LABORATORIUM INSTRUMENTASI ANALITIK

SEMESTER GENAP TAHUN AJARAN 2013-2014

PRAKTIKUM KROMATOGRAFI

Modul : Kromatografi Kilat

Pembimbing : Ibu Endang Widiastuti

Oleh:

Kelompok : VI

Nama :

1. Fauzia Dwi Putri, NIM 121431010

2. Riska Purwanti, NIM 121431021

3. Tanty, NIM 121431026

Kelas : 2A

PROGRAM STUDI DIPLOMA III ANALIS KIMIA

JURUSAN TEKNIK KIMIA

POLITEKNIK NEGERI BANDUNG

2014

Praktikum : 30 Mei 2014

Penyerahan : 6 Juni 2014

(Laporan)

I. TUJUAN

- Memahami prinsip kromatografi kilat (KKi) dan melakukan pemisahan dengan metoda Kki

- Mampu melakukan pemisahan dan mengidentifikasi sampel dengan metoda KKi

II. DASAR TEORI

2.1 Prinsip

Flash kromatografi merupakan kromatografi yang teratur dengan tekanan rendah (pada

umumnya < 20 psi) digunakan sebagai kekuatan bagi elusi bahan pelarut melalui suatu ruangan

atau kolom yang lebih cepat. Ini menghasilkan kualitas yang sedang, tetapi pemisahan

berlangsung cepat (10-15 menit). Pemisahan ini tidak sesuai untuk pemisahan suatu campuran

yang terdiri dari macam-macam zat, tetapi sangat baik untuk memisahkan sedikit reaktan dari

komponen utama dalam sintesa organik. Tergantung dari ukuran kolom, berapa gram sample

dapat dilapisi dalam satu waktu. Metode ini dikembangkan oleh Still, W.C., Khan, M., dan

Mitra, A (J. Org. Chem., 43 (14), 2923, 1987). Terdapat suatu pengaturan umum untuk tekanan-

tekanan yang lebih kecil dari 20 psi dengan control (pengawasan) manual pada aliran dan

terdapat pengaturan tekanan-tekanan yang lebih besar 50 psi dengan suatu ukuran tekanan yang

mengikat untuk mengukur aliran. Dari kolom-kolomnya adalah panjangnya 30 sampai 45 cm,

perubahan persediaan dari 250 ml ke 3000 ml dan untuk unit-unit dengan telanan yang lebih

besar disediakan martel epoksi untuk keselamatan. Pembungkus kolom biasanya silica gel.

Komponen-komponen ini biasanya dijaga oleh pengapit atau disekrup bersama-sama. Setidak-

tidaknya pemisahan ini harus dilakukan dibelakang pelindung keselamatan. Gelas atau kaca frits

tidak digunakan pada alas kolom karena terlalu banyak volume yang macet di bawahnya. Serat

kaca dan pasir tidak digunakan sebagai pengganti.

2.2 Teknik

2.2.1 Pembungkus Kolom

Sebagian besar pembungkus kolom adalah silika gel. Still menemukan ukuran partikel

terbaik yaitu 40-63 mata jala. Pemisahan diberi tanda sebagai penerimaan waktu (r) dibagi

dengan luas puncak (w).

2.2.2 Metode Pembungkus Kering

Metode dari Still untuk sebuah kolom dengan diameter 2 cm. Penambahan 40-63

mata jala silica gel untuk suatu kedalaman 14-15 dalam sebuah penambahan tunggal. Dengan

stopclock membuka kolom tersebut dengan perlahan-lahan ditepuk dengan tegak lurus pada

suatu puncak untuk mengatur letak puncak. Penambahan 2 mm pada 50-100 mata jala pasir pada

puncak pada alas flat gel. Kolom tersebut diapit untuk memekan pembungkus dan pengelusian.

