T. C.Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi

KBB KliniğiŞef: Doç. Dr. Mehmet Külekçi

KRONİK TONSİLLİTTE BİOFİLMİN ROLÜ

(UZMANLIK TEZİ)

Dr. Zafer ÇİFTÇİ

İstanbul 2005

1

ÖNSÖZ

Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Kulak Burun Boğaz Kliniğinde

geçirdiğim 5 yıl boyunca desteğini her zaman yanımda hissettiğim, gerek

hekimlik yaşamımda gerekse sosyal yaşamımda kendime örnek aldığım sayın

hocam Doç. Dr. Mehmet Külekçi'ye, asistanlığım boyunca her an, her konuyu

danışabildiğim ve tüm sıkıntılarımı paylaşabildiğim sayın uzman abilerim Op.

Dr. Özbil Erkan, Op. Dr. Mete Alioğlu, Op. Dr. Murat Topak, Op. Dr. Ömer

Necati Develioğlu ve Op. Dr. Erdoğan Gültekin'e, birlikte gülüp, birlikte

hüzünlendiğim sevgili arkadaşlarım Op. Dr. Ayşe Aslı Şahin ve Op. Dr. Öner

Çelik'e ve diğer tüm asistan arkadaşlarıma,

Sevgili aileme ve dostluklarını kalbimde hissettiğim tüm arkadaşlarıma sonsuz

teşekkürlerimi sunarım...

2

1. GİRİŞ: ...........................................................................................................1 – 3

2. GENEL BİLGİLER: ................................................................................... 4 – 48

1. PALATİN TONSİLLERİN ANATOMİSİ: .........................................................5 – 6

2. PALATİN TONSİLLERİN İMMÜNOLOJİSİ: ................................................. 7 – 9

3. PALATİN TONSİLLERİN BAKTERİYOLOJİSİ: ...........................................10

4. TONSİLLİTİN KLİNİK ÖZELLİKLERİ: .........................................................11– 12

5. AKUT TONSİLLİTİN KOMPLİKASYONLARI: ............................................ 12

6. TONSİLLEKTOMİ ENDİKASYONLARI: ....................................................... 12 – 14

7. KRONİK TONSİLLİTTE MEDİKAL TEDAVİYE

YANITSIZLIKTA ÖNE SÜRÜLEN TEORİLER: ....................................................15

8. BİOFİLM NEDİR? ........................................................................................ 16 – 19

9. BİOFİLM TARİHÇESİ: ............................................................................... 20 – 22

10. NEDEN BİOFİLM OLUŞTURULUR? ........................................................23 – 25

11. BİOFİLM GELİŞİMİNİN BEŞ EVRESİ: ................................................... 26 – 27

12. QUORUM – SENSING MEKANİZMALARI: ........................................... 28 – 29

13. BİOFİLM BAKTERİSİ - PLANKTONİK BAKTERİ

KARŞILAŞTIRILMASI: .............................................................................................29

– 30

14. DOĞADA BİOFİLM: ............................................................................................................. 31

– 34

15. FAYDALI BİOFİLMLER: ....................................................................................................34

– 35

16. TIBBİ ENFEKSİYONLAR VE BİOFİLM İLİŞKİSİ: ........................................................ 36

– 40

17. BİOFİLM ENFEKSİYONLARININ ORTAK ÖZELLİKLERİ: .......................................41

18. BAKTERİYEL BİOFİLMLER NEDEN ANTİMİKROBİYAL İLAÇLARA

DİRENÇLİDİR? ......................................................................................................................42

– 44

19. BİOFİLM VE KBB ENFEKSİYONLARI ARASINDAKİ İLİŞKİ: .................................. 45

– 47

20. BİOFİLM VE KRONİK TONSİLLİT ARASINDAKİ İLİŞKİ: .........................................48

3. MATERYAL VE METOD: .......................................................................................48

– 50

3

4. SONUÇLAR: .............................................................................................................. 50

– 53

5. TARTIŞMA: ............................................................................................................... 54

– 57

6. BİOFİLMLERLE MÜCADELEDE YENİ UFUKLAR: ........................................ 58

– 61

7. REFERANSLAR: …………………………………………………………61 – 64

4

GİRİŞ:

Pediatrik popülasyonda morbiditeye yol açan patolojilerin başında enfeksiyon

hastalıkları gelmektedir. Gerek çocuklarda, gerekse erişkinlerde üst solunum yolu

enfeksiyonları arasında ilk sırayı ‘akut tonsillit’ almaktadır (1, 2).

Akut veya kronik tonsillitin yaratmış oldukları morbidite, olası komplikasyonlar,

uygulanan medikal veya cerrahi tedavi, uygulanan tedavinin getirebileceği morbidite ve

komplikasyonlar ve iş gücü kaybı gibi faktörler göz önünde bulundurulduğunda, karşı

karşıya olduğumuz tablonun büyüklüğü daha da belirgin hale gelmektedir. Roos ve ark.

tarafından İsveç’te yapılan bir çalışmada, bir tonsillit atağında ortalama hastalık süresi 7

gün ve hastalık sonrası iyileşme dönemi 5 gün olarak saptanmıştır. Bu süre içerisinde iş

gücü kaybı, uygulanan medikal tedavinin maliyeti gibi parametreler değerlendirilerek, bir

tonsillit atağının toplam maliyetinin 385 Amerikan doları olduğu hesaplanmıştır (3). Üst

solunum yolu enfeksiyonlarının yarattığı morbiditeye bağlı olarak, 1996 yılında Amerika

Birleşik Devletleri'nde (ABD) okula giden her yüz çocuğun yılda toplam 152 gün okula

devamsızlık yaptığı bildirilmiştir (4).

Tek bir tonsillit atağının erken dönemde getirdiği maliyete ek olarak, tekrarlayan

atakların ve olası komplikasyonların tedavi maliyeti de ekonomik yükü artırmaktadır.

Uygun medikal tedavi kullanılmasına rağmen tekrarlayan tonsillit atakları tonsillektomiyi

5

kaçınılmaz hale getirmektedir. Operasyon gerektiren durumlar da bu tabloya eklenince

akut tonsillitin parasal açıdan, iş gücü kaybı açısından ve beraberlerinde getirdiği

morbidite ve mortalite açısından ne kadar önemli bir sağlık sorunu olduğu ortaya

çıkmaktadır. Kronik tonsillit nedeniyle tonsillektomi uygulanan hasta sayısında dünya

çapında azalma eğilimi olmasına rağmen, bu sayı hala oldukça yüksektir. Tonsillektomi

sayısındaki bu düşüşün, uygun antibiyoterapinin uygun süreler boyunca kullanılması,

sağlık bakım hizmetlerine ulaşabilen hasta sayısında artış olması ve ameliyat kararının

verilmesinde daha objektif kriterlerin göz önünde bulundurulması gibi faktörlere bağlı

olduğu düşünülmektedir. ABD’nde 1971 yılında yapılan tonsillektomi sayısı 1019 x103

ten 1987 yılında 259 x 10 3 e düşmüştür. Buna karşılık İskoçya'da gerçekleştirilen

tonsillektomi sayısında azalma yerine artış söz konusudur. 1977 yılında gerçekleştirilen

tonsillektomi sayısı 12.447 iken 1990 yılında bu değer 12.652 olarak bildirilmiştir (5).

Yaşam kalitesi ve verimlilik üzerine bu denli olumsuz etkileri olan kronik tonsillitin

patogenezini aydınlatmaya yönelik bugüne kadar bir çok çalışma yapılmış ve bir çok teori

öne sürülmüştür. Duyarlı mikroorganizmalara karşı uygulanan medikal tedaviye rağmen

enfeksiyonun neden tekrarladığı veya medikal tedaviye neden direnç oluştuğunu

açıklayabilmek amacıyla bir çok teori öne sürülmüştür. Öne sürülen teoriler arasında: 1)

kommensal organizmaların eliminasyonu, 2) viral patojenlerin varlığı, 3) streptokokların

epitelyal hücrelere internalizasyonu, 4) farklı bakteriyel patojenlerin varlığı ve 5) biofilm

oluşumu yer almaktadır (6).

Bu teorilerden en sonuncusu ve en ilgi çekeni ise biofilm teorisidir. Bu teoriye göre

kronik tonsillitin oluşumunun altında yatan faktör tonsil yüzeyinde oluşturulan bakteriyel

6

biofilmlerdir. Biofilmler, bakterilerin bir araya gelerek oluşturdukları toplumsal bir yaşam

modelidir. Bu model aslında çok eskilere dayanan bir prokaryotik sağ kalım stratejisidir.

Bakteriyel biofilmlerin insanlarda görülen hastalıklarla ilişkisi bir süredir bilinmesine

rağmen, özellikle otorinolarengolojik hastalıklar ve biofilmler arasındaki ilişki yeni yeni

belirlenmeye başlanmıştır. Geçtiğimiz yıllarda yapılan çalışmalarda

kronik otitis media ve kolesteatoma ile biofilmler arasındaki ilişki ortaya konmuş (7) ve

endotrakeal tüpler (8), ses protezleri (9) ve timpanostomi tüplerinin üzerlerinde de (10)

biofilm oluştuğu gösterilmiştir.

Kronik tonsillit ve biofilm oluşumu arasındaki ilişkiye dikkat çeken ilk ve tek çalışma

(11) Chole ve ark. tarafından transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak

gerçekleştirilmiştir. Biz bu çalışmada, kronik tonsillit nedeniyle tonsillektomi

uyguladığımız hastaların tonsillerinin yüzeyinde biofilm varlığını tespit etmek amacıyla

tarama elektron mikroskobu kullandık ve elde ettiğimiz sonuçları literatür ışığı altında

tartıştık.

7

GENEL BİLGİLER:

Akut tonsillit, çocuklarda sık görülen hastalıklardan biridir. En az bir veya iki tonsillit

atağı geçirmemiş bir çocuğun bulunması oldukça güçtür. Bu ataklar özellikle çocuğun ilk

defa çok sayıda çocukla karşılaştığı bir dönemde, yani anaokulu veya ilkokula başlarken

görülür.

Çocuklarda akut tonsillitin bakteriyolojisi ve boğazın normal florası hem ilgi

uyandırıcı hem de şaşırtıcıdır. Yapılan birçok çalışmada "akut tonsillit" anamnezi olan

çocuklardan alınan boğaz kültürlerinin, sağlıklı çocuklardan alınan boğaz kültürlerinden

farklı olmadığı gösterilmiştir (12).

Çocuklarda akut tonsillitin gelişmesinden en çok sorumlu tutulan organizmanın ne

olduğu konusunda hala şüpheler mevcuttur. Bir virüs enfeksiyonunun tonsillit atağı

başlatarak bakteriyel enfeksiyona zemin hazırladığı öne sürülmüştür. Bununla beraber

Adenovirüsler, Ebstein-Barr virüsü ve Herpes Simplex virüsü tek başlarına tonsillit

nedeni olabilmektedirler. Tonsillite neden olan bakteriler arasında en sık Beta-hemolitik

streptokoklar, Streptococcus pneumoniae ve Haemophilus influenzae ile karşılaşılır.

Yüzey sürüntülerinde %32 oranında anaerobların varlığı saptanmıştır fakat bunun

anlamlılığı bilinmemektedir (12).

8

PALATİN TONSİLLERİN ANATOMİSİ:

Palatin tonsiller Waldeyer halkasındaki en büyük lenfoid doku birikimini temsil

ederler. Lingual ve farengeal tonsillerin aksine kendilerine kompakt bir yapı kazandıran

bir kapsüle sahiptirler (Resim 1).

Resim 1: Palatin tonsilin kapsülünü gösteren histolojik kesit

Tonsiller üzerlerinde stratifiye skuamöz epitelle kaplı ve yüzeyden derinlere doğru

uzanan kript adı verilen girintiler bulundurur ( Resim 2).

