrire tous les types de courbes de germination (Dantigny et al., 2011),
par conséquence il peut remplacer le modèle de Gompertz et le modèle logistique.
58
1. V. 1. 2. Modèles de croissance
Après la germination des spores, des mycéliums sont visibles à l’œil nu. Le suivi de la
croissance fongique est alors assuré par la mesure du diamètre de la colonie. Un modèle
primaire a été adapté aux champignons pour suivre la croissance (Barayni et al., 1993). Une
équation linéaire a permis l’estimation de la croissance radiale des colonies des champignons
de manière plus précise.
r = µ (t-l) (4)
où r (mm) est le rayon de la colonie ; l (h) le temps de latence et µ (mm/j) le taux de croissance radiale de la
colonie ; elle est définie comme étant la pente de la courbe.
1. V. 2. Modèles secondaires
Parmi les facteurs environnementaux, l’aw et la température ont la plus grande
influence sur la croissance des moisissures (Dantigny et al., 2005a).
1. V. 2. 1. Modèles cardinaux
Les modèles cardinaux sont nés sur la base de deux critères : un minimum de
paramètres avec une signification commune pour les microbiologistes (critère de parcimonie),
obtention des résultats réels sur le domaine d’étude choisi (critère de consistance). Le premier
facteur intégré dans ce modèle a été la température (Rosso, 1993).
Le modèle température montre la relation entre le taux de croissance et la température (µ =
f(T)) :
où µopt (mm/j) représente le taux de croissance pour T = Topt ; Tmin, Topt et Tmax (°C) ce sont les températures
cardinales.
Le modèle activité de l’eau a été adapté par Sautour et al. (2001a), pour décrire la relation
entre le taux de croissance et l’activité de l’eau (µ = f(aw)) :
µopt(Tmin-Tmax)(T-Tmin)2
(Topt-Tmin)[(Topt-Tmin)(T-Topt)-(Topt-Tmax)(Topt+Tmin-2T)] µ = (5)
59
où µopt (mm/j) représente le taux de croissance pour aw = awopt ; awmin, awopt et awmax ce sont les activités de l’eau
cardinales.
1. V. 2. 2. Modèles d’inactivation
- le modèle utilisé pour décrire le taux de croissance en fonction du cuivre est dérivé du
modèle d’inhibition non-compétitive décrit par Yano et Koga (1973) :
où µopt (mm/j) représente le taux de croissance pour Cu = 0, Cu50 est la concentration en cuivre pour laquelle µ =
µopt/2 et p, un paramètre de conception lié à la courbe.
- le modèle utilisé pour décrire l’influence du cuivre sur le temps de latence est une équation
Monod re-paramétrée (Dantigny et al., 2005a ; Dantigny et al., 2005b) :
où λopt (h) est le temps de latence pour Cu = 0, Cu200 est la concentration en cuivre pour laquelle λ = 2 λopt et
MIC est la concentration minimale inhibitrice de cuivre pour un temps de latence infini.
1. V. 2. 3. Modèles polynomiaux
La matrice factorielle de Doehlert
Cette approche consiste à établir un plan d’expériences pour l’ensemble des facteurs
considérés (température, activité de l’eau, etc.), dans un domaine expérimental bien défini.
Les aptitudes de croissance sont évaluées pour chaque combinaison de conditions
environnementales, par l’intermédiaire d’un paramètre tel que le taux de croissance. Un
µopt(awmin-awmax)(aw-awmin)2
(awopt-awmin)[(awopt-awmin)(aw-awopt)-(awopt-awmax)(awopt+awmin-2aw)] µ = (6)
(7)
(8)
60
modèle polynomial est alors ajusté par régression sur l’ensemble des données, ce qui permet
d’estimer la valeur des coefficients du modèle (Buchanan et Phillips, 1990). L’approche
polynomiale présente donc un intérêt fondamental lorsqu’il s’agit d’évaluer de façon
objective le caractère significatif des effets de chaque facteur et de leurs interactions. Il est
impératif de définir un domaine expérimental car toute extrapolation en dehors de la plage
expérimentale est inadéquate. La matrice de Doehlert permet la description d’une région
autour d’une réponse optimale et contient k²+k+1 points pour k facteurs.
Modèle de Fang
En utilisant la méthodologie des plans d'expériences, Fang et al. (1994), ont étudié
l'effet inhibiteur de la concentration en chitosan et de la teneur en sucre (°Brix), sur la
croissance d'Aspergillus sp. dans des écorces de fruits. Un modèle polynomial du second
ordre a été généré pour observer la croissance :
y = a + b[chitosan] + c(°Brix) + d [chitosan]2 + e [chitosan](°Brix) + f(°Brix)2
La limite du modèle établi est liée à sa structure qui empêche toute extrapolation en
dehors du domaine expérimental exploré.
Modèle de Gibson
Gibson et al. (1994) ont modélisé l’effet de l'activité de l'eau sur la croissance
d’Aspergillus flavus, A. oryzae, A. parasiticus et A. nomius. Le modèle appliqué a été le
suivant :
ln g = C0 +C1bw + C2bw2 avec bw = √(1 – aw)
où C0, C1 et C2 sont des constantes calculées par régression et g le taux de croissance maximum (la
transformation logarithmique permet de stabiliser la variance). La transformation de l'aw en bw permet de
représenter les données sous la forme d'une simple courbe.
La limite du modèle repose sur le nombre trop faible de facteurs pris en compte et le
fait qu'il ne permet pas d'estimer l'awmin de croissance. Enfin, contrairement aux modèles
(9)
(10)
61
cardinaux, les paramètres µopt et awopt n’apparaissent pas dans l'équation mais sont calculés,
une fois les constantes (C0, C1 et C2) estimées par régression.
1. V. 3. Validation des modèles prévisionnels
Les statisticiens associent la notion de prédiction à l’estimation des valeurs théoriques
comparées par la suite aux valeurs observées. Lors d’une approche agro-industrielle, à la
démarche de simulation, s’ajoute une connaissance liée à l’écologie microbienne des produits
et des procédés, nécessaire pour garantir une utilisation de l’outil adaptée à la réalité. Cette
analyse est spécifique du produit, de la fabrication et du stockage.
62
PARTIE 2 MATERIELS ET METHODES
63
2. I. MICROORGANISMES ET MILIEUX DE CULTURE
2. I. 1. Échantillonnage et dénombrement des moisissures
Des grappes de Pinot Noir ont été prélevées sur des parcelles de la commune de
Morey-St Denis (Côte d’Or), à l’automne 2007. Chaque grappe à été pesée et ensuite lavée
pendant une heure, dans un volume d’eau physiologique + Tween 80 (NaCl/eau distillée, 0,9
%, m/v ; 0,1 %, v/v), de même poids, pour mettre en suspension les micro-organismes
présents à la périphérie des baies. A partir des dilutions de 10-1 à 10-8, de chaque suspension
de lavage, des fractions de 0,1 mL ont été étalées au râteau sur milieu gélosé au Dichloran-
rose Bengale (King et al., 1979) et incubées à 25°C. Après 7 jours d’incubation, les
moisissures ont été dénombrées et isolées en culture pure.
2. I. 2. Milieux de culture, inoculation et dispositif d’incubation
Les moisissures ont été entretenues sur gélose glucosée à l’extrait de pomme de terre
(PDA, Potato Dextrose Agar, Biokar Diagnostics) à 25°C.
L’’identification des moisissures a concerné le genre Penicillium car certaines espèces
sont responsables de la production de géosmine (Larsen et Frisvad, 1995). Les critères
morphologiques, macroscopiques et microscopiques, ont été observés sur milieu gélosé de
Czapeck (CZ-broth, Difco ; solidifié par de l’agar 15 g/L). Le milieu CREA Agar, à base de
créatine 0,3 % (m/v), a été préparé d’après les données de Samson et Frisvad (2004b), pour
l’étude de la production d’acide par les souches de Penicillium, test complémentaire à
l’identification morphologique. Pour l’extraction d’ADN, en vue de l’identification par
biologie moléculaire, les souches de Penicillium ont été ensemencées sur milieu PDB (Potato
Dextrose Broth, AES Laboratoires). Les cultures ont été incubées pendant 7 jours à 25°C.
Afin de déterminer les valeurs cardinales de température pour B. cinerea et P.
expansum, on a utilisé le milieu PDA à une activité de l’eau (aw) de 0,99 et différentes
températures d’incubation de 2, 5, 7, 8, 12, 15, 18, 20, 28 et 30°C. Pour les valeurs cardinales
d’aw, la température d’incubation a été maintenue à 25°C, tandis que le milieu PDA a été
ajusté à 0,99, 0,97, 0,95, 0,93, 0,91, 0,89, 0,87, 0,85 aw. Les aw ont été déterminées avec
AquaLab CX2T (Decagon, Devices, Pullman, WA, USA).
64
Les milieux au jus de raisin « naturel » (Benoît Portellia, Dellet, France) et
« synthétique », pour l’étude de la validation du modèle prédictif de croissance, ont été
préparés d’après Paterki et al. (2007) et Leong et al., (2006). L’activité de l’eau des milieux à
été déterminée à 0,985. Afin d’effectuer les expériences de validation, la température (7 à
25°C) ainsi que l’activité de l’eau (0,90 à 0,985) ont varié simultanément.
Dans le but de déterminer le taux de croissance optimal des moisissures sur baies de
raisin, un dispositif expérimental à été développé (Figure 17). Les raisins (« Red Globe ») ont
été nettoyés dans l’éthanol 35 % (v/v) pendant 1 minute et ensuite lavés avec de l’eau distillée
et séchés. Les raisins ont été coupés en deux moitiés, une utilisée pour déterminer l’aw et le
pH et la deuxième pour l’inoculation.
Le milieu PDA (0,99 aw) a été supplémente en cuivre (CuSO4 x 5H2O, Sigma-
Aldrich), sur une gamme de 9 concentrations, de 0 à 8 mM, pour étudier les effets du métal
sur la croissance et le temps de latence des moisissures. Les cultures ont été incubées à 25°C.
Pour l’étude de la croissance et la production de géosmine on a utilisé le milieu CZA
supplémenté en cuivre sur une gamme de 7 concentrations de 0 à 1,2 mM. Les cultures ont
été incubées aux différentes conditions de température (10 à 30°C) et CO2 (0,03 à 3,00 %),
pendant 7 jours, d’après le plan d’expériences établi par la matrice de Doehlert.
L’inoculation des milieux de culture solides est standardisée par le dépôt de 10 µL de
suspension de spores (ajustée à 106 sp/mL) déposés au centre de chaque boîte de milieu en
fonction de l’étude effectuée. Une partie d’eau de la solution physiologique est remplacée par
du glycérol (Fischer Scientific) pour l’ensemencement des milieux en différentes condition
d’activité de l’eau. Si la standardisation n’est pas nécessaire, une inoculation de solide à
solide est effectuée en transférant un petit morceau de gélose portant du mycélium vers un
milieu neuf au moyen de l’oëse spatulée. Les boites de culture sont incubées dans le dispositif
expérimental (Figure 17), afin de maintenir en équilibre l’humidité relative. Toutes les
expériences ont été réalisées en triplicat.
Les raisins ont été inoculés avec 10 µL de la suspension de spores, proche du
pédicelle, afin de suivre la croissance isotropique de la moisissure. Des photos du dispositif,
sans ouvrir le couvercle, ont été effectuées tous les jours et analysées pour déterminer le
rayon. Les raisins ont été incubés à 15°C.
65
Figure 17. Dispositif expérimental d’incubation, A-des boîtes de Petri, B-des raisins
2. I. 3. Dénombrement des spores
A 25°C sur milieu PDA, au bout de 7 jours, les spores sont récoltées. 20 g de billes
verre (� = 0,2 mm), ainsi que 10 mL d’eau physiologique stérile contenant 0,1% (v/v) de
Tween 80 sont ajoutées à la boîte de Petri, laquelle est ensuite fermée avec du Parafilm
(Pechiney Plastic Packaging, Chicago) et agitée 15 minutes à 110 rpm. Une goutte de la
suspension de spores obtenue, est posée sur une cellule de Malassez pour le dénombrement
des spores.
2. I. 4. Détection et dosage de la géosmine
L‘analyse olfactive des cultures à l’issue de la période d’incubation, a permis de
vérifier l’apparition de l’odeur moisie-terreuse (GMT). Une procédure de caractérisation en
deux temps est alors appliquée :
- la première permet une analyse sensorielle, découlant d’un flairage direct des atmosphères
sus-jacentes aux cultures, par un jury entraîné (expériences effectuées au laboratoire) ;
- la seconde permet d’obtenir des signatures instrumentales et des valeurs quantitatives (sous-
traitance par le laboratoire Exact à Macon).
Les composés volatils des cultures en boîtes de Petri sont concentrés, après
l’introduction du contenu total d’une boite de milieu gélosé avec sa colonie mycélienne, dans
un mélange alcool absolu /eau déminéralisée (20 %, v/v). La détection et le dosage sont
effectués par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse, selon le
protocole de Dumoulin et Riboulet (2004). Dans ces conditions, les performances de la
méthode d’extraction sont les suivantes : limite de détection - 5 ng/L ; répétitivité sur 2 fois 5
A B
66
mesures - 6,7 % à 10 ng/L et 6,1 % à 100 ng/L ; linéarité entre 10 et 200 ng/L avec un facteur
de corrélation R = 0,999.