Bahan pelarut secara hati-hati dituangkan diatas pasir untuk mengisi kolom tersebut dengan

penuh. Katup jarum pengontrol arus tersebut dibuka semua pada jarak tersebut, disesuaikan

dengan kerapatan pada puncak kolom dan dilindungi dengan karet penyambung yang kuat. Klep

garis udara yang utama yang mendorong kearah pengontrol arus dibuka sedikit dan sebuah jari

yang ditempatkan secara tepat diatas karet tersebut. Ini akan menyebabkan tekanan di atas alas

adsorben menaikkan dengan cepat dan menekan silica gel tersebut sebagai solven dipaksa

dengan cepat membungkus kolom tersebut. Hal ini penting untuk menjaga tekanan sampai

semua yang ada di udara dilepas dan bagian yang lebih rendah dari kolom tersebut diam, dengan

cara lain kolom tersebut akan pecah dan harus dibungkus kembali.

2.2.3 Pembungkus Basah

Dalam metode ini silica gel dibuat dalam suatu noda dan dituangkan ke dalam

kolomdengan cara membuka jalan keluar. Tekanan dipasang untuk mempertahankan bahan

pelarut yang keluar lewat bagian bawah dan juga membungkus kolom tersebut dengan rapat

tanpa adanya pengikatan udara. Tekanan tersebut dilepaskan, stopcock ditutup, sample

ditambahkan kemudian diikuti dengan prosedur elusi yang tetap.

2.2.4 Pompa

Untuk kebanyakkan aplikasi, udara dari sebuah penekanan angin digunakan, dan

suatupompa tidaklah diperlukkan. Ini mingkin dari sebuah silinder udara. Bagaimanapun, untuk

tujuan pemisahan yang hanya memiliki dana yang minim, dua pelengkap penekan rendah telah

diuji.Tekanan pompa yang lebih rendah adalah suatu pengaturan balon ganda. Suatu balon besar

ditempatkan di dalam balon lain, ditutup dan dikaitkan dengan puncak kolom. Tekanan-tekanan

pada 2-3 p.s.i dicapai. Tekanan tersebut tetap bagus karena volume balon tersebut lebih besar

dari pada volume bahan pelarut yang digunakan. Untuk tekanan yang lebih tinggi, tergantung

dari luas dan bahkan lebih dari suatu laju arus.

2.2.5 Penekan Gas Udara

Penekan udara digunakan secara normal kecuali jika campuran merupakan udara/oksigen

yang sensitive. Kemudian penekan nitrogen digunakan. Gas-gas ini ditekan oleh pompa yang

mempunyai segel minyak, sehingga gas selalu berisi uap air minyak dalam jumlah yang kecil.

Sebuah perangkap antara persediaan dan kolom tersebut dapat digunakan. Tetapi hanya

digunakan jika diinginkan kemudian dihasilkan produk yang sangat tinggi. Dengan perlindingan

system sesederhana mungkin.

2.2.6 Penambahan Sampel

Tujuan pengontrolan arus adalah untuk mengurangi tekanan gas berikutnya yang

diperlukan adalah laju arus bahan yang sesuai dan untuk membebaskan gas yang berlebih keluar

melalui suatu lubang angin. Pengontrol komersil memberikan lima pengontrol kendali dan dapat

bergantian sesuai dengan keperluan untuk perbedaan luas-luas kolom dan berubah-ubah dalam

viskositas pada bahan-bahan pelarut. Bagaimanapun, jika sebuah system sederhana diperlukan

pemisahan yang rutin untuk itu diperlukan pengontrol arus.

2.2.7 Elusi Bahan Pelarut

Pengalaman telah menunjukkan bahwa pemisahan terbaik berlangsung jika diinginkan

komponen yang mempunyai suatu Rf 0.35 pada suatu silica gel lapis tipis dan tidak murni pada

kurang lebih 0.15 Rf ml. system bahan pelarut yang telah ditemukan untuk bekerja dengan

baik meliputi 10-50 % campuran etil asetat / 30-600C dengan petroleum eter atau dengan

heksan.