9

Resim 2: Tonsillektomi spesimeninin görünümü

Tonsillerin arteryel kanlanmaları oldukça zengindir. Primer olarak alt polden tonsile

giren dorsal lingual arterin tonsiller dalı, fasiyal arterin asendan palatin dalı ve fasiyal

arterin tonsiller dalı ile üst kutuptan gelen asendan farengeal arter ve lesser palatine arter

kanlanmayı gerçekleştirir. Venöz dönüş ise bir peritonsiller pleksus aracılığıyla lingual ve

farengeal vene ve daha sonra internal juguler vene doğru gerçekleşir. Lenfatik drenaj

çoğunlukla jugulodigastrik nodlara doğrudur. Tonsillerin innervasyonu ise

glossofarengeal sinirin tonsiller dalları ve lesser palatin sinirin desendan dalları tarafından

gerçekleştirilir.

10

PALATİN TONSİLLERİN İMMÜNOLOJİSİ:

Periferik kanda izlenen T hücre lenfositlerin hakimiyeti, tonsiller doku içerisinde

yerini B hücresine bırakır. B lenfositler tonsiller doku içerisinde tüm lenfositlerin %50 –

65 ini oluşturur. T hücrelerinin ve matür plazma hücrelerinin yüzdeleri ise sırasıyla 40 ve

3 tür. Tonsillerin immünreaktif lenfoid hücreleri 4 farklı alanda bulunur: retiküler hücreli

epitel, ekstrafolliküler alan, lenfoid folikülün mantle zonu ve lenfoid follikülün germinal

merkezi (Resim 3).

Resim 3: Palatin tonsil içerisindeki lenfoid folikülün germinal merkezi

11

Tonsillerin sekretuar immünoglobulin üretimini düzenleyici olduğuna ve sekretuar

immüniteyi indüklediğine dair bir çok kanıt vardır. Bağırsaklardaki epitelde bulunan

Peyer plaklarına benzer bir şekilde antijen alımını sağlayabilen özelleşmiş bir endotel ile

döşeli kanallardan oluşan bir sisteme sahiptirler. Tonsiller, hava yolu ile gelen

antijenlerin dışarıdan, lenfoid hücrelere direkt olarak taşınmasını sağlayan bir yapıya

sahiptirler. Vücudun diğer bölgelerinde ise lenf nodlarında antijenik sunum sadece

efferent lenfatikler aracılığıyla gerçekleşir. Tonsiller kriptler stratifiye skuamöz epitelle

kaplıdırlar. Her bir tonsilde 10 – 30 adet kript bulunmaktadır ve yabancı materyali

yakalayarak lenfoid foliküllere taşıyacak şekilde konumlanmışlardır (Resim 4).

Resim 4 : Yabancı maddenin kriptler aracılığıyla lenfoid foliküllere taşınmasıE :Epitel LT : Lenfatik doku Ok: Tonsiller kript

12

Tonsiller sekonder lenfatik organlar arasında yer alır. İntratonsiller savunma

mekanizmaları zayıf antijenik sinyalleri elimine ederler. Germinal merkezlerde antijene

duyarlı B hücrelerinin proliferasyonu sadece yüksek antijen konsantrasyonlarının

varlığında ortaya çıkar. Düşük antijen dozları ise lenfositlerin plazma hücrelerine

dönüşmelerine neden olur. Tonsillerin germinal merkezlerinde B hücrelerinin

üretilmesinin, tonsillerin en önemli fonksiyonlarından biri olduğu Siegel tarafından öne

sürülmüştür.

Tonsiller lokal çevrelerinde antikor üretebildikleri gibi, farenkse ve periglandüler

lenfoid dokulara migrasyon yapan B hücreleri ile başka bölgelerde de antikor üretimine

katkıda bulunurlar. Tonsillerin T hücrelerinde interferon-gamma gibi önemli

lenfokinlerin üretiminin olduğu gösterilmiştir fakat bu hücrelerin tümör yanıtında rol

oynayıp oynamadıkları halen bilinmemektedir.

İnsan tonsilleri immünolojik olarak en aktif dönemini 4 – 10 yaşlar arasında yaşar.

Puberteden sonra tonsillerin involüsyonu gerçekleşir. Bu dönemde B hücresi sayısı

azalmış ve T / B hücresi oranında rölatif bir artış gerçekleşmiştir. Antikor üretim

fonksiyonları oldukça etkilenmesine rağmen, klinik olarak sağlıklı tonsillerde 80 yaşında

bile anlamlı derecelerde B hücresi aktivitesi izlenebilmektedir. Bununla beraber bu

durum, rekürren tonsillit ile ilişkili olarak ortaya çıkan değişikliklerden farklıdır.

Retiküler kript epitelinin rekürren inflamasyonu sonucu immünolojik olarak aktif

hücreler lümeni doldurur ve antijen transport fonksiyonu engellenmiş olur. Bunun

sonucunda da kript yüzeyi epiteli stratifiye skuamöz epitele dönüşür. Bu değişiklikler

lokal B hücresi sisteminin aktivasyonunun azalmasına, antikor üretiminin azalmasına ve

B hücresi yoğunluklarında ve ekstrafolliküler alanlardaki germinal merkezlerin

sayılarında azalmaya neden olur (13).

13

PALATİN TONSİLLERİN BAKTERİYOLOJİSİ:

Üst solunum yolunda normal floranın oluşması doğumda başlar. 6 – 8. aylarda

Actinomyces, Fusobacterium ve Nocardia edinilir. Daha sonra oral floranın bir parçası

olarak Bacteroides, Leptotrichia, Propionobacterium ve Candida yerleşimi olur. Diş

çıkarılmasından sonra Fusobacterium popülasyonu artış gösterir ve 1 yaşında zirve

değerlere ulaşır. Tükürükteki anaerobik / aerobik bakteri oranı yaklaşık 10:1 dir.

5 yaşına kadar olan sağlıklı çocukların oral floralarında aerobik patojenler bulunabilir.

Ingvarsson, Lundgren ve Irving sağlıklı çocuklarda %19 oranında Streptococcus

Pneumoniae, %13 oranında Haemophilus influenzae, %5 oranında A grubu Streptococcus

ve %36 oranında ise Moraxella Catarrhalis izole etmişlerdir. Yaşın artması ile birlikte

immünitede de artış izlenir ve bu oranlarda azalma izlenir.

14

TONSİLLİTİN KLİNİK ÖZELLİKLERİ:

Tonsil dokusundaki hastalıklar dört kategoride ele alınabilir: akut tonsillit, rekürren

akut tonsillit, kronik tonsillit ve obstrüktif tonsiller hiperplazi.

Akut tonsillit, ani başlangıçlı ve üşüme – titreme ataklarının izlendiği bir klinik seyir

izler. Hastada 390 C'ye kadar yükselebilen ateş ve boğaz ağrısı izlenir. Katı gıdaların alımı

özellikle inflamasyonun maksimum olduğu dönemlerde çok güçleşir.Bazen febril

konvülsiyonlar görülebilir. Hastada ağrılı servikal lenfadenopatiler saptanabilir. Fizik

muayenede tonsiller eritematöz bir görünümdedir. Tonsiller kriptlerin içerisinde sarı-

beyaz pürülan eksuda birikintileri bu tabloya eşlik edebilir. Bu tablonun 4 haftadan az

olmak koşuluyla, aralıklarla tekrarlaması durumunda rekürren akut tonsillitten bahsedilir.

Hastanın boğaz ağrısı veya odinofajisinin 4 haftadan daha uzun sürmesi durumunda,

tablo kronik tonsillit adını alır. Kronik tonsillitle ilişkili semptomlar tonsillolitiazis,

halitosiz, tonsiller üzerinde aşırı debris, peritonsiller ödem ve persistan hassas servikal

lenfadenopati varlığıdır. Fizik muayenede eritem, yüzeydeki damarların dilatasyonu ve

nispeten pürüzsüz bir tonsil yüzeyi dikkat çeker. Tonsiller obstrüktif tonsiller hiperplazi

tablosundaki tonsillerin aksine küçülmüş olarak izlenir.

Obstrüktif tonsiller hiperplazide horlama, disfaji ve ses değişiklikleri gibi semptomlar

izlenir. Yetişkinlerde gün içerisinde aşırı uykululuk hali en sık izlenen semptom olduğu

halde, çocuklarda azalmış okul performansı ve noktürnal enürezis gibi semptomlar

izlenebilir.

15

AKUT TONSİLLİTİN KOMPLİKASYONLARI:

Akut tonsillitin komplikasyonları iki başlık altında incelenebilir: süppüratif

komplikasyonlar ve süppüratif olmayan komplikasyonlar. Akut romatizmal ateş,

poststreptokokkal glomerulonefrit ve kızıl akut tonsillitin süppüratif olmayan

komplikasyonlarıdır. Süppüratif komplikasyonlar ise enfeksiyonun lokal yayılım

göstererek abse oluşturma eğilimi göstermesinin bir sonucudur. Bu komplikasyonlar

arasında servikal adenit, retrofarengeal veya parafarengeal abse, peri tonsiller abse,

intratonsiller abse, inflamatuar tortikolis, hemorajik tonsillit ve postanginal sepsis

(Lemierre hastalığı) yer alır.

TONSİLLEKTOMİ ENDİKASYONLARI:

Palatin tonsillerin enfeksiyöz veya inflamatuar hastalıkları özellikle çocukluk çağında

geçirilen hastalıkların önemli bir kısmını oluşturmaktadır. Medikal tedaviye yanıtsızlık

veya tonsiller hipertofiye bağlı semptomların ortaya çıkması ile tonsillektomi seçeneği

kaçınılmaz hale gelmektedir. Amerika Birleşik Devletleri’nde 1950'li yıllarda

gerçekleştirilen tonsillektomi sayılarının yılda 1.4 milyona kadar ulaştığı, daha sonra bu

sayının 1979 yılında 500.000'e indiği bilinmektedir. 1986 yılında ise bu sayının

azalmasına rağmen hala 287.00 olduğu bildirilmiştir. İskoçya'da 1977 yılında

tonsillektomi sayısı 12.447 iken 1990 yılında 12.652 olarak bildirilmiştir (4).

İdeal olarak, herhangi bir cerrahi prosedür önerilmeden önce sorunun objektif bir

şekilde değerlendirilmesi gereklidir. Bir cerrahi girişim hasta ve hekimin subjektif

16

kararlarına dayandırıldığı oranda etkinliğini yitirir. Aslında tonsillektomi, büyük oranda

çocuğun ebeveynlerinin değerlendirmelerine dayandırılarak gerçekleştirilen

operasyonların başında gelir. Oysa hekim, bunlardan etkilenmeden objektif bir karar

vermek durumundadır.

Geçtiğimiz 30 yıl içerisinde tonsillektomi endikasyonları daha belirgin hale gelmiştir.

Tonsillektominin kesin endikasyonları disfaji, solunum güçlüğü, klinik olarak anlamlı

obstrüktif uyku apne ve alveolar hipoventilasyon veya kor pulmonale'dir. Malignite ve

kontrol edilemeyen tonsiller kanama gibi nadir görülen durumlar da, tonsillektominin

kesin endikasyonları arasındadır. Paradise ve ark. (1984) rekürren tonsilliti olan

çocuklardaki boğaz enfeksiyonlarının sıklığının, tonsillektomiyi takip eden ilk iki yıl

içerisinde anlamlı derecede azaldığını ortaya koymuşlardır (14). Son 3 yıl içerisinde her

bir yılda en az 3, son iki yıl içerisinde her bir yılda en az 5, ve son bir yılda en az 7 kez

tonsillit atağı geçirmiş olmak şeklinde tanımladıkları rekürren tonsilliti, tonsillektomi

endikasyonu olarak kabul etmişlerdir. Her bir atağın mutlaka doktor tarafından

tanımlanması gerekmektedir çünkü yaptıkları çalışmada ailelerden alınan anamnezin

yanıltıcı olabildiği ortaya çıkmıştır. Daha önce bir kez peritonsiller abse geçiren bir

hastanın ikinci bir peritonsiller atak geçirme çok yüksektir ve tonsillektomiden fayda

göreceği öne sürülmüştür. Obstrüktif uyku apnesi, büyüme ve gelişme geriliği, kor

pulmonale ve konuşma bozukluklarına neden olan tonsiller hiperplaziler de tonsillektomi

endikasyonları arasında yer alır.