2. I. 5. Modélisation et traitement des données
La croissance apicale des champignons est suivie sur boîte de Petri par mesure
quotidienne de 2 diamètres perpendiculaires de la colonie mycélienne, à partir desquels on en
déduira le rayon moyen. L’extension radiale en fonction du temps étant linéaire, un taux de
croissance radial (µ, mm/jour) est calculé par régression linéaire pour chaque facteur testé.
L’effet de la température et de l’activité de l’eau sur la croissance est déterminé par
le modèle cardinal avec inflexion (CMI) (Rosso et al., 1993 ; Sautour et al., 2001). Une
transformation racine carrée est effectuée pour stabiliser la variance de µ.
La validation du modèle évaluant l’effet combiné de la température et de l’activité de
l’eau, sur la croissance de B. cinerea et de P. expansum sur baies de raisins, est constituée de
plusieurs étapes.
- à partir des valeurs de taux de croissance mesurés, on déduit le taux de croissance optimal
calculé (µ optc), correspondant à la variance si toutes les conditions optimales avaient été
requises :
µ optc = µ mesuré / (γ(T) x γ(aw))
- par la suite, on déduit un taux de croissance prédit (µprédit) à partir de la moyenne des µoptc :
µ prédit = moyenne µ optc x γ(T) x γ(aw).
Ce µprédit correspond au taux de croissance théorique que nous aurions dû avoir dans
nos conditions expérimentales de température et d’activité de l’eau. γ(T) et γ(aw) sont des
facteurs liés aux valeurs cardinales de température et d’activité de l’eau de la souche
considérée ; c’est le gamma concept de Wijtzes et al. (1998).
Grâce aux taux de croissance mesurés et taux de croissance prédits, on peut calculer le
bias factor et l’accuracy factor (Ross, 1996), permettant de débuter la validation du modèle
établi sur PDA.
Soit le rapport : log (µ prédit / µ mesuré), pour n rapports, on a :
(11)
(12)
67
- le bias factor qui correspond à la moyenne des prévisions et des taux de croissance mesurés.
Un bias factor égal à 1, représente un parfait accord entre les prévisions et les mesures :
Bf = 10Σ(log(µ prédit/µ mesuré)/n)
- l’ accuracy factor qui représente la précision de la manipulation et correspond à la dispersion
des points par rapport à la droite : µ prédit = f (µ mesuré). Un accuracy factor de 1
correspond à un alignement parfait. Plus il sera proche de 1, plus la validation sera solide :
Af = 10 Σ(│log(µ prédit/µ mesuré)│/n)
L’effet du cuivre sur la croissance des moisissures à été traité par le modèle
d’inhibition non-compétitive et par une équation Monod re-paramétrée (Yano et Koga, 1973 ;
Dantigny et al., 2005a). Une transformation racine carrée et logarithmique à été utilisée pour
minimiser la variance de µ et λ. Le temps de latence, λ (h), à été calculé à partir de
l’intersection de la droite (extension radiale en fonction du temps) avec le rayon initial de la
goutte d’inoculation (4,5 mm).
Le logiciel informatique SlideWrite 3.0 (Advanced Graphics Software, Inc, Carlsbad,
CA, USA) a été utilisé pour traiter les données issues de ces études et déterminer les
paramètres des modèles.
Les effets combinés de la température, CO2 et cuivre ont été décrits par le modèle de
Doehlert qui permet la description d’une région autour d’une réponse optimale et contient
k²+k+1 points pour k facteurs. Le domaine expérimental est déterminé en fixant plusieurs
niveaux pour chaque facteur, à partir d’une valeur centrale et d’un pas de variation. Le plan
final d’expérimentation prend en compte tous les niveaux des k facteurs associés dans la
réalisation des k²+k+1 expériences (Sautour et al., 2001a). Pour trois facteurs (température,
CO2 et cuivre), 13 expériences sont nécessaires et dans ce cas une des propriétés de la matrice
de Doehlert est l’uniformité de la distribution dans un espace tridimensionnel. 12 expériences
sont donc équidistantes par rapport à un point central, l’expérience 1 (Figure 18).
Pour calculer la réponse Y, une relation polynomiale du second ordre, comprenant les
termes quadratiques est utilisée (Sautour et al., 2003) :
(13)
(14)
(15)
68
Y = b0 + b1X1 + b2 X2 + b3 X3 + b11 X21 + b22X
22 + b33 X
23 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
où X1, X2 et X3 représentent les facteurs.
Figure 18. Cuboctaèdre avec 13 points expérimentaux pour trois facteurs (X1, X2 et X3), d’après Sautour et al. (2001b)
Les données expérimentales relatives au plan d’expériences sont traitées par le logiciel
Nemrod (LPRAI, Marseille). Chacun des coefficients (b0, b1, b2, b3, b11, b22, …) du modèle
polynomial est calculé par régression linéaire et l’analyse de leur significativité est basée sur
un F-test. Concernant le réseau uniforme de Doehlert, une représentation graphique sous
forme de surfaces d’isoréponses définit les conditions pour lesquelles la réponse est optimale.
69
2. II. IDENTIFICATION DES MOISISSURES
L’identification a été effectuée selon des critères morphologiques et physiologiques
(Pitt et Hocking, 1999 ; Samson et al., 2004b).
Pour les souches de P. expansum, l’identification a été confirmée par analyse
moléculaire des séquences de β-tubulines (Glass et Donaldson, 1995). Le gène de la β-
tubuline est utilisé de plus en plus pour l’identification et la reconstruction phylogénétique de
différents types d’organismes grâce à sa variabilité et à sa conservation dans la cellule
eucaryote.
2. II. 1. Extraction d’ADN L’extraction d’ADN des souches du genre Penicillium a été entreprise avec l’EZNA
Fungal DNA Kit (Omega Bio-tek). Il faut pour cela collecter 100 mg de mycélium frais à
partir d’une culture de 7 jours à 25 °C, sur milieu PDB (les échantillons peuvent être traités
par série de 6). L’échantillon est déposé dans un tube Eppendorf qui contient de l’azote
liquide et broyé grâce à un pilon. Afin de casser au mieux les parois des cellules fongiques,
cette opération peut être répétée deux fois en rajoutant de l’azote liquide. 600 µL de Tampon
FG1 et 10 µL de 2-mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich) sont ajoutés au mycélium broyé et
ensuite vortexés. Le tube est incubé à 65 °C pendant 10 minutes et mélangé à deux reprises
pendant ce laps de temps. 140 µL de Tampon FG2 sont rajoutés au tube Eppendorf, lequel est
à nouveau vortexé. Une incubation de 5 minutes dans la glace doit être effectuée avant de
centrifuger l’échantillon à 10 000 g pendant 10 minutes. Le surnageant ainsi obtenu est
mesuré et transféré dans un nouveau tube Eppendorf. Afin de précipiter l’ADN, 420 µL
d’isopropanol (Sigma-Aldrich) pour 600 µL de surnageant sont ajoutés dans le tube et ensuite
vortexés. Une nouvelle centrifugation de 2 minutes à 10 000 g permet la formation d’un culot
d’ADN. Après l’élimination du surnageant, 300 µL d’eau déminéralisée préchauffée à 65 °C
sont nécessaires pour remettre en suspension l’ADN obtenu. Le tube est vortexé puis 8 µL de
RNase (20 mg/mL) sont ajoutés. 150 µL de Tampon FG3 et 300 µL d’éthanol 96 % (Elvetec
Services) sont ajoutés dans le tube, lequel est ensuite vortexé. L’échantillon complet est
transféré dans une colonne HiBind™ placée dans un tube de prélèvement de 2 mL. Après une
centrifugation à 10 000 g pendant 1 minute (pour lier l’ADN à la colonne), celle-ci est
transférée dans un nouveau tube de prélèvement. 750 µL de Tampon de lavage dilué avec de
70
l’éthanol absolu sont ajoutés dans la colonne et centrifugés pendant 1 minute à 10 000 g.
Cette étape est réalisée une seconde fois. La colonne est centrifugée pendant 2 minutes à une
vitesse maximale pour éliminer les traces d’éthanol. Elle est ensuite transférée dans un
nouveau tube Eppendorf. 100 µL de Tampon d’élution (ou de l’eau déminéralisée)
préchauffée à 65 °C sont additionnés à la colonne, laquelle est incubée 5 minutes à 60 °C.
Une centrifugation d’une minute à 10 000 g va permettre de récolter l’ADN dans le tube
Eppendorf. L’ADN est ensuite conservé au congélateur.
2. II. 2. Dosage de l’ADN
Le dosage et le contrôle de la qualité d’ADN est réalisé après chaque extraction par
spectrophotométrie, à l’aide d’un spectrphotomètre (Eppendorf, Le Pecq, France). Les
rapports de densité optique sont déterminés afin d’évaluer la qualité des échantillons. Les
bases puriques et pyrimidiques absorbant fortement dans l'ultraviolet à 260 nm. Une unité de
densité optique (DO) à 260 nm correspond à une solution d'ADN double brin de 50 µg/mL.
Aussi il convient de rechercher une éventuelle contamination protéique. Pour cette raison on
effectue une seconde mesure de DO à 280 nm. Un ADN pur doit avoir un rapport DO 260/280
compris entre 1,8 et 2. Une éventuelle contamination par du phénol, peut être recherchée en
mesurant l'absorption à 270 nm.
2. II. 3. Amplification par PCR
L’amplification du gène de la β-tubuline a été effectuée avec les amorces Bt2a et Bt2b
(Glass et Donaldson, 1995) : Bt2a : 5’ GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC 3’
Bt2b : 5’ ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC 3’
L’amplification a été rtéalisée grâce au mélange suivant : 2 µL ADN (10 ng/µL), 0,5
µL Taq Polymérase (2,5 U/µL, Euromedex), 5 µL dNTP (1 mM, Invitrogen), 0,5 µL de
chaque amorce (50 pmol/µL, Eurogentec), 2,5 µL Tamponx10 (Euromedex), 1,25 µL MgCl2
(Euromedex), 0,75 µL DMSO (Euromedex) et de l’eau ultra pure jusqu’à 25 µL.
La PCR a été réalisée dans un thermocycleur iCycler™ Thermal Cycle (BioRad). Pour
réduire les amplifications non-spécifiques, la « Touchdown » PCR a été appliquée aux
échantillons (Samson et al., 2004a). Cette PCR utilise, pour les premiers cycles, une
température d’hybridation supérieure à la température optimale des amorces, qui ensuite
diminue de 1 °C par cycle, jusqu’à elle atteigne la température spécifique (« touchdown »)
71
d’hybridation des amorces. La dénaturation à 94 °C pendant 1 minute a été suivie par 5 cycles
comprenant une dénaturation à 94 °C pendant 1 minute, une hybridation à 68 °C pendant 90
secondes et une élongation à 72 °C pendant 2 minutes ; avec une diminution de la température
d’hybridation de 1 °C par cycle. Ensuite, les 5 cycles ont été suivis par 25 cycles comprenant
une dénaturation à 94 °C pendant 1 minute, une hybridation à 64 °C pendant 90 secondes et
une élongation à 72 °C pendant 2 minutes. Une élongation à 72 °C pendant 10 minutes à
finalisé cette PCR.
2. II. 4. Electrophorèse
Les produits PCR sont contrôlés par électrophorèse. La migration des fragments à été
réalisée dans un gel d’agarose 1,5 % (Euromedex), préparé dans du Tampon TAEx1 (Tris
Acétate, Euromedex) à 90 V pendant 60 minutes. 5 µL d’échantillon mélangé à du Bleu de
Bromphénol (6xLoading Dye Solution, Euromedex) ont été déposés dans les puits. Pour
pouvoir repéré le gène de la β-tubuline (environ 500 pb), un marquer moléculaire (Mass
Ruler™ Express DNA Ladder Mix Forxard, 56 ng/µL, Fermentas) a été utilisé.
2. II. 5. Séquençage et analyse des séquences
Les produits PCR ont été séquencés dans les deux directions, avec les amorces Bt2a et
Bt2b. Le séquençage à été réalisé par la société Beckman Coulter Genomics (Takeley, UK).
Les produits PCR ont été préalablement purifiés (peqGold Gel Extraction Kit, peqLab,
Biotechnologie GmBH) et ensuite préparés d’après les recommandations d’envoi au
séquençage (www.beckmangenomics.com). Une recherche d’homologie est effectuée afin de
pouvoir identifier les Penicillium. Les bases de données moléculaires sont riches en séquences
du gène de la β-tubuline. Un Blast nucléotidique (Basic Local Alignement Tool), entre les
séquences de nos échantillons et celles de la base de données, est réalisé sur le site du NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov). L’algorithme renvoie certains paramètres qui permettent de
déterminer s’il y a une cohérence biologique entre les alignements. Plus la E-value
(probabilité que la séquence similaire retrouvée l’ait été par hasard) est faible, plus
l’alignement est significatif. Le logiciel R (2.7, Development Core Team) et PhyML
(accessible en ligne, www.phylogeny.fr), ont été utilisés pour la construction de la
dendrogramme et de l’arbre phylogénétique.
