T.C.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KAN DONÖRLERİNDE OLASI İMMÜN DEĞİŞİKLİKLERİN

PTERİDİN YOLAĞI İLE İLİŞKİLİ PARAMETRELERLE

DEĞERLENDİRİLMESİ

Uzm. Ecz. Songül ÜNÜVAR

Farmasötik Toksikoloji Programı

DOKTORA TEZİ

ANKARA

2012

T.C.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ

SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KAN DONÖRLERİNDE OLASI İMMÜN DEĞİŞİKLİKLERİN

PTERİDİN YOLAĞI İLE İLİŞKİLİ PARAMETRELERLE

DEĞERLENDİRİLMESİ

Uzm. Ecz. Songül ÜNÜVAR

Farmasötik Toksikoloji Programı

DOKTORA TEZİ

TEZ DANIŞMANI

Prof. Dr. Terken BAYDAR

ANKARA

2012

iii

iv

TEŞEKKÜR

Doktora eğitimim süresince, her zaman yanımda olan, tez çalışmalarımda bilgi ve

yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen, beni her zaman destekleyerek yol gösteren,

saygın kişiliğini örnek aldığım çok değerli tez danışmanım Sayın Prof. Dr. Terken

BAYDAR’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım.

Eğitimim sırasında, birlikte çalışmaktan her zaman onur duyduğum, hiç bir zaman

sabır, özveri ve hoşgörüsünü bizlerden esirgemeyen, saygıdeğer hocam Sayın Prof.

Dr. Gönül ŞAHİN’e minnet duygularıyla şükranlarımı sunarım.

Tez örneklerinin toplanmasında benden sabır ve yardımını esirgemeyen, tezim için

gereken uygulamalara emek ve zaman harcayan sevgili arkadaşlarım Dr. Ecz. Gözde

GİRGİN ve Uzm. Ecz. Sezin PALABIYIK’a teşekkürlerimi sunarım.

Tez örneklerinin organizasyonunda katkıda bulunan Sayın Prof. Dr. Osman

ÖZCEBE ve Dr. Tülay KARAAĞAÇ’a ve Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi

Erişkin Hastanesi Kan Merkezi çalışanlarına teşekkür ederim.

Her zaman olduğu gibi tezim süresince de yanımda olan, benden sevgi ve

desteklerini hiçbir zaman esirgemeyen başta eşim, kızım ve kız kardeşim olmak

üzere tüm aileme, dostlarıma destek ve sabırlarından dolayı sonsuz teşekkürlerimi

sunarım.

Bu tez Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi (011 BİYP102001)

tarafından desteklenmiştir.

v

ÖZET

Ünüvar, S. Kan donörlerinde olası immün değişikliklerin pteridin yolağı ile ilişkili parametrelerle değerlendirilmesi. Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Toksikoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, 2012. Organ, doku ve kan transferleri çoğu koşulda hayat kurtarıcıdır. Kan bankaları, kanın uygun ve saf olduğundan ve herhangi bir enfeksiyon, hematolojik veya immunolojik hastalık bulundurmadığından emin olmakla yükümlüdürler. Nakil birimleri kanın toplama, tarama, görüntüleme ve depolama aşamalarında kan bankalarına güvenmektedirler. Neopterin, hücresel immün yanıtın önemli bir biyogöstergesidir. İnterferon gama (INF-) uyarısı ile monosit/makrofajlarca salınır. İnflamasyon ve enfeksiyon sürecinde neopterinin aracı ve düzenleyici olarak potansiyel bir görevi bulunmaktadır. Bu özelliği nedeniyle belli biyolojik sıvılarda neopterin konsantrasyonlarının tayini, tanı koyma, prognoz ve tedavi etkinliğinin izlenmesi ve belli faktörlere temasın erken dönemde belirlenmesinde önemlidir. Fiziksel muayenede belirti göstermedikleri halde yüksek neopterin düzeyine sahip olan kan donörlerinin düşük neopterin düzeylerine sahip donörlere oranla, subklinik akut enfeksiyonu olma olasılığının daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Biyogöstergeler sağlık, zaman ve maliyet açısından kan transferinin güvenliği için önemlidir ve ölçümleri hem kan donörleri hem de alıcılar açısından önem arz etmektedir. Bu tez çalışmasında, neopterin konsantrasyonlarının ve triptofan yıkımının tayini ile 193 kan donöründe (44 kadın ve 149 erkek) immün değişiklikler incelenmiştir. Yaş dağılımı, cinsiyet, kan grubu ve Rh faktörü ile olası değişiklikler değerlendirilmiştir. Neopterin düzeyleri 2,8-36,8 nmol/L aralığında, triptofan yıkımının göstergesi olarak kinürenin triptofan oranının (Kyn/Trp) ise 17,2-76,4 mol/mmol arasında değiştiği saptanmıştır. Kyn/Trp düzeylerinin erkeklerde kadınlara oranla anlamlı yüksek olduğu bulunmuştur (p<0,05). Neopterin düzeyleri ve Kyn/Trp düzeylerinin yaşla arttığı (tümü, p<0,05) kan grubu veya Rh faktörünün herhangi bir değişikliğe neden olmadığı bulunmuştur (tümü, p>0,05). Çalışmaya dahil edilen 193 donörden 5’i (%2,6) normal değerlerden yüksek neopterin düzeyine, %97,4’ü ise normal aralıkta neopterin düzeyine sahiptir. Sonuç olarak, hücresel immün sistem aktivasyonunu göstermesi nedeniyle, neopterin düzeylerinin 19 nmol/L’yi aştığı kan bağışı durumlarında güvenli transferi sağlamak için kanın transfer programından çıkarılması gerekmektedir. Kan bankalarında kan transferinden önce neopterin düzeylerinin rutin olarak analiz edilmesi göz önünde bulundurulmalıdır. Anahtar Kelimeler: Neopterin, Triptofan, Kinürenin, Hücresel immünite, IDO aktivitesi. Destekleyen Kurumlar: H.Ü.B.A.B, Tez Destekleme (011 BİYP102001).

vi

ABSTRACT

Ünüvar, S. Evaluation of possible immune alterations in blood donors by pteridin pathway releated parameters. Hacettepe University Institute of Health Sciences, Ph.D. Thesis in Pharmaceutical Toxicology, Ankara, 2012. Organ, tissue and blood transfusions are life saving in many conditions. Blood banks are responsible to know that the blood unit is potent, pure and will not transfer any infectious, hematologic or immunologic disease. Transfusion units trust the blood banks for all aspects of collection, screening, testing and storage of the blood. Neopterin is an important biomarker of cellular immunity. It is released from monocytes/macrophages with interferon gamma (INF-) stimulation. Neopterin has a potential function in the process of inflammation and infection as mediator and/or regulator. Because of this feature, it is important to assess the neopterin concentrations in certain biological fluids for the diagnosis, prognosis, monitoring of treatment efficacy and early detection of possible effects of contact with certain factors. It has been demonstrated that in blood donors who has already passed the physical examination even they have high neopterin concentrations, they were more likely to have subclinical acute infections with certain viruses compared to donations with lower neopterin concentrations. Biomarkers are important for the safety of blood transfusion in aspects of health, time and cost and their measurements have been reported to be important in terms of both donors and receivers. In this thesis, immune changes were evaluated by determination of neopterin concentrations and also tryptophan degradation in 193 blood donors (44 female and 149 male). Age distribution, gender, blood type and Rh factor differences were also evaluated. Neopterin levels were found to range between 2.8 and 36.8 nmol/L while kynurenine to tryptophan ratio (Kyn/Trp) as an estimation of tryptophan degradation ranged between 17.2 and 76.4 mol/mmol. Kyn/Trp levels were observed to be statistically higher in males compared to females (p<0.05). Neopterin levels and Kyn/Trp were both found to increase with age (both, p<0.05) while neither blood type nor Rh factor has caused any changes (all, p>0.05). Five of the 193 donors included in the study (2.6%) had neopterin levels exceeding the limits while 97.4% were in normal range. In conclusion, donations with neopterin levels above 19 nmol/L should be excluded from the program in order to perform safe transfusion since increased neopterin levels indicate activation of the cellular immune system. Routine measurement of neopterin concentrations before transfusion should be considered in blood banks. Key Words: Neopterin, Tryptophan, Kynurenine, Cellular immunity, IDO activity. Supported by: H.Ü.B.A.B, Ph. D. Thesis Grant (011 BİYP102001).

vii

İÇİNDEKİLER

Sayfa

ONAY SAYFASI iii

TEŞEKKÜR iv

ÖZET v

ABSTRACT vi

İÇİNDEKİLER vii

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ x

ŞEKİLLER DİZİNİ xiii

TABLOLAR DİZİNİ xv

1. GİRİŞ VE AMAÇ 1

2. GENEL BİLGİLER 5

2. 1. İmmün Sistem 5

2. 2. İmmün Yanıt 5

2. 3. İmmün Sistemde Görevli Hücreler 6

2. 3. 1. Lenfositler 7

2. 3. 2. Monosit ve Makrofajlar 8

2. 3. 3. Antijen Sunucu Hücreler 8

2. 3. 4. İnterferonlar 9

2. 3. 5. Kompleman Proteinleri 9

2. 4. Pteridinler 10

2. 5. Neopterin 11

2. 5. 1. Tarihçesi, Kimyasal Yapısı, Biyosentezi ve Diğer Özellikleri 11

2. 5. 2. Hücresel İmmün Sistem Aktivasyonu ve Neopterin 15

2. 5. 3. Neopterin ve Serbest Radikaller 16

2. 5. 4. Neopterinin Fizyolojik İşlevi 17

2. 5. 5. Neopterin Düzeylerine Yaş, Cinsiyet, Hormonal Durum Etkileri

ve Neopterin Biyoritmi

18

2. 5. 6. Gebelik Dönemi 20

viii

2. 5. 7. Bebek ve Çocukluk Dönemi 21

2. 5. 8. Erişkinler 21

2. 5. 9. Neopterin ve Sistemik Hastalıklar 22

2. 5. 10. Neopterinin Klinik Önemi ve Biyogösterge Olarak Kullanmı 23

2. 5. 11. Biyolojik Sıvılarda Neopterin Düzeyleri 28

2. 5. 12. Biyolojik Sıvılarda Neopterin Ölçüm Yöntemleri 29

2. 5. 13. Transplantasyon Olgularında Neopterin 30

2. 5. 14. Neopterinin Hematopoez ve Kan Bankacılığında Önemi 32

2. 6. Kan Donörlerine Uygulanan Standart Tarama Testleri 34

2. 7. Kan Bankacılığının ve Sağlıklı Kan Donörlerinin Önemi 34

2. 8. Ülkemizde Kan Transplantasyonu ve Kan Bankacılığı 36

2. 9. Triptofan 37

2. 9. 1. Triptofan Metabolizması ve Kinürenin Oluşumu 39

2. 10. Kinürenin Yolağı 40

2. 11. Kinüreninin Triptofana Oranı (Kyn/Trp) ve Önemi 41

2. 12. İndolamin 2,3-dioksijenaz 42

2. 13. Triptofan Yıkımını Etkileyen Etmenler 43

2. 14. Triptofan ve Kinürenin Düzeylerinde Değişimler 45

2. 15. Kan Donörlerinde Yapılan Pteridin Çalışmaları 47

3. GEREÇ VE YÖNTEM 50

3. 1. Gereçler 50

3. 1. 1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 50

3. 1. 2. Kullanılan Araç ve Gereçler 50

3. 2. Yöntem 51

3. 2. 1. Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı 51

3. 2. 1. 1. Serum Neopterin Analizinde Kullanılan Çözeltiler 51

3. 2. 1. 2. Serum Triptofan ve Kinürenin Ölçümünde Kullanılan Çözeltiler 52

3. 3. Çalışma Gruplarının Tanımlanması 53

3. 4. Serum Örneklerinin Hazırlanması 56

3. 5. Yöntemler 57

3. 5. 1. Serum Neopterin Düzeylerinin Belirlenmesi 57

ix

3. 5. 2. Sonuçların Hesaplanması 57

3. 5. 3. Serum Triptofan ve Kinürenin Düzeylerinin Belirlenmesi 57

3. 5. 4. Triptofan ve Kinürenin Ölçümleri için Yöntemin Validasyon

Çalışmaları

58

3. 5. 5. Yöntemin Geri Kazanım Oranının İncelenmesi 58

3. 5. 6. Yötemin Tekrarlanabilirliğinin (Kesinliğinin) İncelenmesi 58

3. 5. 7. Yöntemin Duyarlılığının İncelenmesi 58

3. 5. 8. Triptofan ve Kinürenin Standart Kalibrasyon Doğrularının

Hazırlanması ve Sonuçların Hesaplanması

59

3. 6. İstatistiksel Değerlendirme 59

4. BULGULAR 60

4. 1. Neopterin Düzeyleri 60

4. 2. Triptofan ve Kinürenin Düzeyleri 60

4. 3. Triptofan ve Kinürenin Standart Kalibrasyon Doğru Örnekleri 62

4. 4. Triptofan ve Kinürenin Ölçümleri için Uygulanan Yöntemin

Validasyon Çalışmaları

63

4. 4. 1. Geri Kazanım Oranının İncelenmesi 63

4. 4. 2. Yöntemin Tekrarlanabilirliğinin (Kesinliğinin) İncelenmesi 64

4. 4. 3. Yöntemin Duyarlılığının İncelenmesi 66

4. 5. Katılımcıların Neopterin, Kinürenin ve Triptofan Düzeyleri 66

4. 6. Ölçülen Parametrelerin Normal Sınırlara Göre Değerlendirilmesi 82

5. TARTIŞMA VE SONUÇ 85

KAYNAKLAR 92

x

SİMGELER VE KISALTMALAR

Dalga boyu

AdV Adenovirüs

AIDS Kazanılmış immün yetmezlik sendromu (acquired immune deficiency

syndrome)