17

Literatürde tonsillektomi endikasyonları arasında adı geçen diğer durumlar kalp kapağı

hastalıkları, tonsillolitiazis ve medikal tedaviye rağmen streptokokkal taşıyıcılık

durumunun devam etmesidir.

Bununla beraber Amerika Otolarengoloji - Baş ve Boyun Cerrahisi Akademisi [The

American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery (AAO-HNS)], yılda 3 ve

daha fazla sayıda tonsillit atağının varlığını tonsillektomi endikasyonu olarak

belirlemiştir. Maloklüzyon veya disfajiye yol açan hipertrofi, halitozis veya tek taraflı

tonsiller hipertrofi de endikasyonlar arasındadır. Tonsillektomi kararının verilmesinde

bireysel parametrelerin değerlendirilmesi önerilmiştir. Burada ebeveynlerin veya

çocukların tercihleri, korkuları ve hastalığı ne oranda tolere edebildikleri; hastalık

nedeniyle eğitimi aksayan çocuğun okul performansındaki değişiklikler, hastanın sağlık

bakım hizmetlerine ne derece ulaşabildiği, hastalığın tedavisi ve işgücü kaybının birlikte

getirdikleri maliyet artışı, ko-morbid hastalıklar ve perioperatif komplikasyonlar göz

önünde bulundurulmalı ve bu veriler değerlendirilerek operasyona karar verilmelidir.

18

KRONİK TONSİLLİTTE MEDİKAL TEDAVİYE YANITSIZLIKTA

ÖNE SÜRÜLEN TEORİLER:

Antibiyotik tedavisi, sonrası bakteriyel tonsillite neden olan grup A streptokokların

neden tam olarak eradike edilemediği araştırılmış ve bu durumu açıklayacak bir çok teori

öne sürülmüştür (6):

1) Kommensal organizmaların eliminasyonu

2) Viral patojenlerin varlığı

3) Streptokokların epitelyal hücrelere internalizasyonu

4) Farklı bakteriyel patojenlerin varlığı

5) Biofilm teorisi

Bakteriyel biofilmlerin insanlarda görülen kronik enfeksiyonlarda rol oynadıkları ve

sahip oldukları özellikler nedeniyle konvansiyonel terapötiklere yanıt vermedikleri

bilinmektedir. En detaylı şekilde incelenmiş biofilm olan dental plağın yanında, kistik

fibröz pnömonisi, endokardit, kronik prostatit, kronik sistit, böbrek taşları ve osteomiyelit

gibi hastalıkların da biofilm ile ilişkili oldukları gösterilmiştir. Kronik otitis media ve

kronik tonsillit gibi hastalıklarla bakteriyel biofilm oluşumu arasında ilişki olduğu da öne

sürülmüştür. Bu nedenle biofilm tanımın yapılması ve biofilmin tarihçesinin ve yapısal

ve fonksiyonel özelliklerinin açıklanması, biofilm ve hastalıklar arasındaki ilişkinin daha

iyi anlaşılabilmesi açısından gereklidir (15)

.

BİOFİLM NEDİR?

19

Mikroorganizmalar bir süre öncesine kadar, hızlı çoğalan ve tek başlarına hareket

ederek serbestçe dolaşan canlılar olarak görülmekteydi. Araştırmacılar bu yüzden bu güne

kadar, planktonik olarak da adlandırılan ve diğer bakterilerden bağımsız olarak, tek

başlarına dolaşan mikrobiyal hücrelerin davranışlarını incelemiş ve araştırmalarını bu

yönde geliştirmişlerdir. Bununla beraber, bakterilerin planktonik formdan çok, bir yüzeye

tutunarak ve biofilm adı verilen bir yapı oluşturarak hayatlarını devam ettirdiğine dair

kanıtların ortaya konduğu bir çok çalışma gerçekleştirilmiştir.

Biofilm, bir yüzeye yapışarak, belirli bir yapısal bütünlük içerisinde toplu halde

yaşayan ve birbirleriyle haberleşerek varlıklarının devamı için gerekli işlevlerin yerine

getirilmesini sağlayan bakterilerin oluşturduğu karmaşık bir organizasyondur. Bakteriler

ekstraselüler polimerik maddeler olarak da bilinen ve bir dizi polisakkarid, nükleik asit ve

protein içeren çamur veya balçık benzeri bir matriks içerisinde gömülü olarak bulunurlar.

Fosil kayıtlarından edinilen bilgiler prokaryotların 3 milyar yıldan daha uzun bir süreden

beri biofilmler içerisinde yaşadıklarını ortaya çıkarmışlardır (15).

Biofilmler inert veya canlı yüzeylerde oluşabilirler. Bu yüzeyler arasında canlı

dokular, medikal implantlar, endüstriyel veya içme suyu sistemlerinin boruları veya doğal

akuatik sistemler yer alır. Bakteriler bir yüzeye yapıştıktan ve biofilm oluşturduktan sonra

o yüzeyden hafif durulama ile uzaklaştırılamazlar. Biofilm matrikslerinin içerisinde

hücresel olmayan mineral kristalleri, korozyon partikülleri, kil veya çamur parçaları ya da

kan bileşenleri bulunabilir (16).

Yapılan araştırmalar, biofilmlerin sadece yüzeye yapışmış durumda bulunan ve

içerisinde mikroorganizmaların bulunduğu homojen bir tabakadan ibaret olmadığını,

20

bakterilerin belirli bir yapıya sahip, koordinasyon yeteneği bulunan fonksiyonel

toplulukların oluşturduğu biyolojik sistemler olduğunu ortaya koymuştur (17). Biofilmler,

matriksleri içerisinde yaşamlarını sürdüren hücrelere esansiyel besinlerin ve oksijenin

taşınmasına imkan tanıyan 'su kanallarına' sahip, çok tabakalı heterojen bir yapıya

sahiptirler (18). Tam hidrate ve canlı biofilm volümlerinin %15 hücre , % 85 matriks

materyali tarafından oluşturulduğu ve hücrelerin matrikslerinin çevrelediği farklı

yüksekliklerdeki 'kuleler' veya 'mantarlar' içerisinde bulundukları anlaşılmıştır (Resim 5)

(19).

Resim 5: Biofilmlerin yapısal elementlerini oluşturan kule veya mantar benzeri kümelenme gösteren

mikrokolonilerin şematik görünümü

Biofilm içerisinde yaşayan mikroorganizmalar tarafından sentezlenen polisakkaridler

biofilmin ana ekstraselüler komponentini oluşturur (Şekil 1). İçerisinde yaşayan

21

organizmaya bağlı olarak biofilm matriksi farklı özellikler taşıyabilir. Gram negatif

bakterilerin nötral veya polianyonik biofilmler oluşturduğu ve Gram pozitif bakterilerin

katyonik matriksler oluşturduğu bilinmektedir.

Şekil 1: Biofilmin 3 boyutlu görünümü. ( Çizim: Bryan Christie)

Donlan ve Costerton biofilm tanımını biraz daha geliştirmiş v

e biofilmleri aşağıdaki özelliklere sahip mikrobiyal hücrelerden oluşan hareketsiz bir

topluluk olarak tanımlamışlardır:

1) Hücreler irreversibl olarak bir substrata, ara yüze veya birbirlerine tutunmuşlardır.

2) Hücreler kendi ürettikleri ekstarsellüler polimerik maddelerden oluşan bir matriks

içerisinde gömülüdürler.

3) Büyüme hızları ve gen transkripsiyonları açısından serbest dolaşan türdeşleri ile

aralarında farklılıklar vardır.

22

Bu tanım çok önemlidir çünkü bir yüzeyde koloniler halinde tutunarak yaşayan bazı

mikroorganzimaların oluşturdukları her tabakaya ‘biofilm’ denilmemelidir. Gerçekte

biofilm olmayan bu topluluklar, bulundukları yüzeylerde planktonik hücre davranışı

sergilemeye devam ederler. Hiçbirinde biofilm içerisindeki bakterilerde izlenen rezistans

ve irreversibl yapışma gibi özellikler izlenmez. Bununla beraber, biofilm içerisindeki

hücrelerin zamanla matriksten koparak ayrıldıkları ve dolaşıma geçtikleri

unutulmamalıdır. Dolaşıma geçen bu hücreler, planktonik formda olmalarına rağmen,

ayrıldıkları topluluğun tüm rezistans karakterlerini taşımaktadırlar (19).

Bugüne kadar mikrobiyal biofilmlerin yapılarını incelemeye yönelik yapılan

çalışmalarda ışık mikroskopisi, transmisyon ve tarama mikroskopisi kullanılmış ya da

kavramsal modeller geliştirilerek biofilm yapısı aydınlatılmaya çalışılmıştır. Elektron

mikroskopisi için biofilm preparatı hazırlanması esnasında dehidrasyon veya

deformasyon gibi morfolojik değişiklikler ortaya çıkabilir ve fiksasyon esnasında %50 ye

varan küçülmeler izlenebilir. Biofilmlerin görüntülenmesinde kullanılan en yeni teknik

ise konfokal tarama elektron mikroskopisidir (KLTM). Bu teknikte transmisyon veya

tarama elektron mikroskopisinde karşılaşılan dehidrasyon veya deformasyon gibi

istenmeyen değişikliklerle karşılaşılmaz. Konfokal lazer tarama mikroskobu ilk olarak

1950’lerde icat edilmiştir fakat 1980'li yıllara kadar bakterilerin incelenmesinde hiç

kullanılmamıştır. KLTM kompleks yapıların optik dilimlerini ortaya çıkararak odak dışı

kalma gibi etkileri ortadan kaldırır. Eğer hücrelere floresans uygulanabilirse canlı

organizmaların izlenebildiği ve numune hazırlanmasını gerektirmeyen bir tekniktir (20).

BİOFİLM TARİHÇESİ:

23

Mikrobiyoloji tarihinin büyük bir kısmında, mikroorganizmalar primer olarak

planktonik hücreler olarak görülmüş ve zengin kültür ortamlarında gösterdikleri büyüme

özelliklerine göre tanımlanmışlardır. İlk olarak van Leeuwenhoek tarafından bildirilmiş

olan ‘mikroorganizmaların bir yüzey üzerinde tutunarak yaşayabildikleri’ şeklindeki

mikrobiyolojik fenomenin yeniden keşfedilmesi sonucu gerçekleştirilen çalışmalar,

yüzeyle ilişkili mikroorganizmaların (biofilmler) gen transkripsiyonu ve büyüme hızları

açısından farklı bir fenotip gösterdiğini ortaya koymuştur .

İlk olarak Heukelekson ve Heller, suda yaşayan mikroorganizmalarda 'şişe etkisi'ni

izlemişlerdir. Bu organizmalar, tutunabilecek bir yüzey bulmaları halinde, artmış aktivite

ve büyüme hızları sergilemekteydi. Deniz suyu içerisinde yaşayan mikroorganizmaları

inceleyen Zobell de, yüzeylerde bulunan bakteri sayısının, su içerisinde serbest dolaşan

bakteri sayısından çok daha fazla olduğunu ortaya koymuştur.

Bir atık su işleme ünitesindeki filtreleri inceleyen Jones ve ark., filtreler üzerinde

tutunmuş halde bulunan hücrelerin morfolojilerine bakarak, farklı mikroorganizmaların

bir arada bulunduklarını tesbit etmiştir. Rutenyum kırmızısı adı verilen spesifik bir

polisakkarid boyası kullanılarak, bu topluluklar içerisindeki hücreleri çevreleyen matriks

materyalinin polisakkarid olduğu belirlenmiştir.

1973 yılında Caracklis, endüstriyel su sistemlerindeki mikrobiyal toplulukları

incelemiş ve sadece yüzeye kuvvetle tutunmadıklarını, aynı zamanda klor gibi

dezenfektanlara karşı çok dirençli olduklarını da göstermiştir (16).