72
PARTIE 3 RESULTATS ET DISCUSSION
73
3. I. IDENTIFICATION DE LA MICROFLORE DES BAIES DE RAISINS
3. I. 1. Introduction
La pellicule du raisin présente une microflore variée composée des bactéries, levures
et moisissures, appelée flore indigène ou microflore épiphyte. De nombreux facteurs,
géographiques ou climatiques, peuvent faire varier cette flore. Si une partie de la microflore
est nécessaire à la bonne réalisation des étapes fermentaires, l’autre partie est responsable des
déviations organoleptiques (odeur de terre, odeur de champignon frais) nuisibles à la qualité
du vin.
Des études préliminaires ont mis en évidence l’origine fongique des déviations
organoleptiques (Darriet et al., 2000). Botrytis cinerea responsable de la « pourriture grise »
produit du 2-méthyle-isoborneol, tandis que, plusieurs espèces du genre Penicillium ont été
décrites comme productrices de la géosmine. La caractérisation de ce dernier présente donc
un grand intérêt pour cette étude.
Ces constatations ont motivé notre étude sur l’identification de la microflore fongique
des baies de raisins de Bourgogne, dans le but d'isoler des espèces productrices de déviations
organoleptiques de type moisi-terreux dans le vin, en Bourgogne. Des grappes de Pinot Noir
ont été prélevées sur des parcelles de la commune de Morey-St Denis (Côte d’Or) à l’automne
2007 afin de pouvoir isoler un maximum de moisissures.
Tout d'abord on a distingué les différents genres par les critères morphologiques.
Notre étude c'est ensuite centrée sur l'identification moléculaire de souches du genre
Penicillium, par l'amplification du gène de la β-tubuline.
3. I. 2. Analyse de la microflore fongique des vignobles de Morey
Aspects quantitatifs de la contamination
Les prélèvements des échantillons de raisins ont été effectués sur 5 parcelles de
vignobles de Morey (Côte d’Or) associées principalement au défaut GMT. Les grappes (45 à
260 g) de raisins visiblement contaminées par Botrytis sp., ou d’autres moisissures, ont été
rincées par une masse équivalente d’eau physiologique additionnée de Tween 80 à 0,1 %
(v/v). Les dénombrements effectués sur la première eau de lavage des différentes grappes
74
permettent d’apprécier la charge fongique en Unités Formant Colonies par gramme de raisin
(UFC.g-1) (Tableau 8).
Tableau 8. Charge fongique des raisins contaminés des vignobles de Morey
Lieux de prélèvements Valeurs extrêmes des masses des grappes (g)
Charge fongique initiale moyenne (milieu PDA) UFC.g-1
Morey 1 75 - 245 102 - 104 Morey 2 105 - 260 102 - 104 Morey 3 64 - 110 103 - 104 Morey 4 45 -121 103 - 104 Morey 5 75 -150 103 - 104
Dans l’ensemble, le taux de contamination des raisins apparaît assez homogène et ne
dépasse pas les 104 UFC.g-1.
Aspects qualitatifs de la contamination
A partir des raisins contaminés prélevés en Bourgogne, on a pu isoler une centaine de
moisissures. Les caractères morphologiques décrits par Pitt et Hocking (1999) ont révélé la
présence prédominante de quelques genres de moisissures. Par ordre de fréquence
décroissante on remarque : Botrytis (53 %), Penicillium (23 %), Cladosporium (5 %),
Aspergillus (3 %) et d’autres genres (17 %). Ces résultats confirment les identifications de la
flore d’altération de la vigne rapportées par les travaux de Fleet (2003) et Loureiro et
Malfeito-Ferreira (2003).
3. I. 3. Regroupements taxonomiques des espèces de Penicillium
3. I. 3. 1. Analyse hiérarchique ascendante des critères morphologiques
Après croissance sur milieu gélosé de Czapek (CZA), un crible de caractères
morphologiques, microscopiques et macroscopiques, adaptés des travaux de Pitt et Hocking
(1999) et Samson et al. (2004b), a conduit à un premier regroupement d’une vingtaine
d’isolats du genre Penicillium. Parmi ces caractères on peut énumérer : la taille, la couleur
face et revers de la colonie ; la taille et la forme des conidies ; la taille et la forme des
phialides ; le branchement du conidiophore. Les caractères observés ont été comparés avec les
descriptions morphologiques des moisissures, accessibles sur le site du CBS-Fungal
Biodiversity Center (ww.cbs.knaw.nl).
75
Les réponses brutes découlant du crible des caractères morphologiques ont été
soumises à une analyse hiérarchique ascendante au moyen d’un logiciel de statistique (R
version 2.7, Development Core Team). Sur la base des critères morphologiques choisis, le
résultat des regroupements des isolats du genre Penicillium, est constitué d’un dendrogramme
qui fait apparaître huit pôles taxonomiques (Figure 19).
Figure 19. Relations taxonomiques entre les souches de Penicillium isolées en Bourgogne, basées sur des critères morphologiques
3. I. 3. 2. Intérêt taxonomique du milieu CREA
La confrontation supplémentaire avec le test d’acidification sur milieu CREA a permis
d’ajouter un critère métabolique, au crible d’analyse des isolats de Penicillium.
L’homogénéité des 8 pôles a été précisée et la vingtaine de souches se regroupent alors en 13
groupes, dont deux sont rapidement identifiés au niveau de l’espèce :
Groupe 1 → 4 souches : 12.2, 28.1, 15.3 et 18.1 : Penicillium citrinum
Groupe 9 → 1 souche : 25.3 : Penicillium expansum
76
Ainsi, à cette étape de l’étude, une seule souche de P. expansum, espèce rarement
isolée de vignobles de Côte d’Or, a pu être identifiée.
3. I. 3. 3. Identification moléculaire des souches du genre Penicillium isolées
3. I. 3. 3. 1. Analyse des séquences par comparaison à une base de données
L’identification sur la base des critères morphologiques a été ensuite vérifiée par
l’analyse moléculaire. Pour cette identification on a pris comme témoin P. roqueforti (souche
n°818, collection du laboratoire). Les amorces Bt2a et Bt2b (Glass et Donaldson, 1995) ont
amplifié un fragment d’environ 500 pb du gène de la β tubuline des souches de Penicillium
sp. isolées. Afin de vérifier la cohérence du séquençage, un alignement a été réalisé pour
toutes les souches entre les séquences forward (Bt2a) et la reverse complémentaire de la
séquence reverse (Bt2b). Les pourcentages d’alignements obtenus, compris entre 90 et 99 %
nous ont permis d’affirmer que le séquençage a bien fonctionné.
Un BLAST des séquences de β tubulines des souches de Penicillium sp. isolées a été
effectué avec la base de données du NCBI, riche en séquences de β tubulines des
champignons. Les résultats sont présentés dans le Tableau 9.
Pour cette analyse on tient compte de la E-value qui indique le nombre d’alignements
différents, que l’on peut espérer trouver par hasard dans la banque (même s’il n’existe pas de
séquence similaire), et ayant le même degré de similitude. La E-value dépend de la taille de la
séquence, de la taille de la banque et du score d’alignement (S). Un alignement est d’autant
plus significatif que S est élevé et E-value faible. En revanche, une E-value plus élevée
indique que la souche inconnue est proche d’une espèce de référence et présente avec elle des
différences au niveau de la séquence de la β tubuline. On note une E-value égale à 0 pour la
majorité des souches ce qui indique que l’alignement obtenu est valide (Tableau 9). Des
scores élevés (98 et 99 %) et une E-value égale à 0 permettent d’identifier une dizaine
d’isolats fongiques de Bourgogne à des espèces de Penicillium de la base de données.
Pour la souche 29.3 on obtient une E-value égale à 0 avec trois espèces du genre
Penicillium, mais P. bialowiezense est un synonyme du P. brevicompactum qui est très proche
de P. biourgeianum (Peterson, 2004). Un résultat significatif d’un BLAST indique une
similitude entre les séquences et une présomption d’homologie. Une absence de similarité ne
signifie pas une absence d’homologie entre deux séquences.
77
Tableau 9. BLAST des gènes de la β tubuline
Souches isolées /Amorce
% Identité
Score E - value Blast NCBI (souches dans la base de données)
P. roquefortii / BT2B 98% 798 0,00 Penicillium roquefortii strain CBS 23438 beta tubulin like gene, partial sequence 25.3 / BT2B 98% 789 0,00 Penicillium expansum strain CBS 32548 beta tubulin gene, partial cds 1.4 / BT2B 99% 761 0,00 Penicillium chrysogenum strain CBS 478.84 beta tubulin gene, partial cds 2.1 / BT2B 98%
93% 802 649
0,00 0,00
Penicillium citrinum strain 217P beta tubulin gene, partial sequence Eupenicillium tropicum beta tubulin gene, partial cds
5.2 / BT2B 92% 93%
638 617
1e – 179 1e – 173
Penicillium glabrum strain 207P beta tubulin gene, partial sequence Penicillium thomii strain CBS n 350.59 beta tubulin like gene, partial sequence
7.6 / BT2B 98% 782 0,00 Penicillium brevicompactum strain CBS 110069 beta tubulin gene, partial cds 12.2 / BT2B 95%
84% 82%
564 405 348
2e – 157 1e – 109 2e – 92
Penicillium pinophilum strain L14 beta tubulin gene, partial sequence Talaromyces trachyspermus isolate W26 beta tubulin like gene, Talaromyces ucrainicus isolate S27 beta tubulin like gene, partial sequence
12.3 / BT2B 98% 765 0,00 Penicillium brevicompactum strain 282P beta tubulin gene, partial sequence 15.2 / BT2B 97% 778 0,00 Penicillium atramentosum strain CBS 29148 beta tubulin gene, partial cds 15.3 / BT2B 95% 564 2e – 157 Penicillium pinophilum strain L14 beta tubulin gene, partial sequence 21.1 / BT2B 98% 782 0,00 Penicillium brevicompactum strain CBS 110069 beta tubulin gene, partial cds 21.2 / BT2B 98% 776 0,00 Penicillium brevicompactum strain CBS 110069 beta tubulin gene, partial cds 21.4 / BT2B 98% 784 0,00 Penicillium brevicompactum strain CBS 110069 beta tubulin gene, partial cds 22.1 / BT2B 98% 811 0,00 Penicillium brevicompactum strain CBS 110069 beta tubulin gene, partial cds 28.1 / BT2B 94%
91% 595 582
6e – 167 4e – 163
Penicillium thomii strain CBS n 350.59 beta tubulin like gene, partial sequence Penicillium glabrum strain 207P beta tubulin gene, partial sequence
29.3 / BT2B 98 % 99% 99%
780 750 750
0,00 0,00 0,00
Penicillium bialowiezense strain CBS 112882 beta tubulin gene, partial cds Penicillium biourgeianum strain NRRL 2013 beta tubulin gene, partial cds Penicillium brevicompactum strain DAOM 215332 beta tubulin gene, partial sequence
30.1 / BT2B 97% 86%
739 475
0,00 8e – 131
Penicillium corylophilum strain 345P beta tubulin gene, partial sequence Penicillium citreonigrum strain 272P beta tubulin gene, partial sequence
32.4 / BT2B 99 % 793 0,00 Penicillium brevicompactum strain 282P beta tubulin gene, partial sequence
78
3. I. 3. 3. 2. Construction de l’arbre phylogénétique
La construction d’un arbre phylogénétique prend en compte les changements survenus
au cours de l’évolution. Il établit des liens de parenté entre les espèces, à partir de l’analyse de
séquences, par l’intermédiaire d’un alignement multiple contrairement au BLAST qui est basé
sur un alignement local.
A partir des séquences de β tubulines de Penicillium obtenues dans cette étude et des
séquences de la base de données avec lesquelles on a obtenu le meilleur BLAST (Tableau 9),
on a construit un arbre phylogénétique à l’aide du logiciel en ligne PhyML
(www.phylogeny.fr). Pour cela on a choisi la méthode du maximum de vraisemblance, basée
sur la recherche de l’arbre optimal en attribuant une probabilité à chaque changement dans les
séquences. La fiabilité et la robustesse de la topologie obtenue a été évaluée par la méthode du
Bootstrap pour laquelle on a choisi une valeur de 100 (construction de 100 arbres et choix du
plus fiable).
P. glabrum et P. thomii sont deux espèces très proches du point de vue morphologique
et moléculaire (Samson et al., 2004a). Les souches 5.2 et 28.1 s’identifient à P. thomii d’après
l’arbre phylogénétique (Figure 20).
Les espèces du genre Penicillium peuvent avoir des téléomorphes dans Eupenicillium
et Talaromyces (Pitt et Hocking, 1999). Les souches 12.2 et 15.3 s’identifient à Talaromyces
trachyspermus avec une valeur de bootstrap de 93. La souche 30.1 montre clairement
l’appartenance à P. citreonigrum et non pas à P. corylophilum comme on a pu voir dans le
Tableau 9. Les souches 7.6, 12.3, 21.1, 21.2, 21.4, 22.1 et 32.4 appartiennent à P.
brevicompactum. La variation, dans la base de données, des alignements de séquence de β
tubuline de cette souche, explique les valeurs de Bootstrap comprises entre 51 et 91 ; mais en
revanche le clade est bien fiable par une valeur de Bootstrap de 99.