2.2.8 Pengumpulan dan Deteksi

Sampel lewat dengan sedemikian cepat sehingga harus ditemukan sebuah cara yang

mudah untuk mengumpulkan fraksi-fraksi yang ada..Aliran sampel dapat dipantau dengan

menggunakan detektor uv dan fraksi-fraksi target yang telah diperoleh. Yang telah terbukti

berhasil adalah penggunaan rak tabung uji yang memuat beberapa tabung uji berukuran 20×150

mm dan pengumpulan satu fraksi ke dalam setiap tabung tersebut. Ketika dilakukan

kromatografi, fraksi-fraksi yang mengandung senyawa yang diinginkan akan teridentifikasi dan

derajat pemisahan yang dicapai pun diketahui.

2.3 Aplikasi Flash Chromatography

Kromatografi Kolom Kering Tehnik kromatografi kolom kering ini tidak lain merupakan

modifikasi dengan memanfaatkan keunggulan-keunggulan "Flash chromatography" yaitu

pemisahan yang baik dan cepat. Modifikasi yang dilakukan pada prinsipnya memikirkan bahan

yang lebih murah,peralatan yang lebih sederhana dan lebih praktis. Ada dua perbedaan yang

mendasar, pertama tehnik ini menggunakan sistem pengisapan (suction) untuk mempercepat

proses elusi menggantikan sistem penekanan dengan gas. Oleh karena itu proses ini sering

disebut dengan kromatografi cairan vakum ( Vacuum Liquid Chromatography-VLC).

Flash chromatography memisahkan senyawa organik pada pKa tinggi dengan

menggunakan kolom Teledyne Isco’s specialty RediSep. Komponen organik dapat berinteraksi

dengan permukaan senyawa silanol pada kromatografi Flash normal. Interaksi ini menyebabkan

timbulnya goresan puncak tidak tajam, yang akan menyebabkan penumpukan (overlapping)

fraksi selama proses pemisahan pada kromatografi. Untuk memperbaiki resolusi pada pemisahan

senyawa organik atau asam organik, para ahli kimia membuat suau tipe dengan menambahkan

fase gerak yang telah di modifikasi untuk mengurangi goresan puncak. Penambahan sample

dapat menjadi sebuah masalah. Pada kromatografi jenis ini perlu ditempatkan sample di tempat

yang setipis mungkin. Mempermudah penambahan sample dapat menggunakan corong

penambahan sample, dimana sebuah corong dengan tangkai panjang dan teratur, dengan

pembengkokkan pada ujung-ujung tangkai corong dan dengan lobang 4 mm disamping bagian

bawah dinding kolom. Agar ketika sample mencapai puncak atas kolom tidak terjadi gangguan

pada puncaknya.

Kontrol Arus Mempertajam puncak. Triethylamine atau ammonium hydroxide adalah

bahan modifikasi tambahan untuk fase gerak. Teledyne ISCO menawarkan beberapa kolom Redi

Sep khusus yang tersedia untuk flash kromatografi agar lebih efisien dalam pemisahan pada pKa

tinggi dari senyawa organik. Dengan menggunakan kolom tersebut dapat meminimalkan waktu

pemisahan dengan meningkatkan resolusi pemisahan.

III. DATA PENGAMATAN

Gambar Keterangan

Eluen dengan berbagai perbandingan.

Perbandingan antara Metanol dan

Diklorometan. Mulai dari 50:0; 40:10; 30:20;

20:30; 10:40; 50:0.

Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom

saat eluen pertama dimasukkan yaitu DCM

100% atau 50 mL Diklorometan. Belum

terjadi pemisahan pada sampel.

Gambar sebelah kanan adalah eluen yang

telah dilewatkan kedalam kolom.

Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom

saat eluen kedua dimasukkan yaitu DCM dan

Metanol dengan perbandingan 40 : 10. Telah

terjadi pemisahan warna dalam kolom.

Gambar sebelah kanan adalah eluen yang

telah dilewatkan kedalam kolom. Eluen jadi

berwarna merah muda, bercampur dengan

warna biru.

Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom

saat eluen kedua dimasukkan yaitu DCM :

Metanol dengan perbandingan 30 : 20. Hanya

tinggal warna biru dari sampel yang terdapat

dalam kolom.

Gambar sebelah kanan adalah eluen yang

telah dilewatkan kedalam kolom. Eluen

berwarna biru muda.

