la protéomique d’expression différentielle l’analyse différentielle consiste à comparer au...
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La protéomique d’expression différentielle
L’analyse différentielle consiste à comparer au travers de la présence des molécules biologiques, deux situations.
Ceci est réalisé quotidiennement dans les LAM : détection d’un syndrome d’inflammation révélé par la présence de la protéine CRP. Si on cherche à comprendre l’amplitude et l’évolution du syndrome, il est nécessaire de corréler la concentration sérique de la CRP avec celles de l’orosomucoïde et de l’haptoglobine.
Pour découvrir sans a priori de nouvelles molécules d’intérêt
Transcriptome : évènements post-traductionnels pas vus et les aspects cinétiques au niveau des protéines pas considérés
Protéome : la méthode la plus utilisée actuellement : la 2D-PAGEUne nouvelle méthode : l’ICAT (Isotope Coded Affinity Tag)
Patrick O’FARRELL 1970 Actuellement responsable
d’un laboratoire à l’Université de Californie
John YATESActuellement responsable
d’un laboratoire au Scripps Research Institute
La Jolla en californie
La protéomique d’expression différentielle par gel 2D
Deux conditions (ex : cancer – pas cancer, traitée-non traitée)
Les protéines modifiées entre deux situations cellulaires distinctes doivent être effectivement détectables sur gels 2D et à un taux permettant leur identification
Les variations détectées devront être répétitives et statistiquement validées
Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D
Les protéines impliquées dans la transduction de signaux sont rarement mises en évidence sur les gels 2D (100 à 1000 protéines par cellule). Or ces protéines assurent des fonctions très importantes en terme de régulation. Il faut donc utiliser des moyens qui permettent de faire des tris sélectifs de molécule.
Tri par différences de solubilité
Pas la cellule entière mais seulement un des compartiments ou organites : noyau, cytoplasme, mitochondrie
Extraction sans détergent va favoriser l’extraction des protéines cytoplasmiques
L’utilisation de solutions ayant un pouvoir d’extraction croissant va favoriser la solubilisation des protéines hydrophobes
Sur un gel le rapport d’intensité entre le plus petit et le plus gros spot est de 104
Dans une cellule la dynamique d’expression est au moins de 105 voire de 106
Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D
Pré-fractionnement des extraits par chromatographie et méthodes dérivées
Fractionnement de l’extrait protéique selon un critère physico-chimique (charge, hydrophophilie,…). Toutes les fractions sont ensuite analysées par 2D.
Sélection d’une famille de protéines : phosphoprotéome, glycoprotéome
Sans a priori
Avec a priori
Anti-phosphotyrosine
Enrichissement en protéines d’intérêt avant la 2D
Pré-fractionnement des extraits par isoélectrofocalisation
Rotofor®
Deux approches d’analyse différentielle des gels 2D
Comparaison statistique entre plusieurs gels
DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis
Acquisition des images
Gel 2D Données numériques
x
y
Les pixels ont une valeur de densité optique (DO) proportionnelle à l’intensité du signal enregistré
Dans un gel le rapport de DO entre le plus petit spot et le plus gros est de 104
Méthode de détection•Sensible •Linéaire
Méthode de détection
Bleu de coomassie alcoolique ou colloïdalMétaux lourdSonde fluorescente
µg0,2 ng2 ng
Gamme étroite
Instrumentation de digitalisation
Tube photosensible + scanner (lampe fluorescente ou faisceau laser)
Trans-illuminateur à décharge gazeuse + caméra CCD refroidie
PhosphorImager Typhoon
Écran phosphorescent
Les logiciels d’analyse d’image
Année 70 : Gellab, Tycho, Lips ou Elsie
Année 80 : Quest, Mélanie et Kepler
Année 90 : Mélanie II, PDQuest, Phoretix 2D
Aujourd’hui :Progenesis développé par NonLinear Dynamics NewcastleMélanie 4 developpé par SIB à Genève
Unix
Système d’exploitation non programmable
Windows 95 ou NT
Windows XP
Progenesis
≈ 80 000 €
Mélanie
Version gratuite sans la 3D
Analyse statistique
Une analyse différentielle fiable nécessite une comparaison entre des séries d’au moins trois à quatre gels
Outils statistiques•Analyse heuristique•Analyse par correspondance
Détermination de la dispersion entre les gels des différentes séries
NT NT
NT NT
951 spots
Les protéines cytoplasmique des cellules humaines du lymphome de Burkitt
Michel CARON Paris 2002
antiIgM
Lymphome malin non différencié, retrouvé en Afrique centrale mais également dans d'autres régions du monde. La principale manisfestation est une grande lésion ostéolytique de la mâchoire inférieure ou une masse abdominale.
Analyse protéomique du carcinome hépatocellulaire
Jean Rosenbaum Bordeaux 2002
Nicotinamide N-methyltransferase
Ig Kappa Chain V
Nicotinamide N-methyltransferase
Ig Kappa Chain VTissu non tumoral
CHC
Reproductibilité des gels d’electrophorèse 2D: gels résultant de 4 expériences indépendantes réalisées sur le même échantillon
Cas 1 Cas 2 Cas 3 Cas 4
Tissu non tumoral
CHC
Diminution de la formininotransferase cyclodesaminase dans les CHC
Clusterisation hiérarchique
Cas 1 2 3 4
Cas 1 2 3 4
Protéines sur-exprimées dans le foie tumoral
Cas 1 2 3 4
Protéines sous-exprimées dans le foie tumoral
DIGE : DIfferential Gel Electrophoresis
N-hydroxy-succinimidyl ester : réaction de substitution nucléophile avec le groupe amine en des lysines pour former une amide
Differential 2D-Gel Electrophoresis (DIGE)
Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers
DIGE gel images of normal and cancer cells
Cy3 image of proteins from normal cells
Cy5 image of proteins from tumor cells
SYPRO Ruby-stained gel image
Esophageal Scans Cell Cancer-specific Protein Markers
Effects of Culture on Abundance of Myocyte Proteins
The iTRAQ™ reagents consist of a charged reporter group, a peptide reactive group and a neutral balance group. The peptide reactive group reacts with primary amines and labels all peptides. An increase in the overall protein coverage results from all peptides being labeled.
iTRAQ™ développé par Applied Biosystem
114
115
116
117
31
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29
30
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145
145
145
+
+
+
+
As these tags are isobaric in MS, quantitation occurs in MS/MS using reporter ions. Investigation of 75,000 accumulated MS/MS spectra identified a quiet region between m/z of 113-119. Reporter ions reside in this quiet region.
Depiction of a multiplexed reaction of 4 different samples. MS/MS spectra of iTRAQ™ reagent labeled peptide shows good y- and b- ions for peptide sequencing. Zoomed section shows the reporter ions used for quantitation. Efficient multiplexing (n=4) allows multiple comparisons across samples that enable the inclusion of duplicates and triplicates into experimental design.
MS/MS spectra of BSA peptide AEFVEVTK labeled with iTRAQ™ reagents shows a significant enrichment of both the y- and b- ions (without peak splitting), providing higher confidence in peptide identifications. Data collected on Q TRAP® System.