L’analyse phylogénétique a permis la description des souches de Penicillium isolées
en Bourgogne. Cette méthode est fiable et rapide mais elle présente des limitations pour les
souches très proches. L’amplification d’une séquence du gène de la β tubuline n’est pas
suffisante pour différencier des souches telles que P. thomii, P. glabrum, P. biourgeianum ou
P. bialowiezense. L’analyse du Blast et l’arbre phylogénétique ont confirmé l’identification de
la souche 25.3 appartenant à l’espèce P. expansum.
79
Figure 20. Arbre phylogénétique des souches de Penicillium isolées en Bourgogne (en chiffres) et des espèces de la base de données (en lettres)
80
3. I. 4. Recherche des souches de Penicillium productrices de géosmine
La dizaine de souches isolées de Côte d’Or et identifiées au niveau moléculaire ont été
testées pour la production de géosmine sur milieu Czapek-Agar (CZA). A partir des
suspensions de spores (106 sp/mL) les boîtes de Petri ont été inoculées et incubées à 25°C,
pendant 7 jours. Un jury constitué de trois personnes a permis d’identifier les cultures
présentant le plus d’odeur moisi-terreux.
Le flairage des cultures ainsi que la caractérisation instrumentale des extraits de
mycélium par Microextraction en phase solide (CPG-SPME, Dumoulin et Riboulet, 2004) ont
donné des résultats négatifs, à l’exception de la souche 25.3 seule souche productrice de
géosmine et par ailleurs identifiée à Penicilium expansum. Cette souche a été retenue pour nos
prochains travaux expérimentaux.
3. 1. 5. Conclusions
Les observations morphologiques ont permis l'identification d'une centaine de
moisissures. Le quart d’entre elles, non assimilées aux genres Botrytis ou Penicillium n’ont
pas présenté d'intérêt pour cette étude.
L'amplification du gène de la β-tubuline (gène très conservé avec une grande
variabilité) a permis une différentiation rapide et efficace des espèces du genre Penicillium.
En revanche cette méthode présente des limitations au niveau des souches taxonomiquement
très proches.
La part de la présente étude, portant sur les effets des facteurs environnementaux sur la
croissance et la production de géosmine, concernera deux souches de l’espèce Botrytis
cinerea, BC1 et BC2, identifiées par la méthode morphologique et la souche de Penicillium
expansum 25.3, identifiée par biologie moléculaire.
81
3. II. VALIDATION DES EFFETS COMBINES DE LA TEMPERA TURE
ET DE L’ACTIVITE DE L’EAU SUR LA CROISSANCE DE BOTRYTIS
CINEREA ET DE PENICILLIUM EXPANSUM SUR BAIES DE RAISINS
3. II. 1. Présentation
Le réchauffement climatique est lourd de conséquences pour la vigne et le raisin.
Chaque cépage est adapté aux conditions climatiques de sa région et un changement de
température engendre des anomalies de production, parfois importantes. C’est ainsi que
certaines moisissures se développant dans des régions méditerranéennes, sont retrouvées
anormalement dans des régions plus septentrionales.
Selon les protocoles de la mycologie prévisionnelle, on a modélisé la croissance
apicale sur milieu modèle (PDA) de B. cinerea et P. expansum, en fonction de la température
et de l’activité de l’eau, pour en déduire le taux de croissance optimal (µopt) ainsi que les
valeurs cardinales (Tmin, Topt, Tmax, awmin, awopt, awmax). L’objectif a été de valider (grâce au
gamma concept, µ=µoptγ(T)γ(aw)) sur jus de raisin naturel et sur jus synthétique, les résultats
obtenus sur milieu modèle et d’en déduire le µopt de chaque souche sur baie de raisin.
Sur milieu PDA, les facteurs température (de 2 à 30°C) et aw (de 0,85 à 0,99) testés,
ont varié indépendamment. Sur jus de raisin (naturel et synthétique), la température (de 7 à
25°C) et l’aw (de 0,90 à 0,99) ont varié simultanément. Les raisins ont été incubés dans des
dispositifs adaptés afin de pouvoir mesurer le rayon (croissance isotropique) et d’en déduire le
taux de croissance, µ. L’effet combiné de la température et de l’activité de l’eau sur le µ
obtenu, a été calculé, afin d’obtenir le taux de croissance optimal des moisissures, sur baies de
raisins, si les conditions avaient été optimales.
82
83
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89
90
3. II. 2. CONCLUSIONS
Les modèles de croissance ont permis de déterminer les températures et les activités de
l'eau cardinales pour les souches testées. B. cinerea et P. expansum sont des souches
psychotropes care elles peuvent se développer à des températures proches de 0°C.
Contrairement au cas de la température, ces souches ne peuvent pas se croître à des activités
de l’eau très basses. Le taux de croissance est un paramètre qui dépend du milieu tandis que
les valeurs cardinales sont propres à la souche. Cela explique le choix du milieu PDA, un
milieu de base utilisé pour la croissance des champignons ainsi que la variation indépendante
de la température et de l’activité de l’eau pour déterminer les valeurs cardinales. Les
paramètres obtenus lors de cette étude présentent un grand intérêt pour la maîtrise de la
croissance fongique dans le vignoble.
Afin de vérifier si un modèle peut être appliqué aux situations réelles, celui-ci doit être
validé. Le choix du milieu pour la validation est une étape importante. La faible croissance
observée sur jus de raisin synthétique à été due à un ratio C/N de 1/30, conduisant ainsi à une
limitation de l'azote possible. Par conséquent le jus de raisin naturel doit être préféré. Nous
avons pu valider les modèles de croissance pour B. cinerea et P. expansum, sur jus de raisin
naturel. Cette validation nous a permis de décrire l’effet combiné de la température et de
l’activité de l’eau sur la croissance de B. cinerea et P. expansum sur baies de raisins, un
produit dont l’activité de l’eau ne peut pas être changée. On a pu calculer le taux de
croissance optimal de nos souches, sur baie de raisin, en supposant que les conditions de
température et activité de l’eau étaient optimales.
Cette étude a montré que les modèles de croissance utilisant les valeurs cardinales
peuvent être validés sur des produits agro-alimentaires sur une large gamme de température et
d’activité de l’eau.
91
3. III. INFLUENCE DU CUIVRE SUR LE TEMPS DE LATENCE ET LE
TAUX DE CROISSANCE RADIALE DE PENICILLIUM EXPANSUM ET
BOTRYTIS CINEREA
3. III. 1. Présentation
Le cuivre semble avoir une influence importante sur la production de géosmine. La
température ne peut pas être contrôlée dans le vignoble, tandis que le cuivre en tant que
fongicide, est rajouté par l’homme. Dans la suite de ce travail nous nous sommes intéressés à
l’effet du cuivre sur la croissance des champignons contaminants de la vigne, B. cinerea et P.
expansum.
L’approche expérimentale consiste à cultiver ces deux champignons sur un milieu
classique, milieu gélosé à l’extrait de pomme de terre, supplémenté en cuivre (de 0 à 8 mM).
Dans un premier temps l’objectif est d’étudier la croissance des champignons sous l’influence
du cuivre, par la mesure du diamètre. A partir de cette croissance on peut déduire le temps de
latence et donc, voir l’effet du cuivre sur la germination de spores de B. cinerea et P.
expansum.
La modélisation de la croissance a permis l’estimation du taux de croissance optimal
(µopt) et de la concentration en cuivre pour laquelle µ = µopt /2, le Cu50. Le modèle utilisé pour
modéliser le temps de latence a été différent de celui pour la croissance, dû au comportement
de Botrytis cinerea en fonction du cuivre (forme de courbe différente d’une courbe concave
ou convexe obtenue généralement avec un modèle d’inhibition de la croissance). Un temps de
latence infini est obtenu en absence de la croissance, donc la modélisation du temps de latence
a permis l’estimation du MIC (concentration minimale inhibitrice en cuivre).
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3. III. 2. CONCLUSIONS
Pour les moisissures étudiées, le Cu50 varie entre 2,2 et 2,6 mM. Pour P. expansum on
a observé une corrélation linéaire entre le taux de croissance et l’inverse du temps de latence.
Pour B. cinerea, entre 0 et 4 mM, le taux de croissance diminue et le temps de latence reste
constant. tandis que au dessus de 4 mM, le taux de croissance reste constant et le temps de
latence augmente. On déduit donc que le cuivre influence la germination et la croissance de P.
expansum. En revanche, entre 0 et 4 mM, seulement la croissance est influencée par le cuivre,
tandis que, de 4 mM à 8 mM, c’est la germination qui subit les effets du cuivre.
Les moisissures étudiées ont montré une certaine résistance au cuivre, les valeurs MIC
obtenues ont été égales à 4,7 mM pour P. expansum, 8,2 et 7,3 mM respectivement pour B.
cinerea, souche BC1 et BC2. La détermination de la concentration minimale inhibitrice
(MIC) permet de voir dans quelle mesure la « Bouillie Bordelaise » agit efficacement sur le
développement fongique, tout en sachant que les champignons peuvent développer une
résistance au cuivre.
118
3. IV. EFFETS COMBINES DE LA TEMPERATURE, DU DIOXYD E DE
CARBONE ET DU CUIVRE SUR LA PRODUCTION DE GEOSMINE
PAR PENICILLIUM EXPANSUM
3. IV. 1. Présentation
Ce travail consiste à tester les effets de facteurs environnementaux et nutritionnels et
d’approcher les conditions qui limitent la production de géosmine par P. expansum.
L’approche expérimentale choisie a été la matrice de Doehlert, car elle fournit un maximum
d’informations en un minimum d’expériences. On a la possibilité d’étudier l’influence des
facteurs ainsi que leurs interactions, tout en ayant plusieurs niveaux pour chacun des facteurs.
P. expansum a été cultivé sur milieu Czapek Agar, en faisant varier les différents
facteurs d’après la matrice de Doehlert. Une gamme allant de 10 à 30°C a été testée, afin de
couvrir les températures pouvant être rencontrées en période estivale (jour et nuit).
Au cours de la maturation, pendant la véraison, le pourcentage de CO2 augmente dans
l’ambiance en raison de l’utilisation du malate pour la respiration. Compativement au glucose
et à l’amidon, le malate libère plus de CO2 par unité d’O2 consommée. Cela nous a amené à
tester le CO2, de la teneur ambiante (0,03 %) jusqu’à 100 fois plus (3,03 %), avec une valeur
intermédiaire (1,53 %).
Le troisième facteur testé est le cuivre (sous forme de sulfate). Il intervient dans la
production viticole en particulier sous la forme du fongicide appelé « Bouillie Bordelaise ». A
partir d’une concentration de 12,75 mg/L expérimentée précédemment, nous avons déterminé
les niveaux en calculant des multiples de cette valeur entre 0 et 76,50 mg/L.
