Laboratoire Expert BVD

Travaux en cours et perspectives

Journée nationale de la référence professionnelle

08 novembre 2018

Guy Kouokam

Ophélie Pécot

1

Avec le soutien

financier de la

2

But : évaluer l’aptitude des laboratoires à diagnostiquer correctement la BVD

Type d’EILA :

-PCR sur matrice biopsie auriculaire

-ELISA Antigénémie E0 sur matrice biopsie auriculaire

Nombre de laboratoires participants :

-PCR : 53

-ELISA Antigénémie E0 : 38

Analyse des résultats et rédaction des rapports en cours

Rendu des résultats : prévu pour ce mois de Novembre 2018

Organisation d’ EILA

Faits marquants année 2018

Validation de réactifs 2018 : vérification de la fiabilité des kitsBiopsie auriculaire

PCR : Virotype BVD/extraction MagAttract 96 cador Pathogen Kit

RealPCR BVDV RNA Test / extraction NucleoMag Vet

RealPCR BVDV RNA Test/ extraction IDEXX DNA/RNA Magnetic Bead Kit

LSI BVDV4all/Magmaxcore et LSI BVDV screening (sans protéinase K)

ELISA antigénémie E0 : lyse protocole long (72h à 25°C)

Autres activitésAnalyses : 4 génotypages de virus BVDV réalisés (pour 1 GDS, 2 LDA)

Vente de matériaux de référence : 640 unités commercialisées

Cahier des charges pour validation des kits PCR et ELISA antigénémie sur sérum diffusé

Echantillothèque : Prélèvements reçus de 2 élevages

Prélèvements d’IPI reçus de 2 élevages

Caractérisation de l’échantillothèque (PCR, ELISA)

Valorisation scientifique : Présentation d’un poster au 11ème congrès international de virologie vétérinaire

(génotypage de souches de BVDV isolées en France)

Expertise

Faits marquants année 2018

3

Nouveaux matériaux de référence

Renouvellement de la biopsie auriculaire Ned biopsie auriculaire

Remplacement du premier NED ( car quantité limitante)

A destination des producteurs de réactifs et laboratoires départementaux

Sérum Ned (niveau exigible de détection) pour analyses de virologie (PCR et ELISA

antigénémie E0)

But : calage des kits de diagnostic PCR et ELISA Ag E0

Caractéristiques : mélange de sérums issus d’animaux infectés par différentes souches de

virus (BVDV-1b, BVDV-1d, BVDV-1e, BVDV-1k, BVDV-1l)

Utilisable pour validation des kits d’analyses de sérums individuels et de mélanges de 20

sérums (producteurs de réactifs)

Sérum Ned pour analyses de sérologie individuelle et de mélange :

But : validation d’analyses ELISA anticorps (individuelles et de mélange)

Caractéristiques : mélange de 4 sérums issus de bovins infectés par les virus BVBDV-1b

ou BVBDV-1e

Caractérisé avec un kit ELISA anticorps p80 et un kit ELISA anticorps E0

Caractérisé par trois méthodes de séroneutralisation

En cours de validation

Faits marquants année 2018

4

5

Matrice Mélange Prix Validé par le LE-

BVD

Cadre d’utilisation

PCR

BA Oui(10) +++ oui

dépistage des IPI

sérum Oui (20) +++ oui

lait Oui +++ non

ELISA

Ag E0

BA Non ++ oui

sérum Non ++ non (2019)

ELISA

Anticorpssérum Oui (20) + non (2019)

Surveillance des

cheptelslait Oui (LT) + non (2019)

Quelques méthodes utilisables dans le cadre

du programme d’éradication de la BVD

Test de vieillissement des biopsies

auriculaires

6

ETUDE N°1

7

Problématique

Rapport

D’analyse

Biopsie auriculaire :

- Matrice utilisée pour le diagnostic

de la BVD (dépistage IPI, attribution

de garantie, contrôle de mouvement)

- Matrice prélevée par l’éleveur

et acheminée vers le laboratoire

- Problématique du délai

d’acheminement au laboratoire

(stockage prolongé chez l’éleveur,

temps de transport jusqu’au laboratoire…)

- Quel impact de ce délai sur la fiabilité

des résultats de PCR et ELISA antigénémie

- A partir de quel moment une biopsie ne peut

plus être analysée en PCR ou ELISA antigénémie ?

