7.lezione.2010. trascrizione
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MECCANISMO DI TRASCRIZIONE
Sintesi di RNA - DNA dipendente in procarioti
ESPRESSIONE DEL GENE
1909 Un GENE Errore congenito del metabolismo A.GARROD (Alcaptonuria nell’uomo)
Enzima G.BEADLE, E.TATUM
(Mutanti nutrizionali della neurospora Peptide V.M. Ingram (Emoglobinopatie: Hbs)
FLUSSO DELL’INFORMAZIONE
DNA RNA PROTEINA
Studio di proteine non enzimatiche (cheratina, insulina, emoglobina
UN GENE UNA CATENA UN POLIPEPTIDICA
1941
1963
Il promotore e’ il sito di attacco dell’ RNA polimerasi 2. Inizia a valle delle sequenze del PROMOTORE 3. A valle della sequenza codificata c’e’ la sequenza di TERMINAZIONE per la fine del processo di trascrizione 4. Negli eucarioti ogni trascritto inizia da un promotore
Sintesi di RNA
1. Il promotore e’ il sito specifico di attacco dell’ RNA polimerasi 2. La sintesi inizia a valle delle sequenze del PROMOTORE 3. Alla fine della sequenza genica c’è il segnale di TERMINAZIONE 4. Negli eucarioti ogni gene ha un suo promotore da cui inizia la trascrizione 5. La direzione di sintesi è 5’ 3’, per ogni gene è trascritto un solo filamento
RNA in allungamento 5’-3’
SINTESI DI MOLECOLE DI RNALe molecole di RNA sono trascritte dal DNA in base all’appaiamento delle basi complementari come nella duplicazione del DNA con significative differenze
Per la trascrizione di un gene/regione un solo dei due filamenti di DNA è letto : il filamento stampo. Il filamento di DNA non utilizzato come stampo viene definito filamento codificante, perché ha la stessa sequenza dell’RNA trascritto
Nella trascrizione l’ADENINA (A) ha come base complementare l’URACILE (U) al posto della Timina, che è assente nella molecola di RNA perché:
La timina assicura fedeltà di replicazione. Una comune mutazione, la deaminazione della citosina in uracile, è riconosciuta dalla DNApolimerasiI gruppi metilici hanno un ruolo chiave nell’espressione/silenziamento dei geni
Il metile coopera alle attrazioni idrofobiche tra le basi azotate
CARATTERISTICHE della struttura dell’ RNA
Periodo di emivita molto breve: minuti/ore per mRNA, giorni per rRNA e tRNA
Tre diverse molecole di RNA per tre diverse applicazioni : mRNA, tRNA rRNA che assumono complesse forme tridimensionali
La struttura bi/tridimensionale comprende regioni con basi appaiate, gli “steli” a doppi elica, connessi ad “anse” a filamento singolo
La molecola di RNA contiene coppie di basi non convenzionali e basi azotate modificate, utilizzate come siti di riconoscimento per proteine e altri RNA
L’enzima che polimerizza una molecola di RNA è l’RNA polimerasi autonoma nell’iniziare la sintesi e l’allungamento della catena, ma quasi incapace di correzione di errori
RNA polimerasi battericaLe cellule batteriche hanno un solo tipo di RNA polimerasi per la sintesi
di tutti i tipi di RNA: mRNA, rRNA, tRNA
Il “core” enzimato è costituito da 4 subunità: 2α, 1β, 1β’. Al “core” enzimatico si unisce il fattore σ: proteina che riconosce e si lega al promotore e dà inizio alla trascrizione. Senza fattore σ il processo inizierebbe a caso.
