LA TRASCRIZIONELA TRASCRIZIONE

GENOME: total genetic information carried by a cell or organism

GENE: physical and functional unit of heredity, which carriesinformation from one generation to the next. In molecular terms,it is the entire DNA sequence (including exons, introns and noncoding transcriptional control regions) necessary forproduction of a functional protein or RNA

Lodish – Molecular Cell Biology

Struttura del GENE

GENE procarioticoGenoma di E. coliGenoma di E. coli

GENE procariotico

Sequenze regolatrici a monteSequenze regolatrici a montedella sequenza codificantedella sequenza codificante

Sequenze codificantiSequenze codificanti

OPERONEOPERONE

Sequenze Sequenze terminatriciterminatrici

GENE procariotico

animazioneanimazione

GENE procariotico

PromotoriPromotori

GENE procariotico

Sequenze codificantiSequenze codificanti

ATGGTATAT-------------------------------TAA

MET VAL TYR STOP

ORF(Open Reading Frame)

GENE procariotico

PromotorePromotore OperoneOperoneSequenze codificantiSequenze codificanti

TerminatoreTerminatore

AA BB CC

GENE procariotico

PromotorePromotore OperoneOperoneSequenze codificantiSequenze codificanti

TerminatoreTerminatore

AA BB CC

mRNA mRNA mRNA

Proteina Proteina Proteina

PromotorePromotore OperoneOperoneSequenze codificantiSequenze codificanti

TerminatoreTerminatore

AA BB CC

GENE procariotico

Repressione

Nessuna espressione

GENE EUCARIOTICO

GENI DELLA I CLASSE

GENI DELLA II CLASSE

GENI DELLA III CLASSE

RNA RIBOSOMIALE – rRNA (28S-5,8S e 18s)

RNA MESSAGGERO – mRNA

Piccoli RNA nucleari – snRNA

microRNA - LncRNA

RNA TRANSFER – tRNA

Piccoli rna nucleolari – snorna

Piccoli rna citoplasmatici - scrna

GENE EUCARIOTICO

GENE EUCARIOTICO

GENE EUCARIOTICO

GENE EUCARIOTICO

GENE EUCARIOTICO

Promotore

GENE EUCARIOTICO

Promotore

GENE EUCARIOTICO

GENE EUCARIOTICO

Sequenza codificantemodulare

GENE EUCARIOTICO

Segnale di poliadenilazione

GENE EUCARIOTICO

GENE EUCARIOTICO

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4

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La velocità della reazione è di ~40 nt/sec a 37°C (per la RNA pol batterica); molto piùlenta di quella di replicazione del DNA (800 bp/sec)

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NomenclaturaNomenclatura�� la la codingcoding strandstrand ((SenseSense strandstrand) ) del DNA ha la stessa sequenza del del DNA ha la stessa sequenza del

mRNAmRNA�� la la antisenseantisense strandstrand ((TemplateTemplate strandstrand) ) èè quella che funge da quella che funge da

templatetemplate per la sintesi del per la sintesi del mRNAmRNA..�� RNA RNA polymerasespolymerases sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA sono enzimi che sintetizzano RNA usando DNA

come come templatetemplate..�� Un Un promoter promoter èè una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per una regione di DNA dove la RNA polimerasi si lega per

iniziare la trascrizione.iniziare la trascrizione.�� StartpointStartpoint ((StartsiteStartsite) ) si riferisce alla posizione sul DNA che si riferisce alla posizione sul DNA che

corrisponde alla prima base incorporata nel RNA corrisponde alla prima base incorporata nel RNA �� A A terminator terminator èè una sequenza di DNA fa terminare la trascrizione alla una sequenza di DNA fa terminare la trascrizione alla

RNA RNA polymerasepolymerase..�� A A transcriptiontranscription unitunit èè la distanza tra i siti di iniziazione e di la distanza tra i siti di iniziazione e di

terminazione della RNA terminazione della RNA polymerasepolymerase; può includere pi; può includere piùù di un gene.di un gene.�� UpstreamUpstream = a monte.= a monte.�� Downstream Downstream = a valle.= a valle.�� A A primaryprimary transcripttranscript èè il prodotto di RNA non modificato che il prodotto di RNA non modificato che

corrisponde ad una unitcorrisponde ad una unitàà di trascrizione. di trascrizione.

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TrascrizioneTrascrizione

�� La trascrizione produce un filamento di RNA La trascrizione produce un filamento di RNA complementare ad un filamento di DNAcomplementare ad un filamento di DNA

�� Esistono vari tipi di RNAEsistono vari tipi di RNA

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la sequenza “codificante” del DNA è uguale a quella del messaggero

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Startpoint

� Lo startpoint è di solito (>90% delle volte) una purina. Spesso è la base centrale della sequenza CAT.

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La sequenza -10

• la regione di 6 bp è riconoscibile in quasi tutti i promotori. Il centro dell’esamero è generalmente circa 10 bp a monte dello startpoint, ma la distanza varia da -18 a -9. L’esamero è spesso chiamato la sequenza -10 sequence.