24

Characklis ve Marshall'da 1990 yılında uzaysal veya zamansal heterojenisite ve

inorganik yada abiyotik maddelerin biofilmin yapısındaki rolleri gibi , biofilmin diğer

tanımlayıcı özelliklerini açığa çıkararak bu teorinin doğruluğunu desteklemişlerdir .

Biofilmler aslında ilk olarak 17. yüzyılda Anton von Leeuwenhoek tarafından

tanımlanmışlardır. Bununla beraber o dönemde dişinin üzerindeki plaktan aldığı

sürüntüyü inceleyen ve mikroskop altında mikrobiyal kümelerin varlığını izleyen

Leeuwenhoek, baktığı şeyin biofilm olduğunun farkında değildi (Şekil 2).

Şekil 2: van Leeuwenhoek’in ilk biofilm tanımı

25

1970’li yılların başında Costerton dağlardaki akarsuların içerisinde yaşayan bakterileri

incelerken bakterilerin %99.99’unun bir yüzeye yapışarak, balçık benzeri bir yapı

içerisinde yaşadıklarını ortaya koymuştur. Daha önce yapılan çalışmaların da ışığında,

1978 yılında bu toplulukları tanımlamak amacıyla Costerton ilk defa ‘biofilm’ terimini

kullanmıştır (19).

Bakteriyel biofilmlerle ilgili bir çok yayın bulunmasına karşın, fungal biofilmlerle

ilgili yapılan çalışmalar henüz emekleme aşamasındadır. Transplantasyon prosedürleri,

immünsupresyon, kateterlerin uzun süre kullanımı ve yoğun bakımda uzun süre kalma

gibi nedenlere bağlı olarak fungal enfeksiyon görülme riskinde artış izlenmektedir.

Kandidiazis tablosu sıklıkla biofilm gelişimi için bir substart yüzeyi oluşturabilecek

dental implant, kateter, mekanik kalp kapakları, vasküler by - pass greftleri, oküler

lensler,yapay eklemler veya santral sinir sistemi şantları varlığında izlenir (21).

26

NEDEN BİOFİLM OLUŞTURULUR?

Bakteriler gerek in vitro gerekse in vivo ortamlarda biofilm oluşturmak suretiyle bir

dizi avantaja sahip olurlar. Biofilmler bakterileri nem, ısı ve pH değişiklikleri gibi

çevresel koşullardaki flüktüasyonların ve ultraviyole ışığa maruz kalmanın doğuracağı

zararlardan korur. Besinlerin depolanmasının ve atıkların uzaklaştırılmasının

kolaylaştırılması da biofilm oluşumunun getirdiği diğer avantajlardır. Bakterilerin

kümeler halinde ve ekzopolisakkarid matriks içerisinde bulunmaları sonucu fagosite

edilmeleri güçleşir ve hümoral immün sistem bileşenlerinin bakterilere ulaşmaları

engellenmiş olur (15).

Hücrelerin bireysel olarak yaşamak yerine neden biofilm oluşturduklarının

açıklanmasına yönelik bazı spekülasyonlar vardır. Öne sürülen bu mekanizmalar arasında

en ön planda çevrenin zararlı etkilerinden korunmak, besin elde etme ve metabolik

işbirliği, yeni genetik özelliklerin kazanılması yer alır.

1) Çevrenin zararlı etkilerinden korunmak: Ekzopolisakkarid matriksin farklı biofilm

topluluklarında çeşitli roller oynadıkları bilinmektedir. EPS matriksinin aynı zamanda bir

iyon değiştiricisi gibi davranarak çeşitli ajanların biofilm içerisine girişlerini engellediği

bilinmektedir. Ayrıca UV ışıma, pH değişiklikleri, osmotik şok ve kuruma gibi çevresel

streslerin zararlı etkilerinden korumada rol oynar.

27

2) Besin elde etme ve metabolik işbirliği: Biofilm içerisindeki mikrokolonileri çevreleyen

alanlardan geçen yüksek geçirgenliğe sahip su kanalları bulunmaktadır. Bu kanallar

primitif bir dolaşım sistemine benzemektedir. Bu sistem hem besinlerin biofilm içerisinde

eşit bir şekilde dağıtılması, hem de potansiyel olarak toksik metabolitlerin

uzaklaştırılması görevini üstlenir.

3) Yeni genetik özelliklerin kazanılması: Horizontal gen transferi doğal mikrobiyal

toplulukların evrimi ve genetik çeşitliliği için çok önemlidir. Bu durum özellikle

multidrug rezistan bakterilerin ortaya çıkmasında önemlidir. Özellikle biofilm

içerisindeki kapalı ortam konjügasyonun kolaylıkla yapılabilmesine imkan tanır (17).

Biofilm oluşumunun, bakterilerin bir yüzey üzerinde yaşamaya geçmeleri gerektiğini

düşündüren çevre koşullarını hissedebilmeleri sonucu başladığı düşünülmektedir. Bu

çevresel sinyaller mikroorganizmalar arasında farklılıklar gösterebilir. Örneğin P.

Aeruginosa ve P. Fluorescens büyümenin mümkün olduğu her koşulda biofilm

oluşturabilirler. Buna rağmen, yeterli aminoasit miktarının bulunmadığı ortamlarda

Escherichia Clo K12 ve Vibrio Cholera mikroorganizmalar biofilm oluşturmazlar. Tam

aksi bir davranış, sadece düşük besin bulunan ortamlarda biofilm oluşturan E. Coli

O517:H7 tarafından gösterilir. Ortamın besin durumu dışında, sıcaklık, osmolarite, pH,

demir ve oksijen gibi diğer çevresel faktörler de biofilm oluşumu üzerinde rol oynarlar.

P. Gingivalis tarafından biofilm oluşturulması, çeşitli faktörlere bağlıdır. Azalmış

oksijen seviyeleri, yeterli besin kaynakları ve yapışma için uygun bir substrat yüzeyi

varlığında biofilm oluşumu hızla gerçekleşir (22).

28

Costerton biofilm oluşumunun tesadüfi bir olay olmadığını, bir araya gelen farklı

türlerin belirli bir ortak amaç taşıdıklarını belirtmiştir. Argümanını desteklemek için ise

ilk defa ortaya koydukları biofilmlerden olan sığır bağırsaklarındaki biofilmi örnek

göstermiştir. Bağırsaktaki selülozu sindirebilmek için en az 5 farklı türde bakterinin var

olması gereklidir. Bakteriler bu selülozu ancak oluşturdukları mikrobiyal şehirler

içerisinde bir arada çalışarak yıkıma uğrarabilirler. Biofilm ve selüloz arasındaki yüzde

selülozu glükoza dönüştüren Fibrobakter Sukksinogenez bulunur. Bunun arkasında

glükozu bütirata dönüştüren Bütirovibrio bakterisi bulunur. Daha sonra bu bakterinin

komşuları olan fakat başka bir türe ait olan bakteriler tarafından bütirat, asetata

çevirilir.En sonunda asetat özelleşmiş metanojen bakteriler tarafından metana çevirilir.

Yani bir koloni için artık olan şey, diğer koloni için besin anlamı taşımaktadır. Bununla

beraber, bu bakteriyel işbirliği göründüğünden biraz daha derindir. Oksijen metanojen

bakteriler için toksiktir. Bu nedenle metanojen bakterilerin oksijenden zengin biofilm

içerisinde korunmaya ihtiyacı vardır. Bu korumayı da her bir metanojen koloninin etrafını

sarmak suretiyle beşinci bir bakteri türü üstlenir. Tüm bu hücresel etkileşimlerin

randomize oportunistik bir mekanizmanın sonucu olduğunu düşünmek oldukça güçtür.

29

BİOFİLM GELİŞİMİNİN BEŞ EVRESİ:

Biofilm oluşumu bakterilerin bir yüzeye tutunmaları ile başlayan dinamik bir prosestir.

Bu tutunma sonucu biofilm fenotipinin ortaya çıkmasına neden olan bir dizi genetik işlem

başlatılır. Bakterilerin bir yüzeye tutunabilmeleri için, kendilerinin bir yüzey ile ne zaman

temas kurduklarını anlamaları gereklidir. Bakteriler bu çevresel stimulusları fenotipik

değişiklere çevirebilmek amacıyla, bir verici ve bir alıcıdan oluşan düzenleyici bir

sisteme sahiptir. Tutunma işleminden sonra biofilm oluşturmak yönünde farklılaşma

işleminin başlaması, quorum - sensing sistemi denilen başka bir haberleşme sisteminden

gelen yanıtlara bağlıdır. Bu sistem ile bakteriler çevrelerindeki bakteriyel popülasyonun

yoğunluğunu belirlerler. Bir yüzeye tutunan her bakteri, ortama 'Ben buradayım' mesajı

veren bir molekül salgılar. Yüzeye tutunan bakterilerin sayısı arttıkça, bu sinyalin lokal

konsantrasyonları artmaktadır. Bu sinyal molekülünün konsantrasyonundaki artış ile

birlikte, biofilm oluşumuna yönelik bir dizi işlem başlatılmış olur. Yani, biofilm

içerisindeki bakteriler interselüler, düşük molekül ağırlıklarına sahip haberciler

aracılığıyla haberleşmektedirler (Şekil 3).

İkinci basamak ise bakterilerin yüzeye yapışma veya kuvvetli bir şekilde tutunma

işlemidir. Üçüncü evrede ise bakteriler mikrokoloniler haline dönüşürler. Dördüncü

evrede ise mikrokoloniler büyürler ve kompleks, mantar şeklindeki yapılara veya kulelere

dönüşürler. Konfokal lazer mikroskopisi ile yapılan çalışmalar bakterilerin, kompleks

ekzopolisakkarid ile çevrilmiş mikrokoloniler içerisinde yaşadıklarını ortaya

koymuşlardır. Çeşitli yüksekliklerde kuleler oluşturan mikrokolonilerin aralarında,

30

besinlerin ulaştırılması ve metabolik atık ürünlerin uzaklaştırılması için primitif bir

dolaşım sistemi olarak görev yapan su kanalları bulunmaktadır.

Şekil 3: P. Aeruginosa biofilm gelişiminin beş evresi

Biofilm gelişiminin beşinci evresi ise kopma veya ayrılma evresidir. Bu evrede tek bir

bakteri veya bakteri kümeleri biofilm tabakasından koparak ortama yayılır. Bu ayrılma

işlemi dış kuvvetlerin etkisiyle olabileceği gibi, biofilm oluşum prosesinin bir parçası

olarak tek bir hücrenin veya multipl hücrelerin emboli şeklinde kopmasının bir sonucudur

(15).

31

QUORUM 1 – SENSING MEKANİZMALARI:

Biofilm oluşumu sadece bakterilerin bir araya gelerek belirli bir yüzeye tutunarak

yapışmaları ve o yüzeydeki diğer türlerle birlikte yaşamaya devam ettikleri, rasgele

gerçekleşen bir olay değildir. Bakteriler biofilm oluşturmak için çeşitli kimyasal işaret

mekanizmaları kullanırlar. Kimyasal sinyalin, lokal ekstraselüler konsantrasyonu belirli

bir seviyeye ulaşması, çevrede bulunan bakteriler için o bölgede belirli yoğunlukta bir

hücresel kümelenmenin başladığı anlamına gelir. Kimyasal olarak popülasyon

yoğunluğunun hissedilmesi işlemine ‘quorum - sensing’ adı verilir (Şekil 4).

HÜCRELERARASI İLETİŞİM

Şekil 4: Biofilm içerisindeki hareketsiz hücreler yeni mikrokoloniler yaratmak ve su kanallarını açık

tutabilmek için birbirleriyle konuşurlar.

1 Quorum: Yoğunluk

32

Quorum - sensing işlemi ilk olarak Hastings ve Nealson’un bazı gram negatif

bakterilerin belirli bir yoğunluğa ulaştıktan sonra bir ışık yaydıklarını fark etmesi ile

gündeme gelmiştir (23). Daha sonra Eberhard ve ark., N-acyl homoserin lakton (AHL)’in

bioluminesans için gerekli olan agregasyonu başlatan faktör oluğunu ortaya koymuşlardır

(24).