ALT Alanin aminotransferaz

Anti-HBc Hepatit B yüzey antijenine karşı antikor

Anti-HCV Hepatit C virüsüne karşı antikor

Anti-HIV İnsan immün yetmezlik virüsüne karşı antikor

APC Antijen sunucu hücreler (antigen presenting cells)

BH4 Tetrahidrobiyopterin

BNAA Büyük nötral aminoasit

BOS Beyin omurilik sıvısı

CRP C-reaktif protein

CSF Serebrospinal sıvı (Cerebrospinal fluid)

DHFR Dihidrofolat redüktaz

DHPR Dihidropterin redüktaz

DOPA 3,4-Dihidroksi-L-fenilalanin

DPT Devlet Planlama Teşkilatı

DSÖ Dünya Sağlık Örgütü

DTE Ditioeritritol

EBV Ebstein Barr virüsü

ELISA Enzim bağlı immünoassay

FMF Ailesel Akdeniz ateşi (Familial Mediterranean Fever)

GC-MS Gaz kromatografisi-kütle spektrometresi

GTP Guanozin trifosfat

GTPCHI Guanozin trifosfat siklohidrolaz I

HBsAg Hepatit B yüzey antijeni

HBV Hepatit B virüsü

HCV Hepatit C virüsü

5-HIAA 5-hidroksiindolasetik asit

HIV İnsan immün yetmezlik virüsü

xi

3-HK 3-Hidroksikinürenin

H2O2 Hidrojen peroksit

HOCl Hipokloröz asit

HSV Herpes simpleks virüsü

HTLV İnsan T hücresi lenfotropik virüsü

HVA Homovanilik asit

IDO İndolamin 2,3-dioksijenaz

IgM İmmunoglobulin M

IL İnterlökin

INF-γ İnterferon gama

INF-α İnterferon alfa

INF-β İnterferon beta

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

kD Kilodalton

KH2PO4 Potasyum dihidrojen fosfat

K2HPO4 Dipotasyum hidrojen fosfat

KİNA Kinürenik asit

KUİN Kuinolinik asit

Kyn/Trp Kinüreninin triptofana oranı

1-MT 1-metil triptofan

NaCI Sodyum klorür

NAD Nikotinamid adenin dinükleotid

NADH Nikotinamid adenin dinükleotid redükte

NADP Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat

NADPH Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat redükte

NCL Nicel limit

NO Nitrik oksit

NOS Nitrik oksit sentaz

NTL Nitel limit

OH˙ Hidroksil radikali

ONOO˙ Peroksinitrit radikali

O2˙ Süperoksit radikali

xii

PAH Fenilalanin 4-hidroksilaz

PCD Pterin karbonilamin dehidrogenaz

PCR Polimeraz zincir reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction)

PTPR 6-pürivoyiltetrahidropterin redüktaz

PTPS 6-pürivoyiltetrahidropterin sentetaz

PV B19 Parvovirüs B-19

RES Retiküloendotelyal sistem

RIA Radyoimmünoassay

RNA Ribonükleikasit

RPR Sifilis için tarama testi (Rapid plasma reagin)

RSV Respiratuar sinsial virüs

SH Standart hata

SPSS Sosyal bilimler için istatistik programı (Statistical package for the

social sciences)

SR Serbest radikal

SS Standart sapma

TDO Triptofan (2,3)-dioksijenaz

Th Yardımcı T (T helper)

TH Tirozin hidroksilaz

TNF-α Tümör nekroze edici faktör-α

TPH Triptofan hidroksilaz

TPHA Treponema pallidum hemaglütinasyon testi

UV Ultraviyole

VK Varyasyon katsayısı

YPSK Yüksek performanslı sıvı kromatografisi

XOD Ksantin oksidaz

xiii

ŞEKİLLER

Sayfa

2. 1. Pteridin ve pterinin kimyasal yapısı 10

2. 2. Konjuge olmayan pteridinlerin kimyasal yapıları 11

2. 3. Neopterinin kimyasal yapısı 13

2. 4. Konjuge olmayan pteridinlerin biyosentezi ve katabolizması 13

2. 5. Neopterin sentezi 14

2. 6. Hücresel immün yanıt sırasında aktive T-lenfositler tarafından INF-γ

salınımı ve bunun etkisine bağlı olarak makrofajlar tarafından

neopterin üretiminin uyarılması

15

2. 7. Neopterinin fizyolojik fonksiyonları 17

2. 8. Triptofanın kimyasal yapısı 37

2. 9. Triptofanın metabolik yolakları 38

2. 10. Triptofan metabolizmasının oksidasyon (kinürenin) yolu 39

4. 1. Neopterin kalibrasyon doğru örneği 60

4. 2. Triptofan ve kinürenin standartlarına ait kromatogramlar 61

4. 3. Serum örneğine ait kromatogramlar 61

4. 4. Triptofan ve kinürenin standartlarına ait kalibrasyon doğruları 62

4. 5. Cinsiyete göre serum triptofan, kinürenin, neopterin ve Kyn/Trp

konsantrasyonlarının karşılaştırılması

68

4. 6. Sigara içme alışkanlığının serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp

ve neopterin konsantrasyonlarına etkisi

69

4. 7. Yaş grupları arasında serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp

ve neopterin konsantrasyonlarının karşılaştırılması

71

4. 8. Kan grupları arasında serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp

ve neopterin konsantrasyonlarının karşılaştırılması

73

4. 9. Rh pozitif ve negatif olmasına göre katılımcıların serum

triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin konsantrasyonlarının

karşılaştırılması

74

xiv

4. 10. Yaş ile serum triptofan değişimi 75

4. 11. Yaş ile serum kinürenin değişimi 75

4. 12. Yaş ile Kyn/Trp oranının değişimi 76

4. 13. Yaş ile serum neopterin değişimi 76

xv

TABLOLAR

Sayfa

2. 1. Sağlıklı bireylerde serum neopterin düzeyleri 19

2. 2. Artmış neopterin düzeylerinin saptandığı hastalıklar 22

2. 3. Triptofan metabolizması ve immün aktivasyon ilişkisi 46

3. 1. Katılımcıların demografik özellikleri ve sigara alışkanlıkları 54

3. 2. Yaş gruplarına göre katılımcıların demografik özellikleri 55

3. 3. Kan gruplarına göre katılımcıların demografik özellikleri 55

3. 4. Rh pozitif ve negatif olmasına göre katılımcıların

demografik özellikleri

56

4. 1. Triptofan için YBSK yönteminin geri kazanım yüzdesi 63

4. 2. Kinürenin içinYBSK yönteminin geri kazanım yüzdesi 64

4. 3. Gün içi ölçümlere ait varyasyon katsayıları 65

4. 4. Günler arası ölçümlere ait varyasyon katsayıları 65

4. 5. Triptofan ve kinürenin için nitel limit ve nicel limit 66

4. 6. Katılımcıların serum triptofan, kinürenin, IDO ve neopterin düzeyleri 67

4. 7. Yaş gruplarına göre serum triptofan, kinürenin ve neopterin

konsantrasyonları ve Kyn/Trp oranı

70

4. 8. Kan gruplarına göre serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve

neopterin konsantrasyonları

72

4. 9. Rh pozitif ve negatif olmasına göre katılımcıların serum

triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin konsantrasyonları

74

4. 10. Yaş ile ölçülen parametreler arasındaki ilişki 77

4. 11. Yaş gruplarında parametreler arasındaki ilişki 78

4. 12. Cinsiyete göre parametreler arasındaki ilişki 79

4. 13. Sigara içme alışkanlığına göre katılımcılarda belirlenen

parametreler arasındaki ilişki

80

4. 14. Rh (+) ve (-) durumuna göre katılımcılarda belirlenen

parametreler arasındaki ilişki

81

xvi

4. 15. Kan gruplarında parametreler arasındaki ilişki 82

4. 16. Neopterin düzeylerinin cinsiyete göre dağılımı 83

4. 17. Triptofan düzeylerinin cinsiyete göre dağılımı 83

4. 18. Kinürenin düzeylerinin cinsiyete göre dağılımı 84

4. 19. Kinürenin/Triptofan oranının cinsiyete göre dağılımı 84

1

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Kan transfüzyonu, başta cerrahi girişimler sırasında olmak üzere birçok

travmatik durumda ve bazı patolojilerde hayat kurtarıcı bir gereksinimdir. Ancak

güvenli kan transfüzyonu, kimyasal, fiziksel ve biyolojik bulaşanlar açısından çeşitli

biyogöstergelerin değerlendirilmesiyle mümkündür. Günümüzde bu amaçla birçok

parametre kullanılmakla birlikte, daha duyarlı ve erken dönem biyogöstergelerine

gereksinim vardır. Bilindiği üzere doku ve organ naklinde veya enfeksiyonlar,

otoimmün hastalıklar ve kötü huylu oluşumlar gibi çeşitli hastalıklarda immün

sistemin aktivasyonu anahtar rol oynar. Patolojilerdeki nedensel faktörü bulmak,

uygun tanı ve tedaviyi belirlemek, tedavi etkinliğini değerlendirmek ve hastalığın

gidişatını izlemek için çeşitli biyogöstergeler kullanılmaktadır. Bunun yanı sıra,

hastalarda başta immünolojik değişiklikler ile enfeksiyona bağlı kontaminasyonun

ve/veya inflamatuar hastalıkların erken dönemde tanı ve prognozunun duyarlı

markörlerle izlenmesi, başta sağlık olmak üzere ekonomik açıdan da önem

taşımaktadır (1, 2). Kan ve kan ürünleri günümüzde laboratuar koşullarında tam

olarak elde edilemediğinden yaşamsal önemi olan kanın, toplumdaki sağlıklı

bireylerden sağlanması gerekmektedir (2).

Bir pirazinoprimidin bileşiği olan 2-amino-4-hidroksi-6-(D-eritro-1’,2’,3’-

trihidroksipropil)-pteridin yapısındaki neopterin, özellikle hücresel immün

mekanizmaların etkin olduğu önemli patolojilerde oldukça güncel bir biyogösterge

olarak kullanılmaktadır. Kolay ölçülebilir olması, tanı, prognoz ve tedavi etkinliğini

değerlendirmede yol gösterici olması nedenleriyle dikkatleri üzerine çekmektedir (3-

5). Neopterin üzerindeki bilimsel ilgi özellikle enfeksiyon hastalıkları konusunda

yoğunlaşmıştır. Bununla beraber neopterinin artmış konsantrasyonu kötü huylu

oluşumlar ve otoimmün hastalıklar dahil immün yanıtın aktif olduğu tüm durumlarla

ilişkilidir. Patolojilerin yanı sıra, kan ve organ donör taramaları için de anlamlı bir

göstergedir (6).

Neopterin, hücresel immün aktivasyonu gösteren ve biyolojik sıvılarda kolay

ve duyarlı olarak izlenebilen bir biyogöstergedir (4, 7). İnsan immün yetmezlik

2

virüsü-1 (HIV-1) seropozitif hastalarda, neopterinin HIV enfeksiyonlarında önemli

göstergeler olduğu bilinen β2-mikroglobulin, p24 antijen ve interferon-γ (INF-γ) ile

beraber değerlendirilmesi önerilmektedir. HIV tarama testi bulaşmasından uzun bir

süreç sonrasında, diğer bir değişle yaklaşık 3 aylık kuluçka döneminden sonra doğru

sonuç verebilmektedir. Neopterin özellikle donörde HIV kontaminasyonu olması

durumunda mevcut yapılan testlere göre, doğru, duyarlı ve çok daha erken dönemde

belirleyici bir biyogösterge olarak üstünlüğü bilinmekle beraber, uygulanmasının

yaygınlaşması için konu ile ilgili daha fazla sayıda bilimsel veriye gereksinim

duyulmaktadır (8-10).

Pteridin yolağında yer alan neopterin ile ilişkili triptofan ve triptofanın ana

yıkım ürünü olan kinüreninin bazı metabolik bozukluklar, depresyon, otoimmün

hastalıklar, çeşitli kanserler ve nörodejeneratif hastalıklarla ilişkili olduğu

bildirilmektedir. Genetik, çevresel ve immün etmenlere bağlı gelişen birçok

hastalıkta immün yanıtın düzenlenmesinde triptofan katabolizmasına bağlı

mekanizmaların rol aldığı düşünülmektedir. Romatoid artrit, virüs enfeksiyonları ve

bazı kötü huylu oluşumlarda ve/veya HIV enfeksiyonlarında hastalık seyri kötüye

giden kişilerde triptofan yıkımının arttığı bildirilmiştir (11-15). Bu nedenle neopterin

ile beraber triptofan düzeylerinin saptanması ve kinürenin/triptofan oranı (Kyn/Trp),

ile belirlenen indolamin 2,3-dioksijenaz (IDO) aktivitesinin değerlendirilmesi

önemlidir (3, 4, 16).

Kinüreninin triptofana oranı, IDO’nun ve hücresel immünitenin in vivo ve in

vitro aktivasyonunun değerlendirilmesinde duyarlı bir gösterge olarak kabul

edilmektedir. Virüs enfeksiyonları, otoimmün hastalıklar ve kötü huylu oluşumlar

gibi T-hücre aktivasyonuyla ilişkilendirilen çeşitli patolojilerde serum triptofan

düzeylerinde azalma ve paralelinde kinürenin düzeylerinde artma bildirilmiştir. Bu

durumun IDO aktivasyonundan kaynaklandığı ileri sürülmektedir (17). Triptofan

veya kinürenin konsantrasyonunun değerlendirilmesinin yanı sıra, IDO

aktivasyonunu yansıtan Kyn/Trp oranının da hesaplanması, triptofan yıkımının

değerlendirilmesi için daha uygundur (11-17).