• Il consenso è TATAAT, e può essere indicato nella forma T80A95T45A60A50T96 dove il pedice indica la percentuale dell’occorrenza della base più comune, che varia 45-96%. (dove non c’è evidente preferenza si usa una N). La basi più importanti sembrano essere le piùconservate: la TA iniziale e la T finale.

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La sequenza -35• Un altro esamero conservato è centrato ~35 bp a monte dello startpoint. È chiamata la sequenza -35.

• Il consenso è TTGACA; • in forma più dettagliata T82T84G78A65C54A45

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Distanza –10 / -35

� La distanza che separa i siti–35 e –10 è tra 16-18 bp nel 90% dei promotori; ma può essere fino a 15 o 20 bp.

� La sequenza nella regione non èimportante, ma la distanza ècritica per tenere i due siti nella geometria corretta per il legame al promotore.

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regolazione dell’espressione genica mediante l’intervento di fattori sigma alternativi

geni “heat-shock”: CCCCCC - 15/17 basi - CCCC

promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA

geni “spo ” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La RNA polimerasi batterica è fatta da subunità multiple

� L’oloenzyme (enzima completo) è un complesso di 5 subunità che comprende il “coreenzyme” (αααα2 β β β β ββββ′′′′)))) e il σ σ σ σ factorche è competente per l’inizio della trascrizione batterica.

� RNA core polimerasi batteriche sono ~500 kD complessi multisubunità con la struttura generale α2 β β ′ .

� Negli eubatteri un solo tipo di RNA polimerasi è responsabile della sintesi di tutti i RNA (mRNA, rRNAe tRNA)

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RNA polimerasi batterica

� Le subunità β β β β and β β β β ′′′′insieme fanno il centro catalitico.

� La subunità α α α α ènecessaria per assemblaggio del core enzyme.

� La subunità σσσσ èinteressata specificamente con il riconoscimento del promotore

β=blue

β’ = viola

α = giallo e verde

Mg

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4regolazione dell’espressione genica mediante l’intervento di fattori sigma alternativi

geni “heat-shock”: CCCCCC -15/17 basi - CCCC

promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA

geni “spo ” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione

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Fattori sigma� E. coli ha diversi

sigma factors, ognuno dei quali fa sìche la RNA polimerasi inizi a dei promotori definiti da specifiche sequenze–35 e –10.

� I promotori per ogni enzima hanno tutti la stessa dimensione e localizzazione relativa allo startpoint, ed hanno sequenze conservate solo intorno ai siti –35 e –10.

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Legame al DNAIl DNA binding domain del fattore sigma èhelix-turn-helix che riconosce il sito –35

Il sito –10 è riconosciuto dalla subunitàalfa. Ha amino acidi aromatici che aiutano l’apertura del DNA

La forza di un promotore è collegata alla affinità di legame ed alla capacità di evadere dal promotore

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La RNA pol

� La distanza tra i siti

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La trascrizione avviene con l’appaiamento di basi in una

“bolla" di DNA

RNA pol separa i due filamenti di DNA in una “bolla”transiente ed usa un filamento come template per la sintesi di una sequenza di RNA complementare.

La bolla è lunga ~12-14 bp, e la lunghezza dell’ibrido RNA-DNA è di ~8-9 bp.

La velocità della reazione è di ~40 nt/sec a 37°C (per la RNA polbatterica); che è simile alla velocità di traduzione (15 amino acidi/sec), ma molto piùlenta di quella di replicazione del DNA (800 bp/sec)

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La reazione di trascrizione ha tre passaggi

� Iniziazione descrive il passaggio fino alla sintesi del primo legame del RNA. Include il legame della RNA polimerasi al promotore ed il “melting” di una corta regione di DNA in singolo filamento.

� Elongazione è il passaggio nella reazione di sintesi della macromolecola (per la replicazione, trascrizione, o traduzione) quando la catena nucleotidica o peptidica si allunga per l’aggiunta della subunità.

� Terminazione è il passaggio che termina la sintesi della macromolecola bloccando l’addizione delle subunità, e generalmente causando la dissoluzione dell’apparato di sintesi

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De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4Tensione superelica- DNA supercoiling

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4La terminazione nei batteriLa terminazione è sempre letta sulla

sequenza di DNA trascritta, non su DNA

Ci sono due tipi di terminatori:� Rho-indipendenti: una sequenza

invertita (palindromica) di 20 nt seguita da circa 8 nt A-T

� Rho-dipendenti: reclutano la proteina rho, una ATPasi ad anello che separa il RNA dallo stampo. Circa 40 nt ricchi di C.