Gambar sebelah kiri adalah kondisi kolom

saat eluen kedua dimasukkan yaitu DCM :

Metanol dengan perbandingan 20 : 30. Sudah

tidak ada lagi warna yang terdapat dalam

kolom.

Gambar sebelah kanan adalah eluen yang

telah dilewatkan kedalam kolom. Tidak

terjadi perubahan warna.

Eluen ke 5 dengan perbandingan DCM dan

Metanol 10 :40, tidak mengalami perubahan

warna setelah dilewatkan dalam kolom.

Karena sampel sudah terbawa oleh fasa

gerak.

Eluen ke 6 dengan perbandingan DCM dan

Metanol 0 :50, tidak mengalami perubahan

warna setelah dilewatkan dalam kolom.

Karena sampel sudah terbawa oleh fasa

gerak.

a. Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum Rhodamin B dengan Spektrofotometri

Visible

Panjang gelombang (nm) Transmitan (%T) Absorbansi (A)380 87,8 0,057400 81,3 0,090420 83,2 0,080440 91,1 0,040460 87,5 0,058480 70,0 0,155500 37,3 0,428510 18,8 0,726540 4,10 1,387550 3,60 1,444

560 (λmaks) 2,30 1,638570 9,10 1,041580 45,5 0,342

Kurva panjang gelombang maksimum Rhodamin B

350 400 450 500 550 6000.000

0.200

0.400

0.600

0.800

1.000

1.200

1.400

1.600

Series2

panjang gelombang (nm)

abso

rban

si

Dengan Spektrofotometri UV-Vis Shimadzu λmaks Rhodamin B dengan komposisi eluen (DCM:

MeOH) 50:50 adalah 560 nm.

b. Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum Methylene Blue dengan

Spektrofotometri Visible

Panjang gelombang (nm) Transmitan (%T) Absorbansi (A)400 94,7 0,024420 97,5 0,011440 98,1 0,008460 97,8 0,010480 97,2 0,012500 93,6 0,029520 88,2 0,055540 80,4 0,095560 77,7 0,110570 76,5 0,116

580 (λmaks) 69,2 0,160600 70,0 0,155620 74,6 0,127

Kurva panjang gelombang maksimum Methylene Blue

350 400 450 500 550 600 6500.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

Series2

panjang gelombang (nm)

Abso

rban

si

Dengan Spektrofotometri UV-Vis Shimadzu λmaks Methylene Blue dengan komposisi eluen

(DCM: MeOH) 50:50 adalah 580 nm.

c. Pengukuran absorbansi sampel

Komposisi Eluen

(DCM : Metanol)

λmaks Rhodamin B (560

nm)

λmaks Methylene Blue (580

nm)

%T A %T A

50 : 0 96,7 0,16 100 0

40 : 10 4,2 1,426 23,5 0,648

30 : 20 90 0,046 87,6 0,058

20 : 30 96,8 0,014 97,3 0,011

10 : 40 98,7 0,008 97,3 0,09

0 : 50 99,1 0,001 98,7 0,03

Kurva Pengukuran Absorbansi Sampel

0 10 20 30 40 50 600

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

A560A580

Komposisi DCM

Adso

rban

si

IV. PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, bertujuan untuk memahami prinsip kromatografi kilat serta

melakukan pemisahan dan identifikasi terhadap sampel dengan metoda KKi. Kromatografi kilat

adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari suatu campuran dalam

jumlah tertentu berdasarkan afinitas sampel terhadap fasa gerak maupun fasa diam yang berada

pada kolom dengan penambahan tekanan dari luar ( pompa ) untuk menekan fasa gerak, oleh

karena itu kecepatan aliran dari fasa gerak yang melalui fasa diam tidak hanya dipengaruhi oleh

gaya grafitasisaja, melainkan dipengaruhi juga oleh besarnya tekanan dari pompa. Sama halnya

dengan kromatografi kolom, prinsip kerja pemisahan senyawa pada kromatografi kilat pun

didasarkan pada afinitas sampel terhadap fasa gerak dan fasa diamnya. Sampel yang mempunyai

afinitas besar terhadap fasa diam akan secara selektif tertahan sedangkan yang afinitasnya paling

kecil akan mengikuti aliran pelarut.