3

Konjuge olmayan pteridinler, birçok biyokimyasal yolakta rolü olan klinik ve

toksikolojik açıdan önemli bileşiklerdir. Neopterin, triptofan, kinürenin ve/veya IDO

aktivitesinin değerlendirilmesi klinikte tanı, tedavi ve prognozda önemli markörler

olarak kullanılmakta, birçok toksisite mekanizmasına açıklık getirebilmekte veya

katkıda bulunabilmektedir (15).

Virüs enfeksiyonları başta olmak üzere patojenezinde T-lenfosit

aktivasyonuna neden olan durumlar neopterin profilini değiştirdiğinden dolayı, kan

bankalarında donöre hepatit B yüzey antijeni (HBsAg), alanin aminotransferaz

(ALT), kardiyolipin, HIV-1’e karşı antijen taraması ve Treponema pallidum

hemaglütinasyon testi (TPHA) yapılmasının yanı sıra, bu rutin protokole neopterin

taramasının da eklenmesi önerilmektedir. Kanın güvenliğinin izlenmesi için

enfeksiyon hastalıklarına ait göstergelerin ve kan bankalarının takip edilmesini

sağlayan kapsamlı bir yapılanma gereklidir. Kan stoklarının güvenliğinin izlenmesi

ve yeni tarama testlerinin potansiyel etkisinin değerlendirilmesi için transfüzyonla

bulaşan enfeksiyonlara ait risk doğru tahmin edilebilmelidir. Transfüzyonla bulaşan

enfeksiyonların saptanması, takibi için yeterli bir hemovijilans sistemine ve kalite

kontrol uygulamalarına ihtiyaç vardır. Ülkemizde transfüzyonla bulaşan

enfeksiyonlarla ilgili çalışmalar kısıtlı sayıdadır (18).

Neopterin, enfeksiyonlar sırasında özgül antikorlardan daha önce ve hızlı

oluşmaktadır. Viral bulaştan hemen sonra inkübasyon periyodu sona ermeden

neopterin düzeyi artmaya başlar. Klinik semptomların ortaya çıktığı dönemde

yüksekliğin devam ettiği ve hastalığın son döneminde hızlı bir düşme ile normale

döndüğü saptanmıştır (19). Neopterinin bu kinetiği, antikor oluşmadan önceki

dönemde donörlerin veya asemptomatik enfeksiyon göstermekte olan enfekte

donörlerin saptanmasına olanak tanıyarak, kan bankacılığında çok büyük bir önem

kazanmıştır (20). Kan bağışında bulunan seronegatif donörlerin pencere döneminde

olma olasılığı gibi nedenlerden dolayı, kan donörlerinde neopterin düzeylerinin

taranması ile kan transfüzyonlarının güvenilirliği artırılacaktır.

4

Bu çalışma kapsamında, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Erişkin

Hastanesi Kan Merkezi’ne başvuran erişkin bireylerde neopterin, triptofan ve

kinürenin düzeylerinin belirlenmesi ile, ülkemizde kan donörlerinin güvenirliliği

konusunda ilk adımların atılması ve çalışmaya katılan kan donörleri arasından,

yüksek neopterin konsantrasyonuna sahip olanların kan merkezine ivedilikle

bildirilmesi, katılımcılarda saptanan neopterin konsantrasyonlarının, triptofan yıkımı

ve ilişkili parametre sonuçları ile doğrulanması amaçlanmıştır.

Serum triptofan ve kinürenin düzeyleri sırası ile floresans ve UV (ultraviyole)

dedektörleri kullanılarak ters-faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi (YPSK) ile

eş zamanlı ölçülmüştür. Serum neopterin düzeyleri ise ticari olarak temin edilen

enzim bağlı immünoassay (ELISA) ile belirlenmiştir.

5

2. GENEL BİLGİLER

2. 1. İmmün Sistem

İmmün sistem organizmayı, virüs, bakteri, mantar gibi yabancı

organizmalara, neoplazma gibi yabancı hücrelere ve diğer yabancı

maddelere/bileşiklere karşı korumak üzere uyum içinde ve düzenli bir şekilde çalışan

hücre (immünosit), hücre ürünleri, doku ve organlardan meydana gelen karmaşık ve

dinamik bir sistemdir. İçerdiği koruma mekanizmalarıyla organizmanın her yerine

yayılan bu sistem kendinden olmayan yabancı bileşeni, antijeni tanımak ve vücuttan

yok etmek üzere düzenlenmiştir. Bu düzen farklı düzeylerde görev yapan sinyallerle

sağlanır (21-25).

İmmün sistem bileşenleri, birbirinden bağımsız ancak, birbiriyle uyumlu

hareket eder. Bu sistem esas olarak kemik iliği, timus, dalak, karaciğer, lenf

düğümleri ve bu organlarda bulunan lenfositler, tek çekirdekli veya polimorf fagosit

hücreler, bağ dokusu histiyositleri, seröz sıvı ve alveol makrofajları, sinir sistemi

mikrogliaları, Langerhans ve Kupffer hücrelerinden oluşur (24-27).

2. 2. İmmün Yanıt

Yeterli bir immün yanıt için immünositler ve salgılanan ürünler bir şebeke

gibi çalışırlar. Sinir ve nöroendokrin gibi sistemlerle etkileşmeler de immün yanıtın

oluşmasına katkıda bulunur. Uygun bir immün yanıt, gerekli sitokinlerin salınımı ile

gerçekleşir. Bunun için B lenfositlerinin yabancı antijeni etkisizleştirebilecek

antikorları oluşturması, makrofajların antijeni fagosite edebilmesi ve T lenfositlerine

sunumu, lenfokin ile aktive öldürücü hücrelerin, doğal öldürücü hücrelerin ve T

lenfositlerinin yabancı hücreyi ortadan kaldırmak için organize olması gereklidir

(22).

İmmün yanıtın özelliği özgüllüğüdür ve bu özgüllük hücre yüzeyindeki

genetik olarak belirlenen reseptörlerle sağlanır. Bu reseptörler antijen yüzeyindeki

6

konfigürasyonlara yapısal tamamlayıcılık gösterirler. Vücutta antijenik bir sataşma

olduğu zaman T ve B lenfositlerinin alt grupları klonal bölünmeye uğrarlar ve bu

bölünmeyi takiben blast hücreleri de klonlarına bölünür. Bir kısım T ve B hücreleri,

antijen ile yeniden temas durumunda reaksiyon oluşturabilen uzun ömürlü bellek

hücrelerine dönüşür (23).

İmmün yanıtın aktivasyonu, düzenlenmesi ve kontrolü, uyumlu hücre-hücre

iletişimlerine bağlıdır. Bu iletişimler ya doğrudan hücrelerin teması yada lokal

mediyatörler aracılığı ile olur (22, 23).

İmmün sistem kimyasal madde, ilaç veya bunların metabolitleriyle reaksiyona

girebilir. Etkileşim sonucu ya baskılanır (immünosüpresyon) veya artabilir

(immunopotansiyalizasyon). İmmün sistemin baskılanması sonucu organizmanın

fırsatçı viral, fungal veya bakteriyel patojenlere karşı direnci azalabilir veya kanser

gelişimine duyarlılık artabilir. İmmunosupresif kemoterapi veya radyasyon tedavisi

gören hastalarda bazı kanser türlerinin görülme sıklığının yüksek olduğu

bildirilmektedir (21, 28, 29).

İmmün yanıt daima iki bileşenden oluşur: Patojen veya yabancının tanınması

ve uzaklaştırılması. Bunlar, ya doğal ya da kazanılmış immün yanıtla gerçekleştirilir.

Her iki yol da kompleman, sitokin gibi çözünür mediyatörler (aracılar) ile

gerçekleşen lökosit aktivasyonuna dayanır. İmmün sistemin çoğu hücresi, farklı

sitokinlerin etkisi altında hem kendini yenileyebilme hem de diğer kan hücrelerine

farklılaşabilme yeteneğine sahip olan pluripotent kök hücrelerinden kaynaklanır (30).

2. 3. İmmün Sistemde Görevli Hücreler

Omurgalıların immün sisteminde, kan ve dokularda bulunan üç ayrı hücre

grubu görev yapmaktadır. Bunlar; lenfositler, monositler ve polimorf nükleer

granülositlerdir. Bu hücrelerin bir kısmı antijen özelliğindeki molekülleri fagosite

eder. Diğer bir kısmı ise antijen uyarımıyla farklılaşarak onlara karşı immün yanıt

ürünleri oluşturur ve antijenleri yok eder (26).

7

Kemik iliğinde yapılan hücrelerin lenfoid serisinden lenfositler, miyeloid

serisinden ise fagositik hücreler gelişmektedir. Yerleşim bölgeleri ve işlevlerine göre

lenfositler üç büyük grupta toplanır; yüzeylerinde antijeni tanıyan reseptörleri

bulunan ve immün yanıt ürünlerinin yapımından sorumlu olan T ve B lenfositler ile

diğer olgun hücrelerdir. T lenfositler timus kontrolünde olgunlaşırken B lenfositler

ise ‘Fabricus kesesine’ eşdeğer organların kontrolünde olgunlaşır. B lenfositlerin

farklılaşmasıyla plazmositler gelişir. İmmün yanıtta görevli olan diğer bir hücre

grubu da, T veya B lenfositlerine veya makrofajlara özgü yüzey işaretlerini

taşımayan, hücresel veya hümoral immünite sınıfına sokulamayan, null hücreler

olarak adlandırılan öldürücü hücreler ve doğal öldürücü hücreleridir (21, 25).

Nötrofiller, kanda en fazla bulunan granülositlerdir. Belirgin granülleri ve

lizozomları vardır. Etkili fagositoz kapasiteleri ile dokuları temizlerler. Bazofiller,

dokulardaki mast hücrelerinin kandan gelen karşılıklarıdır. Mast hücreleri ise doku

ve mukoza kaynaklı olarak iki çeşittir. Bağ dokusundakiler, histamin ve heparin

içerir; uyarıyla beraber prostaglandin D2 sentezler. Mukozal mast hücreleri ise T

hücrelerince sitokinler aracılığıyla aktive olduktan sonra senteze başladığından, az

oranda histamin içerir ve uyarıldıklarında genellikle lökotrienleri salgılar (28, 29).

2. 3. 1. Lenfositler

Kemik iliğinden kaynaklanan bazı hücreler timusa giderek timik hormonların

ve timus çevresinin etkisi ile olgunlaşarak T lenfositleri oluştururlar. Bu hücrelere

timustan türeyen hücreler de denir. T lenfositler, kana geçip dolaşıma giren

lenfositlerin %70’ini oluşturur; bazıları ise dalağa ve lenf bezlerinin timusa bağlı

alanlarında yerleşir. T lenfositlerinin ömürleri 15-20 yıldır. Efektör T hücrelerinin,

antijen tanıma, hücre tahribi, lenfokin salınımı gibi görevleri vardır. T lenfositleri

fungal ve viral enfeksiyonlarda, tümör hücrelerinin öldürülmesinde, organ

nakillerinde, otoimmünitede etkilidirler (22, 23).

8

B lenfositleri hümoral immünitenin efektör hücreleri olup, lenfositlerin

%30’unu oluştururlar. B lenfositlerinin ömürleri ise 15 gündür (31).

2. 3. 2. Monosit ve Makrofajlar

Monosit ve makrofajlar, kemik iliği pluripotent kök hücresinden kaynak alır;

kemik iliğinden salındıktan sonra kan ve dokulara geçer. Fagositik hücreler olan

makrofajlar, sitoplazmik hidrolitik enzimlerce zengindirler. Pek çok immün olayı

düzenlerler; akut ve kronik inflamasyonlarda, pirojenik reaksiyonlarda, antijeni T ve

B lenfositlerine tanıtmada önemli rolleri vardır. Makrofajlar membranları üzerindeki

Fc reseptörleri ile antikorla kaplanmış hücre veya organizmayı tanır. Ayrıca

makrofajlar; koagülasyon ve pıhtılaşma olayını düzenleyerek, fagositoz ve enzim

salgılanması ile ölü dokunun parçalanmasını, granülosit yapımının düzenlenmesini,

yeni damar oluşumunu, endotelyal hücrelerin ve fibroblastların düzenlenmesini

sağlayarak yara iyileşmesinde yardımcı rol oynarlar (23).

Antijeni ilk karşılayan hücreler olan makrofajlar, membranları altındaki aktin-

miyozin flamanları ile yabancı maddeyi yakalayarak özgül olmayan bir şekilde

yabancı maddeyi fagosite ederek öldürürler (26).

2. 3. 3. Antijen Sunucu Hücreler

Antijen sunucu hücreler (Antigen Presenting Cell/s, APC); Langerhans

hücreleri, B lenfositler, monositler ve makrofajlar ile retiküler dentritik hücrelerinden

oluşan immünostimülatör kapasiteli heterojen bir gruptur. Kemik iliğinde yapılan bu

hücreler deri, lenf düğümleri, dalak ve timusta bulunur. Bazıları yardımcı T (T

helper/Th) lenfositlere antijen sunar, bazıları ise diğer lökositlerle ilişki kurar (26).

9

2. 3. 4. İnterferonlar

İnterferonlar, virüslere karşı hücrede koruyucu olarak gelişen protein

yapısındaki maddelerdir. Antikorlarla etkisizleştirilemeyen bu proteinler, virüslerin

hücre içinde çoğalmasını önler ve bu tür organizmalara karşı en hızlı üretilen en

önemli savunma mekanizmasıdır. İnterferonlar, ancak hücrelerin bir virüs ya da

başka yabancı bir madde tarafından uyarılması sonucu üretilir. Bu nedenle interferon

yapımı, hücrenin yabancı nükleik asit alış-verişine karşı bir çeşit silahlanma olayıdır

(32).