119
Combined effects of temperature, copper and CO2 on geosmin production 1
by Penicillium expansum 2
3
Daniela Judet1, Maurice Bensoussan2, Claudine Charpentier3 and Philippe Dantigny4,* 4
5
1 Laboratoire Eau, Molécules Actives, Macromolécules, Activité 6
2 GTR Mycologie, Sécurité Microbiologique Alimentaire et Environnement 7
3 Institut Universitaire de la Vigne et du Vin, UMR INRA 1131 8
4 Laboratoire de Génie des Procédés Microbiologiques et Alimentaires, 9
Université de Bourgogne, Dijon, France 10
11
Running title: Geosmin production by Penicillium expansum 12
13
Keywords: geosmin, Penicillium expansum, copper, temperature, carbon dioxyde 14
15
16
*Corresponding author. 17
Mailing address: 18
Laboratoire de Génie des Procédés Microbiologiques et Alimentaires, 19
Agro-Sup Dijon, 1 Esplanade Erasme, 21000 Dijon, France. 20
Phone: 33 (0)3 80 77 40 71 21
22
120
Abstract 23
24
Aims: This study aimed at assessing the influence of temperature, 10-30°C, copper 25
concentration, 0-76.50 mg l-1 and CO2 in the headspace, 0.03-3%, on the production of 26
geosmin by Penicillium expansum according to a Doehlert design. 27
28
Methods and Results: 29
In the experimental domain, the factors were ranked by an increasing order of importance, 30
temperature, CO2 and copper concentration. Production of geosmin was enhanced at low 31
temperature, 0.03 % CO2 (i.e., atmospheric level) and high copper concentration. 32
33
Conclusions: Up to 3150 ng l-1 geosmin were produced on Czapeck agar after 7 days 34
incubation under atmospheric CO2at 20°C and 63.75 mg l-1 copper. 35
36
Significance and Impact of the Study: Low copper concentration on grapes, as a result of 37
cupric fungicide treatments of vineyards (i.e. bordelaise mixture) may stimulate geosmin 38
production by P. expansum. 39
40
121
Introduction 41
42
Grape rot is one of the major causes of degradation of grape compounds, leading to 43
deterioration of wine quality. Over the past ten years winegrowers in Burgundy have observed 44
organoleptic defects with earthy/musty odors in musts and wines made with rotten grapes. 45
The compound responsible for this odor in Bordeaux wines was identified as geosmin by 46
Darriet et al. (2000). The content of geosmin in various Bordeaux wines varied between 20 47
and 300 ng l-1 , thus indicating that the concentrations were sometimes clearly higher than the 48
perception threshold of racemic mixture of geosmin as described in the literature ca. 20ng l-1 49
in water (Maga 1987). 50
Penicillium expansum and other species have long been associated with distinctive 51
odors. Raper and Thom (1949) described the odor of various penicillia as being “strong, 52
moldy or earthy” (P. expansum and P. crustosum Thom), “moldy“ (P. claviforme Bain and P. 53
olivino-viride Biourge). Matheis and Roberts (1992) identified geosmin as the primary 54
component of the odor associated with P. expansum. Microbiota on grapes with earthy odor 55
was analyzed and its potential to produce geosmin on malt agar and grape juice tested. 56
According to La Guerche et al. (2004 and 2006) all the strains producing geosmin belong to 57
only one Penicillium species: P. expansum. 58
For various microorganisms, geosmin production was affected by environmental and 59
nutritional factors. Abiotic factors (temperature, humidity, oxygen concentration) were tested 60
separately to identify their influence on geosmin production by P.expansum. The modification 61
of these factors affected growth, sporulation and geosmin production of P. expansum but did 62
not have a direct effect on its synthesis (La Guerche et al., 2005). A study of the impact of 63
grape juice composition) on geosmin production by P. expansum (La Guerche et al., 2007) 64
122
revealed the importance of nitrogen composition: Ammonium played a leading part in 65
inducing geosmin synthesis but mixed amino acids inhibited geosmin synthesis. 66
Global warming may lead to important variations in rainfalls, temperature and 67
percentage of carbon dioxide in the atmosphere. An increased accumulation of geosmin in P. 68
expansum exposed to 40°C, but no geosmin was produced in the range 10-30°C 48h after 69
inoculation (Dionigi and Ingram, 1994). An increase in geosmin accumulation was also 70
reported by these authors when P. expansum was incubated at 10% O2. But to our knowledge, 71
the effect of CO2 on geosmin accumulation in P. expansum was never studied. It should be 72
noted also that CO2 can be accumulated localy when P. expansum is found on the stem. 73
Copper salts through the use of bordelaise mixture (Ca(OH)2 + Cu SO4) are widely 74
applied as fungicide against mildew of grape vine. An increased growth and geosmin 75
accumulation in P. expansum were observed by exposure to copper (1 and 5 mg l-1), through 76
the addition of copper sulphate to growth media (Dionigi 1995, Dionigi et al. 1996). The 77
intensive and long-term use of copper has raised concerns regarding the negative effects on 78
the environment (Beltrami and Capri, 1999; Capri et al., 1999) and wine quality (Gennaro et 79
al., 1986). Copper concentrations in the top soils exposed to these treatments exhibited 80
commonly values in the range 100 to up 1500 mg kg-1 (Brun et al., 2001). For these and other 81
reasons, the EC N° 1410/2003 has fixed maximum residue levels MRL in grape and wine of 82
20 mg kg-1 and 1 mg l -1, respectively. But a recent study has shown that 13% of grape 83
samples and 18% of wine samples exceeded the MRL (García-Esparza et al., 2006). 84
This study aimed at assessing the combined effects of temperature, 10-30°C, copper 85
concentration, 0-76.50 mg l-1 and CO2 in the headspace, 0.03-3%, on the production of 86
geosmin by Penicillium expansum according to a Doehlert design. 87
123
Material and Methods 88
89
Isolation of microorganisms 90
91
Microorganisms were isolated from rotten Vitis vinifera cvs Pinot noir, collected in Morey-St 92
Denis vineyards in 2007. Each grape sample was washed with the same weight of saline 93
(NaCl 9 g l-1), containing Tween 80 (0.1% v/v) to remove microorganisms from the berries. 94
The suspensions were stirred for one hour at ambient temperature (approximately 20°C. 95
Fractions of 0.1ml of the diluted suspensions (from 10-1 to 10-8) were spread on Petri dishes 96
containing Rose Bengal agar medium and incubated at 25°C. After 7 days incubation, 97
colonies were counted, isolated in pure culture and maintained on Potato Dextrose Agar 98
(PDA; BioMérieux, Marcy l’Etoile, France). Amongst the isolated strains, Penicillium 99
expansum was identified at the laboratory according to macroscopic criteria (Samson et al., 100
2004). 101
102
Media and incubation devices 103
104
Czapek broth (Difco) solidified by agar (15 g l-1) was used as basal medium (Raper and 105
Thom, 1949). Cultures of P. expansum were incubated in the range 10-30°C. The effect of 106
CO2 was investigated in incubators with atmospheres containing 0.03, 1.5 and 3.0 % CO2. 107
Supplementation in copper sulfate (CuSO4, 5H20) was tested in the range 0-76.5mg l-1of 108
copper. Petri dishes were incubated for 7 days in hermetically closed devices that contained 109
water to maintain a constant relative humidity throughout the experiments as described 110
previously (Sautour et al., 2001a). 111
124
Quantification of geosmin 112
113
The sporulating mycelium and the agar medium (approximately 15 ml) were removed from 114
the plate and mixed into 100ml of absolute ethanol solution (20% v/v) with a magnetic stirrer 115
at 250 rpm 20°C for 1h. After filtering the mixture, a 6 ml aliquot of sample was diluted with 116
ultra pure water UHQ. According to Dumoulin and Riboulet (2004), geosmin was quantified 117
at Laboratoire Exact, (Macon, France). Briefly, geosmin (d5) was used as internal standard. 118
Solutions of geosmin and geosmin (d5) 10 µg. l-1 were prepared by dilution with absolute 119
ethanol. The volatile compounds were extracted by SPME fiber on a polydimethylsiloxane 120
(PDMS) at 40°C for 30 min. SPME fiber were desorbed for 10 min in the injector of a gas 121
chromatograph coupled to a mass spectrometer ion trap. The separation of volatile 122
compounds was conducted on a capillary column VF5-MS (VARIAN). Identification of 123
geosmin and geosmin (d5) was performed in MS/MS fragmentation ion selective 112 and 124
114, respectively. Quantification was based on the ions son 97 (geosmin) and 99 (geosmin 125
(d5)). Limits of detection and quantification of geosmin were 5 and 10 ng l-1, respectively. 126
127
Experimental matrix 128
129
An experimental domain was defined over 10-30°C, cupper 0.00-63.75 mg l-1 and CO2 0.03-130
3.0%. The Doehlert design allows the description of a region around an optimal response and 131
contains k2 + k + 1 points for k factors. For 3 factors, a set of 13 experiments was required 132
and, in that case, one of the properties of the Doehlert design is the uniform distribution of the 133
experiments in a three-dimensional space (Sautour et al., 2001b). Thus, 12 experiments are 134
equidistant from a central experiment (Experiment 13) having the coded values: (0, 0, 0). 135
Experimental values are listed in Table 1. 136
125
Analysis and interpretation of the results 137
138
The experimental response, Y, was the concentration of geosmin ng l-1. A second-order 139
polynomial relationship which included quadratic terms was used to determine the optimum 140
or minimum conditions for geosmin accumulation. 141
142
Y = b0 + b1X1 + b2 X2 + b3 X3 + b11 X12 + b22X2
2 + b33 X32 + b12 X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 143
where X1 (temperature), X2 (copper) and X3 (CO2) = coded factors studied. 144
145
Multiple regression analysis based on the least square method was performed by using 146
Nemrodw software (LPRAI, Marseille, France). The analysis concerned the linear and 147
quadratic effects of the three factors and their interactions. The significance of the coefficients 148
was evaluated by multiple regression analysis based upon the F-test with unequal variance, 149
P<0.05 (*) and P<0.01 (**). 150
151
Results 152
153
The concentrations of geosmin are shown on Table 1. Regardless of temperature and CO2 154
level, high concentrations of geosmin, greater than 1500 ng l-1, were obtained at 76.5 mg l-1 155
copper. In contrast, for copper free media, concentrations of geosmin remained less than 100 156
ng l-1. There is a trend in an increase of geosmin production with increasing copper 157
concentration. The highest geosmin concentration, 3150 ng l-1, was exhibited at 63.75 mg l-1 158
copper, 0.03% CO2 and 20°C. Production of geosmin was stimulated at 0.03% CO2. In 159
contrast, at 3% CO2, concentrations of geosmin were less than 15 ng l-1. The effect of 160
temperature on geosmin production was less clear and required a statistical analysis. 161
126
The model coefficients of the polynomial model were listed on Table 2. The b0 162
coefficient represented the concentration of geosmin produced at 20°C, 38.25 mg l-1 copper 163
and 1.5% CO2, experiment 1. The estimated value by the model, b0=10 ng l-1, was close to the 164
experimental datum, 5 ng l-1. However, compared to the high concentrations detected in other 165
experiments, 10 ng l-1 was a low concentration and b0 was not a significant parameter of the 166
model. In contrast, b1 was a significant parameter of the model. The negative value indicated 167
that greater concentrations of geosmin can be obtained at 10°C than at 30°C. In contrast, the 168
positive value of b2 was synonymous for greater concentrations of geosmin at 76.5 mg l-1 169
copper than at 0 mg l-1. More geosmin can be produced at 0.03% CO2 than at 3%, as 170
suggested by the negative value of b3. The significance of the main effects of the factors, X1 171
(temperature), X2 (copper) and X3 (CO2) can be ranked according to the absolute value of the 172
model coefficients. In the experimental domain, |b1|<|b3|<|b2|, thus by an increasing order of 173
importance, the most important factors were temperature, CO2 and copper. 174
Compared to the quadratic effects of copper and CO2, that one of temperature was not 175
significant as demonstrated by the p-value, 29.3, reported for b11, Table 2. The interaction 176
effect between temperature and copper was not significant either as highlighted by the p-177
value, 13.8, for b12. In contrast, significant interaction effects were shown between 178
temperature and CO2, b13 = 1181.3, and between copper and CO2, b23 = -1088.6. Both these 179
effects were synergistic. Assuming the terms b1.X1 and b3.X3 positives, X1 and X3 should 180
be negatives, due to b1 and b3 also negatives. The term b13.X1.X3 was positive, such as the 181
other terms b1.X1 and b3.X3, thus increasing the production of geosmin. Similarly, assuming 182
the terms b2.X2 and b3.X3 positives, X2 should be positive and X3 negative due to b2>0 and 183
b3<0. The effect of interaction between the factors X2 (copper) and X3 (CO2) was synergistic 184
because b23.X2.X3 was positive. The polynomial model associated with the surface response 185
127
methodology can be used also as a predictive model as suggested by a regression coefficient 186
close to one, r2 = 0.99. 187
At 1.5 % CO2, the estimated geosmin concentrations were shown as a function of 188
temperature and copper, Fig. 1. For copper concentrations less than 38.25 mg l-1 and at 189
temperatures greater than 20°C, no geosmin can be produced according to the model. In 190
contrast, at 15°C, 76.5 mg l-1 copper, the value of geosmin predicted by the model was greater 191
than 2500 ng l-1. This result was in accordance with the experimental value, 2620 ng l-1, 192
obtained for experiment 6, Table 2. 193
At 38.25 mg l-1 copper, no geosmin can be produced at temperature in the range [20, 194
30°C] and CO2 in the range [1.5, 3%]. However, whatever the temperature, at the atmospheric 195
CO2 concentration, 0.03%, a significant concentration of geosmin can be produced according 196
to the model, Fig. 2. 197
At 20°C, no geosmin can be produced at copper concentrations less than 38.25 mg l-1 198
and at CO2 levels in the range [1.5, 3%], Fig. 3. In the lower right quarter of the graph, a clear 199
increase of the concentration of geosmin was described with increasing the concentration of 200
copper. The maximum response curve was set to 2500 ng l-1 geosmin, but 3150 ng l-1 was 201
obtained at 20°C, for 63.75 mg l-1 copper and 0.03 % CO2, experiment 10. 202
203
Discussion 204
205
In this experimental domain, temperature was significant. It was shown that geosmin 206
production was enhanced at 10°C. In contrast the biomass produced at 10°C was less than that 207
produced at 30°C. Therefore, the specific geosmin production was greater at 10°C than at 208
30°C. Saadoun et al. (2001) analysed the geosmin production by the cyanobacteria Anabaena 209
sp. They noticed that the ratio of the geosmin produced to the biomass was maximum at 15°C 210
128
whereas the geosmin production by the cyanobacteria greatly decreased above 20°C. Geosmin 211
production was negatively affected by an increase of CO2 concentration. Whatever the levels 212
of copper content and temperature, the geosmin production remained close the limits of 213
quantification. It was shown that elevated carbon dioxide concentrations decreased the 214
production of geosmin in Streptomyces albidoflavus (Sunesson et al., 1997). The decrease in 215
the production of secondary metabolites at elevated CO2 concentration was observed for other 216
fungi. At 20% CO2 concentration, a low biomass and penicillin concentrations were reported 217
by Ho and Smith (1986) thus indicating an inhibition of both primary and secondary 218
metabolism. To inhibit P. verrucosum growth and OTA production by 75% Cairns-Fuller et 219
al (2005) showed that at least 50% CO2 was needed. It is worth keeping in mind that elevated 220
CO2 may impact the production of geosmin in combination to other factors such as copper 221
concentration as suggested by the results of the present study. 222
Up to 3150 ng l-1 geosmin were produced on Czapeck agar after 7 days incubation at 223
20°C and 63.75 mg l-1 copper under atmospheric CO2. But, important geosmin concentrations 224
can also be obtained in less favourable conditions under atmospheric CO2. For example, 1939 225
ng l-1 at 15°C and 25.50 mg l-1 copper. It is difficult to correlate the concentrations of geosmin 226
obtained in this study with the concentrations that can be found in wine. But, due to a very 227
low perception threshold, earthy/musty odors may be detected in wines for environmental 228
conditions far from the optimum ones. 229
129
Conclusions 230
231
It is difficult to correlate the concentrations of geosmin obtained in this study with the 232
concentrations that can be found in wine. But, due to a very low perception threshold, 233
earthy/musty odors may be detected in wines for environmental conditions far from the 234
optimum ones. The enhancement of geosmin production in P. expansum was demonstrated at 235
low temperatures, high copper content and atmospheric CO2 concentration. However, the 236
concentrations of geosmin found in this study were obtained on Czapek agar. The 237
concentrations of geosmin produced by P. expansum should also be evaluated on grapes and 238
correlated to the quantities of geosmin detected in wine. The mechanisms that could explain 239
the role of cupper in the enhancement of geosmin production remained unknown. More 240
studies should be conducted to quantify more accurately the effect of cupper on the growth 241
and on the production of geosmin in P. expansum on grapes. 242
243
244
Acknowledgements 245
Authors wish to thank the National Program on earthy/musty taste of vine (FRANCE 246
AGRIMER, Paris) 247
248
130
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358
135
Figure captions 359
360
Figure 1 Contour plot of the influence of copper and temperature on the production of 361
geosmin on Czapek agar by Penicillium expansum at 1.5% CO2. 362
363
Figure 2 Contour plot of the influence of CO2 and temperature on the production of geosmin 364
on Czapek agar by Penicillium expansum at 38.25 mg l-1. 365
366
Figure 3 Contour plot of the influence of CO2 and copper on the production of geosmin on 367
Czapek agar by Penicillium expansum at 20°C. 368
369
370
136
371
372
Fig. 1 373
137
374
375
Fig. 2 376
138
377
378
Fig. 3 379
380
139
Table 1 Experimental values for assessing the influence of factors (temperature, cupper 381
concentration and CO2) on the production of geosmin by Penicillium expansum on Czapek 382
agar. 383
384 Experiment Coded values Experimental values Response
X1 X2 X3 Temperature °C Copper mg l-1 CO2 % Geosmin ng l-1
1 +1 0 0 30 38.25 1.5 5 2 -1 0 0 10 38.25 1.5 710 3 +0.5 +0.866 0 25 76.50 1.5 1659 4 -0.5 -0.866 0 15 0.00 1.5 84 5 +0.5 -0.866 0 25 0.00 1.5 17 6 -0.5 +0.866 0 15 76.50 1.5 2620 7 +0.5 +0.289 +0.816 25 51.00 3.0 5 8 -0.5 -0.289 -0.816 15 25.50 0.03 1939 9 +0.5 -0.289 -0.816 25 25.50 0.03 300 10 0 +0.577 -0.816 20 63.75 0.03 3150 11 -0.5 +0.289 +0.816 15 51.00 3.0 13 12 0 -0.577 +0.816 20 12.75 3.0 10 13 0 0 0 20 38.25 1.5 10
385
386
387
Table 2 List of model coefficients and p-values 388
389
390
391
392
393
394
395
Coefficient Value p-value b0 10.0 96.6 b1 -510.6 1.78 b2 1197.5 0.117 b3 -1094.3 0.158 b11 347.5 29.3 b22 1330.9 1.48 b33 919.6 3.89 b12 -516.2 13.8 b13 1181.3 2.45 b23 -1088.6 3.07
140
3. IV. 2. CONCLUSIONS
De fortes quantités de géosmine sont produites à basse température, CO2 ambiant et
forte concentration en cuivre. Grâce à la matrice de Doehlert, on a pu observer que la
température et la teneur en cuivre sont des facteurs importants dans la production de
géosmine. 3150 ng/L de géosmine ont été produites à 20 °C et 63,75 mg/L de cuivre.