Modello molecolare
Dopo aver innescato il processo di inizio il fattore σ si distacca dal core enzimatico
PROCESSO DI TRASCRIZIONE
PROCARIOTI
1.Promotore: elemento regolatore con regioni a -35 e -10 specifico per
2. l’RNA polimerasi: oloenzima che mediante la subunità σ riconosce il sito di inizio, l’elica stampo e la direzione 5’-3’
3.Bolla di trascrizione l’RNApol catalizza il legame fosfodiestere mediante l’energia dei nucleotidi trifosfati4. La terminazione: indotta da sequenze G≡C specifiche con struttura a forcina o mediata dalla proteina ρ (rho)
TRASCRIZIONE IN PROCARIOTI
Nei Batteri un promotore può regolare la trascrizione di più geni
L’RNApol deve riconoscere esattamente l’inizio del gene
L’enzima si associa debolmente lungo il DNA, ma si aggancia strettamente solo a livello del PROMOTORE
Il FATTORE SIGMA (σ) svolge il ruolo di riconoscere il promotore e permettere l’ attacco della RNApol
L’RNApol sintetizza un RNA di 10 nucleotidi, il fattore σ si distacca e la polimerasi può continuare autonomamente
La doppia elica del promotore presenta una asimmetria, lega la polimerasi solo in un orientamento e, poiché la sintesi procede da 5’→ 3’, un solo filamento di DNA /gene viene trascritto
TRASCRIZIONE-TRADUZIONE PROCARIOTI
Elica di DNA NON stampo
Elica di DNA trascritta
Nei batteri è assente la membrana nucleare; NON avviene “maturazione” dei trascritti; il processo di traduzione inizia prima del completamento della trascrizione ; i due processi sono simultanei
POLISOMA (POLIRIBOSOMA)
E’ costituito da una serie di ribosomi ognuno con le rispettive molecole di polipeptide nascente che si sposta lungo la molecola di mRNA dall’estremità 5’ (la prima sintetizzata) alla 3’ (ancora in sintesi)
Immagine al microscopio elettronico di polisoma batterico
La simultaneità del processo di trascrizione e traduzione nei batteri è visualizzata dal POLISOMA
Meccanismo di TRASCRIZIONE e sua REGOLAZIONE in
EUCARIOTI
In che modo l’ informazione conservata nel nucleo arriva al citoplasma?
Una volta che l’informazione è uscita dal nucleo non può più tornare indietro (F. Crick)
Contenuto cellulare di RNA EUCARIOTICO
Classi di RNA presenti nei diversi sistemi cellulari: procarioti e eucarioti. Alcune molecole sono presenti solo all’interno del nucleo: small nuclear (sn) e small nucleolar (sno)
I microRNA sono costituiti da 18-25 nucleotidi, sono presenti in tutti gli eucarioti. A oggi sono stati identificati 12 geni per miRNA nelle cellule staminali.
CLASSIFICAZIONE degli RNA EUCARIOTICISigla Prodotto Funzione
mRNA proteina Trasferimento dell’informazione specifica codificata ai ribosomi
rRNA NO proteina Struttura ribosomi per la sintesi delle proteine
tRNA NO proteina Trasporto degli aminoacidi per la sintesi delle proteine
scRNA NO proteina Nell’apparato per smistamento delle proteine in sintesi
snRNA NO proteina Nell’apparato per maturazione degli mRNA
MicroRNA NO proteina Regolazione dell’espressione genica
Struttura del gene eucariotico e maturazione mRNA
Introne 2 3
(900 geni / 106 di bp nei procarioti rispetto a 9 geni / 106 di bp nell’uomo)
La complessità del genoma eucariotico ha reso più complicato il processo di trascrizione a causa di:
Una prima soluzione è rappresentata dall’uso di tre diverse RNA polimerasi con ruoli specifici e lavori differenziati
1. presenza della membrana nucleare; 2. organizzazione del genoma in cromatina; 3. struttura del gene “in pezzi”.
Gli eucarioti hanno un numero maggiore di geni, ma dispersi in una enorme quantità di DNA non codificante: la densità genica è 100 volte più bassa
GENI DISCONTINUI: gli INTRONI
1. Il prodotto della trascrizione è un RNA PRECURSORE (preRNA) che ha la stessa lunghezza del gene
2. Geni e trascritti primari hanno sequenze non codificanti : INTRONI
3. Le sequenze NON codificanti interrompono quelle codificanti
4. Le sequenze NON codificanti sono rimosse mediante RNA SPLICING
5. Le sequenze codificanti, ESONI, sono saldate tra loro nell’mRNA
6. Lo splicing è controllato da molecole snRNP = SPLICEOSOMA e da RIBOZIMI = molecole di RNA con funzione catalitica
RUOLO EVOLUTIVO del GENE DISCONTINUO: 1. splicing alternativo; 2. evoluzione di domini proteici(dominio= esone); 3. possibile aumento di ricombinazione; 4. proteine con nuovi assortimenti funzionali
Trascrizione e livelli di controllo PREtrascrizionali
La trascrizione può essere considerato un insieme di livelli di regolazione dell’espressione del gene
Pol I (nel nucleolo)→ pre-rRNA (28S, 5.8S, 18S) Pol III →tRNA e rRNA 5S e altri piccoli RNA (U6, 7S) Pol II → mRNA trascritto genico per le proteine. Ha un dominio
carbossi-terminale per la fosforilazione che determina attività enzimatica
I.