Üç tip interferon tanımlanmıştır. Lökositler tarafından salınan 18-20 kD

molekül ağırlığında interferon alfa (INF-α), fıbroblastlar tarafından salgılanan 23 kD

molekül ağırlığında interferon beta (INF-β) ve T lenfositleri tarafından yapılan 20-25

kD molekül ağırlığında olan INF-γ’dır. İnterferon-γ, immün interferon olup

makrofajları, doğal öldürücü hücreleri, öldürücü T hücreleri ve B lenfositleri aktive

eden bir immünomodülatördür (33).

İnterferon-α, antiproliferatif ve antiviral özellikte olup, immün sistemin

dengelenmesinde doğal öldürücü hücreler ile birlikte önemli rol oynar. INF-β,

düzenli bir bağışıklık sitokinidir. Bu önemli antiviral sitokin, doğal öldürücü

hücrelerden salgılanan bir üründür. INF-γ ise INF-α’dan birkaç yıl sonra

tanımlanmış, mitojen stimülasyonu sonrasında üretilen bir sitokindir (24-27, 33, 34).

2. 3. 5. Kompleman Proteinleri

Konakçı savunmasında immün yanıtın önemli bir kolunu kompleman

proteinleri oluşturur. Komplemanlar, karaciğerde yapılan, doğal immünitede önemli

rolü olan 30 kadar protein grubudur. En az 9 ana proteinden oluşurlar. Kompleman

proteinleri, çeşitli patojenleri tanıyarak bunları etkisizleştirir. Hücre lizisi,

opsonizasyon, kemotaksi, inflamasyon mediyatörlerinin salgılanmasını uyarma ve

antijen-antikor nötralizasyonunda önemli görevleri vardır. Kompleman proteinleri,

bazofillerden, mast hücrelerinden histamin gibi vazoaktif aminlerin salgılanmasını

10

artırırlar. Vasküler permeabiliteyi artırarak, alyuvarların dolaşımdan dokuya

girmesini sağlarlar. Bunun yanı sıra kemotaktik aktiviteleri de vardır. Kompleman

proteinleri birbirlerini enzimatik olarak aktive edebilme yeteneğindedirler ve bu

aktivasyon ya antijen-antikor kompleksi ile C1’den ya da probertin, faktör B ve C

gibi bazı aracı proteinler ile başlar (26).

2. 4. Pteridinler

Lepidoptera (pul kanatlılar, kelebekler) kanatlarından izole edilen

pigmentlerin yapılarının aydınlatılmasından sonra, bu pigmentlere kanat anlamındaki

Yunan kökenli pteron kelimesinden esinlenerek ‘pteridin’ ismi verilmiştir. Pteridin,

pirazin ile pirimidin halkasının birleşmesinden oluşmuş pirazino-(2,3-d)-pirimidin

bisiklik azotlu halka sistemini ifade eder (Şekil 2. 1), (4, 35-37).

Bu bileşiklerin kimyasal yapılarını aydınlatma çalışmaları, Purrmann’ın

böcek pigmenti olan ksantopterin, izoksantopterin ve lökopterinin bisiklik nitrojenli

halka sistemi pirazino-(2,3-d)-pirimidin yapısında olduğunu bulana kadar devam

etmiştir. Pteridinler; pterinler (2-amino-4-okso-3,4-dihidropteridin türevleri) ve

lumazinler (2,4-diokso-1,2,3,4-tetrahidropteridin) olmak üzere sınıflandırılabilirler

(38).

Şekil 2. 1. Pteridin ve pterinin kimyasal yapısı (37).

Neopterin ve biopterin gibi bu ana bileşiğin küçük substitüent taşıyan

türevleri ‘konjuge olmayan pteridinler’ (Şekil 2. 2); folik asit, riboflavin ve

Pteridin Pterin

(2-Amino-4-oksopteridin) (Pirazino[2,3-d]pirimidin)

11

metanopterin gibi daha büyük grup taşıyan türevleri ise ‘konjuge pteridinler’ olarak

adlandırılır (4, 39).

Şekil 2. 2. Konjuge olmayan pteridinlerin kimyasal yapıları (35).

2. 5. Neopterin

2. 5. 1. Tarihçesi, Kimyasal Yapısı, Biyosentezi ve Diğer Özellikleri

Neopterin ilk kez 1963 yılında arı larvalarında, işçi arılarda ve arı sütü

içeriğinde keşfedilmiş ve kimyasal yapısı tanımlanmıştır (38). Pteridin grubuna ait

yeni bir molekül olması nedeniyle de “neopterin” (neo: yeni) olarak

isimlendirilmiştir. İnsanda ise ilk kez 1967 yılında idrardan izole edilerek

tanımlanmıştır. 1976 yılında atipik fenilketonürili çocukların idrarlarında yüksek

konsantrasyonlarda bulunduğu gösterilmiştir (40). 1979 yılında kanser hastalarında

ve viral enfeksiyonu olanlarda, idrarla yüksek neopterin atılımı rapor edilmiş ve

1982-1983’de ilk kez in vitro olarak insan periferal kan mononükleer hücrelerinden

Konjuge Olmayan Pteridinler

12

mitojenik ve alloantijenik uyarıyı takiben sentez edildiği gösterilmiştir (41). 1984

yılında bir in vitro çalışmada INF-γ’nın makrofajlardan büyük miktarlarda neopterin

üretimine yol açığı bildirilmiştir (42). Bütün bu bulgular, neopterinin konak yanıtı

sonucu sentezlendiğininin anlaşılmasını sağlamıştır. Aynı yıllarda, idrar neopterin

düzeyi izlenerek böbrek nakli yapılan hastalarda organ reddi reaksiyonlarının takibi

amacıyla kullanılmıştır. Bugüne dek yapılan yoğun çalışmalar sonunda, neopterinin

biyogösterge olarak klinikteki potansiyel önemi büyük ölçüde aydınlatılmıştır (43).

Neopterin, farklı stereoizomerlere sahiptir; ancak biyolojik sıvılarda bulunan

ve klinik önemi olan formu 6-D-eritro-neopterin (Şekil 2. 3.)’dir. Neopterin, farklı

okside formlarında bulunabilir. Doğada, 7,8-dihidroneopterin formu daha yaygındır

ve tamamen okside form olan aromatik neopterinin, 7,8-dihidroneopterin ile

arasındaki sabit oran yaklaşık 1:2’dir. Neopterin doğal olarak çok kuvvetli floresan

verme özelliğine sahipken, 7,8-dihidroneopterin floresan vermemekte ve daha kararlı

bir özellik taşımaktadır. Neopterin, diğer pteridin türevleri gibi güneş ışığına karşı

oldukça hassas olup, bozulmasına yol açan başka bir fiziksel faktör belirlenmemiştir

(40).

Neopterin, aktive makrofaj/monositler tarafından, guanozin trifosfat

siklohidrolaz-I enziminin yardımıyla guanozin trifosfattan (GTP) sentezlenir (9).

Guanozin trifosfattan oluşan 7,8-dihidroneopterin trifosfat, pteridin biyosentez

yolunun en önemli ara ürünüdür. Bu madde daha sonra konjuge pteridin türevleri ile

konjuge olmayan pteridin türevlerine dönüşmektedir. 7,8-dihidroneopterin trifosfat,

magnezyum bağımlı 6-piruvoil-tetrahidropterin sentetaz tarafından karalı olmayan 6-

piruvoil-tetrahidropterine, bu madde de 5, 6, 7, 8-tetrahidrobiopterine (BH4) çevrilir

(9, 44).

Bütün insan hücreleri, GTP’tan BH4 oluşturur. Ancak, 6-piruvoil-

tetrahidropterin sentetaza sahip olmayan monosit/makrofaj hücrelerinde neopterin,

7,8-dihidroneopterin trifosfatın hidrolizi ve oksidasyonu sonucu oluşur (44).

13

Şekil 2. 3. Neopterinin kimyasal yapısı (45).

Şekil 2. 4’te konjuge olmayan pteridinlerin biyosentezi ve katabolizması

gösterilmiştir. Guanozin trifosfat siklohidrolaz-I enziminin aktivitesi, büyük ölçüde

INF-γ, daha az oranda da INF-α tarafından artırılmaktadır. Neopterin üretiminin

ayrıca lipopolisakkaritler tarafından da indüklendiği belirlenmiştir (44).

Şekil 2. 4. Konjuge olmayan pteridinlerin biyosentezi ve katabolizması (46).

XOD: Ksantin oksidaz, GTPCHI: Guanozin trifosfat siklohidrolaz I, SR: Serbest radikal, DHFR:

Dihidrofolat redüktaz, PTPS: 6-pürivoyiltetrahidropterin sentetaz, DHPR: Dihidropterin redüktaz,

PTPR: 6-pürivoyiltetrahidropterin redüktaz, NADH: Nikotinamid adenin dinükleotid redükte, NAD:

Nikotinamid adenin dinükleotid, TDO: Triptofan (2,3)-dioksijenaz, IDO: İndolamin 2,3-dioksijenaz,

TPH: Triptofan hidroksilaz, TH: Tirozin hidroksilaz, PAH: Fenilalanin 4-hidroksilaz, L-DOPA: 3,4-

Dihidroksi-L-fenilalanin, 5-HIAA: 5-hidroksiindolasetik asit, HVA: Homovanilik asit.

14

Yapılan çalışmalarda, maymunlarda GTP siklohidrolaz-I enziminin en yüksek

düzeylerinin, pineal bezler, ince barsak, karaciğer ve böbrekte olduğu bildirilmiştir.

Aynı türde neopterinin en yüksek konsantrasyonlarının ise karaciğer, dalak, pineal

bezler, böbrek ve akciğerde saptandığı bulunmuştur (47). Neopterin sentezi Şekil 2.

5’te verilmiştir.

Neopterin biyosentezi, primat ve insanlar için özgül olup, ölçülebilir

konsantrasyonlar sadece bu türlerde mevcuttur (40). Köpeklerde eser düzeyde

bulunabilen neopterin, fare, kobay ve hamsterlerde saptanamamaktadır. Fare

monosit/makrofaj ve fibroblastları konstitütif olarak (denetim mekanizmasına bağlı

olmayan) pteridin biyosentezi yaparlar, ancak insan hücrelerinin aksine neopterin

oluşturmazlar. Fare fibroblastlarında GTP siklohidrolaz-I enziminin aktivitesi ve

biopterin üretimi, insan hücrelerinin aksine INF-γ ile değil tümör nekroze edici

faktör-α (TNF-α) ile stimüle edilmektedir (3).

Şekil 2. 5. Neopterin sentezi (11, 38) NADP: Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat, NADPH: Nikotinamid adenin dinükleotid

fosfat redükte, DHFR: Dihidrofolat redüktaz, DHPR: Dihidropterin redüktaz, NAD:

Nikotinamid adenin dinükleotid, NADH: Nikotinamid adenin dinükleotid redükte, PCD:

Pterin karbonilamin dehidrojenaz PAH: Fenilalanin 4-hidroksilaz, TH: Tirozin

hidroksilaz, TPH: Triptofan hidroksilaz, NOS: Nitrik oksit sentaz, DOPA: 3,4-

Dihidroksi-L-fenilalanin, NO: Nitrik oksit.

15

2. 5. 2. Hücresel İmmün Sistem Aktivasyonu ve Neopterin

Monosit/makrofajlarca neopterin oluşturulmasına rağmen henüz ne

neopterinin ne de 7,8-dihidroneopterinin doğrudan herhangi bir biyokimyasal veya

fizyolojik işlevi tanımlanmamıştır. Hücre kültürüne neopterin eklenmesinin

lipopolisakkarit ile stimüle edilmiş monositlerden TNF-α salınımını artırdığı

gözlenmiştir. Neopterinin immün aktivasyon sonrasında sitokin düzeylerini

etkilemesi önemli olmakla birlikte, başka bağımsız çalışmalar tarafından

desteklenmemiştir (40).

İnterferon-γ makrofajlarda GTP siklohidrolaz I aktivitesinin en güçlü

indükleyicisi olup, T hücreleri ve doğal öldürücü hücreler tarafından oluşur. Şekil 2.

6’da da görüldüğü üzere hücresel immün yanıt sırasında aktive T lenfositler

tarafından INF-γ salınımı ve neopterin üretimi uyarılır. Neopterin konsantrasyonu

INF-γ aktivitesini yansıttığı için sistemik immün aktivasyonun göstergesi olduğu,

dolayısıyla da INF-γ’yı oluşturan T lenfositleri ve doğal öldürücü hücrelerinin de

aktivitesini yansıttığı düşünülmektedir. 7,8-dihidroneopterin/neopterin oranı sabittir.

Bu nedenle neopterin konsantrasyonu in vivo GTP siklohidrolaz I aktivitesinin,

dolayısıyla da makrofaj aktivasyonunun değerlendirilmesinde kullanılmaktadır.

Endotel hücreler, B-lenfositler veya böbrek hücreleri gibi hücre tiplerinde de

neopterin oluşumu gösterilmiştir; ancak monosit/makrofajlara oranla oldukça

düşüktür (48).

Şekil 2. 6. Hücresel immün yanıt sırasında aktive T lenfositler tarafından INF-γ

salınımı ve makrofajlar tarafından neopterin üretiminin uyarılması (49).

Th hücresi

Makrofaj

Tümör nekroze edici faktör-α Reaktif oksijen bileşikleri

16

2. 5. 3. Neopterin ve Serbest Radikaller

Makrofajların sitotoksik mekanizmaları ve neopterin üretimi arasında olası

bir ilişkinin varlığını ortaya koyan bazı çalışmalar yapılmıştır (50-56). Neopterin

üretimi, reaktif oksijen bileşiklerini serbestleştirmek için, monosit/makrofajların

kapasitesi ile yakından ilişkilidir. Bu nedenle neopterin üretimi, immünolojik olarak

uyarılmış oksidatif stresin büyüklüğünün dolaylı bir ölçümü olarak yorumlanabilir.