Gram pozitif bakteriler de ‘quorum – sensing’ mekanizması kullanırlar fakat bu

mekanizmada üç farklı bileşen bulunur: salgılanan bir peptid, membrana bağlı bir hsitidin

kinaz reseptörü ve bir intraselüler yanıt regülatörü. Buna ek olarak hem Gram negatif hem

de Gram pozitif bakterilerin otoindükleyici 2 ( autoinducer 2: AI-2) adında üçüncü bir

sistem de kullandığı gösterilmiştir (25).

BİOFİLM BAKTERİSİ - PLANKTONİK BAKTERİ

KARŞILAŞTIRILMASI:

Biofilm içerisinde yaşayan bakterilerin, planktonik bakterilerle karşılaştırıldıkları

zaman farklı gen ekspresyon paternleri olduğu izlenir. Gen ekspresyonundaki bu farklılık

planktonik benzerlerinden fenotipik olarak farklı özelliklere sahip bakterilerin ortaya

çıkmasına neden olur.

33

Klinik olarak çok önemli olan diğer bir avantaj da, biofilm içerisindeki bakterilerin

antibiyotiklere karşı, planktonik benzerlerinden binlerce kat daha rezistan oluşlarıdır. İlk

başlarda ekzopolisakkarid matriksin antimikrobiyal maddeyi absorbe ettiği veya

diffüzyonunu kısıtladığı düşünülmüş olsa da, artık bir çok antibiyotiğin biofilm tabakasını

kolayca penetre ettiği bilinmektedir. Bunun en olası açıklaması, biofilm bakterisinin

geçirdiği fenotipik değişikliklerin kendisi için koruyucu bazı özellikleri kazandırmış

olmasıdır. Başka bir deyişle, bir çok antibiyotik hızla bölünen bakterileri hedeflediği için,

özellikle biofilmin derin tabakalarında bulunan ve azalmış metabolik ve bölünme hızları

sergileyen bakterilere etkili olamamaktadır. Antibiyotiklerle tedavi edilmiş olan

biofilmlerin perifer kısımlarında bakterisidal etki izlenirken, daha derin kısımlarda

yaşayan bakteriler hayatta kalmakta yeniden enfeksiyon gelişiminde bir nidus teşkil

etmektedirler (15).

Mikrobiyal hücrelerden salgılanan ekzopolisakkaridler hem fiziksel hem de kimyasal

özellikler açısından farklılıklar gösterir. Polisakkaridler uzun, ince moleküler zincirlerdir

ve 0,5 - 2,0 x106 Da lık bir moleküler yapıya sahiptirler.Biofilm preparatlarında

polisakkaridler bakteriyel hücre yüzeyine tutunmuş olan ince şeritler halinde ve hücrenin

etrafında kompleks bir ağ oluşturmuş şekilde izlenir (26).

34

DOĞADA BİOFİLM:

Doğal bir ortamda, tek bir tür bakteri izole bir kültür içerisinde yaşayamaz. Bakteriler

her zaman diğer bakteri türleri ile bir alış veriş arayışı içerisindedir. Bu alışveriş

esnasında birbirlerinin atıklarını kullanırlar ve hatta birbirlerine genetik paketler

gönderirler. Hayvanların yaşantısında uygulanabilen ‘evrimsel hayat ağacı’ , bakterilerin

yaşamlarındaki gelişimi izleyebilmek için kullanılamaz. Bakterilerde bir ‘hayat

ağacı’ndan çok türler arası bir ağdan bahsedilebilir. Bu da bakterilerin mevcut genetik

özelliklerini sadece kendisinden önceki türlerden, yani atalarından değil, kendisiyle

herhangi bir ilişkisi olmayan fakat bulunduğu ortamda komşusu durumunda bulunan

başka tür bir bakteriden genetik materyal alarak elde edebileceği anlamını taşır.

Henrici ve Zobell gibi araştırmacılar neredeyse 70 yıl önce yüzeye yapışmış

bakterilerin varlığını tanımladıkları ve inceledikleri halde, biofilm topluluklarının anlamı

daha yeni yeni anlaşılabilmektedir. Bunun da ötesinde, bakterilerin multisellüler davranış

perspektifinde görülmeye başlanması ile, mikrobiyolojiye bakış açımız değişmiştir (18,

28).

Tek başlarına biofilm oluşturabilen veya diğer mikroorganizmalarla ortak biofilm

oluşturmak için iletişime geçebilen sayısız bakteri ve üretilebilecek sayısız polisakkarid

türü var olduğu düşünüldüğünde, elde edilebilecek farklı türdeki biofilm sayısı sonsuza

yaklaşmaktadır. Bu nedenle, doğada tek bir türün oluşturduğu biofilmler çok nadir olup,

daha çok birden fazla organizmanın oluşturduğu biofilmler izlenir (Resim 6) (26).

35

Resim 6: Nehir yatağındaki çakıl taşlarının üzerinde izlenen biofilm

Diş yüzeylerinde biofilm oluşması için 3 basamak gereklidir. 1) diş minesi üzerinde

kazanılmış bir pellikül veya 'hazırlayıcı film' oluşması 2) bunu takiben primer

kolonizasyon yapan hücrelerin yüzeye yapışması 3) ikincil ve üçüncül kolonizasyon

yapan hücrelerin birbirlerine ve primer kolonizasyon yapan hücrelere tutunmaları

36

Resim 7: Dental plakların gingival marjinler ve kontakt alanlarda birikmesi (üst) Aynı dişlerinfırçalandıktan sonraki görüntüsü

Diş yüzeyi tamamen temizlense dahi, çok kısa bir süre içerisinde glikoproteinler,

asidik prolinden zengin proteinler, musinler, bakteriyel hücre debrisleri, alfa amilaz gibi

ekzo ürünler ve sialik asitten zengin bir karışım ile tamamen kaplanır. Bu durum

kaçınılmazdır (Resim 7). Bu kazanılmış pellikül, primer kolonizan bakteriler için bir

substrat görevi görür. İlk kolonize olan bakteriler daha sonra büyüyerek lokal çevrenin

koşullarını değiştirebilirler. Bu ortam değişiklikleri sahayı daha zararlı bakterilerin

kolonizasyonu için daha uygun hale getirir. Bu geç kolonize olan bakteriler ko-

agregasyon adı verilen bir işlemle daha önce tutunmuş olan bakterilere tutunarak, multipl

bakteri türünün oluşturduğu belirli bir yapıya sahip bir biofilm tabakası, başka bir deyişle

dental plak oluşturabilirler (27). Dental plak içerisindeki patojen bakterilerin sayısının

daha fazla olması durumunda ise hastalık durumundan bahsedilebilir.

37

Bakterilerin doğal ve endüstriyel sistemlerde tercihen bir matriks içerisindeki bir

biofilmde yaşadıkları konusunda konsensus sağlanmış olmasına rağmen, bu görüş

medikal ve dental hastalıkların açıklanmasında hemen kabul görmemiştir. Bununla

beraber yeni metodlar sayesinde, biofilm içerisinde yaşayan bakterilerin medikal implant

veya bazı organlarla ilişkili kronik enfeksiyonlarda rol oynadığı ortaya konmuş ve bu

teori sonunda kabul görmüştür (19).

FAYDALI BİOFİLMLER:

Bazı durumlarda bakterilerin biofilm oluşturmaları sayesinde, doğada bulunan ve

insan sağlığına zararlı bir çok madde elimine edilebilmektedir. Bu durumlara örnek

olarak, yer altı su kaynaklarının kontaminasyonunun engellenmesi, kullanılmayan ve

çevreye zararlı olabilecek petrol yataklarının çevrelenmesi ve maden yataklarından

çevreye yayılan sülfür ve benzeri yan ürünlerin detoksifikasyonu gösterilebilir (Şekil 5).

Kontamine bölgelerde yer altı su kaynaklarına ucuz karbon kaynaklarının pompalanması

ile oluşturulan biofilmler hem oluşturdukları bariyerle su kaynakları ve çevre kirleticileri

arasındaki geçişleri engelleyecek hem de biofilm içerisindeki azot veya sülfür tüketici

bakteriler sayesinde ortamdaki istenmeyen miktardaki inorganik madde yükü

azaltılabilecektir (Şekil 6) (29).

38

Şekil 5: Oksijenin yer altındaki su kaynaklarına ulaşmasını engelleyen bir biofilm oluşturmak suretiyleasidik su drenajının önüne geçilebilir.

Toprağa inoküle edilen ve uygun

besinler verilen bakteriler,

bir süre sonra su geçirmez bir

biofilm tabakası oluştururlar.

Bu biofilm tabakası, nehir

yatağına sıkı bir şekilde

tutunmakta ve ağır metaller gibi

çevre kirleticileri besin olarak

kullanıp tüketmektedir.

BESİN

NEHİR

AĞIR METAL

Şekil 6: Biofilm perdesi, zararlı maddelerin nehir yataklarına ulaşmasını engelleyebilir.

TIBBİ ENFEKSİYONLAR VE BİOFİLM İLİŞKİSİ:

39

Mikrobiyal biofilmlerin insan sağlığı üzerinde önemli etkileri vardır. Amerika Birleşik

Devletlerindeki Ulusal Sağlık Enstitüleri ( The National Institutes of Health),

enfeksiyonların %80 inden fazlasına biofilmlerin neden olduğunu tahmin etmektedir.

Donlan, bir çok idrar yolu enfeksiyonundan katater veya implantlar üzerinde oluşan

biofilmlerin sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Bunlara ek olarak ABD’de

gerçekleştirilen plastik cerrahi operasyonlarının %2 sinde biofilm enfeksiyonları

nedeniyle protezin değiştirilmesi gerekmektedir. Bu da yılda yaklaşık 900 milyon

Amerikan dolarının bu değiştirme operasyonları için harcanması anlamına gelmektedir.

Biofilm ile ilişkili organizmaların insanda hangi mekanizmalarla hastalığa yol açtığı

halen tam olarak anlaşılabilmiş değildir. Öne sürülen mekanizmalar arasında

1) Medikal cihazlar (implantlar) üzerindeki biofilmden kopan hücre veya hücre

kümelerinin kanda veya üriner sistemde enfeksiyona neden olmaları

2) Endotoksin üretimi

3) Konak bağışıklık sistemine karşı yapısal direnç göstererek varlığını sürdürme

4) Biofilm içerisinde rezistans plazmid değişimi yapmak aracılığıyla, antimikrobiyal

madde direnci kazanarak varlığını sürdürme bulunmaktadır (19).

Bilimsel gelişmelerin sonucu olarak, bir çok akut enfeksiyon antibiyotiklerle etkin bir

şekilde tedavi edilebilmektedir. Bununla beraber bu durumun iki istisnası vardır.

Bunlardan ilki antibiyotiğe duyarlılığı olmayan bakteri varlığıdır. İkinci istisnai durum ise

biofilm içerisinde yaşayan bakteri varlığıdır. Biofilm bakterilerinin, planktonik yaşayan

aynı türdeki bakteriler oranla antibiyotik tedavisine 100 kat daha rezistan olabildiği

bildirilmiştir (17).

ENFEKSİYON BİOFİLM İÇERİSİNDEKİ BAKTERİ Diş çürükleri (Şekil 7) Asidojenik gram pozitif kok (Streptokok)

40

Periodontit Gram negatif anaerobik oral bakteriOtitis media H. İnfluenzanın tiplendirilemeyen suşları

Nektorizan fasiit Grup A streptokokGastrointestinal ve bilier

traktus enfeksiyonu (Resim 9)

Enterik bakteri ( E. Coli)

Osteomiyelit Çeşitli bakteri veya fungus türlerBakteriyel prostatit E. Coli ve diğer gram negatif bakteriDoğal kapak endokarditi Streptokok ViridansKistik fibroz pnömonisi P. Aeruginosa ve Burkholderia cepaciaNozokomiyal enfeksiyonlar * Endotrakeal tüpler Çeşitli bakteri ve funguslar * Santral venöz kateterler S. epidermidis ve diğerleri

* Kontakt lensler P. Aeruginosa ve gram pozitif koklar * Vasküler greftler Gram pozitif koklar * Ortopedik implantlar S. Aureus ve S. Epidermidis * Penil protezler S. Aureus ve S. Epidermidis * Mekanik kalp kapakları S. Aureus ve S. Epidermidis

Tablo: Biofilmlerin sorumlu olduğu insanlarda görülen enfeksiyonların bazıları (30)

Stafilokok ve Pseudomonas gibi bazı bakterilerin yapıları, antibiyotiklerin

penetrasyonuna rezistan bir glikoprotein tabakasına sahip bir biofilm oluşturmaya

müsaittir. İmplant materyalleri üzerinde böyle bir biofilm oluşumu, implantların üzerinde

kalıcı bir enfeksiyon kaynağı oluşturarak, implantın çıkarılmasını gerektirebilir .

