ÜNÜ

2209

ÜNİVERSİTE ÖĞRENCİLERİ YURT İÇİ / YURT DIŞI ARAŞTIRMA PROJELERİ DESTEKLEME PROGRAMI

SONUÇ RAPORU

PROJE BAŞLIĞI: Meme Kanseri Hücre Hattında Kızılçam (Pinus brutia) Kabuk Ekstratının Antikanserojen Etkisinin İncelenmesi PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI: Mehmet KİRAZLAR

DANIŞMANININ ADI: Prof. Dr. Sevinç İNAN

GENEL BİLGİLER

PROJENİN KONUSU

Meme Kanseri Hücre Hattında Kızılçam (Pinus

brutia) Kabuk Ekstratının Antikanserojen

Etkisinin İncelenmesi

PROJE YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI

Mehmet Kirazlar

DANIŞMANIN ADI

Prof. Dr. Sevinç İNAN

PROJE BAŞLANGIÇ VE BİTİŞ TARİHLERİ

Eylül 2013 – Eylül 2014

Sonuç Raporu Formatı:

1. Giriş

Proje konusu hakkında kısa bilgi

2. Rapor dönemlerinde yapılan çalışmalar

I. Dönem...

II. Dönem...

3. Sonuç:

4. Çıktılar [Yayınlar, sunumlar v.b.]

PROJE

YÜRÜTÜCÜSÜNÜN ADI – SOYADI - İMZA

DANIŞMANIN

ADI – SOYADI - İMZA

Tarih

Mehmet KİRAZLAR Prof. Dr. Sevinç İNAN

1.GİRİŞ

Meme kanseri tüm kadınlarda, özellikle endüstriyel ülkelerdeki kadınlarda çok

sık görülen kanser türüdür (Charles et al., 1995). Heterojen ve karmaşık yapıda bir

kanser türü olup genetik, diyet ve çevresel faktörlerin etkisi altında kalabilmektedir

(Russo and Russo 2000). Kadınlarda görülme olasılığı en yüksek kanser

sıralamasındadır. Histolojik olarak meme karsinomlar in situ ve invaziv karsinomlar

olmak üzere iki ana gruba ayrılmaktadır. İn situ karsinomda malign epitelyal hücreler

bazal membranla çevrili duktus ve asinuslar içinde sınırlı iken, invaziv karsinomda

neoplastik hücreler bazal membranı aşarak stromaya invazyon göstermektedir. Bu

nedenle invaziv karsinomlar, lenfatik ve kan damarlarını invaze ederek bölgesel lenf

düğümlerine ve uzak organlara metastaz yapabilme kapasitesine sahiptir (İlhan ve

ark., 2006). Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) östrojen reseptör negatif olması

nedeni ile MDA-MB 231 ile karşılaştırıldığında dana az malign olan bir hücre dizinidir.

Bu iki dizin hücre meme kanseri araştırmalarının büyük çoğunluğunda kullanılan dizin

hücre hatlarıdır (Lacroix et al., 2006). MDA-MB 231 invaziv bir adenokarsinom olup

meme kanseri olup östrojen negatif bir hücre hattıdır (Brinkley et al., 1980).

Pinus familyasının genel farmakolojik özelliklerinin antiinflamatuar (Rohdewald

P. 2002), antioksidan (Guri et al., 2006), antineoplastik (Vuorela S. 2005) ve immuno-

modulatör (Li et al., 2007) olduğu bilinmektedir. Bu özellikleri Pinus familyasının

siklooksijenaz aktivitesi, prostoglandin E2 (PGE2) üretimi (Karonen et al., 2004),

nitrik oksit sentaz (NOS) aktivitesi (Virgili F. 1998) ve kanser (Li et al., 2007) ile

ilişkilerini değerlendirme çalışmalarına önem kazandırmıştır. Pinus cinsinin

Türkiye’deki en önemli türlerinden olan kızılçam (Pinus brutia Ten, Syn.: Pinus

pityusa Stev.) Sylvestris alt seksiyonuna ait diploxylon çam türüdür. Bu çam türü

Doğu Akdeniz bölgesinin bir türü olup dünyada Türkiye’de akdeniz iklimi hakim olan

bölgelerde geniş yayılım göstermektedir (Kasaplıgil B 1999). Kızılçam bitkisinin

uçucu ekstraksiyonlarının gaz kromatografisi ve kütle spektometresi ile analizinde