Hatta neopterin türevleri, oksidan maddelerin etkilerini düzenleyebilirler.

Kemiluminesans çalışmalar, hidrojen peroksit (H2O2), kloramin, peroksinitrit

(ONOO˙) gibi çeşitli reaktif maddelerin etkilerini neopterinin güçlü bir şekilde

artırdığını göstermektedir (50). Bu bulgular, neopterin türevlerinin üretiminin yeni

bir önemini göstermektedir: Neopterin, aktive makrofajların sitotoksik etki

fonksiyonlarının endojen düzenleyicisi olarak etki etmektedir (51).

Kojima ve diğerleri, neopterin ve biopterinin serbest oksijen radikali

oluşumunu makrofajlar üzerinden azaltırken, tetrahidroneopterinin doğrudan oksijen

radikali ile etkileşerek antioksidan etki gösterdiğini bildirmişlerdir. Yine aynı

çalışmada, bu üç pteridin türevi, ‘süperoksit dismutaz benzeri’ olarak

adlandırılmıştır. Makrofajların, ortamda aşırı miktarda radikal bulunduğunda

kendilerini pteridin türevleri ile koruyabildikleri rapor edilmiştir (52). Ancak

bilindiği üzere makrofajlar, sitokinlerin uyarısı ile yüksek miktarda hidrojen peroksit,

süperoksit (O2˙) ve hidroksil radikali (OH˙) gibi reaktif oksijen metabolitlerini de

üretir. Dihidroneopterin özellikle iyonik demir varlığında oksijen radikallerinin

oluşmasını potansiyelize etmektedir. Neopterinin aynı zamanda reaktif oksijen

bileşiklerinin oksidatif potansiyelini artırarak pro-oksidatif etki gösterdiği de

belirtilmiştir (53, 54).

Neopterinin Th-1 hücrelerinde hücre içi kalsiyum düzeylerini artırdığı ve

reaktif ürünlerin üretiminde doğrudan bir rolü olduğu öne sürülmektedir (55).

İndirgenmemiş bir pteridin molekülü olan neopterin, serbest radikaller için bir

“süpürücü” olmamakla birlikte, ksantin oksidazın kompetitif olmayan bir inhibitörü

olarak görev yapmaktadır. Diğer taraftan hidrojen peroksit ile kloraminin etkilerini

17

artırarak, onların mikroorganizmalar üzerindeki toksik etkilerine katkıda

bulunmaktadır (56). Neopterinin H2O2, hipokloröz asit (HOCl) ve peroksinitritler

gibi güçlü saldırgan moleküllerin düzeylerini artırması, “aktive makrofajların

sitotoksik etkilerini düzenleyen endojen bir düzenleyici” olarak tanımlanmasına da

neden olmuştur (51).

2. 5. 4. Neopterinin Fizyolojik İşlevi

7,8-dihidroneopterin trifosfat, BH4 prekürsörüdür. BH4, çeşitli

monooksijenazlar için kofaktör rolü oynayarak katekolamin ve serotonin sentezinde,

bir grup membran lipitinin oksidasyonunda görev almaktadır. 7,8-dihidroneopterin

mikroorganizmalarda ise folatların prekürsörüdür. Triptofanın yıkımı ile insan

makrofajlarından INF-γ indüksiyonu ile neopterin salınması arasında ilişki

bulunmaktadır. Neopterinin vücuttaki biyokimyasal ve fizyolojik rolü henüz tam

olarak açıklanamamakla birlikte bazı fizyolojik fonksiyonları Şekil 2. 7’de

verilmiştir (40).

Şekil 2. 7. Neopterinin fizyolojik fonksiyonları (42).

TNF-α: Tümör nekroze edici faktör-α, IL-2: İnterlökin-2, IFN-γ: İnterferon-γ, CSF: Serebrospinal

sıvı, NO: Nitrik oksit.

Siklik guanozin monofosfat

18

Vücut sıvılarında lokal makrofaj aktivasyonunun bir göstergesi olan

neopterin, romatoid artrit hastalarının sinoviyal sıvısında, aseptik meningoensefalit

ve Parkinson hastalarının beyin omurilik sıvısında (BOS), pankreatik sıvıda ve

hamilelerin amniyotik sıvısında yüksek düzeylerde saptanmıştır (40).

2. 5. 5. Neopterin Düzeylerine Yaş, Cinsiyet, Hormonal Durum Etkileri

ve Neopterin Biyoritmi

Sağlıklı bireylerdeki ortalama itrahı (1,58 µmol/1,2 L/gün) ve ortalama serum

düzeylerinden (4,9 nmol/L) hareketle, neopterin klerensi 225 ml/dk olarak

hesaplanmıştır (57).

Diğer vücut sıvıları ile karşılaştırıldığında, idrarın gün içi aktiviteye göre su

içeriğinin değişmesi gibi özel bir durumu vardır. İdrar neopterin düzeyleri bu nedenle

kreatinine oranlanarak verilir. Erkeklerin kadınlara göre daha yüksek kreatinine sahip

olması nedeniyle, neopterin/kreatinin oranının yaş ve cinsiyetle değişmesi

beklenebilir. Bu açıdan bakıldığında yetişkin kadınların, yetişkin erkeklere göre daha

yüksek neopterin/kreatinin oranına sahip olduğu, çocukların ise yetişkinlere göre

daha yüksek oranda neopterin itrah ettiği bildirilmektedir. Neopterin itrahının

sirkadyen ritmi incelendiğinde; idrar ile itrahın gece geç saatte ve sabah erken saatte

arttığı saptanmış ve neopterin düzeylerinin sabah ilk alınan idrar örneğinde

belirlenmesinin uygun olacağı belirtilmiştir (4, 57, 58).

Renal fonksiyonlardaki herhangi bir değişikliğin, neopterin düzeylerinin

değişmesine neden olabileceği bildirilmiştir. Bu gibi durumlarda, hücresel immün

yanıtın izlenmesinde serum neopterin/kreatinin oranının, tek başına serum neopterin

konsantrasyonlarından daha anlamlı olacağı düşünülmektedir (49, 57).

Farklı yaş ve cinsiyetten sınırlı sayıda gönüllüde yapılan çalışmalarda serum

neopterin düzeylerinin yaşa göre değişim gösterdiği fakat cinsiyete göre bir fark

göstermediği bildirilmiştir (Tablo 2. 1), (4).

19

Tablo 2. 1. Sağlıklı bireylerde serum neopterin düzeyleri (59).

Yaş (yıl) Cinsiyet n Neopterin (SS)

(nmol/L)

Üst sınır

0-18 K, E 263 6,78 (0,22) 13,5

19-75 K, E 359 5,34 (0,14) 8,7

>75 K, E 40 9,67 (0,79) 19,0

* K, kadın; E, erkek; n = denek sayısı; SS, standart sapma

Herhangi bir hücresel immün aktivasyon söz konusu değilse, idrar neopterin

itrahının yıl içi değişimi, çok az değişkenlik göstermekte ve neopterin düzeyleri

genellikle normal sınırlarda kalmaktadır (60).

Neopterinin infradyan ritmi menstrüel siklusta neopterin düzeyleri ile

değerlendirilmiştir. Tam bir menstrüel dönem boyunca serum neopterin düzeyleri

izlenmiştir. Bu dönem boyunca serum neopterin düzeylerinin normal sınırlar içinde

kaldığı, menstrüel siklusun son günlerinde neopterinin en yüksek düzeye ulaştığı,

fakat bu değerlerin sağlıklı bireyler için kabul edilen normal sınırlar içerisinde

kaldığı bildirilmiştir (4).

Uzun süreli fiziksel egzersiz yapıldığında immün durumu gösteren akut faz

yanıtta ve immün sistem aktivasyonunda değişiklikler görülür. Koşma gibi kas

aktivasyonu, iskelet kasında inflamatuar yanıtı indükleyen mikrotravmaya neden

olur. Bu nedenle, vücut homeostazında çeşitli değişikliklere neden olan fiziksel

egzersizler, neopterin düzeylerini artırma yönündedir. Anksiyete ve stres ise

neopterin düzeylerinde azalmaya neden olur (40, 61, 62).

Normal ve üst limit değerleri yaşa göre degişiklik göstermektedir. Bu nedenle

neopterin konsantrasyonlarının yaş gruplarına göre sınıflandırılması gerekmektedir.

20

Bununla birlikte neopterin için farklı çalışmalarda farklı üst sınırlar belirlenmiştir (4,

6, 59, 63).

Sigaranın etkilerine bağlı olarak neopterin konsantrasyonlarının değişip

değişmediğini inceleyen çalışma sonuçları çelişkilidir. Bazı araştırmacılara göre,

sigara içme ile neopterin düzeyleri arasında hiçbir bağlantı yoktur, bazılarına göre

sigarayı bırakmış veya hiç sigara içmemiş kişilere kıyasla sigara içenlerde daha

düşük neopterin düzeyleri bulunmuştur (64-66).

18-65 yaşları arasında 1156 kan donöründe neopterin düzeylerini etkileyen

demografik özellikler ve laboratuar paramatreleri araştırıldığında, neopterin

düzeylerinin yaşla, arteriyel diastolik kan basıncı ve vücut kütle indeksi ile pozitif

korelasyon gösterdiği, günlük içilen sigara sayısıyla negatif korelasyon gösterdiği

saptanmıştır. Sigara içen bireylerde, içmeyenlere oranla serum neopterin

konsantrasyonunun daha düşük olduğu saptanmıştır. 41 yaş üstü bireylerde neopterin

düzeyleri (ortanca: 6,1 nmol/L), 41 yaş altına (ortanca: 5,5 nmol/L) göre yüksek

bulunmuştur (66).

2. 5. 6. Gebelik Dönemi

Neopterin, gebeliğin son 3 ayında anne serumunda ve amniyotik sıvıda

yükselir (67). Doğuma yakın dönemlerde ise annenin serum neopterin düzeylerinin

yüksek olduğu saptanmıştır. Doğumdan sonraki 2 ay içerisinde ise düzeyler normal

değerlerine dönmektedir (68). Amniyotik sıvıda pteridin konsantrasyonunun yüksek

oluşunun, fetusta pterin metabolizmasının varlığını yansıtabileceği öne sürülmüştür

(60). Herhangi bir komplikasyonu olmayan gebelerde serum neopterin düzeyleri ile

doğum sonrası kordon kanı neopterin konsantrasyonlarını karşılaştırmak üzere yaş

ortalaması 29 yıl olan 541 sağlıklı gebe kadın ile yapılan bir çalışmada, gebeliğin 28.

haftasında neopterin düzeyleri (ortanca: 5,4 nmol/L) ile sağlıklı yeni doğanda kordon

kanı (ortanca: 13,0 nmol/L) neopterin düzeyleri arasında oldukça anlamlı bir ilişkinin

olduğu bulunmuştur (69).

21

2. 5. 7. Bebek ve Çocukluk Dönemi

Yeni doğan-21 yaş arası 156 sağlıklı çocukta yapılan bir çalışmada, yaş

arttıkça serumda belirlenen neopterin düzeyleri (2,8-89,6 nmol/L), kinürenin

düzeyleri (0,6-4,1 µmol/L) ile Kyn/Trp oranlarının (12,8-92,9 mol/mmol) azaldığı

saptanmıştır. Ancak bu azalmalar istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (70). 1

ay-18 yaş arası 105 sağlıklı çocukta yapılan bir başka çalışmada ise yaşla serum

neopterin düzeyleri arasında ilişki olmadığı bulunmuştur. Serum neopterin düzeyleri

doğumdan sonraki dönemlerde sağlıklı çocuklarda cinsiyet ve yaştan bağımsız olarak

11 nmol/L’den düşük bulunmuştur (71). Serum neopterin düzeylerinin 0-18 yaş arası

sağlıklı bireylerde 3,5-13,5 nmol/L iken 19 yaş ve üzeri için 3,7-19,0 nmol/L olarak

belirlenmiştir (67).

12-19 yaşları arasında adolesan grupta yapılan bir çalışmada, bu fizyolojik

dönemde yaşın neopterin düzeylerine anlamlı bir etkisinin olmadığı bildirilmiştir. Bu

grupta ortalama serum neopterin düzeyi 4,42 nmol/L (sınır: 2,2-9,1 nmol/L) olarak

tespit edilmiştir (72).

2. 5. 8. Erişkinler

18-75 yaş arası bireylerin serum neopterin düzeylerinin önemli ölçüde

farklılık göstermediği bildirilmiştir. 18 yaşından genç ve 75 yaşından yaşlı bireylerde

neopterin düzeyleri anlamlı yüksek bulunmuştur (6). Yaş ve neopterin

konsantrasyonu arasında bulunan pozitif korelasyon ise yaşla immün stimülasyonun

arttığı görüşünü desteklemiştir (63). En düşük neopterin düzeylerinin erkeklerde 26-

45, kadınlarda ise 18-35 yaşları arasında bulunduğu belirlenmiştir. Neopterin

düzeyleri daha yaşlı gruplarda, erkeklerde kadınlara kıyasla daha düşük oranda

olmak üzere, biraz artmaktadır (60).

22

2. 5. 9. Neopterin ve Sistemik Hastalıklar

Artmış serum ve/veya idrar neopterin düzeyleri romatoid artrit,

glomerülonefrit, Sjögren sendromu, sistemik lupus eritematoz, diyabet, akut

romatizmal ateş, Crohn hastalığı, ülseratif kolit ve Graves hastalığında, akciğer

kanseri, over kanseri, serviks kanseri, meme kanseri, tiroid kanseri, pankreas

adenokanser, kolon adenokarsinomu ve multipl myelomda da izlenmiştir. Otoimmün

hastalıklarda neopterin makrofaj göçü olan bölgelerde üretilir (9, 38, 73).