Cambiamenti nella conformazione della cromatina mediante fosforilazione, metilazione, deacetilazione,…. I fattori che rimodellano la cromatina partecipano all’attivazione dei promotori ( p.e. elicasi e altri implicati nell’assemblaggio dei complessi di inizio) Repressione mediata dalla struttura dell’eterocromatina che inibisce l’espressione genica in corrispondenza dei telomeri e di regioni compattate (eterocromatina , eucromatina ipoacetilate)
II.
Transito nella fase S del ciclo cellulare e riparazione cotrascrizionale dei danni al DNA sotto il controllo di fattori di espressione come TFIIH che
attiva la protein-chinasi necessaria
III.
LA TRASCRIZIONE IN EUCARIOTI
DNA a DOPPIA ELICA: un solo filamento stampo
MONOMERI costituiti da RIBONUCLEOTIDI TRIFOSFATI
Tre RNA polimerasi DNA dipendenti nucleari e una RNA polimerasi mitocondriale
Sito di inizio a monte di ogni gene: TATA box + fattori proteici di inizio
Direzione di sintesi: 5’ 3’⇨
Allungamento della catena : legame fosfodiestere
Assenza di attività di correzione delle bozze
Terminazione della sintesi con sequenze segnale specifiche :
RNA I ►18 nucleotidi ; RNA II ►10-35 nucleotidi a valle di AAUAAA
RNA III ►sequenze UUUU…
Inizio trascrizione eucarioti
TFIID = fattore di trascriz. specifico di Pol II, si lega a TBP e al DNA
L’RNApol II di mammifero ha una coda CTD: Dominio Carbossi-Terminale di 52 ripetizioni di un eptapeptide
TFII A,B,E,F: fattori trascrizionali costituenti l’oloenzima
TFII H: attività elicasica per aprire la doppia elica ( bolla di trascrizione)e di fosforilazione di CTD
La Pol II inizia a trascrivere, si allontana dal promoter - gli altri fattori vengono rilasciati - TBP resta sulla TATA box con altri TF che restano legati al promotore per attirare un’altra RNA pol II
RNA
TATA box: sede del 1° evento
TBP: TATA binding protein, attira gli altri GTF la RNApolII al promotore
RNApolII eTFIIF completano il complesso pre-iniziale PIC che adatta l’enzima nella precisa posizione di start
bolla di trascrizione
RNApol.II
Maturazione cotrascrizionale di RNA eucariotiNegli eucarioti il trascritto primario viene modificato durante il processo di maturazione ad opera del CTD: 1. aggiunta di un cappuccio all’estremità 5’; 2. aggiunta di una coda di poliA al 3’ (poliadenilazione); 3. meccanismo di splicing per la saldatura degli esoni dopo rimozione degli introni
Maturazioni delle estremità *5’: Durante l’allungamento dell’RNA proteine specifiche interagiscono con CTD aggiungendo al 5’ il cap(capping), residuo 7-metilguanosidico, di protezione e necessario per la traduzione *3’: alla fine della sintesi un enzima riconosce la sequenza AAUAAA , taglia l’estremità 3’ 20 basi dopo la sequenza e aggiunge un segmento di 150-200 Adenine
Splicing di RNA trascritto primario Rimozione di sequenze non codificanti dei geni eucariotici, gli introni, e saldatura delle sequenze codificanti, gli esoni. Dopo lo splicing l’mRNA ha una sequenza del tutto colineare con la sequenza primaria del polipeptide codificato. Grande quantità di DNA dei mammiferi codifica introni. Gene DMD: 79 esoni, 78 introni in 2,5x106 bp
CTD
1. L’ultimo fosfato dell’ultimo nucleotide 5’ trifosfato del preRNA viene rimosso e trasformato in difosfato
2. Aggiunta Guanosina monofosfato (GMP) 5’ con orientamento invertito
3. Formazione di un ponte trifosfato 5’-5’
CAP al 5’
4. Metilazione in posizione 7 della guanosina e metilazione del penultimo nucleotide in posizione 2 del ribosio
Meccanismo di splicing
Sequenze evolutivamente conservate
Particelle nucleari ribonucleoproteiche (snRNP) Small nuclear RiboNucleoprotein Particles
Legami H tra snRNA e sequenze complementari dli introni allineano i siti di splicing
Formazione del cappio
GU A
AG
Appaiamento complementare snRNA e sequenze introniche