422 ayrı etken içerdiği anlaşılmıştır (Mateus et al., 2010). Kızılçam 15-20 metre

boylarında kalın dallı bir ağaçtır. Genç sürgünleri kalın ve kızıl renktedir. Hızlı

büyüme siklusu ile ürün eldesi açısından verimli bir türdür. Kuraklığa dayanıklı olup

ılık hava yaşam şartları ortamı genel aurasıdır. Genellikle sahil kesimlerinde yayılış

yapmasına rağmen 1200 m yükseltilere değin çıkabilmektedir. Kızılçam Türkiye

orman envanterlerine göre 5,4 milyon hektar alanı ile ülkemizde en geniş yayılış

alanına sahip türlerin başında gelmektedir. Toplam ormanlık alanın %15 kızılçam

ormanları ile kaplıdır (Sarıbaş ve Ekici 2004). Kızılçam Türkiye’de ağaçlandırmalarda

en yaygın olarak kullanılan türdür. Türkiye’de yapılan ağaçlandırmalarda kızılçamın

payı %40 a yaklaşmaktadır. Kızılçamın ağaçlandırma potansiyelinin yüksek olması

genetik ıslah çalışmalarının daha düşük maliyetle gerçekleştirilmesi açısından önemli

bir özelliktir (Usta 1991).

Kızılçam kabuğu ekstraktının, insan sağlığı açısından çok değerli polifenol

maddeleri içermektedir. Bu maddelerin başında oligomerik proantosiyanidin (OPC)

denilen çok değerli bir polifenol gelmektedir. OPC veya fenoller, ilk olarak üzüm

tohumundan ya da çam kabuğundan izole edilmiş ve ayrıca yeşil çay, üzüm, soğan,

bezelye ve maydanozda da bulunur. OPC, farmakolojik olarak tanen denen

flavonoid’lere yakın karmaşık polifenol bileşikleri olarak sınıflandırılmıştır. OPC

şimdiye kadar kılcal damar stabilitesi ve lenfatik drenajı pekiştirmek için kullanılmıştır.

OPC, güçlü antioksidandırlar ve damar koruyucu etkilidir (Çetin ve ark 2013). OPC,

lipooksigenaz ve siklooksigenazı inhibe eder (Cretu et al., 2013) ve bu da kanserin

engellenmesinde faydalı olması muhtemeldir. Yapılan bir çalışmada, OPC'nin prostat

kanserinde kemoterapi etkisi ile önemli bir ajan olduğu bildirilmiştir (Neuwirt et al.,

2008). Kızılçam kabuk ekstratından polifenollerin yanında tanen ve lignin eldesi de

mümkündür. Lignin hücre membran yapısında dayanıklılığı artırdığı gösterilmiştir

(Lebo et al., 2001). Kabuğun en önemli bileşenlerinden biri tanenlerdir. Tanenler çok

eski zamanlardan beri bilinen ve dericilikte sepi maddesi olarak kullanılan

makromolekül bileşiklerdir. Hayvan derisindeki proteinler ile etkileşime sokulan

tanenler derideki proteini çöktürerek derinin bozulmayan, esnek ve bakteri etkilerine

karşı stabil hale getirilmesini sağlamaktadır. Ayrıca geleneksel olarak yerel halkın

ihtiyaçları için bitkisel ilaçlarda; antiviral, antimikrobiyal ve antikansorejen etkileri

nedeni ile tıpta ve farmakolojide doğal hammadde olarak bitki tanenleri

kullanılmaktadır (Kwak et al., 2006, Scalbert 1991).

Son yıllarda doğal koruyucu maddeler arasında çevreye zararlı etkileri

bulunmayan bitkisel ekstraktlar içinde tanenler önemli yer tutmaktadır. Çalışmamızda

kızılçam kabuk ekstratı 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve 0.001 mg/ml dilüsyonlarında toksik

etkisi MDA-MB231 meme kanseri dizin hücrelerinde sitotoksisite ve hücre ölümü

(apoptozis) açısından değerlendirildi.

2. RAPOR DÖNEMLERİNDE YAPILAN ÇALIŞMALAR

I. DÖNEM:

Proje kabul edildikten sonra deneyde kullanılacak olan malzemelerin temini ve

laboratuar ortamı sağlandı.

Bitkisel materyal: Bu çalışmada Balıkesir Kale Naturel Ltd Şti.’nden temin edilen Pinus brutia kabuk

ekstratı kullanıldı.