Ateroskleroz gibi bazı kalp hastalıklarında da neopterin düzeyi artar (73, 74).

Hücresel immün cevabı tetikleyen başta virüs enfeksiyonları olmak üzere bakteriyel

ve paraziter enfeksiyonlarda da vücut sıvılarında saptanan neopterin düzeylerinde

önemli oranda artış görülmektedir (40, 73).

Böbrek hastalıklarında, hemodiyalize giren hastalarda serum neopterin

düzeyleri düşmektedir (75). Steroid bağımlı hastalarda da, idrar neopterin düzeyleri

belirgin olarak düşüktür (76). Birçok hastalıkta neopterin düzeylerinin arttığı

saptanmıştır (Tablo 2. 2), (49, 77-79).

Tablo 2. 2. Artmış neopterin düzeylerinin saptandığı hastalıklar

Otoimmün hastalıklar −İnflamatuar bağırsak hastalıkları Ülseratif kolit Crohn hastalığı Gluten enteropatisi −Romatoid artrit −Sistemik lupus eritematoz −Tip-1 diyabet −Glomerülonefrit −Sjögren sendromu −Graves hastalığı −Behçet hastalığı −Ailesel Akdeniz ateşi −Sarkoidoz −Multipl skleroz −Kalp hastalıkları −Otoimmün tiroid

Kötü huylu oluşumlar (Malign hastalıklar) −Jinekolojik tümörler Over kanseri Uterus serviks kanseri Uterus sarkomaları Uterus miyomları −Meme kanseri −Genitoüriner sistem tümörleri Prostat kanseri Mesane kanseri Testis tümörleri Böbrek kanserleri Pankreatit ve pankreas kanseri - Hematolojik tümörler Hodgkin lenfoma Hodgkin olmayan lenfoma

23

Renal Patolojiler −Diyabetik nefropati −Nefrotik sendrom −Glomerülonefrit

Diğer hastalıklar −Down sendromu −Hipernefroma −Şizofreni −Atipik fenilketonüri

Lösemi Kan kanseri −Hepatoselüler karsinoma Karaciğer sirozu −Mide kanseri −Baş ve boyun bölgesi kanserleri Gırtlak, ağız içi, yutak, Paranazal sinüs kanserleri −Malign melanom −Akciğer kanseri Solid organ transplantasyonu Kemik iliği transplantasyonu Gref Versus Host hastalığı

Enfeksiyon hastalıkları −Viral enfeksiyonlar Akut viral hepatit HIV Kızamıkçık Su çiçeği Sitomegalovirüs enfeksiyonu Enfeksiyöz mononükleoz Sepsis ve travma −İntraselüler parazit enfeksiyonları

Malarya Sistozomiyaz −İntraselüler bakteri enfeksiyonları Akciğer tüberkülozu Pnömoni Lepra Melioidoz Lyme hastalığı

2. 5. 10. Neopterinin Klinik Önemi ve Biyogösterge Olarak Kullanmı

Bilindiği gibi hücresel immün yanıt; Th1 lenfositlerinin aktivasyonuyla INF-γ

ve interlökin (IL)-2 salgılanması ve Th-2 lenfositlerinin aktivasyonuyla da

immünoglobulin üretimine yol açan IL-4, 5 ve 10’un salgılanmasıyla ortaya

çıkmaktadır. Dolayısıyla neopterin konsantrasyonlarında bir artışın olması, Th-1 tipi

hücresel immün yanıtın oluştuğunun en önemli göstergesidir (9, 73, 80).

Neopterin sentezi, T hücre proliferasyonundan 3 gün önce başlayarak en fazla

düzeye ulaşmaktadır. Enfeksiyon durumunda, özgül antikorların sentezlenmesinden

yaklaşık 1 hafta önce neopterin konsantrasyonu yüksek düzeylerdedir. Bu nedenle

neopterinin en önemli klinik yararı, inflamasyon varlığının erken bir belirleyicisi

olmasıdır (77).

24

Artmış neopterin konsantrasyonları yoğun monosit/makrofaj aktivitesinin

görüldüğü patolojilerin izlenmesine imkan sağlar. Vücut sıvılarında neopterin

ölçümü hücresel immün yanıtın mevcut durumu hakkında bilgi sağlar ve sıklıkla

hastalığın gelişimini öngörmeye yardımcı olur (4, 9, 10, 48, 77, 81).

Kabakulak ve suçiçeği gibi viral enfeksiyonlarda neopterin düzeylerinin

arttığı bildirilmiştir. Suçiçeği hastalığında idrar neopterin düzeyleri izlendiğinde

neopterin düzeylerinin kuluçka döneminde yükseldiği ve döküntülerle birlikte ani bir

artış gösterdiği gözlenmektedir. Döküntülerin sonlanmasıyla neopterin düzeylerinin

ani bir düşüş gösterdiği ve birkaç gün içinde normal düzeylere indiği saptanmıştır.

Benzer şekilde kızamık geçiren çocuklarda yapılan bir çalışmada belirtiler ortaya

çıktıktan sonra, serum neopterin düzeylerinin sağlıklı çocuklar ve farklı enfeksiyon

şikayetiyle hastaneye başvuran çocuklardan daha yüksek olduğu gözlenmiştir.

İnterferon düzeylerinin döküntüden sonra 1-2 gün içinde azalırken, neopterin

düzeylerinin döküntüden sonra 1-3 gün en fazla düzeyde olduğu ve 10 gün kadar

yüksek seyrettiği belirtilmiştir. Canlı kabakulak-kızamık aşısı yapılan daha önce

aşılanmamış veya hastalık geçirmemiş ve virüsle ilk defa karşılaşan çocuklarda

neopterin itrahı viral enfeksiyonda gözlendiği gibi seyreder. Neopterin düzeylerinin

kuluçka döneminde artmaya başladığı ve virüse özgül antikorların kanda

tanımlanmaya başlandığı zaman ise en fazla konsantrasyona ulaştığı gözlenmiştir.

Dolaşımdaki antikor sayısı arttıkça neopterin düzeyleri azalmaya başlamaktadır (4,

82).

Artmış neopterin düzeyleri, bakterilerin yol açtığı enfeksiyonlarda olduğu

kadar HIV, sitomegalovirüs, hepatit-B ve hepatit-C gibi virüslerin yol açtığı

enfeksiyonlarda da görülebilir (4, 78-84). HIV tarama testi inokülasyondan uzun bir

süreç sonrasında, diğer bir deyişle kuluçka dönemini takiben doğru sonuç

verebilmektedir. Ancak HIV kontaminasyonunu takip eden 11-15 gün gibi çok kısa

süre sonrasında ortalama neopterin düzeyleri yaklaşık 12 kat artmaktadır. Bunun yanı

sıra neopterin ölçümü için biyolojik örnek olarak idrar örneklerinin kullanılması da

bir avantajdır (83). HIV hastalarında yüksek neopterin düzeyleri ile hastalığın daha

25

hızlı ilerlemesi; ileri safhalarda ise ikincil enfeksiyonların gelişmesi arasında ilişki

bulunmuştur (84).

T-hücrelerinin aktivasyonu ve interferon düzeylerinin önemli derecede

yükselmesi, neopterinin otoimmün hastalıkların erken evrelerinde artmaya

başlamasına neden olmaktadır. Bu durum otoimmün hastalıkların aktivitesini ve

yaygınlığını göstermesi bakımından neopterinin biyogösterge olarak

değerlendirilmesine olanak sağlar (4, 5, 67, 77). Tekrarlanan abdominal ağrı ve ateş

ile karakterize ailesel Akdeniz ateşi (Familial Mediterranean Fever, FMF) otoimmün

bir hastalıktır. Neopterin düzeylerinin, FMF hastalarında, kontrol grubuna ve kolşisin

ile tedavi edilen asemptomatik hastalara göre yüksek olduğu gösterilmiştir.

Neopterin düzeyleri atak sırasında tedavi edilen hastalarda, asemptomatik tedavi

edilmeyen hastalardan daha yüksek bulunmuştur. Bu bulgularla tedavi edilmeyen

FMF hastalarının idrar neopterin düzeylerinin önemli ölçüde arttığı ve kolşisin

tedavisinin idrar neopterin düzeylerini düşürdüğü bildirilmiştir (85).

Merkezi sinir sistemi veya periferik enfeksiyonu olan çocuklarda, Millner ve

diğerleri BOS neopterin değerlerinin merkezi sinir sistemi enfeksiyonları için yüksek

oranda duyarlı ve özgül, serum neopterin düzeylerinin ise periferik enfeksiyonlar için

özgül olduğunu göstermişlerdir (86). Klinik depresyon, 3,4-dihidroksi-L-fenilalanin

(DOPA) duyarlı distoni gibi değişmiş nörotransmitter düzeyleri ile ilişkili olan

hastalıklar dahil olmak üzere pek çok merkezi sinir sistemi patolojisinde neopterin

düzeyleri değişmektedir. Pek çok inflamatuar merkezi sinir sistemi hastalığında,

neopterin düzeylerinin arttığı gözlenmiştir. Beyin enfeksiyonu olan çocuklarda (86),

nörosistisarkoz hastalarında (87), BOS’da neopterin düzeyleri yüksek bulunmuş,

nörosistisarkoz hastalarında, tedavi sonrası neopterin düzeylerinin normale döndüğü

bildirilmiştir. Multipl skleroz tekrarında ise neopterin düzeylerinin koruyucu önemi

bulunduğu saptanmıştır (88). Nörolojik semptomların dahil olduğu ailesel

eritrofagositik lenfohistiositoz patolojisinde BOS neopterin konsantrasyonu kontrole

kıyasla 200 kat daha fazla bulunmuştur (89).

26

Down sendromlu çocuklarda enfeksiyonlara karşı artmış duyarlılık ile özgün

ve özgün olmayan immünitede çeşitli derecelerde yetmezlik nedeniyle

enfeksiyonların görülme sıklığı yüksektir. Böyle durumlarda inflamasyonlarda

primer rol oynayan ve immün regülasyondan sorumlu sitokinlerin ve diğer

moleküllerin beyinde dejeneratif değişimlere katkıda bulunduğu ve bu

nöroinflamasyonun değişmiş immün yanıtlara, dolayısıyla hastalık patojenezine eşlik

ettiği bildirilmektedir (89). Down sendromlu hastalarda yapılan bir çalışmada

neopterin düzeylerinin kontrol grubuna göre anlamlı şekilde arttığı gösterilmiştir

(90). Licasto ve diğerleri, Down sendromlularda kontrole kıyasla IL-6 ve plazma C-

reaktif protein (CRP) değerlerinin yükseldiğini, kan neopterin düzeylerinin ise

değişmediğini saptamışlardır. Ancak neopterin düzeylerinin değerlendirilmesinin

kognitif bozunma ve demans oluşmadan çok önce, merkezi sinir sistemi değişiminin

erken habercisi olacağı bildirilmiştir (91).

Bir diğer çalışmada ise yine neopterin düzeylerinin Alzheimer hastalarında

benzer şekilde arttığı gösterilmiş, amloid-β proteinlerle ilişki gözlenmemesinden

dolayı, bu artışın nöropatolojiden çok immün sistem aktivasyonu ile ilişkili olduğu

bildirilmiştir (92).

Alerjik olan ve olmayan astım hastalarında yapılan çalışmalarda, neopterinin

ayırıcı tanıda kullanılabileceği belirtilmektedir. Her iki astımda da neopterin

düzeyleri sağlıklı gönüllülere göre yüksek olmakla birlikte, alerjik astım hastalarında

ve atopik kişilerde alerjik olmayan hastalara göre daha düşük neopterin düzeyleri

bulunmuştur (93, 94). Ailesel atopi hikayesi bulunan çocuklarda da idrar neopterin

düzeylerinin düşük olduğu bildirilmiştir (95).

Kötü huylu hastalıklarda neopterin konsantrasyonundaki artışın tümör tipine

göre değiştiği bildirilmiştir (53, 96). Hematolojik neoplazilerin %90’ında, yumurtalık

kanserlerinin %80’inde, pankreatik kanserlerin %70’inde, akciğer kanserinin

%58’inde ve rahim ağzı kanserlerinin %55’inde yüksek neopterin konsantrasyonu

saptanmıştır (53). Sadece tümör tipinin değil, aynı zamanda tümör safhasının da

neopterin konsantrasyonundaki artışı etkilediği bildirilmiştir. Neopterin düzeyleri

genellikle ileri safhalarda, başlangıç aşamasına göre daha yüksek bulunmuştur. Diğer

27

taraftan pek çok olguda neopterin düzeyinin düşmesi veya normale dönmesi

neoplazinin azalması ve tedavinin başarılı olması ile ilişkilendirilmiştir. Tahmini

tümör kitlesi ile idrar neopterin konsantrasyonu arasında da bir ilişki gösterilmiştir.

Kanser hastalıklarında neopterin düzeyinin prognoz konusunda önemli ve bağımsız

bir gösterge olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, serum veya idrar neopterin

düzeylerinin artmasının kötü gidişatı gösterdiği belirtilmiştir (53, 96).