Splicing alternativoDiversi tipi di splicing del gene α-tropomiosina nei vari tipi cellulari: 9 diverse proteine da un solo trascritto primario
Verde= introne Non verde=esoni A=Poliadenilazione
= regioni rimosse
Maturazione post-trascrizionale dell’mRNA eucariotico RNA precursore, copia esatta del gene, subisce modifiche strutturali prima
di uscire dal nucleo
1. Aggiunta del cap al 5’
2. Aggiunta della coda di poliA al 3’
3. Splicing degli esoni
4. Uscita dal nucleo come mRNA (maturo)
SIGNIFICATI DEI MECCANISMI POST-TRASCRIZIONALI
1. Aggiunta del cap al 5’ Protegge l’estremità 5’ dall’attacco delle esonucleasi
Favorisce il trasporto dell’RNA fuori dal nucleo
Svolge un ruolo nell’inizio della traduzione
2. Aggiunta della coda di poliA al 3’
situata 15 nucleotidi a valle di AAUAAA è il sito di riconoscimento per l’assemblaggio del complesso proteico che compie, in associazione con la RNApol, la maturazione dell’estremità 3’. Una endonucleasi taglia il pre-RNA a valle e la poli(A)polimer aggiunge 250 adenosine senza necessità di stampoUUU
Protegge l’estremità 3’ da una prematura degradazione da parte delle esonucleasi e identifica l’RNA come un messaggero
Sequenze regolatrici dei geni eucarioticiGli intensificatori (enhancer), lunghi 100-200 bp, possono essere localizzati fino a decine di migliaia bp a monte o a valle del promotore, all’interno di un introne o a valle dell’esone finale. Inducono un over-trascriction del gene. Mutazioni a livello di enhancer provocano diminuzione del prodotto genico
I repressori inibiscono l’espressione di un gene a livelllo della trascrizione. Proteine a tipica azione repressoria sono gli oncosoppressori. La mutazione di un sito di legame con il repressore provoca un aumento dell’espressione del gene. Il gene WT1 mutato → induzione del tumore di Wilms neonatale
Gli elementi di regolazione sono spesso specifici per tipo cellulare e attivi in relazione al differenziamento.Il gene TTR (transtiretina= proteina di trasporto nel sangue dell’ormone tiroideo) si esprime nell’epatocita e in cellule del cervello secernenti il liquido cerebrospinale. Sono stati identificati elementi di controllo di trascrizione alternativi, specifici per i due tessuti.
CONTROLLO DELLA TRASCRIZIONE
Regolatori della trascrizione a livello della struttura della cromatina mediante fosforilazione, metilazione, iperacetilazione e ipoacetilazione degli istoni, microRNA
Nelle cellule umane il TFIIH è anche un regolatore del ciclo cellulare necessario per attivare la protein-chinasi richiesta per il transito in fase S del ciclo cellulare e per la riparazione co-trascrizionale dei danni al DNA.
Gli elementi che controllano la trascrizione sono tessuto-specifici e responsabili del DIFFERENZIAMENTO cellulare
In trans: Proteine di legame affini al DNA ⇨ eterodimeri ► Intensificatori (enhancer):inducono livelli massimi di trascrizione► Repressori: p.e. la proteina del gene WT1(oncosoppressore), espresso nel
rene durante lo sviluppo, blocca l’espressione del gene EGR1
In cis: il PROMOTORE con la TATA BOX (-25) a cui si legano i fattori di base della trascrizione (TF)
TRASCRIZIONE e RETROTRASPOSONII trasposoni sono elementi genetici mobili che possono spostarsi all’interno di un genoma anche lasciando una propria copia nel sito originario.
1. trascrizione del DNA del trasposone con RNApol.
2.Trascrizione inversa di DNA RNA dipendente e sintesi di cDNA
Trasposizione attraverso intermediario di RNA
Integrazione in un diverso sito del DNA del trasposone. Possibili mutazioni per inserzione
Le sequenze umane LINE (long interspersed sequence: 3000 bp) e le SINE (100-400bp) sono retrotrasposoni capaci di spostamenti autonomi; sono il 20% del genoma umano. Tra le LINE le sequenze L1hanno una ORF per trascrittasi inversa. Caso di Emofilia in bambini per insrzione di L1nel gene fattore VIII (OMIM 306700)