Le cuivre résiduel retrouvé sur les raisins, après les traitements par des fongicides,
peut stimuler la production de géosmine par P. expansum. Néanmoins, avec ce plan à 13
expériences, les conditions conduisant à la production minimale de géosmine ont pu être
définies. Cependant, la production de géosmine a été décrite sur milieu gélosé modèle. Elle
doit maintenant être confirmée sur matrice raisin.
141
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
L’objectif de cette étude est de répondre aux problèmes posés par l’apparition
d’arômes terreux dans les vins, dépréciant ainsi leur qualité et entraînant des pertes pour les
viticulteurs.
La principale molécule responsable de ces altérations est la géosmine. Les
observations effectuées sur le terrain et les enquêtes auprès des viticulteurs révèlent que le
défaut terreux est déjà perçu au niveau de la grappe.
Parmi la microflore indigène de la pellicule du raisin, une partie a été identifiée
comme responsable des déviations organoleptiques. P. expansum est connu en tant que
producteur de géosmine (Dionigi et al., 1996).
La présence de déviations organoleptiques dans des nombreux cépages nous a motivés
à une étude approfondie de la microflore des baies de raisins en Bourgogne. L’influence des
facteurs environnementaux et nutritionnels, sur le développement des moisissures
productrices de géosmine, représente notre principal objectif.
Les résultats obtenus lors de l’identification morphologique et moléculaire ont mis en
évidence la présence majoritaire de Botrytis sp. et Penicillium sp. en Bourgogne, des genres
caractéristiques comme contaminants de la vigne (La Guerche et al., 2006).
La validation du modèle prédictif sur baies de raisins, nous a permis de déterminer les
taux de croissance des champignons testés, si les conditions avaient été optimales, en tenant
compte du fait que certains facteurs intrinsèques du raisin (comme l’aw interne de la baie) ne
peuvent pas être modifiés. Cette étude est un outil indispensable qui pourra être utilisé par la
suite, pour valider un modèle prédictif sur d’autres produits alimentaires.
L’effet du cuivre sur le temps de latence et la croissance de B. cinerea et P. expansum
a permis de déterminer les concentrations minimales inhibitrices en cuivre (CMI)
correspondantes, lesquelles, à notre connaissance, n’ont pas été précédemment rapportées
dans la littérature par le biais des modèles prédictifs. L’originalité de cette étude a été
d’utiliser un modèle qui détermine la CMI par l’intermédiaire du temps de latence, dû au
comportement spécifique de B. cinerea en présence de cuivre, et non pas par l’intermédiaire
de la croissance comme cela a été fait auparavant (Dantigny et al., 2005b). Les moisissures
testées ce sont montrées résistantes au cuivre, P. expansum c’est développé jusqu’à 4 mM de
cuivre tandis que les deux souches de B. cinerea, BC1 et BC2, jusqu’à 8 et 7 mM de cuivre.
Ces concentrations sont donc suffisantes pour contrôler le développement des moisissures
142
contaminantes de la vigne. Les fongicides doivent être dosés et appliqués en conséquence. La
toxicité mesurée au laboratoire doit être confirmée par des expériences dans le vignoble, pour
étudier la réponse des moisissures envers une toxicité à long terme due à l’accumulation du
cuivre.
Des études peuvent être envisagées afin de déterminer la variation, sur plusieurs
années, de la concentration en cuivre sur la pellicule du raisin et étudier la corrélation de
celle-ci, avec la présence de P. expansum et la quantité de géosmine. Des méthodes de dosage
du cuivre sur le raisin ont été déjà mises au point dans le laboratoire.
L’étude des effets combinés de facteurs environnementaux et nutritionnels sur la
production de géosmine par P. expansum a mis en évidence un accroissement de la
production avec l’augmentation de la concentration en cuivre. Ces résultats confirment les
résultats antérieurs de Dionigi et al., (1996) et apportent des réponses supplémentaires, car les
concentrations testées dans notre étude sont nettement supérieures à celles testées
précédemment (1,2 mM par rapport à 0,08 mM). Après 7 jours de culture sur milieu de
Czapek, 3150 ng/L de géosmine sont produites par P. expansum à 20 °C et à 1 mM cuivre.
Le cuivre à un effet activateur sur la production de géosmine et cet effet est maximisé par une
température sous-optimale de 20 °C. Cela apporte des informations au niveau du vignoble :
notamment durant la période antérieure à la vendange, pendant laquelle la concentration en
cuivre sur les raisins est la plus faible, en raison de l’arrêt des traitements par les fongicides,
on est alors pour ce facteur dans les conditions minimisant la production de géosmine par P.
expansum.
En perspective il sera intéressant de comprendre le mécanisme d’action du cuivre sur
la production de géosmine. Des expériences ont été menées au laboratoire pour identifier le
gène qui code pour l’aristolochène synthase, dernière enzyme qui intervient dans la voie de
biosynthèse de la géosmine, déjà décrite chez P. roqueforti (Caruthers et al., 2000). Ce travail
permettra de donner de bonnes bases pour continuer à élucider la voie de biosynthèse de la
géosmine. Par la suite, la (+) aristolochène pourra être déterminée par SPME à partir des
cultures de P. expansum sur milieu solide supplémenté en cuivre, afin d’étudier si l’effet du
cuivre est corrélé à la dernière étape enzymatique dans la voie de biosynthèse de la géosmine
(Demyttenaere et al., 2002).
En conclusion, le travail de cette thèse a contribué à la caractérisation d’une espèce (P.
expansum) responsable du défaut organoleptique dû à la géosmine, au moyen des outils de la
mycologie prévisionnelle. Il a permis de tester les effets des facteurs liés à la production de
143
géosmine, et en particulier de vérifier sur milieu modèle l’effet du cuivre, élément actif des
fongicides.
En perspective, une connaissance de la germination de spores de B. cinerea et P.
expansum, en fonction du cuivre, apportera des informations supplémentaires en ce qui
concerne les mécanismes de résistance aux fongicides. La méthodologie expérimentale, déjà
mise au point durant le travail de Master Recherche (Judet et al., 2008, Annexe 1) pourra être
utilisée et adaptée. La germination des spores de B. cinerea et P. expansum sera observée
dans une solution d’eau physiologique supplémentée en cuivre, a travers la boîte de Petri. Les
observations microscopiques de la germination peuvent être un point de départ pour la
compréhension des mécanismes de résistance au cuivre. Le nouveau modèle de germination
qui permet de décrire les différentes types de courbes de germination (Dantigny et al., 2011,
Annexe 2) sera très outil car on ne connaît pas encore le type de courbe de germination des
spores en fonction du cuivre.