Hücre kültürü: Çalışmamızda Celal Bayar Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim

dalı öğretim üyesi Prof.Dr. M.İbrahim Tuğlu’dan temin edilen MDA-MB 231 hücre

dizini kullanıldı. Hücrelerin çoğalması ve konfluent olmasını sağlamak için %1

penisilin-streptomisin %1 L-glutamin ve % 10 fötal sığır serumu (FBS) içeren RPMI-

1640 ile kültür ortamına bırakılarak 370C sıcaklıkta, yaklaşık % 60–80 nem orana

sahip etüvde inkübe edildi. İki günde bir kültür mediumları değiştirildi.

Çoğaltılan hücrelerin bir kısmı çalışmada kullanılmak üzere %10 dimetil sülfoksit

(DMSO) içeren kültür mediumunda -800C’ de dondurularak saklandı.

MDA-MB 231 hücrelerinin inverted

ikroskop görüntüsü. X100.

MDA-MB 231 hücrelerinin inverted mikroskop görüntüsü. X400.

II. DÖNEM Dondurularak saklanan hücreler dondurucudan çıkarılarak uygun koşullarda

yaşatıldı. Kızılçam kabuk ekstraktı farklı dozlarda hazırlanarak MDA-MB 231 meme

kanseri hücrelerine uygulandı ve ekstraktın sitotoksik etkisi MTT ve TUNEL

yöntemleri ile değerlendirildi.

Hücrelerin çoğaltılması:

Hücreler dondurucudan çıkarılarak %1 penisilin-streptomisin %1 L-glutamin ve % 10

fötal sığır serumu (FBS) içeren RPMI-1640 ile kültür ortamında, 370C sıcaklıkta,

yaklaşık % 60–80 nem orana sahip etüvde inkübe edildi. İki günde bir kültür

mediumları değiştirildi.

Sitotoksisite testi: Hücreler çoğaltıkdıktan sonra MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide) sitotoksisite testi yapıldı. Bunun için hücreler 96

kuyucuklu kültür kabına ekilerek hücrelerin yapışması için 24 saat inkübe edildi.

Ertesi gün kızılçam (Pinus brutia) kabuk ekstraktı DMSO ile dilue edilerek 0.1 mg/ml,

0.01 mg/ml ve 0.001 mg/ml doz uygulaması 24 saat süreyle yapıldı. Her dilusyon

üçer kez tekrarlandı. 24 saat sonra ekstrakt içeren kültür mediumu çekilip atıldı. 100

μL yeni medium konularak üzerine 10 μL MTT (M-6494, İnvitrogen) solusyonu

eklendi ve 370C’de 4 saat süre ile inkübe edildi. Süre sonunda medium ve MTT

solusyonu atılarak her bir kuyucuğa 50 μL DMSO konularak 10 dakika sonra

spektrofotometrede okutuldu.

Hücrelere olan toksik etkinin anlaşılması için yapılan MTT testinde artan dilüsyonlarda

toksik etkinin çoğalmayı durdurduğunu ancak hücre ölümünü fazlaca etkilemediğine işaret

etti (Resim 1 ve Tablo 1).

Kızılçam kabuk ekstraktı uygulanan meme kanseri hücrelerinde hücre ölümü ve

boşluklu alanlar. X400.

Resim 1. Kültür ortamında Kızılçam kabuk ekstraktına maruz kalmış MDA-MB 231

hücrelerinin davranışları.

Tablo 1. Kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücresine toksik etkisinin MTT

analizi ve kültür ortamında MTT formazon reaksiyonunun fotoğrafı.

Apoptotik hücre varlığı: TUNEL yöntemi ile apoptotik hücre varlığına bakıldı. Bunun için ApopTag® Plus

Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit (S7101, Millipore) kullanıldı.

Hücreler 24 kuyucuklu hücre kültür kaplarına ekildi ve hücrelerin yapışması için bir

gece inkübe edildi. Ertesi gün kızılçam kabuk ekstraktı 0.1 mg/ml, 0.01 mg/ml ve

0.001 mg/ml olacak şekilde uygulandı ve 24 saat bekletildi. Süre sonunda medium

atılarak hücreler % 4’lük paraformaldehit ile tespit edildikten sonra fosfat tamponu

(PBS) ile yıkandı. Yıkandıktan sonra 20-µg/ml Proteinaz-K 370C’de 15 dak. süre ile

uygulandı. 5’şer dakika 3 kez PBS ile yıkamayı takiben 5 dak. % 3’lük hidrojen

peroksit ile muamele edildikten sonra yeniden 5’şer dakika 3 kez PBS ile oda

ısısında yıkandı. Örnekler 5 dak. Equilibration buffer ile oda ısısında tutulduktan

sonra TdT-enzimi ile nemli atmosferik ortamda 370C de 60 dak. plastik slipler kesitleri

kapatacak şekilde bekletildi. Sürenin ardından Stop Wash Buffer ile 10 dak.