Eklem replasman protezleri, pacemakerlar, kalp kapakçıkları, vasküler stentler ve

oftalmik implantlar gibi çeşitli implantlar üzerinde biofilm oluşumu izlendiğine dair bir

çok yayın bulunmaktadır (Resim 8)

41

Resim 8: Bir kontakt lens kabının içerisinde oluşan bir biofilmin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

Başka bir çalışmada ionize floroplastik timpanostomi tüpü materyalinin, tüp

aplikasyonu sonrası bakteriyel biofilm oluşumunun engellenmesi açısından oldukça etkili

olduğu gösterilmiştir (28).

Medikal protezler ya Teflon, plastik, lateks ve silikon gibi hidrofobik materyallerden

veya cam veya çeşitli metaller gibi hidrofilik materyallerden yapılmaktadır. Genelde

yüzeyi daha kaba ve daha düzensiz olan ve daha hidrofobik olan materyallerde (Şekil 8)

biofilm daha hızlı bir şekilde gelişmektedir (18).

42

DİŞ ETİ

DİŞ ETİ

DİŞ

DİŞ

Şekil 7: Yüzlerce mikrobiyal tür insan ağzında kolonize olabilr. Bu türlerin bazıları patojendir veenfeksiyon, diş çürükleri ve diş eti hastalıklarına yol açabilir.

TAMPON LİFİ

EPİTEL

Şekil 8: Vajina epiteli ve tampon lifleri üzerinde kolonize olan mikroorganizmalar inflamasyona

43

veya Toksik Şok Sendromu gibi hastalıklara yol açabilirler.

Resim 9:Bir farenin bağırsağının lümenal yüzeyinin tarama elektron mikoskopisi görüntüsü. Dehidrasyona bağlı boyutlarında küçülme izlenen intestinal biofilmin epitel yüzeyinin

büyük bir kısmını kapladığı izleniyor. Biofilmin bakteriyel ve protozoal bileşenleri olduğu izleniyor. P ile işaretli olan büyük bir Giardia nın yüzeye tutunduğu görülüyor.

BİOFİLM ENFEKSİYONLARININ ORTAK ÖZELLİKLERİ:

1) Biofilmler tercihen inert yüzeylerde veya ölü bir doku üzerinde yerleşirler ve genelde

medikal aygıtlar ve kemik sekestrasyonları gibi ölü doku fragmanları üzerinde oluşurlar.

Endokardit olayında olduğu gibi canlı dokularda da yerleşebilirler.

2) Biofilmler yavaş büyüme özelliğine sahiptirler ve biofilm enfeksiyonları sıklıkla

belirgin klinik semptom vermeden gelişirler. Hareketsiz bakteriyel hücreler antijen

salgılayarak antikor üretimin stimüle ederler fakat antikorların biofilm içerisindeki

bakterileri öldürebilme yeteneği yoktur. Biofilmler bu yolla çevreleyen dokularda immün

44

kompleks hasarına yol açabilirler. Mükemmel hücresel ve hümöral immün yanıtları olan

bireylerde bile, konak savunma mekanizmaları biofilm enfeksiyonlarını

sonlandıramamaktadırlar. Antibiyotik tedavisi biofilmden ayrılmış olan planktonik

hücrelerin neden olduğu semptomları ortadan kaldırır fakat biofilmi yok edemez. Bu

nedenle biofilm infeksiyonları, dönem dönem kullanılan antibiyoterapiye rağmen

semptomlar göstermeye devam ederler. Bu durum biofilm popülasyonunun cerrahi olarak

vücuttan uzaklaştırılmasına kadar devam eder.

3) Planktonik bakteriyel hücreler biofilmlerden salınmaktadır ve biofilmden kopma

işleminin doğal olarak programlanmış bir olay olduğu görüşünü destekleyen kanıtlar

vardır. Bu nedenle, biofilmler akut enfeksiyon için bir 'nidus' görevi görerek, salınan

planktonik hücrelerin konak savunma mekanizmalarının başarısız kaldığı durumlarda

akut enfeksiyon gelişimine neden olabilmektedirler (30).

BAKTERİYEL BİOFİLMLER NEDEN ANTİMİKROBİYAL

İLAÇLARA DİRENÇLİDİR?

Doğal ve endüstriyel çevrelerde büyüyen biofilmlerin bakteriyofaj, amipler ve çeşitli

kimyasal biyosidlere karşı duyarlı oldukları bilinmektedir. Tıbbi alanda ise, hareketsiz

bakteriyel hücreler konak savunma mekanizmalarına karşı koyabilmekte ve planktonik

formda olan bakterilere oranla, antibiyotiklere çok daha fazla dirençli olabilmektedirler.

Biofilmlerin bu dirence multipl mekanizmalar aracılığıyla sahip oldukları

düşünülmektedir (30):

1. Antimikrobiyal ajanın biofilmin tüm tabakaları boyunca penetrasyon göstermemesi

(Şekil 9). Biofilm matriksi içerisindeki polimerik maddelerin antibiyotik diffüzyonunu

45

güçleştirdiği bilinmektedir. Bu durum yeterli antibiyotik konsantrasyonuna asla

ulaşılamaması anlamına gelmektedir.

2. Biofilm içerisindeki hücrelerden en azından bir kısmı besin yetersizliği yaşamakta ve

bu nedenle yavaş büyüme fazına girmek zorunda kalmaktadırlar (Şekil 10).

3. Yavaş büyüyen veya büyüme göstermeyen hücreler bir çok antimikrobiyal maddeye

karşı duyarlı değildirler ve bir çoğu hayatta kalabilmektedirler (Şekil 11).

4. Biofilm içerisindeki bakteriler arasında rezistan genlerin değişimi söz konusudur.

Penetrasyon Başarısızlığı

ANTİMİKROBİYAL AJANLARA KARŞI BİOFİLM REZİSTANSI

Şekil 9:Biofilm rezistans hipotezi: Penetrasyon başarısızlığı

46

ANTİMİKROBİYAL AJANLARA KARŞI BİOFİLM REZİSTANSI

BESİN KISITLILIĞINA BAĞLI DEĞİŞEN FİZYOLOJİ

Şekil 10: Biofilm rezistans hipotezi: Ortamdaki besin besin kısıtlılığına bağlı değişen fizyoloji

47

Besinleri tükenmesisonucu, farklı metabolikaktivite sergileyen bölgeler ortaya çıkmaya başlar

Biofilmin en dış kısmında yer alan hücrelerhasarın daha iç kısımlara geçmesini engelleyerek, şok dalgasını absorbe ederler.

İç tabakalardaki

hücrelerin stres

yanıtı ortaya

koymak

için daha fazla

zamanları vardır.

Saldırıdan

sağ kurtulan

hücre sayısı

beklenenden

çok daha

yüksek

olabilir.

BİOFİLMLERDEKİ MULTİSELÜLERİTE BAKTERİYEL SAVUNMAYI GÜÇLENDİRİR

Şekil 11: Biofilmlerin birden fazla hücre türünden oluşması sonucu, içerisinde yaşayan bakterilerin hayattakalma şansları artmaktadır. Biofilmin dış tabakaları hasarı absorbe ederken, iç tabakalarda stres yanıtınınbaşlaması için zaman kazanılmış olur. Besin yetersizliğine bağlı değişen mikroçevreye daha çabuk adapte

olabilen türler, saldırı sonunda hayatta kalarak yeniden çoğalma işlemine hızla başlayabilirler.

BİOFİLM VE KBB ENFEKSİYONLARI ARASINDAKİ İLİŞKİ:

48

Geçtiğimiz yıllar içerisinde baş boyun bölgesindeki kronik bakteriyel enfeksiyonlar ile

biofilm oluşumu arasındaki bağlantı daha belirgin hale gelmiştir.

Kronik otitis media, patofizyolojisi planktonik formdaki bakterilere odaklanılarak

açıklanılamayan hastalıklardan biridir. Kronik otitis mediada izlenen effüzyonların sadece

%30'u kültür pozitifliğine sahiptir. Biofilmler içerisindeki bakterilerin immün sistem ve

antibiyotiklere rezistan olmalarını sağlayan faktörler nedeniyle bakterilerin in vitro

ortamda kültüre edilmeleri de çok zordur. Elde edilen bakteri sayıları, gerçeği çok

altındaki değerler olabilir veya biofilm bakterilerinin düşük metabolik hızları nedeniyle

kültüre etmek mümkün olmayabilir (15). Bu 'kültüre edememe' sorunu neticesinde,

efüzyonlu otitis medianın primer olarak steril, enflamatuar bir proses olduğu bile öne

sürülmüştür. Post, elektron mikroskobu kullanarak yaptığı çalışmada, chinchilla

modelinde orta kulak mukozasının yüzeyinde biofilm oluştuğunu ortaya koymuştur (7).

Bu sayede kronik effüzyonlu otitis medianın patofizyolojisinde biofilm oluşumunun

rolü olduğu anlaşılabilmiştir. Bu durumun anlaşılması, in vitro şartlarda antibiyoterapiye

duyarlı mikroorganizmaların neden in vivo tam olarak eradike edilemediğinin

açıklanmasına yardımcı olmuştur.

Chole ve Faddis 24 kolesteatomlu hastayı incelemiş ve ışık mikroskobu ve

transmisyon elektron mikroskobu kullanarak bu hastaların 16'sında kolesteatoma

üzerinde biofilm oluştuğuna dair histomorfolojik kanıtları elde etmiştir (31).

Endotrakeal tüpler, trakeostomi tüpleri, ses protezleri ve timpanostomi tüplerinin

hepsinin üzerinde biofilm oluşumu için uygun yüzey bulunmaktadır ( Resim 10, 11, 12).

49

Bu biofilmler hastanın yaşamını tehdit eden enfeksiyonların kaynağı olabilirler ve

antibiyotik tedavisine dirençleri çok yüksektir (15).

Hidrofilikyüzey

Hidrofobik yüzey

Resim 10: Ses protezinin hidrofilik yüzeyinde makroskopik biofilm oluşumu

50

Mantar

Bakteri

Resim 11: Ses protezi üzerinde oluşan biofilmin tarama elektron mikroskobu görüntüsü. Bakteriyelelemanların yanında fungal kolonizasyon da dikkati çekmekte.

Resim 12: Endotrakeal tüp lümeninde oluşan büyük bir biofilmin tarama elektron mikroskobu görüntüsü.Bu hücre topluluğu sık sık parçalanarak gastanın akciğerlerine bakteriyel hücrelerin aspire edilmesine neden

olur.

51

BİOFİLM VE KRONİK TONSİLLİT ARASINDAKİ İLİŞKİ:

Yakın zamanda Chole ve Faddis ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu

kullanarak gerçekleştirdikleri çalışmada, rekürren tonsillit veya tonsiller hipertrofi

nedeniyle tonsillektomi yapılan hataların tonsilleri üzerinde biofilm varlığını

göstermişlerdir (11).

Bu bulgu, yeterli antibiyoterapiye rağmen β – hemolitik streptokoklara bağlı

tonsillitte, tedavi sonrası vakaların neden sadece %20 sinde bakteriyolojik pozitiflik

izlendiğini açıklamaktadır. Bakterilerin kültüre edilememelerinin sebebi, biofilm

içerisinde yaşayan bakterilerin sahip oldukları düşük büyüme hızlarıdır (32).