144
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ANNEXE 1
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ANNEXE 2
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ANNEXE 3
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Effets du cuivre et de la température sur la croissance de moisissures d’altération de la vigne. Claudine Charpentier1, Daniela Correia-Judet2, Brigitte ROUX 2, Philippe Dantigny3, Maurice Bensoussan2 1Université de Bourgogne-UMR INRA 1131-IUVV-Dijon-France 2Université de Bourgogne-GTR MycoSMAE-AgroSup Dijon-France 3Université de Bourgogne-GPMA-AgroSup Dijon-Dijon-France Publié dans la Revue des œnologues nr. 139 1. Introduction 1.1. L’origine biologique de l’odeur de terre. Des odeurs de terre émanant de certaines eaux ont été décrites depuis longtemps (Medsker et al., 1968 ; Rosen et al., 1970 ; Piet et al., 1972). Ainsi, le lac Ontario, qui est la source d'eau potable de plusieurs millions de consommateurs connaît, dans sa portion nord-ouest, des épisodes pendant lesquels l'eau dégage une odeur terreuse. Ces épisodes surviennent la fin de l'été et en automne, associés à la prolifération de bactéries filamenteuses comme les Actinomycètes (Scholler et al., 2002), lesquelles sont à l’origine de concentrations élevées de géosmine et de 2-méthylisobornéol ayant des niveaux de perception très bas (Gerber, 1977; Ridal et al, 1999). 1.2. Le gout moisi-terreux dans les vins Dans le vin, l’odeur terreuse a été associée à certaines conditions de stockage et de conditionnement, parfois teintées de goût de bouchon (Silva Pereira et al., 2000). Mais, au niveau des raisins, l’odeur de terre a été mise en évidence, dès 1992, dans le Val de Loire sur le cépage Chenin et, depuis lors, ce défaut est apparu en 1999 dans le Beaujolais et en Bourgogne et s’est répandu, avec plus ou moins d’intensité, dans plusieurs régions viticoles comme le Bordelais, l’Alsace et le Jura avec un impact sur l’économie du vin en 2002 et en 2004. Ainsi, une diversité de composés responsables ont pu être identifiés (Tableau 1). L’origine fongique des molécules associées au goût moisi-terreux a été démontrée (Darriet et al., 2000), mais, seule la géosmine s’est révélée non dégradée lors de la fermentation alcoolique. 1.3. Le cuivre et les traitements antifongiques L'activité biocide du cuivre est connue depuis longtemps. La recette d’un pesticide (algicide et fongicide) dans lequel l’acidité du sulfate de cuivre est neutralisée par de la chaux éteinte (CuSO4 + Ca(OH)2), date du début des années 1880, mise au point par Ulysse Gayon et Alexis Millardet lors de leur collaboration pour protéger les vignes du « mildiou » (Plasmopara viticola) venu d’Amérique. Utilisée en 1885 dans le Bordelais, la « bouillie bordelaise » contient 20% (m/m) de cuivre. Depuis cette date, le cuivre est entré dans la composition de fongicides appartenant à diverses familles chimiques (sulfates, hydroxydes, oxychlorures, ...) et, suite aux traitements préventifs de la vigne, les niveaux de cuivre peuvent atteindre de fortes concentrations dans l’environnement des ceps (Brun et al., 2001). Paradoxalement, cet état favorise la prolifération et la persistance de spores du genre Penicillium. Yamamoto et al. (1985) ont ainsi montré que le genre Penicillium était prédominant dans des sols pollués par le cuivre. Or, il a été démontré que la production de
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géosmine par P. expansum est stimulée par la présence de cuivre (Dionigi et Ingram, 1994). Des études préliminaires sur milieu modèle, en cultures pures et en co-cultures de Botrytis cinerea et Penicillium expansum, ont depuis lors montré que le 2-méthylisobornéol est produit par les moisissures du genre Botrytis et que la géosmine est produite, entre autres, par Penicillium expansum (Charpentier et al., 2006). Ces deux composés qui dérivent de la voie du mévalonate, sont des terpénoides. Ils sont considérés comme des métabolites secondaires, car leur niveau de biosynthèse n’est pas constant et varie selon les effets de facteurs biotiques ou abiotiques conditionnant la croissance des moisissures impliquées. Il est aussi généralement connu que, comme chez tout microorganisme, la température influence les cinétiques de croissance des moisissures (Sautour et al, 2001). De ces constatations, a découlé l’étude des effets de deux facteurs environnementaux (la teneur en sel de cuivre et la température de l’ambiance) sur les croissances de Botrytis cinerea et Penicillium expansum. En parallèle, les niveaux de production de géosmine par les deux souches de Penicillium expansum isolées du Val de Loire pour l’une, de la Côte bourguignone, pour l’autre ont été recherchés. 2. Matériels et Méthodes 2.1. Les microorganismes : échantillonnage, dénombrement, identification. Des grappes de Pinot Noir, des feuilles et des échantillons de sol ont été prélevés sur des parcelles de la commune de Morey-St Denis (Côte d’Or) à l’automne 2007. Chaque grappe est lavée pendant une heure dans un volume d’eau physiologique (NaCl/eau distillée, 0,9 % m/v) de même poids, contenant du Tween 80 (0,1%, v/v; MERCK-Eurolab, Lyon, France) pour mettre en suspension les micro-organismes présents à la périphérie des baies. A partir
des dilutions de 10-1 à 10
-8 de chaque suspension de lavage, des fractions de 0,1 ml sont
ensuite étalées au râteau sur milieu gélosé au Dichloran-rose Bengale (King et al., 1979) et incubées à 25°C. Après 7 jours d’incubation, les moisissures sont dénombrées et isolées en culture pure. Leur identification est effectuée selon des critères morphologiques et physiologiques (Pitt et Hocking, 1999; Samson et al., 2004). Pour les souches de P. expansum, l’identification à été confirmée par analyse biomoléculaire des séquences de β-tubulines (Glass et Donaldson, 1995). Ainsi, deux souches de Botrytis cinerea (Bc1 et Bc2) et une souche de Penicillium expansum (Pe25.3) provenant des vignes de Morey-St Denis ont été sélectionnées dans cette étude, à laquelle a été associée une souche de P. expansum (Pe1619) provenant du Val de Loire, fournie par l’ITV de Tours. 2.2. Milieux. Les moisissures sont entretenues sur gélose glucosée à l’extrait de pomme de terre (Potato Dextrose Agar, PDA; Ainsworth et Bisby, 1945). Le milieu de base pour l’étude de la croissance et la production de géosmine est le bouillon de Czapek (CZ-broth, Difco ; d’après Thom et Raper, 1945.), solidifié par de l’agar (15 g.L-1) et supplémenté en cuivre (sous forme de sulfate pentahydraté - Sigma-Aldrich; Dionigi et al., 1996) sur une gamme de treize concentrations : 0 ; 0,2 ; 1 ; 1,2 mM.L-1, puis neuf autres concentrations jusqu’à 10 mM.L-1 (soit : 0,00; 12,70; 63,54; 76,25; 127,08; 190,62; 254,16; 317,70; 381,24; 444,78; 508,32; 571,86 et 635,40 mg.L-1). 2.3. Inoculation et dispositif d’incubation Les moisissures sont initialement incubées à 25°C sur milieu PDA, dans une enceinte close pour maintenir constante l’humidité ambiante (Figure 1). Au bout de 7 jours, les spores sont récoltées, dénombrées sur cellule de Malassez et mises en suspension dans de l’eau
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physiologique. 10µL de suspension (standardisée à 106 sp.mL-1) sont déposés au centre de chaque boite de milieu de Czapek. Pour chaque concentration en cuivre, les cultures sont incubées à trois températures 15, 20 et 25°C, choisies en fonction des températures optimales (Topt) de ces espèces déterminées par Correia-Judet et al. (2010). 2.4. Recherche et dosage du cuivre Huit semaines après la dernière application de fongicide à base de cuivre sur les parcelles, soit une semaine avant la vendange, trois types d’échantillons ont été prélevés au niveau de trois ceps: baies de raisin, feuilles et sol superficiel. Le taux de cuivre endogène ou résiduel a été recherché par spectrophotométrie d’absorption atomique après minéralisation par voie humide selon la norme NF ISO11466 (X31-415). 2.5 Détection et dosage de la géosmine L‘analyse olfactive des cultures à l’issue de la période d’incubation de 7 jours a permis de vérifier l’apparition de l’odeur moisie-terreuse (GMT). Une procédure de caractérisation en deux temps est alors appliquée : - la première permet une analyse sensorielle découlant d’un flairage direct des atmosphères sus-jacentes aux cultures par un jury entraîné, - la seconde permet d’obtenir des signatures instrumentales et des valeurs quantitatives. Les composés volatils des cultures en boites de Petri sont concentrés après inclusion de la totalité du milieu gélosé avec sa colonie mycélienne dans un mélange alcool absolu/eau déminéralisée (20%, v/v) . Détection et dosage sont effectués par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse selon le protocole de Dumoulin et Riboulet, (2004). Dans ces conditions, les performances de la méthode d’extraction sont les suivantes : limite de détection : 5 ng.L-1 ; répétabilité sur 2 fois 5 mesures : 6,7% à 10 ng.L-1 et 6,1% à 100 ng/litre ; linéarité entre 10 et 200 ng.L-1 avec un facteur de corrélation R2 = 0,999. 3. Résultats 3.1 Analyse de la microflore fongique du vignoble de Morey-St Denis. 3.1.1 Aspects quantitatifs de la contamination Des échantillons de raisins ont été prélevés sur 5 parcelles de vignobles de Morey-St Denis (Côte d’Or) associées au défaut GMT. Les grappes (45 à 260 g) de raisins visiblement contaminés par Botrytis sp., ou d’autres moisissures, ont été lavées par une masse équivalente d’eau physiologique additionnée de Tween 80 à 0,1% (v/v). Les dénombrements effectués sur l’eau de lavage permettent d’apprécier la charge fongique (Tableau 2) en Unités Formant Colonies par gramme de raisin (UFC.g-1). Dans l’ensemble, le taux de contamination des raisins apparaît assez homogène et ne dépasse pas les 104 UFC.g-1. 3.1.2 Aspects qualitatifs de la contamination D’un point de vue qualitatif, l’identification d’une centaine de contaminants fongiques a révélé la présence prédominante de quelques genres de moisissures. Par ordre de fréquence décroissante, on remarque: Botrytis (53 %), Penicillium (23 %), Cladosporium (5 %), Aspergillus (3 %), et d’autres genres (17 %). Ces résultats confirment les identifications de la flore d’altération de la vigne rapportées par les travaux de Fleet (2003) et de Loureiro et Malfeito-Ferreira (2003). Après analyse biomoléculaire au moyen des amorces de β-tubulines BT2a et BT2b, une seule moisissure a été identifiée à l’espèce Penicillium expansum (Pe25.3). Elle a été intégrée à l’étude en cours avec une autre souche de P.
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expansum (Pe1619) provenant du Val de Loire et avec deux souches de Botrytis cinerea (Bc1 et Bc2) provenant de Morey-St Denis. 3. 2. Le cuivre dans le vignoble Les trois étages d’échantillonnage choisis dans le vignoble de Morey-St Denis témoignent de l’homogénéité de la distribution du cuivre total dans les compartiments analysés huit semaines après la dernière pulvérisation de bouillie bordelaise. Les teneurs moyennes en cuivre exprimées en ppm par rapport à la matière sèche (Figure 2) sont inférieures à 6 ppm pour les baies de Pinot Noir, à 400 ppm pour les feuilles et à 800 ppm pour le sol.
- les raisins : des teneurs en cuivre total allant de 2,95 à 5,28 ppm (mg/g de baies de raisin) témoignent de l’efficacité des précipitations estivales. Ces concentrations résiduelles en cuivre sont à rapprocher des recommandations de l’OIV pour les vins (1 ppm, soit 1 mg.L-1: www.oiv.org), mais, elles sont cependant comparables aux valeurs de 1,46 à 3,43 ppm relevées dans des jus de raisins en bouteilles de verre (Schiavo et al., 2008). Néanmoins, ces concentrations en cuivre mesurées au niveau des baies de Pinot Noir sont toutes inférieures à celles trouvées par Garcia-Esparza et al. (2006) lors d’un échantillonnage (n=22) de raisins rouges italiens (11,32 ppm ± 8,61).
- les feuilles : le dosage du cuivre n’a porté que sur des portions du limbe; les niveaux
de 334 à 393 ppm trouvés à Morey-St Denis sont supérieurs aux faibles concentrations (17 à 34 ppm) observées sur des feuilles d’un vignoble allemand (Gaertel, 1959), mais bien inférieurs aux résultats (500 à 1490 ppm) obtenus dans un vignoble portugais de la plaine de Porto (Margalhaes et al., 1985). Molot et Gaimon (2004) ont modélisé que la perte de cuivre par lessivage était de nature hyperbolique, baissant jusqu’à 40% de la dose initiale après 50 mm de pluie artificielle. Néanmoins, bien que ces vignobles se situent dans trois zones géographiques aux conditions météorologiques différentes, en l’absence de relevés précis, il est difficile de supposer que ces différences de concentrations en cuivre résiduel sur les feuilles pourraient être uniquement liées aux différences de précipitations. Par ailleurs, compte tenu de la permanence de ces quelques centaines de ppm de cuivre résiduel, en Bourgogne, comme au Portugal, aucun symptôme chlorotique ou nécrotique n’a été observé sur les feuilles.
- les sols : les prélèvements de sol ont été effectués dans les trois premiers cm de
l’horizon superficiel. On y a retrouvé de 602 à 765 ppm de cuivre total. Ce qui situe les parcelles étudiées du vignoble de Morey-St Denis dans la moyenne des sols viticoles de France, où l’on trouve des concentrations de 100 à 1500 mg.kg-1 (Flores-Veles et al., 1996), résultat d’un dépôt annuel de 600 tonnes de cuivre via les pesticides ou les engrais à base de composés organo-métalliques. Ces teneurs sont à comparer aux concentrations en cuivre dans les sols non touchés par l'action humaine, lesquels se situent sur une plage allant de 2 à 50 mg.kg-1 avec une valeur moyenne d'environ 10 mg.kg-1 (McKenzie, 1966).
Ainsi, dans les parcelles étudiées, le niveau de cuivre atteint, est tel que cet environnement restera encore longtemps marqué par son passé riche en fongicide à base de cuivre. Or Yamamoto et al. (1985) ont montré que le genre Penicillium était prédominant dans des sols pollués par le cuivre.
174
3. 3. Effets de la température et de la teneur en cuivre sur la croissance mycélienne. 3.3.1. Cas de Botrytis cinerea L’augmentation de la teneur en cuivre se traduit, initialement, par un accroissement du diamètre des colonies mycéliennes. Ainsi, l’effet du cuivre sur la croissance de B. cinerea1 et B. cinerea2 est positif jusqu’à une concentration de 200 à 300 mg.L-1, concentration-seuil qui varie en fonction de la température d’incubation et de la souche (Figures 3a et 3b). Bien qu’un effet-souche soit visible, du fait des profils de croissance qui ne sont pas superposables, c’est aux températures de 20 et 25°C que les colonies mycéliennes exhibent les plus grands diamètres. Ces deux valeurs de température encadrent la température optimale déterminée par Correia-Judet et al. (2010) pour B. cinerea1 (Topt= 21,4 °C ± 0,6 °C). Néanmoins, pour B. cinerea1 et B. cinerea2, l’effet positif du cuivre sur la croissance est maximal à 20°C à la concentration de 3 mM. L-1 (190,62 mg.L-1). Au delà de 3 mM.L-1, la croissance mycélienne décroît fortement, sans qu’il y ait inhibition totale du taux de croissance pour les teneurs en cuivre les plus fortes. Au dessus de 8 mM.L-1, si la germination est encore possible aux trois températures, on ne note pas de croissance mycélienne appréciable à l’œil nu. 3.3.2. Cas de Penicillium expansum Dans le cas de Penicillium expansum, le taux de croissance optimal est bien inférieur à celui de Botrytis cinerea (Correia-Judet et al., 2010). Quelle que soit la température (Figures 4a et 5a), l’effet de faibles teneurs en cuivre sur la croissance mycélienne est peu perceptible pour des concentrations égales ou inférieures à 1, 2 mM (76,50 mg.L-1). En revanche, pour des concentrations en cuivre supérieures à 2 mM.L-1, la croissance décroît fortement. Au delà de 5 mM.L-1, la croissance apicale est de moins en moins perceptible et pour la souche isolée de Bourgogne (P. expansum 25.3) la germination est encore observée à 20°C jusqu’à la concentration de 10 mM.L-1.