Paramètres de l’étude

2 températures évaluées : 25°C (température ambiante hors période estivale)

37°C (pic de température en période estivale)

Origine des biopsies : 1 animal ayant été caractérisé avec un Ct faible (28-30) : MR80

2 animaux ayant été caractérisés avec des Ct moyens (~25) : D001, D004

1 animal sain : G002

Nombre de jours : J7, J11, J14, J18 J22, J32 et J40, J45, J60 (pour certaines BA)

Techniques utilisées :

PCR : 3 méthodes validées par LE-BVD

(couple extraction-PCR) : extraction sur colonne/PCR1 => kit A

extraction rapide/PCR2 => kit B

extraction sur bille/PCR3 => kit C

ELISA antigénémie E0

Finalité : - Orientation pour les laboratoires de diagnostic qui utilisent la PCR et l’ELISA antigénémie sur

biopsies auriculaires pour le diagnostic BVD

- Sensibilisation pour les éleveurs impliqués dans l’envoi des échantillons de biopsies

8

9

Kit A Kit B Kit C

biopsie 25°C 25°C 25°C

MR80 + + +

D001 + + +

D004 + + +

MR80 + + +

D001 + + +

D004 + + +

MR80 + + +

D001 + + +

D004 + + +

MR80 + + +

D001 + + +

D004 + + +

MR80 + + -

D001 + + +

D004 + + +

MR80 - + -

D001 + + +

D004 + - +

J22

J32

J0

J7

J11

J18

A 25°C : Le dernier signal positif BVDV détecté l’est à 18j j pour les 3 biopsies avec les 3 kits

La valeur maximale de Ct obtenue à J18 : 32,02 (D004, kitB)

A 37°C : Le dernier signal positif BVDV détecté l’est à 14j j pour les 3 biopsies avec les 3 kits

La valeur maximale de Ct obtenue à 7j : 35,7 (D001, kitB)

Efficacité

des 3 kits

Divergence

de résultats

des 3 kits

Vieillissement des biopsies auriculaires à 25°C- PCR

10

Résultats des analyses ELISA antigénémie E0

- Toutes les biopsies analysées sont positives jusqu’à 32j d’incubation à 37°et à 25°C

- Les biopsies moyennement chargées (D001 et D004) restent positives à J40, J45, J60

- Pour l’ELISA Ag E0 , les valeurs des pourcentages de DO calculées sont très fortes et

très éloignées du seuil de positivité du kit

% D

en

sit

é o

pti

qu

e

Durée d’incubation (jours)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40 50 60 70

Kit ELISA Ag X-25°C

D001 D004 MR80

0

1

2

3

4

5

6

7

0 10 20 30 40 50 60 70

Kit ELISA Ag X-37°C

D001 D004 MR80

Durée d’incubation (jours)

% D

en

sit

é o

pti

qu

e

Seuil de

positivité

Conclusion

Analyses PCR

- Pour un échantillon faible positif la durée limite de conservation avant analyses pourrait être

fixée à 7 jours (pour une température de 37°C) ou à 18 jours (pour une température de

25°C). => important car ce type d’échantillon peut être retrouvé sur le terrain (ex :16/64, LE-

BVD)

- Conservation à 37°C des biopsies => Ct max observé très tardif => pas compatible avec

des analyses de PCR en mélange de 10 => analyse individuelle souhaitable dans ce cas

Analyses d’ELISA antigénémie E0

- Jusqu’à une période de 32 jours de conservation de la biopsies à 25°C et 37°C les résultats

des tests ELISA antigénémie E0 sont positifs (statut attendu) avec le kit X (quid de la

spécificité ?)

Proposition :

Dans les situations critiques choisir le test en fonction du temps d’acheminement de la biopsie :

- PCR si échantillon reçu dans les 7 jours (période estivale) ou 18 jours (hors période estivale)

- ELISA Antigénémie E0 si échantillon reçu au-delà de ces périodes

- Demander un autre prélèvement au-delà de 32 jours par sécurité

Résultats cohérents avec ceux obtenus en 2012 par Bapelle et col, 2012

11

12

Perspective Etude à replacer dans son contexte :

Tests réalisés sur biopsies ayant été congelées

biopsies non fraiches => miment-t-elles réellement la réalité des pratiques sur le

terrain ?

Tests réalisés avec uniquement trois kits => des résultats similaires

seraient-t-ils obtenus avec d’autres kits ?

Quelques questions :

Comment expliquer les résultats non convergents des kits au delà de 7j /37°C

et de 18j (25°C) ?

Dégradation aléatoire des biopsies ?