MATERYAL VE METOD:

Kronik tonsillit tanısı ile Taksim Eğitim ve Araştırma Hastanesi Kulak Burun Boğaz

Kliniğine başvuran ve tonsillektomi yapılması planlanan hastalar çalışmaya dahil

edilmiştir. Yaşları 4 – 35 arasında değişen toplam 10 hasta, cinsiyet farkı gözetilmeksizin

rasgele seçilmiştir. Hastalardan alınan tonsiller çıkarılır çıkarılmaz steril şartlar altında 15

numara bistüri kullanılarak 4 farklı grup oluşturmak üzere eşit parçalara bölünmüştür

(Resim 13).

52

Resim 13: Elde edilen 4 gruptaki tonsil parçalarının epitelle döşeli olan yüzeyleri 4 farklı protokole tabi

tutularak tarama elektron mikroskobunda incelenmek üzere hazırlanmışlardır.

Dört farklı grup halinde alınan doku örnekleri için dört farklı uygulama yapılması

planlanmıştır. Birinci gruptaki tonsiller herhangi bir işleme tabi tutulmadan tarama

elektron mikroskobu protokolüne alınmışlardır. İkinci gruptaki tonsiller 10 ml lik üç

farklı salin solüsyonunda 10 ar saniye boyunca durulandıktan sonra tarama elektron

mikroskobu protokolüne alınmışlardır. Üçüncü gruba ait tonsillerin epitelyal yüzeyleri

yumuşak bir fırça yardımıyla 30 saniye boyunca fırçalanmış ve 10 ml’lik üç farklı salin

solüsyonunda 10 ar saniye boyunca durulandıktan sonra tarama elektron mikroskobu

protokolüne alınmışlardır. Dördüncü gruba ait tonsillerin epitelyal yüzeyleri sert bir fırça

yardımıyla 30 saniye boyunca fırçalanmış ve 10 ml’lik üç farklı salin solüsyonunda 10 ar

53

saniye boyunca durulandıktan sonra tarama elektron mikroskobu protokolüne

alınmışlardır.

Dört farklı gruba da aynı tarama elektron mikroskobu protokolü uygulanmıştır. Doku

örnekleri, tarama elektron mikroskopu için, ilk önce 2 saat boyunca %2 lik fosfatla

tamponlanmış glutaraldehid solüsyonunda bekletilmişlerdir. ( 0.1 M, pH 7.2). Daha sonra

1 saat boyunca %1 lik fosfatla tamponlanmış osmium tetroksid solüsyonunda bekletilmiş

ve artan alkol ve amil asetat serilerinden geçirilmişlerdir. Dokular Bio – Rad kurutma

cihazında kurutulduktan ve Bio – Rad Sputter Coatter ( SC 502) ile altınla kaplandıktan

sonra JEOL 5300 JSM tarama elektron mikroskubu ile incelenmişlerdir.

SONUÇLAR:

Birinci gruba ait olan ve durulama veya fırçalama işlemi uygulanmayan tonsillerde

epitel hücrelerinin görülemediği ve tonsil yüzeyinin kalın bir biofilm tabakası ile örtülü

olduğu izlendi (Resim 14, 15). Biofilm tabakası üzerinde birkaç adet eritrosit ve fibrin

artıklarının bulunduğu dikkat çekiyordu. İkinci gruba ait olan ve sadece durulama işlemi

uygulanmış olan tonsillerde epitel yüzeyini örten biofilm tabakasının bütünlüğünün

bozulmadığı, sadece biofilm tabakası üzerindeki eritrositlerin ve fibrin artıkların

uzaklaştırıldığı izlendi (Resim 16). Üçüncü gruba ait olan ve yumuşak bir fırça

yardımıyla fırçalandıktan sonra durulanan tonsillerde biofilm tabakasının yer yer

parçalandığı ve biofilm tabakasının kalınlığının azaldığı izlendi (Resim 17). Buna rağmen

epitelyal hücrelerin sınırları tam olarak belirlenemiyordu. Dördüncü grupta yer alan ve

sert bir fırça yardımı ile fırçalandıktan sonra durulanan tonsillerin yüzeylerinde biofilm

tabakasının parçalanarak uzaklaştırıldığı ve tonsil yüzey epitelinin belirgin bir şekilde

ortaya konduğu izlendi (Resim 18, 19).

54

Resim 14: 1. grupta bulunan tonsil yüzeylerinin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

Resim 15: 1. grupta bulunan tonsil yüzeylerinin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

55

Resim 16: 2. grupta bulunan tonsil yüzeylerinin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

Resim 17: 3. grupta bulunan tonsil yüzeylerinin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

56

Resim 18: 4. grupta bulunan tonsil yüzeylerinin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

Resim 19: 4. grupta bulunan tonsil yüzeylerinin tarama elektron mikroskobu görüntüsü

57

TARTIŞMA:

İnsanda görülen hastalıkların genellikle serbest hareket eden organizmalar olarak

düşünülmüştür. Ayrıca Koch'un zamanından beri, bakteriyologlar ve klinisyenler

planktonik bakteriler üzerine odaklanmışlardır. Bununla beraber, doğada bakterilerin

sadece küçük kısmı planktonik formda bulunmaktadırlar ve planktonik bakteriler biofilm

içerisindeki bakterilerden çok farklıdırlar (15).

Büyüme hızları ve genetik özellikleri daha farklı olan biofilm bakterilerinin neden

olduğu enfeksiyonlardan birisinin de kronik tonsillit olduğu öne sürülmüştür. Buna

rağmen bugüne kadar kronik tonsillitli hastaların tonsil yüzeylerinde biofilm oluşumu

tarama elektron mikroskobu ile gösteren herhangi bir çalışma yapılmamıştır.

Tonsillektomi yaptığımız hastalarda tonsil yüzeyini örten mukozanın biofilmle kaplı olup

olmadığını araştırmak amacıyla, tonsil spesimenlerini dört farklı gruba ayırarak, her bir

grupta farklı mekanik işlemler uyguladık ve transmisyon elektron mikroskobu ile

inceledik.

Tarama elektron mikroskopu ile incelediğimiz birinci gruba ait tonsillerin yüzeyinde

izlenen biofilm tabakası, tonsil yüzeyini düşeyen epitelin değerlendirilmesini imkansız

kılıyordu. İkinci gruba ait tonsiller, 30 saniye boyunca steril salin solüsyonunda

durulanmış olmalarına rağmen, incelendiklerinde biofilm tabakasının herhangi bir

özelliğini kaybetmeden bütünlüğünü koruduğu ve sadece yüzeyde bulunan eritrositlerin

ve fibrinin uzaklaştırıldığı izlendi. Bu bulgu daha önce yapılmış olan ve biofilmlerin

solüsyon içerisinde durulanma veya çalkalanma ile uzaklaştırılmadığını daha önce

58

göstermiş olan çalışmaları destekler nitelikteydi (18, 28). Üçüncü gruba ait olan ve

yumuşak bir fırça yardımıyla 30 saniye fırçalandıktan sonra 30 saniye boyunca steril salin

solüsyonunda durulanmış olan tonsillerin yüzeyinde bakteriyel biofilm tabakalarının

halen büyük plaklar halinde bulundukları ve bütünlüklerini yer yer küçük kırılmalar

nedeniyle kaybetmiş olsalar bile, tonsil yüzeyini döşeyen epitelin üzerinden

uzaklaşmadıkları izlendi. Diş minesi üzerinde oluşan ve uygun bir fırça ile uygun süreler

boyunca fırçalanarak uzaklaştırılabilen dental plaklar, bugüne kadar üzerinde en çok

çalışılmış olan bakteriyel biofilm tipidir. Nispeten daha sert olan ve bakterilerin daha

güçlü bir şekilde tutunabileceği bir substrat yüzeyi sunan dişlere oranla tonsil yüzeyindeki

biofilm tabakasının daha kolay uzaklaştırılabileceği düşünülse de, yumuşak fırça ile

fırçalama sonucunda bu tabakanın uzaklaştırılamamış olması ilgi çekicidir. Bu durumda

tonsil yüzeyini döşeyen epitelin sahip olduğu kriptler ve beraberinde getirdiği girintili

çıkıntılı yapılar ve artmış yüzey alanı gibi faktörlerin de önemli olduğu öne sürülebilir.

Bununla beraber dördüncü gruba ait olan tonsiller 30 saniye boyunca sert bir fırça ile

fırçalandıktan sonra durulanmışlar ve tonsil yüzey epiteli net bir şekilde izlenmiş ve

üzerilerinde defragmente ve yüzeyle ilişkisiz oldukları izlenen biofilm parçacıkları

görülmüştür.

Sonuç olarak bu çalışma ile, kronik tonsillit nedeniyle tonsillektomi uyguladığımız

tüm hastaların tonsillerinin yüzeyinde biofilm tabakasının oluştuğu ve bu tabakanın

sadece mekanik güçler kullanılarak uzaklaştırılabildiği, ilk kez tarama elektron

mikroskobu kullanılarak kanıtlanmıştır.

Ağız içi ortamının yüksek akım güçleri ve mekanik etkiler altında kaldığı ve bu

durumun biofilm oluşumunu kaçınılmaz kıldığı kabul edilmiş bir gerçektir. Kronik

tonsillitli hastalarda tonsil yüzeyini döşeyen epitelin üzerinde biofilm oluştuğunun

59

kanıtlanmasına rağmen, sağlıklı tonsillerde de biofilm oluşup oluşmadığı henüz

gösterilmemiştir. Oral kavite içerisinde biofilm oluşumunun patolojik bir proses mi

olduğu yoksa bu çevre içerisinde edinilmesi gereken doğal bir yaşam formu mu olduğu

henüz açıklığa kavuşturulamamıştır. Oral mikrofloranın oluşturulabilmesi için

bakterilerin biofilm oluşturması gerektiği görüşü kabul edilmiştir.

İnsan oral kavitesi multipl antimikrobiyal aktiviteye ve doku yüzeyleri üzerinde

sürekli saliva akımına bağlı olarak, mikroorganizmalar için tehlikeli bir ortam

oluştururlar. Oral bakteriler bu kötü koşullardan, oral dokulara yada diğer oral

mikroorganizmalara tutunarak korunurlar. Bu tutunma işlemi, bir çok türün bir araya

gelmesi ile oluşan, karmaşık yapıda bir biofilm oluşumuna zemin hazırlar.

Oral bakterilerin hayatta kalabilmeleri için 'tutunma' en önemli ekolojik belirleyicidir.

Ağız, vücutta deskuamasyon göstermeyen yüzeylerin bulunduğu ( dişler) ve yaygın

biofilm oluşumunun izlenebileceği (dental plaklar) eşsiz bir ortama sahiptir. Buna karşın

mukozal yüzeylerde izlenen deskuamasyon, bakteriyel yükün mukozal yüzeylerde

nispeten daha az olmasına olanak tanır.

Diş yüzeyi üzerinde saniyeleri içerisinde oluşan biofilm tabakasının diş çürüklerine

veya periodontite yol açabilmesi için belirli bir süreçten geçmesi gerektiği bilinmektedir.

Asidofillerin veya Gram (-) anaerobların sayısında artış izlenilen plak toplulukları,

insanda en sık görülen oral hastalıklardan biri olan periodontal hastalıklar ve diş

çürüklerinin ortaya çıkmasına neden olur. Yetişkin periodontitten, özellikle

Porphyromonas Gingivalis gibi bazı spesifik gram (-) anaerobların artmış oranda

bulunduğu gingival plak oluşumu sorumlu tutulmaktadır. Gingival plak

kompozisyonundaki değişiklikler hastalık prosesinin başlamasındaki ana belirleyicidir .

60

Mikrobiyal biofilmler arasıda belki de en iyi incelenmiş olanı dental plaktır. Dental

plak, 500 farklı türden bakterinin belirli bir sıra dahilinde, birbirleri ardına birikmeleri

sonucu oluşan karmaşık ve dinamik bir biofilmdir. Belirgin bir hastalık varlığı olmadan,

oral kavite içerisinde Streptokokkus Gordonii gibi gram (+) kommensallerin ve

Aktinomyces suşlarının oluşturduğu plakları incelemek mümkündür (22).