3. 3. Effets de la température et de la teneur en cuivre sur la production de géosmine par Penicillium expansum.
Les fortes productions de géosmine par P. expansum 25.3 et P. expansum 1619 sont le plus fréquemment observées à 15 et 20°C (Figures 4b et 5b), soit à quelques degrés en dessous de la température optimale de croissance (Topt= 23,9 ± 1°C; Correia-Judet et al., 2010). Néanmoins, pour de faibles concentrations en cuivre, on note que, quelque soit la température, l’effet du cuivre est fortement positif jusqu’à 1 mM.L-1 (P.expansum 25.3) ou 1,2 mM.L-1 (P. expansum 1619). 3.4.1. Cas de P. expansum 25.3 De la culture témoin sans cuivre jusqu’à la culture en présence de 1 mM.L-1, en fonction de la température, les performances de la culture de P. expansum 25.3 se traduisent à 15 et 25°C, d’une part, et à 20°C d’autre part, par des multiples de production de géosmine de 200 et de 400 respectivement, pour atteindre 2000 ng.L-1 à 20°C. Au delà de 1 mM.L-1, l’effet du cuivre s’inverse et la production de géosmine fléchit fortement, pour passer dès la concentration en cuivre de 5 mM.L-1 (317,70 mg L-1) sous le seuil de détection. 3.4.2. Cas de P. expansum 1619 Bien que la production de géosmine de cette souche provenant du Val de Loire se situe à un niveau 10 fois plus faible que celle de P. expansum 25.3, les tendances de production de géosmine liées à l’augmentation de la teneur en cuivre sont identiques. La production de géosmine passe par un maximum (à 1,2 mM.L-1, 76,5 mg.L-1), est ensuite suivie d’une
175
décroissance, puis, au delà d’une teneur en cuivre de 5 mM.L-1, passe également sous le seuil de détection. 4. Discussion Le cuivre, comme cofacteur de plusieurs enzymes, est un élément essentiel pour les êtres vivants. Mais, si à de fortes concentrations, il peut entraîner l’apparition de radicaux libres hautement réactifs sur les structures cellulaires (Halliwell et Gutteridge, 1984), on note qu’il induit une résistance chez certains organismes. Ainsi, une partie de la flore fongique ayant la capacité de croître en présence de 1,6 mM de cuivre (100 mg) par kg de sol a été définie comme tolérante au cuivre (Wainwright et Gadd, 1977). Sur la base de leurs résultats de croissance, les souches de Botrytis cinerea (Figures 3A et 3B) et de Penicillium expansum (Figures 4a et 5a) peuvent être assimilées à cette mycoflore tolérante au cuivre. On remarque ainsi que jusqu’à 4 mM.L-1 pour B. cinerea et jusqu’à 3 mM.L-1 pour P. expansum, leur croissance est largement égale ou supérieure à la croissance en l’absence de cuivre. Néanmoins, cette tolérance au cuivre est limitée car, au delà de ces concentrations-seuils, la réduction de la croissance apicale est manifeste. Une tolérance au cuivre et à d’autres métaux lourds a été attribuée à des mécanismes d’accumulation sous forme d’adsorption à la paroi fongique ou d’absorption intracellulaire, ou à une combinaison de ces deux mécanismes (Ahuja et al., 2001). L’effet du cuivre sur la production de géosmine par Penicillium expansum apparaît plus limité et sans relation étroite avec la croissance apicale. Indépendamment des différences entre les niveaux de production des deux souches de P. expansum, on note que le maximun de production de géosmine apparaît aux concentrations en cuivre de 1 et 1,2 mM.L-1. Lorsque s’amorce le fléchissement de la croissance apicale (vers 4 mM. L-1), les niveaux de production de géosmine avoisinent déjà le niveau de détection (5 ng.L-1). On sait que les métabolites secondaires, au sein desquels se classe la géosmine, ne sont pas essentiels au bon déroulement de la croissance. On pourrait ici supposer que comme dans le cas de certains végétaux (Cobbett et Goldsbrough, 2000), jusqu’à une concentration de 4mM. L-1, le champignon modifie son métabolisme avec la production de géosmine pour s’adapter à la présence dans son environnement d’un métal toxique comme le cuivre. Les voies de synthèse et le métabolisme de la géosmine par Penicillium expansum n’ont pas encore été établies. Darriet et al. (2000) ont montré que seule la forme (-) est synthétisée par Streptomyces et Penicillium. Chez Streptomyces, la voie de synthèse est étroitement liée à celle des terpénoïdes. Deux voies sont possibles, elles conduisent toutes deux à la formation de farnésyl pyrophosphate qui est transformé en géosmine. Une des réactions impliquée dans cette transformation ferait intervenir une cytochrome P450 oxydoréductase (Figure 6) dont l’activité serait influencée par le cuivre (Lamb et al., 2003) . 5. Conclusion Il résulte des cultures en milieu modèle présentés ici que le cuivre, jusqu’à des concentrations de 1 à 1,2 mM.L-1, selon la souche, entraîne un effet activateur sur la production de géosmine par P. expansum. Néanmoins, cet effet activateur du cuivre est maximisé par une température sous-optimale (20°C). Au niveau du vignoble, cela signifie qu’une limitation de la production de géosmine par P. expansum durant la période antérieure à la vendange, est liée à une
176
concentration en cuivre (issue de traitements préventifs) la plus faible possible, dans son environnement immédiat. Dans ces conditions, le faible taux de cuivre résiduel n’aurait pas de rôle activateur de la production de géosmine si la température ambiante venait se positionner pour quelque temps au dessus de la température optimale de croissance (Topt= 23,9 °C) .
177
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180
Liste des légendes
Tableaux Tableau 1. Le défaut moisi-terreux dans le domaine vinicole et les molécules impliquées Tableau 2. Charge fongique des raisins contaminés des vignobles de Morey-St Denis. Figures Figure 1. Dispositif d’incubation sous taux d’humidité contrôlé Figure 2. Le cuivre au niveau de la vigne Figure 3. Effets de la température et du cuivre sur la croissance de Botrytis cinerea1 (A) et Botrytis cinrerea2 (B). Figure 4. Effets de la température et du cuivre sur la croissance (A) et la production de géosmine (B) par Penicillium expansum 25.3 Figure 5. Effets de la température et du cuivre sur la croissance (A) et la production de géosmine (B) par Penicillium expansum 1619 Figure 6. Voie hypothétique de la synthèse de géosmine chez Penicillium expansum
181
Tableaux Tableau 1
Molécule Odeur Seuil olfactif dans le vin (ng/l)
Rémanence au cours de la vinification
Références
Géosmine Moisi, Terreux
50 Après la FA Darriet et al. 2000
2-méthylisobornéol Moisi, Terreux
55 Eliminé durant la FA La Guerche et al., 2003
(+) -Fenchol Terreux 50 000 (dans l’eau)
A un niveau inférieur au seuil olfactif
La Guerche et al, 2006
(+) -Fenchone Terreux 500 000 (dans l’eau)
A un niveau inférieur au seuil olfactif
La Guerche et al, 2006
2- méthoxy-3- isopropyl-pyrazine
Moisi 5 Rémanence partielle après la FA
Allen et al., 1991
2,4,6-trichloroanisole Moisi 3 Après la FA Alvarez-Rodriguez et al.,
2002
Tableau 2
Lieux de prélèvements
Valeurs extrêmes des masses des grappes (g)
Charge fongique initiale moyenne (milieu PDA)
UFC.g-1
Morey-St Denis 1 75 - 245 102 - 104
Morey-St Denis 2 105 - 260 102 - 104
Morey-St Denis 3 64 - 110 103 - 104
Morey-St Denis 4 45 -121 103 - 104
Morey-St Denis 5 75 -150 103 - 104
182
Figures
Figure 1
Figure 2
183
a
b
Figure 3
184
LDD < * Figure 4
185
LDD < * Figure 5
186
OPP
HO
Farnésylpyrophosphate
Hedycaryol
Géosmine
Cytochrome P450 oxydoréductase
OH Figure 6
187
ANNEXE 4
CORREIA (Judet) Daniela
A-Publications Judet, D., Matei - Radoi, F., Bensoussan, M., Jurcoane, S., 2006. Studies on Aspergillus flavus growth
and toxicity, Romanian Biotechnological Letters (2011 FI 0,152), 11 : 2593 - 2597. Judet, D., Bensoussan, M., Perrier - Cornet, J.M., Dantigny, P., 2008. Distributions of the growth rate
of the germ tubes and germination time of Penicillium chrysogenum conidia depend on water activity, Food Microbiology (2011 FI 3,216), 25 : 902 - 907.
Correia - Judet, D., Bollaert, S., Duquenne, A., Charpentier, C., Bensoussan, M., Dantigny, P., 2010. Validation of a predictive model for the combined effect of temperature and aw on growth of Botrytis cinerea and Penicillium expansum on grape berries, International Journal of Food Microbiology (2011 FI 3,011), 142 : 106 - 113.
Dantigny, P., Nanguy, M., Correia - Judet, D., Bensoussan, M., 2011. A new model for germination of fungi, International Journal of Food Microbiology (2011 FI 3,011), 146 : 176 - 181.
Charpentier, C., Correia, D., Dantigny, P., Bensoussan, M., 2011. Nouvelles données expérimentales concernant les effets du cuivre et de la température sur la croissance de moisissures d’altération de la vigne et la production de géosmine - responsable du goût moisi - terreux du vin, Revue des œnologues, 139.
Correia - Judet, D., Bensoussan, M., Charpentier, C., Dantigny, P. Combined effects of temperature, copper and CO2 on geosmin production by Penicillium expansum, Journal of Applied Microbiology, (2011 FI 2,098), soumis.
Correia - Judet, D., Charpentier, C., Bensoussan, M., Dantigny, P. Modelling the inhibitory effect of copper sulphate on the growth of Penicillium expansum and Botrytis cinerea, Food Research International (2011 FI 2,414), soumis.
B-Posters Correia - Judet, D., Olivier, F., Charpentier, C., Dantigny, P., Bensoussan, M. Earthy - Musty taste of
wine : an organoleptic deviation associated with the metabolism of fungal spoilage flora of grapes. 4ème Congrès International Goût - Nutrition - Santé, Dijon, France, 18 - 20 Mars, 2009.
Correia - Judet, D., Boivin, A.-L., Charpentier, C., Dantigny, P., Bensoussan, M. Earthy - Musty taste of wine : effects of temperature, carbon dioxide and copper on geosmin production by Penicillium expansum. 5ème Congrès International Goût - Nutrition - Santé, Dijon, France, 23 - 24 Mars, 2010.
Correia, D., Boivin, A.-L., Charpentier, C., Dantigny, P., Bensoussan, M. Earthy - Musty taste of wine : application of a Doelhert design to determine the combined effects of environmental factors on geosmin production by Penicillium expansum. XVIème Forum des jeunes chercheurs, Besançon, France, 7 - 8 Juin, 2010.
Correia - Judet, D., Dantigny, P., Bensoussan, M., Charpentier, C. Geosmin production by Penicillium expansum is greatly dependent on the copper concentration. 22ème Congrès International ICFMH, Food Micro, Copenhague, Danemark, 30 Août - 3 Septembre 2010.
Correia - Judet, D., Dantigny, P., Bensoussan, M., Charpentier, C. Validation of a predictive model for the combined effect of temperature and aw on growth of Botrytis cinerea and Penicillium expansum on grape berries. 22ème Congrès International ICFMH, Food Micro, Copenhague, Danemark, 30 Août - 3 Septembre 2010.
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Correia - Judet, D., Dantigny, P., Bensoussan, M., Charpentier, C. Tolerance of Botrytis cinerea and Penicillium expansum at high copper concentrations. 22ème Congrès International ICFMH, Food Micro, Copenhague, Danemark, 30 Août - 3 Septembre 2010.
Correia - Judet, D., Bensoussan, M., Charpentier, C., Dantigny, P. Inhibition of growth of Penicillium expansum and Botrytis cinerea by copper sulphate. 1st International CIGR Workshop Food Safety: Advances and Trends, Dijon, France, 14-15 Avril, 2011.
C-Présentations Orales Correia - Judet, D., Olivier, F., Charpentier, C., Dantigny, P., Bensoussan, M. Growth, metabolism
and genetic investigations on fungal spoilage flora of grapes. XVème Forum des jeunes chercheurs, Dijon, France, 25 - 26 Juin, 2009.
Correia - Judet, D., Dantigny, P., Bensoussan, M., Charpentier, C. Validation of a predictive model for the combined effect of temperature and aw on growth of Botrytis cinerea and Penicillium expansum on grape berries. 3ème Congrès International de Biotechnologie, Bucarest, Roumanie, 18 - 19 Novembre, 2010.