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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

Terminatore forte o rho-indipendente:

-struttura secondaria stabile e forte per la presenza di molte G e C nello “stem”- sequenza di tante U al 3’della struttura secondaria (che facilita la separazione dell’ibrido DNA/RNA)

De Leo - Fasano - Ginelli – Biologia e Genetica, II Ed. – Capitolo 4Rho-indipendenti� La responsabilità della terminazione sta nella sequenza già trascritta dalla RNA polimerasi

� I terminatori rho-indipendenti richiedono la formazione di una forcina nella struttura secondaria seguita da una sequenza di A (>8)

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Rho factor� Il fattore Rho è una proteina terminatore

che si lega al RNA nascente si muove fino a una sequenza che è ricca in C e povera di G che precede il sito di terminazione.

� È ~275 kD esamero di Rho subunitàidentiche, della famiglia delle elicasi ATP-dipendenti che funzionano passando l’acido nucleico nel foro dell’esamero.

� I terminatori Rho-dipendenti sono la metà

dei terminatori di E. coli.

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Terminatore debole o rho-dipendente

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Le RNA polimerasi eucariotiche sono composte da piu’di 10 subunità

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Dal Volume: La Cellula, un approccio molecolare Piccin Nuova Libraria S.p.A.

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TATA BOX

TBP

Saddle-likedomain

TATA BOX BINDING PROTEIN

DNABINDING

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TAF3

TAF10

TAF6 TAF11

TAF12

TAF4

TATA BOX

TAF1TBP

TAF5TAF10

TAF8

TAF5TAF4

TAF12TAF13TAF9 TA

F3

TAF11

TAF6TAF13 TAF9

TAF8

TAF7

TAF1: Acetyltransferase activity

Interaction withTFIIF

TAF5 stabilizesTAFs interaction, specially histone-like ones (TAF6,

TAF9)

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TAF3

TAF10

TAF12TAF4

TATA BOX

TA

F1

TBPTAF5

TAF10TAF8

TAF11TAF6

TAF13

TAF9TAF8

TAF7TAF6

TAF1

1TA

F4TA

F12

TAF1

3

TAF9

TAF3

TAF5

DNA BENDING

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TAF3

TAF10

TAF12TAF4

TATA BOX

TA

F1

TBPTAF5

TAF10TAF8

TAF11TAF6

TAF13

TAF9TAF8

TAF7TAF6

TAF1

1TA

F4TA

F12

TAF1

3

TAF9

TAF3

TAF5 TFIID

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TFIIDTFIIA

TFIIB

DAB

RNA POL II

TFIIF

TFIIE

TFIIH

TFIIB INTERACTS WITH

SADDLE-LIKE DOMAIN OF TBP

AND WITH BENDED DNA ON

SIDES OF TATA BOX.

TBP/TFIIB COMPLEX

RECRUITS RNA POLII AND

OTHER GTF

HETEROTRIMER

(A, B, C SUBUNITS)

BINDS PROMOTER

REGION WITH TFIID

TFIIE MODULATES THE

HELICASE AND KINASE

ACTIVITIESOF TFIIH

BY STIMULATING CTD

DOMAIN RNA POLII

PHOSPHORYLATION

HETEROTETRAMER(RAP30)2 (RAP74) 2

(RAP30)2 BINDS RNA POL II AND TFIIB. RAP74 INTERACTS WITH

DNA. TFIIF STABILIZES THE INTERACTION OF RNA POLII WITH

PROMOTER AND STIMULATES ELONGATION RATE

TFIIH STIMULATES PROMOTER

MELTING AND IT HAS KINASE

ACTIVITY AGAINST RNA POL II

P

PHOSPHORYLATION OF

RNA POLII CTD STIMULATES

PROMOTER MELTING AND

TRANSCRIPTION START

TWO DOMAIN:

N-TERMINAL

Zn-RIBBON AND

CORE DOMAIN

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Aggiunta di guanina al 1° nt trascritto dopo la trascrizione di 20-30 nt.; legame 5’-5’ trifosfato

Struttura del cappuccio

Metil transferasi aggunge CH3 al 7’ di G; anche i primi 2 nt sono metilati

Cappuccio

Funzioni: protezione al 5’; esportazione; traduzione

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I cleavage factors (CF) e i cleavage and polyadenilation factors (CPF) consentono alla poli(A) polimerasi (PAP) di riconoscere il sito di taglio.

La PAP aggiunge solo una decina di A.

Questa corta coda viene riconosciuta dalla polyA binding protein (PABII) che la allunga fino ad arrivare a 200 A.

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Splicing

Rimozione di un introne attraverso due reazioni sequenziali di

trasferimento di fosfato, note come transesterificazioni.

Queste uniscono due esoni rimuovendo l’introne come un

“cappio”

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Structure of eukaryotic mRNA

7mGpppCap

5’5’ untranslated region

AUGinitiation

translated region

(A)~200

poly(A) tail

3’ untranslated region

UGAtermination

3’AAUAAApolyadenylation signal

• all mRNAs have a 5’ cap and all mRNAs (with the exce ptionof the histone mRNAs) contain a poly(A) tail

• the 5’ cap and 3’ poly(A) tail prevent mRNA degradati on• loss of the cap and poly(A) tail results in mRNA de gradation