Pour la suite : Inclure de nouveaux kits dans le protocole

Analyse d’une série d’échantillons faibles positifs (J7/37°C, J18/25°C) Tenir compte des recommandations de cette étude lors de l’analyse des biopsies

reçues en laboratoire pour analyse afin de s’assurer de la fiabilité des résultats

Détection d’IPI en lait de tank

13

ETUDE 2

14

Paramètres

Contexte (programme d’éradication) :

- Une garantie bovin non IPI est requise pour la circulation de bovin

- Différentes modalités d’attribution de la garantie : surveillance sérologique, diagnostique virologique

- Autre possibilité : analyse PCR du lait de tank (deux analyses espacées de 3 à 6 mois)

But : Déterminer la taille limite de mélange de lait de tank pour la détection d’IPI par PCR

Matériel requis et stratégie :

- Laits d’IPI et d’animaux sains collectés en élevages laitiers

- Étape 1 : caractérisation de laits d’IPI laitiers individuels (IPI forts, faibles, moyens)

- Etape 2 : caractérisation de laits de tank où la présence d’IPI laitiers a été identifiée

- Etape 3 : constitution de laits de mélange (lait de tank) artificiels

=> race prim’holstein, statut négatif (virologie et de sérologie)

=> taille 50, 75, 100, 125, 150, 180

- Réalisation de PCR sur les laits de tank reconstitués avec des laits d’IPI avec un kit 1, kit2, kit 3

- Y a t-il une corrélation avec les résultats obtenus sur laits de tank prélevés en élevages infectés ?

15

Va

leu

rsd

es

Ct

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Caractérisation de 12 IPI laitiers kit1

Numéro des échantillons

Va

leu

rsd

es

Ct

Analyses :

- Ct obtenus : fort 21,1 faible : 28,3

moyen : 24,5

- Jusqu’à une taille de mélange de 180 bovins

contribuant au lait de tank artificiel, on peut

détecter des IPIs quel que soit leur type (fort,

moyen, faible) avec le kit 1

- l’IPI faible peut être retrouvé positif en PCR

si dilué au 1/600ième au moins sur lait individuel

avec le kit1 et le kit 2

- Aucun Ct de sorti avec le kit 3 sur LI

Taille des mélanges

Résultats d’analyses

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 25 50 75 100 125 150 175 200

Détection d’IPI en lait de tank artificielkit 1

IPI Faible IPI Moyen IPI Fort

Dilution d’IPI faible sur un lait individuel (LI)

Dilution Ct kit 1 Ct kit 2 Ct kit 3

50ième 34,7 28,1 0

200ième 31,8 29,5 0

300ième 31,8 30,6 0

600ième 31,9 - 0

1000ième Inhibé 32,2 0

16

Ct lait de tank Ct IPI

Vaches en lactation et

nombre d’IPI détectés

E001LT 36,5 28,2 Non communiqué (NC*),1 IPI

E002LT 31,2 26,1 52 en lactation, 6 IPI

E008LT 32,4 24,7 57 en lactation, 1 IPI

E013LT 39,9 21,5 NC , 1 IPI

E014LT 35,6 22,6 NC, 4 IPI

E017LT 30,3 24,8 NC, 2 IPI

E018LT 27,1 24,5 25, 1IPI

E019LT 0 NR NC,1IPI

E020LT 30,7 21,1 1 IPI

Caractérisation de laits de tank de terrain

1 IPI moyen se détecte dans du lait de 25 ou de 57 vaches en lactation

1 IPI faible se détecte dans du lait de 52 vaches en lactation

Ct obtenus cohérents avec Ct obtenus sur des mélanges artificiels

Conclusion - Quelques valeurs de Ct obtenus sur des laits d’IPI

- La présence d’un IPI peut être identifiée par analyse du lait de tank artificiel de

180 vaches (résultats confirmés avec deux kits sur trois) la PCR assez

sensible sur la matrice lait

- Quelques difficultés techniques avec le lait :

répétabilité des valeurs des contrôles endogènes

matière grasse du lait (inhibition) => tests PCR de contrôle

culot cellulaire pas forcément identique d’un essai à l’autre

que donnerait la même étude sur du lait issu d’une autre

race de vache (brune des alpes ? Montbéliarde ?)

- Pour aller plus loin :

refaire des essais avec des dilutions de lait plus poussées

sur un lait individuel de vaches de races différentes et

sur des laits de tank (réels issus d’élevages mixtes ou non)

refaire les analyses avec d’autres kits PCR

intérêt d’un calage des kits de PCR sur lait

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Perspectives pour l’année 2019

Validation des réactifs :

PCR et ELISA antigénémie E0 sur sérum

- Période de validation: Mi Janvier à Mi-Avril

ELISA anticorps sur lait, sérum, mélanges de lait et de sérums :

- Cahier des charges en cours de validation (GDS-France/Anses)

- Matériel de référence en cours de préparation

- Période validation : Mi-Avril à fin Août

Recherche et développement :

Contribution à l’optimisation des méthodes de diagnostic de la BVDV en

cas d’avortement déclaré chez les ruminants (dispositif OSCAR)

Echantillothèque :

Réception de prélèvements et caractérisation

18

Niort

Remerciements

Ophélie Pécot

Aurore Teillet

Aude Allemandou

Sophie Stourm

Benoît Croisé

Christian Baudry

Marc Tabouret

Groupements de Défense Sanitaire

Laboratoires départementaux

Producteurs de réactifs

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MERCI DE VOTRE ATTENTION

20