Görüldüğü gibi, oral mikroflora üyesi olsun olmasın, oral mikroçevre şartlarına maruz

kalan tüm bakteriler herhangi bir yüzeye tutunmak ve uygun şartlar varlığında biofilm

oluşturmak zorundadır. Bu durumda konakta biofilm oluşup oluşmadığı değil, biofilm

oluşumunun hangi evrede konak için patolojik hale geldiği daha önemli bir soru haline

gelmektedir. Palatin tonsillerin yüzeyinde tarama elektron mikroskobu kullanarak

izlediğimiz bakteriyel biofilm tabakalarının kronik tonsillit patogenezinde yerinin olup

olmadığının belirlenebilmesi için bu incelemelerin sağlıklı birey tonsilleri üzerinde

gerçekleştirilmesi, izlenen biofilm tabakalarının daha detaylı görsel bilgi sağlayabilecek

konfokal tarama elektron mikroskopisi ile incelenmesi ve biofilm oluşturan bakterilerin

genetik yapılarının detaylı bir şekilde incelenerek virülans faktörlerinin ortaya konması

gerekmektedir.

BİOFİLMLERLE MÜCADELEDE YENİ UFUKLAR:

61

ŞŞekil 12: Antibiyotik etkinliği zayıf , intermitan bir elektriksel saha varlığında bile artmaktadır.

62

ANTİBİYOTİK

ANTİBİYOTİK

BİYOELEKTRİK ETKİ

Şekil 13: Elektriksel alan varlığında antibiyotik etkinliği artmaktadır.

Şekil 14: Biofilm oluşum senaryosunun şematik olarak gösterimi (üst) Biofilm sinyal analogları

kullanılarak bu prosesin engellenmesi (alt)

63

Şekil 15: Biofilmden doğal yollarla kopmanın şematik görüntüsü (sol) Bu prosesin ayrılma sinyali

analoglarıyla hızlandırılması

Biofilmlerle savaş konusunda önümüzde uzanan yol açık görünmektedir. Bakteriyel

biofilmlerin benzersiz biyolojileri hakkında kapsamlı bilgi sahibi olmuş durumdayız.

Biofilmlerin kendi savunma ve iletişim sistemleri olan mikrobiyal topluluklar oldukları

anlaşılmıştır fakat biofilmlerin biyolojilerine ilişkin hala cevaplanmayı bekleyen bir çok

soru vardır. Elimizdeki bilgiler ışığında biofilmler ile mücadelede, biofilmin oluşmasını

engelleyebilecek iletişim sinyalleri analoglarının kullanımı veya biofilmin parçalanmasını

sağlayacak fiziksel veya kimyasal maddelerin uygulanması gibi metodların faydalı

olabileceği görünmektedir ( Şekil 12, 13, 14, 15)

Biofilm matriksinin polisakkarid içeriği biofilmin stabilitesini belirleyen önemli

faktörlerden biridir. Örneğin polianyonik ekzopolisakkaridler metal iyonlarıyla etkileşime

girebilir. Demir gibi bazı metaller biofilm matriksi içerisine dahil edilerek matriksin

stabilizasyonun katkıda bulunabilirler. Yakın zamanda yapılan bir çalışmada, memeli

bağışıklık sistemi tarafından üretilen ve demir bağlayıcı özelliği bulunan laktoferrinin

64

Pseudomonas Aeruginosa’nın biofilm yapabilme yeteneğini ortadan kaldırabileceği

gösterilmiştir (33).

Doğada biofilm oluşumu ne kadar eski ise, doğanın kendi biofilm inhibitörlerini

kullanımı da o kadar eskidir. Biofilmlerin ıslak yüzeylerin büyük çoğunluğunda

oluşabildiğinin bilinmesine rağmen, bu durumun da bazı istisnaları izlenebilir. Bazı su

bitkileri biofilm oluşmasını engelleyen bileşenler salgılamaktadırlar. Bunun nedeni,

bakterilerin yapışmak suretiyle bitkiye ulaşan güneş ışığını engellemesidir. En detaylı

tanımlanmış olan biofilm engelleme sistemi, Avustralya Botanik Koyu’ndaki kırmızı

algae, Delisea Pulchra’da bulunmaktadır. Steinberg ve ark. yaptıkları çalışmada

bitkinin,bakteriyel biofilmleri uzaklaştırmak için halojenli furanonlar salgıladığını ortaya

koymuşlardır. Daha sonraki dönemde yaptıkları çalışmalarda ise halojenli furanonların

AHL quorum – sensing sistemini inhibe ettiklerini göstermişlerdir (34).

Her ne kadar biofilmler, belirli koşullar altında sağlığımızı tehdit ediyorlarsa da,

özellikle endüstriyel atıkların detoksifikayonunda ve nitrojen ve fosforun

uzaklaştırılmasında %100 e yakın başarılar elde ettikleri unutulmamalıdır (35). Bu

durumda akla hemen şu sorular gelmektedir. Acaba bütün biofilmlerle savaşmalı mıyız?

Yoksa onların varlıklarını sürdürmesi bizim varlıklarımızı sürdürmemiz için gerekli mi?

Buna benzer tüm soruların cevabının bulunması için daha bir çok çalışmanın yapılması

gereklidir.

65

REFERANSLAR:

1. Wagner S, Jung H, Nau F, Schmitt HJ. Relevance of infectious diseases in a pediatric practice.,

Klin Padiatr. 1993 Jan-Feb;205(1):14-7

2. Birnbaum HG, Morley M, Greenberg PE, Colice GL. Economic burden of respiratory infections in

an employed population. Chest. 2002 Aug;122(2):603-11

3. K Roos, R Claesson, U Persson, and K Odegaard. The economic cost of a streptococcal tonsillitis

episode. Scand J Prim Health Care, December 1, 1995; 13(4): 257-60

4. Vital and Health Statistics. Current estimates from the national health interview survey, 1996.

Series 10, No. 200. Atlanta GA: Centers for Disease Control and Prevention, National Center for

Health Statistics, October 1999

5. Owings MF, Kozak LJ. Ambulatory and inpatient procedures in the United States, 1996. Vital

Health Stat 13 (139). Hyattsville, MD: National Center for Health Statistics; 1998:49

66

6. Conley J, Olson ME, Cook LS, Ceri H, Phan V, Davies HD. Biofilm formation by group a

streptococci: is there a relationship with treatment failure? J Clin Microbiol. 2003 Sep;41(9):4043-

8

7. Post JC. Direct evidence of bacterial biofilms in otitis media. Laryngoscope. 2001 Dec;111(12):

2083-94

8. Zur KB, Mandell DL, Gordon RE, Holzman I, Rothschild MA. Electron microscopic analysis of

biofilm on endotracheal tubes removed from intubated neonates.Otolaryngol Head Neck Surg.

2004 Apr;130(4):407-14

9. Everaert EP, Mahieu HF, van de Belt-Gritter B, Peeters AJ, Verkerke GJ, van der Mei HC,

Busscher HJ. Biofilm formation in vivo on perfluoro-alkylsiloxane-modified voice prostheses.

Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 1999 Dec;125(12):1329-32

10. Bothwell MR, Smith AL, Phillips T. Recalcitrant otorrhea due to Pseudomonas biofilm.

Otolaryngol Head Neck Surg. 2003 Nov;129(5):599-601

11. Chole RA, Faddis BT. Anatomical evidence of microbial biofilms in tonsillar tissues: a possible

mechanism to explain chronicity. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2003 Jun;129(6):634-6

12. Cowan DL, Hibbert J. Acute and chronic infection of the pharynx and tonsils, Scott Brown’s

Otlolaryngology, Volume 5, Chapter 4, 6th edition, 1997

13. Wiatrak BJ, Woolley AL. Pharyngitis and adenotonsillar disease, Otolaryngology Head & Neck

Surgery, Volume 5, Chapter 12, 3rd edition 1998 Cummings

14. Paradise JL, Bluestone CD, Bachman RZ, Colborn DK, Bernard BS, Taylor FH, Rogers KD,

Schwarzbach RH, Stool SE, Friday GA, et al. Efficacy of tonsillectomy for recurrent throat

infection in severely affected children. Results of parallel randomized and nonrandomized clinical

trials. N Engl J Med. 1984 Mar 15;310(11):674-83

15. Post JC, Stoodley P, Hall-Stoodley L, Ehrlich GD. The role of biofilms in otolaryngologic

infections. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 2004 Jun;12(3):185-90. Review

16. Donlan RM. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 2002 Sep;8(9):881-90.

Review

17. Davey ME, O'toole GA. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbiol Mol

Biol Rev. 2000 Dec;64(4):847-67. Review

67

18. Bothwell MR, Smith AL, Phillips T.Recalcitrant otorrhea due to Pseudomonas biofilm.

Otolaryngol Head Neck Surg. 2003 Nov;129(5):599-60

19. Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.

Clin Microbiol Rev. 2002 Apr;15(2):167-93. Review

20. Lawrence JR, Korber DR, Hoyle BD, Costerton JW, Caldwell DE. Optical sectioning of microbial

biofilms. J Bacteriol. 1991 Oct;173(20):6558-67

21. Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK, Hoyer LL, McCormick T, Ghannoum MA. Biofilm

formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug

resistance. J Bacteriol. 2001 Sep;183(18):5385-94.

22. Lamont RJ, El-Sabaeny A, Park Y, Cook GS, Costerton JW, Demuth DR. Role of the

Streptococcus gordonii SspB protein in the development of Porphyromonas gingivalis biofilms on

streptococcal substrates. Microbiology. 2002 Jun;148(Pt 6):1627-36

23. Nealson KH, Hastings JW. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance.

Microbiol Rev. 1979 Dec;43(4):496-518

24. Eberhard A, Widrig CA, McBath P, Schineller JB. Analogs of the autoinducer of bioluminescence

in Vibrio fischeri. Arch Microbiol. 1986 Oct;146(1):35-40

25. Cloak OM, Solow BT, Briggs CE, Chen CY, Fratamico PM. Quorum sensing and production of

autoinducer-2 in Campylobacter spp., Escherichia coli O157:H7, and Salmonella enterica serovar

Typhimurium in foods. Appl Environ Microbiol. (2002 Sep;68(9):4666-71

26. Sutherland I. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky framework. Microbiology. 2001

Jan;147(Pt 1):3-9. Review

27. Marsh PD. Are dental diseases examples of ecological catastrophes? Microbiology. 2003 Feb;149

(Pt 2):279-94.

28. Biedlingmaier JF, Samaranayake R, Whelan P. Resistance to biofilm formation on otologic

implant materials. Otolaryngol Head Neck Surg. 1998 Apr;118(4):444-51

29. Chenier MR, Beaumier D, Roy R, Driscoll BT, Lawrence JR, Greer CW. Impact of seasonal

variations and nutrient inputs on nitrogen cycling and degradation of hexadecane by replicated

river biofilms. Appl Environ Microbiol. 2003 Sep;69(9):5170-7.

68

30. Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacterial biofilms: a common cause of persistent

infections., Science. 1999 May 21;284(5418):1318-22

31. Chole RA, Faddis BT. Evidence for microbial biofilms in cholesteatomas. Arch Otolaryngol Head

Neck Surg. 2002 Oct;128(10):1129-33.

32. Brook I. Failure of penicillin to eradicate group A beta-hemolytic streptococci tonsillitis: causes

and management. J Otolaryngol. 2001 Dec;30(6):324-9. Review

33. Singh PK et al. A component of inate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature

417, 552 – 555,(2002)

34. Manefield M, de Nys R, Kumar N, Read R, Givskov M, Steinberg P, Kjelleberg S.Evidence that

halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated

gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein. Microbiology. 1999

Feb;145 ( Pt 2):283-91.

35. Altinbas U, Ozturk I. Comparison of intermittently aerated continuous and batch biofilm reactor in

nutrient removal. Water Sci Technol. 2003;48(11-12):371-6.

69