bekletildikten sonra Antidioksigenin Peroksidaz Konjugatı ile 30 dak. muamele edilen

örnekler 5’şer dakika 3 kez PBS ile yıkandı. Ardından DAB (Diaminobenzidin) ile

boyama yapıldı, birkaç kez distile su ile yıkandı. Hücre çekirdek boyaması Mayer’s

Hematoksileni ile yapıldı. Kör yöntemle TUNEL pozitif hücreler saptandı ve

ortalamalar istatiksel olarak değerlendirildi.

İstatistiksel Analiz: Tüm MTT analizine ait absorbans sonuçları ve apoptotik hücre

sayıları graphpad yazılım programında ortalama ± Standart hata olarak hesaplandı.

MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam

kabuk ekstraktı içinde PBS kullanılmış

kontrol boyamalarında negatif boyanma.

X200

MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam

kabuk ekstraktı içinde toksik etkiye bağlı

TUNEL pozitif boyanma. X200

MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam

kabuk ekstraktı içinde PBS kullanılmış

kontrol boyamalarında negatif boyanma.

X400

MDA-MB 231 hücrelerinin kızılçam

kabuk ekstraktı içinde toksik etkiye bağlı

TUNEL pozitif boyanma. X400

Resim 2. kızılçam kabuk ekstratının MDA-MB 231 dizin hücresine toksik etkisinin

TUNEL immunohistokimyasında az miktarda hücrenin pozitif boyandığı bulundu.

Tablo 2. Kızılçam kabuk ekstraktının MDA-MB 231 dizin hücresine toksik etkisinin

TUNEL immunohistokimyasında skorlama yapılarak gerçekleştirilen morfometrik

analizinde gruplar arasında anlamlı fark olmadığı izlendi.

3. SONUÇLAR Hazır halde gelen ekstraktlar katlı dilüsyonlar olarak MDA-MB 231 hücrelerinin

semikonfluent aşamasında üzerine konuldu. Hücreler kontrol olarak kullanılan

sadece besiyeri (BY) ve DMSO çözücüler içinde normal davranışlarını göstererek sıkı

şekilde birbirine yapışarak üremeye devam ettiler. Her kuyucuğa 10000 hücre

yerleştirilerek başlatılan kültürlerde yaklaşık 3 gün içerisinde konfluent olan

hücrelerde kullanılan ekstraktın dilüsyonlarına bağlı olarak bozulmalar ve kayıplar

gözlendi (Resim 1). Ekstraktlar hücrelerin ölüm mekanizması olarak kullandıkları

apoptoz için boyandıklarında (TUNEL) bazı hücrelerin pozitif boyandıkları gözlendi

(Resim 2). TUNEL pozitif görülen hücrelerin skorlama ile yapılam morfometrik

değerlendirmesinde çok fazla hücrenin boyanmadığı ve gruplar arasında farkın fazla

olmadığı görüldü (Tablo 2).

Biz bu çalışmada kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücrelerinde toksik

etkisini araştırıp tedavi açısından kullanılacak bir ürün olması ihtimalini inceledik.

Ekstraktın hücre çoğalmasına etki etmediğini ve hücre ölümüne neden olmadığını

saptadık.

Biz bu çalışmada kızılçam ekstresinin meme kanseri dizin hücrelerinde toksik

etkisini araştırıp tedavi açısından kullanılacak bir ürün olması ihtimalini inceledik.

Ekstraktın hücre çoğalmasına etki etmediğini ve hücre ölümüne neden olmadığını

saptadık.

Kızılçam kabuğu ekstraktı içerisinde özel bir etken olarak oligomerik

proantosiyanidin (OPC) başta olmak üzere fenolik bileşikler ve flavanoidlerin

bulunduğu birçok çalışma ile gösterilmiştir (Apak ve ark., 2004).

Kızılçam ağacı ekstrelerin MTT analizinde çoğalan hücreyi durdurdukları ve

antiproliferatif etki gösterdikleri önceki çalışmalarda saptanmış olup bir çalışmada

pinusun bir başka türünde de bu etkinin var olduğu ayrıca apoptozuda arttırdığı

görülmüştür (Zhang et al., 2012).