Bu verilerin sonucu olarak T hücrelerinin aktivasyonunda ve otoimmüniteden

köken alan hastalıklarda neopterin ölçümünün hastalıkların aktivitesinin ve

prognozunun belirlenmesinde yararlı olacağı kabul edilmektedir. Aktive edilen T

hücreleri tarafından salınan IL-2 ve INF-γ benzeri sitokinler hücresel immün yanıtın

izlenmesi için analiz edilebilir. Ancak biyolojik yarı ömürlerinin kısa olması

biyogösterge olarak kullanılabilirliklerini bazı durumlarda kısıtlamaktadır. Örneğin

INF-γ salındıktan sonra hızlı bir şekilde hedef moleküllere veya reseptörlere

bağlanarak nötralize edilir. Dolayısıyla bölgesel olarak sentezlenen sitokinlerin kan

dolaşımına ulaşması çoğunlukla mümkün olmamaktadır. Ayrıca protein yapısındaki

sitokinlerin çoğu biyolojik olarak kararsızdır (4, 40). Bu nedenle rutin laboratuar

analizleri için uygun moleküller değildirler. İmmün sistemde gerçekleşen

reaksiyonların takibi için alternatif bir yol da, sitokinlerin indüklediği biyokimyasal

değişiklikleri ölçmektir. Bu açıdan biyolojik sıvılardaki neopterin düzeylerinin

ölçülmesi, hücresel aracılıklı immün yanıtın izlenmesine olanak sağlamaktadır (40).

Neopterin, sistemik hasarın doğrudan tanımlanması ve olası risklerin

değerlendirilmesinde uygun bir parametredir. Vücuttaki yarı ömrü sadece renal itraha

bağlıdır ve biyolojik olarak dayanıklı bir moleküldür. İdrar örnekleri başta olmak

üzere çeşitli biyolojik sıvılarda da ölçümünün yapılabilmesi nedeniyle, doğrudan

INF-γ gibi sitokinlerin analiz edildiği yöntemlere göre üstündür. Bunun yanı sıra

neopterin, tek bir sitokinin etkisinden çok, immün sistem ağının toplamsal etkisini ve

monosit/makrofaj popülasyonundaki etkileşmeleri saptamaya olanak sağlar (97). 7,8-

dihidroneopterinin kimyasal olarak dayanıklı olmaması ve oksidasyona uğrayarak

kolaylıkla bozulması klinikte kullanımını kısıtlamaktadır (53, 97).

28

2. 5. 11 Biyolojik Sıvılarda Neopterin Düzeyleri

Neopterin vücut sıvılarında dayanıklı olup, immün yanıt süresince

saptanabilmektedir. Bundan dolayı neopterin düzeylerini ölçmek zor değildir.

Neopterinin düşük molekül ağırlığından dolayı başlangıçtaki yapısı değişmeksizin

böbreklerden atılır. Neopterin klerensi inülin klerensinden daha yüksektir. Çünkü

neopterin glomerüler filtrasyon yanında tübüler sekresyonla da böbreklerden atılır.

Serum neopterin konsantrasyonlardaki değişiklikler idrar neopterin

konsantrasyonlarında paralel bir değişikliğe neden olur. İdrar neopterin ve serum

neopterin düzeyleri arasında pozitif bir korelasyon gözlenmiştir. Neopterin ışığa ve

yüksek sıcaklığa duyarlı olduğundan saklama ve taşınma esnasında doğrudan güneş

ışığından korunmalıdır. Ayrıca, biyolojik örneklerin tekrar çözme dondurma

durumlarında mevcut neopterin miktarlarında azalma görülmüştür. Neopterinin;

serum, BOS, sinoviyal sıvı, idrar, pankreatik sıvı ve plazma gibi çeşitli vücut

sıvılarında ölçümü yapılabilir (98).

Venöz kan örneklerinden plazma veya serumu ayırırken neopterin kaybı

olmadığı tahmin edilmektedir. Serum ve plazma neopterin düzeyleri karanlık bir

yerde, oda ısısında üç güne kadar dayanıklıdır/kararlıdır. Serum daha uzun süre için

saklanacaksa -20 oC’de üç aya kadar, -80 oC’de ise bir yıla kadar depolanabilir. İdrar

örneklerinin çalışmadan önce toplanması ve saklanması çok önemlidir (98).

Beyin omurilik sıvısındaki neopterin düzeylerinde cinsiyete göre fark

bulunmamaktadır. Sağlıklı yetişkin bireylerde BOS neopterin düzeyleri 3,3 ± 0,24 ile

4,2 ± 1,0 nmol/L arasında değişmektedir (98-100). Plazma ve eritrosit için sırasıyla

3,0 ± 0,21 ve 2,7 ± 0,15 nmol/L olduğu bildirilmiştir (100). BOS örneklerinin yanlış

toplanması, saklanması ve işlenmesi mevcut neopterin konsantrasyonlarında daha

düşük değerlerin bulunmasına neden olmaktadır. İçinde 1 mg/ml ditioeritritol (DTE)

ve 1 mg/ml asetilen triamin penta asetik asit bulunan tüplere BOS örnekleri alınmak

suretiyle bu sorun engellenebilmektedir. Bu şekilde toplanan BOS örnekleri

dondurularak bir yıldan daha fazla saklanabilir (98, 99). Ayrıca safrada neopterin

29

konsantrasyonunun ölçülmesi için örneklerin %0,9 sodyum klorür (NaCl) çözeltisi

ile seyreltilmesinin uygun olduğu bildirilmiştir (97-99).

Serum ve plazmada tespit edilen neopterin değerleri arasında farklılık

bulunmamıştır (77). Sabah günün ilk idrarında tespit edilen neopterin

konsantrasyonları yaklaşık 1500 nmol/l’dir. İdrar neopterin konsantrasyonları idrar

dansitesindeki değişikliklerin etkisini ortadan kaldırmak için kreatinine oranlanarak

verilmektedir. Kreatinin konsantrasyonları ise yaklaşık olarak 12 mmol/l’dir. Yaş ve

cinsiyetten etkilenen kreatinin klerensindeki değişiklikler neopterin atılımına

yansımaktadır. Örneğin yaşla azalan kreatinin düzeyi, idrar neopterin

konsantrasyonlarının artmasına neden olmaktadır. Neopterin düzeyi erkeklerde 101-

133 μmol/mol kreatinindir. Kadınlarda idrar neopterin düzeyi daha yüksektir ve 124-

156 μmol/mol kreatinin olarak bildirilmektedir (78).

2. 5. 12. Biyolojik Sıvılarda Neopterin Ölçüm Yöntemleri

Nicel olarak neopterin analizi, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-

MS) ve radyoenzimatik yöntem gibi değişik yöntemlerle yapılabilmektedir. Fakat

GC-MS’nin biyolojik örneklere uygulanmasındaki zorluklar, radyoenzimatik

yöntemlerin çok zaman alması ve bütün pteridin türevleri için uygun olmaması gibi

nedenlerden dolayı, YPSK veya immünassay yöntemler bunların yerine tercih

edilmektedirler (101).

Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, pek çok örneğin analiz edilmesi için

hassas ve uygun bir yöntemdir. Ancak serum gibi protein içeriği yüksek örneklerde

yöntemin uygulanması uzun ön işlemler gerektirir. Serum neopterin

konsantrasyonunun idrara göre yaklaşık 200 kat daha düşük olması nedeniyle de, bu

yöntem ile serum neopterin düzeylerinin saptanması zordur (38).

Diğer taraftan immünoassay yöntemlerle yüksek hassasiyet ve duyarlılıkta

çok sayıda örneğin aynı anda analizi yapılabilmektedir (40, 101). Katı bir destek

üzerine antikorun mobilize edildiği ELISA, neopterin düzeylerinin belirlenmesinde

30

yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntemdir. Bu yöntemde ligand, spesifik aktivite

gösteren ve ligandla çabuk birleşebilen, dayanıklı ve vücutta bulunmayan bir enzimle

işaretlenmiştir. Enzimle bağlanmış olan ligandın örnekteki bağlanmamış olan ligand

ile substrata karşı yarışması yöntemin esasını oluşturmaktadır. Sonuçlar,

spektrofotometrik olarak değerlendirilmektedir.

Radyoimmünoassay (RIA) yöntemi ise, neopterin analizinde kullanılan diğer

bir yöntemdir. Radyoimmünoassay yönteminin esası ELISA’dan farklı olarak,

spesifik antikora karşı radyoaktif işaretli ve örnekteki işaretsiz antijen arasındaki

yarışmalı bağlanmaya dayanmaktadır. Sonuçlar özel sayaçlar ile

değerlendirilmektedir (38). RIA ve ELISA yöntemlerinin birbirlerine üstünlükleri ve

dezavantajları mevcuttur. RIA yönteminde, radyoaktif madde kullanılması ve uzun

sürede sonuç vermesi dezavantajlarındandır. ELISA yönteminde, plak

okuyucularının hemen hemen tüm araştırma laboratuarlarında bulunması, radyoaktif

materyal taşımaması ve hızlı sonuç vermesi önemli üstünlükleri olarak söylenebilir

(38, 102).

Plazma, serum, BOS ve safra gibi diğer protein içeren biyolojik sıvılardaki

neopterin düzeyleri RIA ve ELISA ile belirlenebilmektedir. İmmünoassay

yöntemlerde çok az miktarda serum, plazma veya BOS örneğinin yeterli olduğu

belirtilmiştir (97).

2. 5. 13. Transplantasyon Olgularında Neopterin

Kemik iliği alıcılarının yanı sıra böbrek, karaciğer, pankreas, kalp, akciğer

gibi solid organ alıcılarının vücut sıvılarında neopterin ölçümü, organ reddi ve

enfeksiyonlar gibi komplikasyonların öngörülmesinde klinik öneme sahiptir. Ölçülen

neopterin konsantrasyonları ile organ reddinin şiddeti arasında paralel bir ilişki

bulunmuştur (40). Organ reddi sırasında neopterin konsantrasyonları artar. Birçok

hastada reddin klinik belirtileri ortaya çıkmadan önce neopterin seviyeleri artar. Buna

karşı düşük ve sabit neopterin atılımı immünolojik problemleri düşündürmez, kalıcı

veya yüksek neopterin atılımı reddin enfeksiyondan ayırımını sağlamaz. Ayırıcı tanı

31

için başka bilgilere ihtiyaç vardır (103). Neopterin konsantrasyonlarının artması

enfeksiyonların şiddetine bağlıdır. En yüksek değerler, hastalığı bakteriyel süper

enfeksiyonlarla komplike olmuş hastalarda görülür (104).

Kalp naklinde, doku reddinin saptanmasında neopterinin tanısal duyarlılık ve

özgüllüğü %80-90 olarak bildirilmektedir (105). Bu tip hastalarda neopterin düzey

takibi, gereksiz endomiyokardiyal biopsi uygulamalarını da azaltır. Karaciğer

naklinde neopterin ölçümü, red krizleri ve enfeksiyon hastalıkları gibi immüolojik

komplikasyon riski göstermesi açısından yararlıdır. Ancak, hepatik graft alıcılarında

nakilden sonraki yaklaşık 7. günde neopterin konsantrasyonları immünolojik

komplikasyonlardan bağımsız bir şekilde yükselir. Değerler daha sonra düşer ve

komplikasyon yoksa düşük seyreder, fakat red durumu veya enfeksiyonu olan

hastalarda yeniden yükselir (106).

Kemik iliği naklinde neopterin düzeylerinin, organ reddinin şiddetine ve

hızına paralel olarak IL-10 ile birlikte artış gösterdiği saptanmıştır. Neopterin

düzeyleri, uygulanan tedaviye ve gelişebilecek immünolojik komplikasyonlara bağlı

olarak değişiklik gösterebilir (107). Rejeksiyon ve enfeksiyon, organ nakli yapılan

kişilerde, organ naklinin başarısızlığına veya hastanın ölümüne neden olan immün

sistemle ilişkili en önemli komplikasyonlardır. Böbrek, karaciğer, pankreas ve kalp

gibi organ nakli gerçekleştirilen veya kemik iliği nakli yapılan hastalarda biyolojik

sıvılardaki yüksek neopterin düzeyleri immünolojik reaksiyonları, klinikte yaygın

olarak kullanılan diyagnostik yöntemlerden daha önce bildirmektedir (108). Organ

nakli yapılan kişilerde immünolojik komplikasyonların erken dönemde tespit

edilmesi açısından neopterinin iyi bir biyogösterge olduğunu bildiren çok sayıda

çalışma yapılmıştır (4, 49, 105, 108-111). Neopterin, tek bir hastalığa özgün olmayıp

intraselüler patojenlerin neden olduğu hastalıkları ve viral hastalıkların büyük

bölümünü içine alan hücresel immün yanıtı uyaran çok sayıdaki değişik enfeksiyona

karşı duyarlı bir erken dönem biyogöstergesidir. Bu nedenle kan transfüzyonlarını

daha güvenli hale getirmek için kan donörlerinin taranmasında ölçümü yapılmaktadır

(102).

32

Viral enfeksiyonlarda neopterin düzeyleri, enfeksiyonun belirlenmesi için

gereken düzeyde antikor oluşumundan çok daha önce artmaktadır. Bu özellikle

bağışıklık sisteminin çökmesine neden olan HIV gibi sessiz periyodu uzun olan

hastalıklarda önemlidir. 35 000 kan donörü üzerinde yapılan araştırma sonucunda,

donör kaybının %1,6 kadar düşük olması da uygulanabilirliğini desteklemektedir (49,

81).

2. 5. 14. Neopterinin Hematopoez ve Kan Bankacılığında Önemi

Demir, immün sistem fonksiyonlarında önemli rolü olan bir elementtir.

Kanser ve otoimmün hastalıkların da dahil olduğu birçok kronik hastalıkta anemi

görülür. Bu durum inflamatuar süreçte demirin kullanılarak depoların boşalmasıyla

açıklanmaktadır. Yapılan çalışmalarda demir eksikliğinin neopterin salınımını

indüklediği gösterilmiştir. Neopterinin eritropoez üzerinde inhibitör etkisi mevcuttur.