Metode pemisahan dengan kromatografi kolom kilat ini, kolom yang digunakan adalah

kolom yang terbuat dari kaca dengan pompa dan labu penampung fasa gerak diatasnya,

sedangkan fasa diam yang digunakan adalah silika gel karena silika gel memiliki tekstur dan

struktur yang lebih kompak serta teratur, dan fasa gerak yang digunakan adalah Methanol dan

DCM dengan komposisi DCM : Mathanol berturut-turut 50%:0%, 40%:10%, 30%:20%,

20%:30%, 10%:40%, dan 0%:50%. Fasa gerak akan membawa campuran komponen keluar dari

kolom. Karena afinitas komponen dalam sampel terhadap fasa gerak maupun fasa diam berbeda-

beda sehingga terjadi pemisahan komponen dalam campuran. Komponen yang terpisah

merupakan pita-pita dalam fasa diam, dan masing-masing pita didorong keluar kolom dengan

penambahan fasa gerak.

Meoda yang digunakan untuk memasukan silika gel kedalam kolom adalah metoda

basah. Dalam metode basah ini, silika gel yang akan digunakan sebagai fasa diam terlebih dahulu

disuspensikan dengan fasa gerak yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom

melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit agar tidak terdapat rongga udara

dalam silika gel yang akan mengganggu proses pemisahan sampel. Karena jika terdapat rongga

dalam kolom, maka total jarak yang ditempuh oleh sampel dari awal sampai akhir akan berbeda-

beda sehingga pemisahan tidak dapat berjalan dengan maksimal dan juga dapat mempengaruhi

kecepatan pemisahan. Kemudian, eluen dialirkan hingga silika gel mapat, setelah silika gel

mapat eluen dibiarkan mengalir hingga ketinggian eluen ±2 cm diatas permukaan silika gel agar

silika gel tersebut tidak kering dan mengeras.

Pada praktikum kali ini, sampel yang digunakan dalah percampuran antara metilen biru

1% dan rhodamin B 0,5% dengan perbandingan antara metilen biru dan rhodamin B adalah 5:1.

Sebelum dimasukan, terlebih dahulu sampel dicampurkan dengan silika gel hingga berbentuk

pasta, barulah sampel dimasukan kedalam kolom tepat diatas fasa diam yang digunakan. Setelah

sampel dimasukan dalam kolom, barulah sampel tersebut didorong keluar sampel dan dipisahkan

menjadi fraksi-fraksi dengan menggunakan fasa gerak yang dibantu oleh pompa agar pergerakan

dan pemisahan sampel dapat lebih cepat. Penambahan fasa gerak ini dilakukan secara perlahan

melalui dinding kolom agar tidak terbentuk rongga pada kolom yang akan menghambat proses

pemisahan fraksi-fraksi sampel dalam kolom.

Pemisahan fraksi-fraksi pada sampel dengan menggunakan kromatografi kilat,

didasarkan pada afinitas sampel terhadap fasa diam dan fasa geraknya. Afinitas ini dipengaruhi

oleh kepolaran dari sampel, fasa diam dan fasa gerak tersebut. Agar fraksi tertentu turun, maka

kepolaran dari fasa gerak harus ditingkatkan dari non polar sampai polar, hal ini dikarenakan

didalam sampel itu terdapat senyawa yang berbeda kepolarannya. Untuk meningkatkan

kepolaran pelarut dilakukan perbandingan campuran pelarut. Sebelum fraksi itu turun dan keluar

dari kolom, kita akan melihat pita-pita warna pada kolom kromatografi.

Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, terlihat bahwa sampel terpisah menjadi 2

warna yakni pink (rhodamin B) dan biru ( metilen biru). Terpisahnya kedua warna tersebut

terjadi saat penambahan eluen yang pertama dengan perbandingan DCM:metanol ( 50:0 ),

sedangkan pada penambahan eluen yang kedua dengan perbandingan DCM:metanol (40:10),

warna pink (rhodamin B) dan biru (metilen biru) keluar dari kolom dengan warna pink

(rhodamin B) keluar terlebih dulu kemudian disusul oleh warna biru (metilen biru). Hal tersebut

menunjukan bahwa metilen biru memiliki sifat yang lebih polar dibandingkan dengan rhodamin

B. Sehingga metilen biru memiliki afinitas yang lebih besar dengan silika gel (fasa diam) yang

bersifat polar juga, oleh karena itu metilen biru lebih lama tertahan dalam kolom. Sedangkan

rhodamin B, memiliki afinitas yang lebih tinggi dengan eluen yang digunakan dibandingkan

dengan afinitasnya terhadap silika gel (fasa diam) sehingga dapat keluar kolom lebih dulu. Hal

tersebut disebabkan perbandingan eluen yang digunakan lebih banyak mengandung DCM,

dimana DCM ini merupakan larutan yang memiliki kepolaran rendah, sehingga eluen DCM :

metanol ( 40 : 10 ) ini pun memiliki kepolaran yang rendah pula atau bahkan cenderung bersifat

non polar.

Setelah semua eluen dilewatkan kedalam kolom, maka hasil dari setiap eluen tersebut

diukur dengan menggunakan alat spektrofotometri Visible untuk mengetahui dan

membandingkan nilai absorbansi terhadap kepekatan warna yang dihasilkan. Panjang

gelombang yang digunakan dalam pengukuran dengan spektrofotometri ini adalah panjang

gelombang maksimum dari rhodamin B dan metilen biru yang telah didapatkan dari percobaan

sebelumnya, yakni 560 nm untuk rhodamin B dan 580 untuk metilen biru. Panjang gelombang

tersebut tidak jauh berbeda dengan panjang gelombang maksimum rhodamin B dan metilen biru

berdasarkan literatur yakni 544 nm dan 586 nm.

Dari data pengamatan dapat diketahui bahwa adsorbansi teringgi yang didapat pada

lamda 560 nm dan 580 nm adalah adsorbansi eluen yang kedua yakni 1,426 pada lamda 560 nm

dan 0,648 pada lamda 580 nm hal ini sesuai karena sampel yang diukur berwarna keunguan yang

merupakan percampuran dari warna merah (Rhodamin B) dan biru (metil biru). Akan tetapi

dapat dilihat bahwa adsorbansi pada lamda 560 nm lebih besar dibandingkan adsorbansi pada

580 nm, hal tersebut dikarenakan warna yang dominan pada eluen yang kedua ini adalah merah

(Rhodamin B), itu membuktikan bahwa lamda 560 nm ini merupakan lamda maksimum untuk

rhodamin B sehingga pada panjang gelombang tersebut, rhodamin B dapat terserap secara

maksimal. Adsorbansi yang besar untuk eluen yang kedua ini menunjukan bahwa sampel paling

banyak keluar dari kolom ketika diberi eluen yang kedua. Sedangkan adsorbansi eluen yang

berikutnya semakin kecil, hal tersebut dikarenakan sampel yang keluar dari kolom setiap

penambahan eluen berikutnya sudah semakin sedikit bahkan mendekati habis pada penambahan

eluen yang terakhir, ditunjukan dengan nilai adsorbansi yang sangat kecil, yaitu 0,001 pada

lamda 560 nm dan 0,03 pada lamda 580 nm.

V. KESIMPULAN

1. Sampel terdiri dari senyawa yang memiliki kepolaran berbeda.

2. Metilen blue merupakan senyawa yang bersifat lebih polar daripada Rhodamin B.

3. Pemisahan dengan menggunakan kromatgrafi kilat dipengaruhi oleh dorongan/tekanan

dari pompa yang digunakan.

4. Semakin tinggi tekanan maka kecepatan laju alir eluen dan proses pemisahan

semakin cepat

VI. DAFTAR PUSTAKA

Anonim.2013.”Pelarut”. http://id.wikipedia.org/wiki/Pelarut [diakses pada tanggal 3 Juni 2014]

Firmansyah, Bayu. 2010. “Kromatogravi Vakum Cair (KVC)”.

http://www.bayufirmansyah.com/2010/08/kromatografi-vakum-cair-kvc.html

[ diakses pada tanggal 4 Juni 2014]