Uzun yıllardır Çin tıbbında etkin olarak kullanıldığı bilinmekte olup in vivo

olarak servikal kanser tanısı konmuş hastalara 158 ve 250 mg/kg dozunda

verildiğinde tümör hacmini azalttığı görülmüş ve bu antitümör etkisi, çoğalma

belirteçlerini ile birlikte oksidatif stres belirteçlerini (süperoksit dismutaz,

malondialdehit) ve apoptoz belirteçlerini (p53, Bcl-2) azaltması ile ilişkilendirilmiştir (Li

et al., 2007).

Yapılan bir çalışmada faklı pinus türüne (Pinus massonian) ait kabuk ekstraktı

farklı çözücülerde hazırlanmış ve antitümörojenik etkisi, meme (MDA-MB-231),

servikal (Hela), akciğer(A549) ve karaciğer (BEL-7402) kanser dizinlerinde

araştırılmıştır. Etil asetat fraksiyonu ile elde edilen ekstraktın servikal ve karaciğer

kanser hücreleri üzerine zayıf etki gösterirken suda hazırlanan ekstrakt servikal

kanserde zayıf etkiye sahip olduğu diğer kanser hücrelerine etki etmediği

saptanmıştır (Shen et al., 2010).

Benzer şekilde Eggenschwiler ve arkadaşları, farklı cinslerdeki ağaçlara ait

ekstraktların farklı meme kanseri dizinleri (Kpl-1, MCF-7, Mfm-223) üzerine sitotoksik

etkisini çalışmışlar ve meşe ve elma ağacı ekstraktlarının çam ve göknar

ekstratlarına oranla daha etkili olduğu, kanser hücrelerini öldürdüğü ve immun ve

stress yanıtına ait mRNA seviyelerinin daha iyi olduğu belirlenmiştir (Eggenschwiler

et al., 2006).

Çalışmamızın sonucunda kızılçam kabuk ekstraktı ile yapılan denemelerde

MDA-MB-231 dizin hücrelerinde çoğalmaya ve hücre ölümüne etkisi belirgin olmadığı

ve kanser tedavi edici yönünde etkisinin bulunmadığı saptandı.

Kızılçam kabuk ekstraktının etkisinin diğer hücre dizinleri ile karşılaştırılması

ve önceki çalışmalarda görülen farklı hücre dizinlerinde farklı etki göstermesi

incelenmelidir. Kızılçam kabuk ekstraktı ile yapılan çalışmalarda gösterildiği üzere

oksidatif stres ile ilişkisi ortaya konmalıdır. Hem farklı kanser hücrelerinde hem de

farklı mekanizmalarda olan etkisi İleri tekniklerle araştırılması gerekir.

TÜBİTAK 2209-A Üniversite Öğrencileri Yurt İçi Araştırma Projeleri

Programı’na desteğinden dolayı teşekür ederiz.

KAYNAKLAR

Apak R, Güçlü K, Ozyürek M, Karademir SE. Novel total antioxidant capacity index

for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupric ion reducing

capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method. J Agric Food Chem.

2004; 52(26):7970-81.

Brinkley BR, Beall PT, Wible LJ, Mace ML, Turner DS, Cailleau RM. Variations in cell

form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. Cancer Res. 1980,

40(9):3118-29.

Cetin EO, Yesil-Celiktas O, Cavusoglu T, Demirel-Sezer E, Akdemir O, Uyanikgil Y.

Incision wound healing activity of pine bark extract containing topical formulations: a

study with histopathological and biochemical analyses in albino rats. 2013.

Pharmazie Jan; 68 (1) :75-80.

Charles,M.H. Susan, ML. Breast cancer, In "Cancer Treatment", Eds. Charles M

Haskell and Jcmathen S. Berek W. B. Saunders Company, 4th edition, Philadelphia,

1995, p. 323.

Cretu E, Miron SD, Miron A. Bioactivity screening of Pinus brutia bark extracts:

superoxide dismutase-like and nitric oxide scavenging effects. Rev Med Chir Soc

Med Nat Iasi. 2013, 117(2):551-7.

Eggenschwiler J, Patrignani A, Wagner U, Rehrauer H, Schlapbach R, Rist L, Ramos

MH, Viviani A. Gene expression profiles of different breast cancer cells compared

with their responsiveness to fermented mistletoe (Viscum album L.) extracts Iscador

from oak (Quercus), pine (Pinus), white fir (Abies) and apple tree (Malus) in vitro.

Arzneimittelforschung. 2006; 56(6A):483-96.

Guri A, Kefalas P, Roussis V. Antioxidant potential of six pine species. Phytother

Res. 2006, 20(4):263-6.

Ilhan G, Karakus S, Andic N. Risk factors and primary prevention of acute leukemia.

Asian Pac J Cancer Prev. 2006, 7(4):515-7.

Karonen M, Hämäläinen M, Nieminen R, Klika KD, Loponen J, Ovcharenko VV,

Moilanen E, Pihlaja K. Phenolic extractives from the bark of Pinus sylvestris L. and

their effects on inflammatory mediators nitric oxide and prostaglandin E2. J Agric

Food Chem. 2004; 52(25):7532-40.

Kasaplıgil, B.1999.Türkiye’nin Geçmişteki ve Bugünkü Çam Türleri. O.G.M. Yayını

No: 674, 99s., Ankara.

Kwak CS, Moon SC, Lee MS. Antioxidant, antimutagenic, and antitumor effects of

pine needles (Pinus densiflora). 2006; 56(2):162-71.

Lacroix, M, Toillon RA, Leclercq G. (2006). "p53 and breast cancer, an

update". Endocrine-Related Cancer 13 (2): 293–325.

Lebo, Stuart E. Jr.; Gargulak, Jerry D. and McNally, Timothy J. (2001). "Lignin". Kirk

Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, Inc Erişim tarihi:

2007-10-14.

Li K, Li Q, Li J, Zhang T, Han Z, Gao D, Zheng F. Antitumor activity of the

procyanidins from Pinus koraiensis bark on mice bearing U14 cervical cancer.

Yakugaku Zasshi. 2007 Jul;127(7):1145-51.

Mateus E, Barata RC, Zrostlíková J, Gomes da Silva MD, Paiva MR.

Characterization of the volatile fraction emitted by Pinus spp. by one- andtwo-

dimensional chromatographic techniques with mass spectrometric detection. J

Chromatogr A. 2010, 1217(11):1845-55. doi: 10.1016/j.chroma.2010.01.045.

Neuwirt H, Arias MC, Puhr M, Hobisch A, Culig Z. Oligomeric proanthocyanidin

complexes (OPC) exert anti-proliferative and pro-apoptotic effects on prostate cancer

cells. Prostate. 2008 Nov 1;68(15):1647-54. doi: 10.1002/pros.20829.

Rohdewald P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a

herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int J Clin Pharmacol Ther.

2002;40(4):158-68.

Russo J, Russo IH. Atlas and histologic classification of tumors of the rat mammary

gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2000,(2):187-200.

Sarıbaş M, Ekici B, 2004. Kızılçam (Pinus brutia Ten.)’in Batı Karadeniz Bölgesindeki

Doğal Yayılışına Katkı. Bartın Orman Fakültesi Dergisi Sayı 1- 2, s. 127- 135, Bartın.

Scalbert A. Antimicrobial properties of tannin. Phytochem. 1991 30:3875-3883

Shen X, Wang Y, Wang F. Characterisation and biological activities of

proanthocyanidins from the barks of Pinus massonian and Acacia mearnsii. Nat Prod

Res. 2010; 24(6):590-8. doi: 10.1080/14786410903194472.

Usta HZ, 1991. Kızılçam (Pinııs brııtia Ten.) Ağaçlandırma alarında hasılat

Araştırmaları, Ormancılık Araştırma Enstitüsü Yayınları, Teknik Bülten Serisi N o.219,

s. 1-36, Ankara.

Virgili F, Kobuchi H, Packer L. Procyanidins extracted from Pinus maritima

(Pycnogenol): scavengers of free radical species and modulators of nitrogen

monoxide metabolism in activated murine RAW 264.7 macrophages. Free Radic Biol

Med. 1998, 24(7-8):1120-9.

Vuorela S, Kreander K, Karonen M, Nieminen R, Hämäläinen M, Galkin A, Laitinen L,

Salminen JP, Moilanen E, Pihlaja K, Vuorela H, Vuorela P, Heinonen M. Preclinical

evaluation of rapeseed, raspberry, and pine bark phenolics for health related effects.

J Agric Food Chem. 2005 J;53(15):5922-31.

Zhang JH, Feng DR, Ma HL, Liu B, Wang HB, Xie H, Li RD, Wang JF. Antitumor

effects of Pinus massoniana bark extract in murine sarcoma S180 both in vitro and in

vivo. Am J Chin Med. 2012;40(4):861-75. doi: 10.1142/S0192415X12500644.