Hayvan deneylerinde, böbrek perfüzyon sıvısına neopterin eklenmesinin eritropoetin

salınımını azalttığı gösterilmiştir. Aynı çalışmada ortama eritropoetin eklenmesi de

neopterin düzeylerinde azalmaya neden olmaktadır. Kronik hastalığı bulunan

kişilerde serum neopterin düzeyleri ile demir, transferin, hemoglobin düzeyleri

arasında ters, ferritin düzeyleri ile doğru ilişki saptanmıştır. Bunun yanı sıra, anemisi

olan kanser hastalarında neopterin düzeylerinin daha yüksek olduğu saptanmıştır.

Anemi ile neopterin seviyeleri arasında doğrudan bir ilişki ispatlanamasa da,

neopterinin eritropoetin üretimini inhibe ederek anemi gelişimine neden olduğu

düşünülmektedir (73).

Günümüzde kan donörlerinden alınan kanlar Hepatit C virüsü (HCV), HIV,

Hepatit B virüsü (HBV) gibi bazı enfeksiyonlar açısından test edilse de, bu durum

tüm enfeksiyonların kontrol edildiği anlamına gelmez. Bu nedenle spesifik olmayan

testler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Serumda neopterin ölçümü bu testlerden birisidir.

Neopterin düzeylerinin, özellikle viral enfeksiyonların erken dönemlerinde özgül

antikorların pozitifleşmesinden önce yükselmeye başlaması nedeniyle, herhangi bir

enfeksiyonun gözden kaçırılmaması yönünden özgül olmayan, ancak duyarlı bir

belirleyici olarak, kan bankacılığında ayrı bir yeri vardır. Yapılan çalışmalarda, kan

33

donörlerinde neopterin taramasıyla birçok enfeksiyon ajanın serokonversiyon

öncesinde belirlendiği ve transfüzyonla ilişkili birçok enfeksiyonun önlenmesinde

büyük yarar sağladığı bildirilmektedir (7, 8, 73, 112, 113).

Özellikle sık kan transfüzyonu yapılan hematoloji ve onkoloji hastalarında

enfeksiyon etkeni olabilecek, ancak kan bankalarında uygulanan rutin testler arasında

yer almayan bazı etkenlerle oluşabilecek enfeksiyonların saptanması, neopterin

düzey taraması ile başarılmaktadır (7, 8, 112, 113).

Bu konu ile ilgili 1986-1988 yılları arasında Avusturya’da yapılan geniş

kapsamlı bir çalışmada; 76 587 kan donöründe neopterin düzeyi araştırılmış, yüsek

düzey neopterin saptanan donör oranı %1,62 olarak bulunmuş ve ileri çalışmalarda

bu donörlerin %23’ünde ya bir enfeksiyon ya da anormal bir klinik sendrom varlığı

belirlenmiştir (20). Ayrıca, bu uygulama sırasında değişik inflamatuar ve kanserler

de fark edilmiştir. Bu sonuçlardan sonra, Avusturya kan bankalarında neopterin

düzey tayini rutin tarama testleri arasına alınmış ve diğer test parametreleri yönünden

negatif olsalar bile, serum neopterin düzeyi >10 nmol/L olan donör kanlarının

transfüzyon için kullanılmaması kararlaştırılmıştır (7).

Ülkemizde Fişenk’in Hacettepe Üniversitesi Hastanesi’nde rutin tarama

testleri negatif olan 2760 kan donoründe neopterin düzeylerini taradığı çalışmasında,

donörlerin 2619’unda (%94,9) neopterin konsantrasyonunu normal sınırlarda,

141’inde (%5,1) ise yüksek olarak saptanmıştır (8).

Neopterin analizi için günümüzde kullanılan hızlı, kolay uygulanabilir ve

ekonomik yöntemlerin varlığı, bu testin kan donörlerinde rutin olarak kullanılmasına

olanak sağlamakta ve ciddi bir ek maliyet getirmemektedir. Kan bankalarında

neopterin taraması sonucu elenen kan donörü sayısı düşük olmasına rağmen (< %2),

asemptomatik kişiler, inkübasyon ya da pencere dönemindeki seronegatif kişiler ve

sessiz metabolik veya kanser hastalığına sahip kişiler bu şekilde seçilebilecek ve kan

transfüzyonlarının güvenirliği önemli ölçüde artacaktır (18).

34

2. 6. Kan Donörlerine Uygulanan Standart Tarama Testleri

Kan vermesinde sakınca görülmeyen kişilerden ön kol veya antekübital

bölgedeki venlerden flebotomi ile uygun teknikle yaklaşık 450-500 ml alınan kan

antikoagülanlı ve tamponlu plastik torbalara toplanır. Daha sonra bu kan örneğinden

yaklaşık 5-6 ml jelli vacotainer tüplere alınarak santrifüj edilir. Ayrılan serum

örneklerine de HBsAg, insan immün yetmezlik virüsüne karşı antikor (anti-HIV) tip1

ve 2, hepatit C virüsüne karşı antikor (anti-HCV) ve sifilis için tarama testi-Rapid

Plasma Reagin (RPR) testleri uygulanır. Bu testlerden herhangi birisinde pozitiflik

saptandığında kan örneği reddedilir ve nakil için kullanılmaz (114).

2. 7. Kan Bankacılığının ve Sağlıklı Kan Donörlerinin Önemi

Enfeksiyon hastalıkların bulaşmasında transfüzyon önemli bir yoldur. Enfekte

donörlerden alınan kan ve/veya kan ürününün kullanımı ile bulaşan enfeksiyon

hastalıkları transfüzyonun en çok karşılaşılan ve korkulan komplikasyonudur. Her ne

kadar güvenli kanın en önemli parametrelerinden biri olarak enfeksiyonsuz olması

kabul edilse de, enfeksiyon etkenlerinin bulaşma oranını bugün için sıfırlamak

mümkün gözükmemekte, ancak minimum düzeylere düşürülmeye çalışılmaktadır.

Mevcut rutin tarama testlerinde sağlanan ileri derecedeki gelişmelerin kan ve kan

ürünleri transfüzyonu ile özellikle virüs enfeksiyonlarının bulaş riskini çok azalttığı

bir ortamda halen azda olsa devam etmektedir (7).

Kan ve kan ürünlerinin naklinde güvenirliliğin sağlanması için öngörülen

önlemler arasında; kayıtlı ve devamlı donörlerin kullanılması, donör seçiminde

sorgulamanın iyi yapılması, donör kayıtlarının iyi tutulması, hepatit B yüzey

antijenine karşı antikor (anti-HBc) taraması, Treponema pallidum için özgül antikor

testlerinin kullanılması, plazma türevi ürünlere inaktivasyon yöntemlerin

uygulanması ve karaciğer enzim düzeylerinin ölçülmesi gibi uygulamalar yer

almaktadır (115-117).

35

Kan transfüzyonu ile enfeksiyon ajanlarının bulaşma riskinin önlenememesi

konusunda öne sürülen en az dört neden bulunmaktadır (117).

1) Donör kan bağışında bulunduğu sırada enfeksiyonun erken döneminde

olabilir ve laboratuar testleri negatif sonuç verebilir (pencere dönemi),

2) Klinik olarak asemptomatik seyreden kronik taşıyıcı durumundaki donörde

sürekli tarama testleri negatif çıkabilir,

3) Donör, mutant veya varyant bir suş ile enfekte olabilir,

4) Tarama testlerinin uygulanması sırasında laboratuardan kaynaklanan

teknik hatalar olabilir.

Yapılan bir araştırmada, rutin tarama sırasında anti-HIV negatif olduğu

saptanan 7 donörden kan alan 13 kişi, 8-20 ay izlenmiş ve bu kişilerin üçünde HIV’le

ilişkili hastalık, 1’inde kazanılmış immün yetmezlik sendromu (AIDS) geliştiği

saptanmıştır. Bu 7 donörün daha sonraki sorgulamasında, son 4 ay içinde bulaş riski

bulunan aktivitelerde bulundukları belirlenmiş ve bu süre içinde enfekte olan bu

kişilerden eldeki tarama testleri ile negatif sonuç alındığı belirtilmiştir (118).

Bu bulgular, rutin tarama testlerinin erken dönem enfeksiyonlarda yararsız

olduğunu vurgulamaktadır. Her ne kadar bu oran düşük gibi görünse de özellikle

HIV gibi virüslerin bulaşmasında önemli olup, gözardı edilmesi mümkün değildir.

Kan transfüzyonu ile virüs, bakteri ve parazit gibi birçok enfeksiyon etkeni

bulaşabilmektedir. Ancak bunların arasında en önemlilerinin HIV, HBV, HCV ve

insan T hücresi lenfotropik virüsü (HTLV) olduğu kabul edilmektedir (119).

36

2. 8. Ülkemizde Kan Transplantasyonu ve Kan Bankacılığı

Dünyada kan bankacılığının özellikle son 20 yıl içinde göz kamaştıran bir

hızla gelişme içerisinde olduğu gözlemlenmektedir.

“Güvenli kan” denildiğinde, hastaya verildiğinde ek olumsuzluklara neden

olmayan, kaynağı takip edilebilen, virüs, bakteri ve parazit gibi mikroorganizmaları,

ilaçları, kimyasal maddeleri içermeyen kan anlaşılmalıdır.

Türkiye’de ilk kan transfüzyonu 1921 yılında İstanbul Üniversitesi Tıp

Fakültesi’nde yapılmış, 1957 yılında da Türkiye Kızılay Derneği’nce “Kamu Kan

Bankaları” hizmete açılmıştır.

Günümüzde, Sağlık Bakanlığı hastanelerinde kullanılan kan ve kan

bileşenlerinin %60’ı Kızılay kan merkezlerinden temin edilmektedir. Üniversite

hastanelerinde bu oran %20’dir. Tam kan kullanım oranı %95’lerden %15

dolaylarına inmiş olup, tam kanın tamamına yakını hastane kan bankalarından

sağlanmaktadır.

Sağlık Bakanlığı tarafından hazırlanan ve Haziran 2005 tarihinde hayata

geçirilen “Güvenli Kan Temini Projesi” kapsamında, ülkemizin ihtiyacı olan kan

ürünlerinin tümünün Bölge Kan Merkezleri aracılığıyla toplanması ve toplanan

kanların da %60’tan fazlasının düzenli kan bağışçılarından elde edilmesi

amaçlanmaktadır (120).

Ülkemiz; kan bağışı konusunda gelişmiş ülkeler ile kıyaslandığında oldukça

geri sıralarda yer almaktadır. Bu ülkelerde gönüllü kan bağışlarının nüfusa oranı

%5’e ulaşırken ülkemizde bu oran halen %1,5-2 civarındadır. En önemli sorun

gönüllü kan donörü sayısındaki yetersizliktir. Gönüllü kan bağışı ile karşılanamayan

kısım hastane kan merkezleri tarafından çoğunlukla replasman, kana kan, zorunlu

yöntem ile karşılanmış ve karşılanmaktadır.

37

Ülke genelinde sağlıklı istatistiki verilere ulaşmak ve kullanılan kanların

izlenebilirliğini sağlamak pek mümkün değildir. Ayrıca, kan hizmetleri konusunda

kapsamlı bir standardizasyon ve denetim de mevcut değildir. Ülkemizde toplanan

kan bağışını kesin bir sayıyla söyleyebilmek mümkün değildir. Türkiye Kan

Merkezleri ve Transfüzyon Derneği tarafından 2003 yılında ülke genelindeki kan

merkezlerinde yapılan anket çalışması sonuçları ile Sağlık Bakanlığı Yataklı Tedavi

Hizmetleri Yıllığı verileri uyumlu değildir. Sağlık Bakanlığı verilerine göre 2004’te

873 454 ünite kan bağışı toplanmış, Türkiye Kan Merkezleri Transfüzyon

Derneği’nin anket sonuçlarına göre ise 1 236 776 ünite kan toplanmıştır (121).

2. 9. Triptofan

Triptofan, 2-amino-3-(1H-indol-3-il) propanoik asit olarak adlandırılan,

apolar yan zincire sahip esansiyel bir amino asittir (Şekil 2. 8), (100). İlk olarak

1900’lerin başlarında Hopkins ve Cole tarafından kazein proteininin izolasyonunun

ardından keşfedilmiş, kısa bir süre sonra ise Ellinger ve Flamand tarafından kimyasal

yapısı aydınlatılmıstır. Sentezi ise, ilk defa 1949’da yapılmıştır (122).

Şekil 2. 8. Triptofanın kimyasal yapısı (100).

Triptofan, indol halkası içeren tek amino asittir (123). Bitkiler ve

mikroorganizmalar tarafından sentezlenebilen triptofan, insanda de novo

sentezlenememektedir. İnsan vücudunda sentezlenemeyen triptofan diyetle alınması

gereken 8 esansiyel amino asitten biridir (122, 124). İnsanda dokularda nispeten az

depolanan triptofan, diğer amino asitlerle kıyaslandığında vücutta konsantrasyonu en

düşük olanıdır. Hindi, tavuk, muz, ceviz, çikolata, peynir, avokado ve yulaf gibi

gıdalar triptofan yönünden zengin besinlerdir. Triptofan için minimum gereksinim

38

günlük ortalama 200 mg’dır. Gelişmiş ülkelerde diyet ile ortalama günlük triptofan

alımının yaklaşık 1 g olduğu bildirilse de, (125) yetişkinler için önerilen günlük alım

miktarı 250-425 mg/gün olarak belirlenmiştir. Bu da diyetle 3,5-6,0 mg/kg/gün

triptofan alımına karşılık gelmektedir (122).

Absorbe olan triptofan amfipatik yapısından dolayı diğer amino asitlerin

aksine dolaşımda %85-90 oranında plazma albüminine bağlı olarak, kalanı ise

serbest formda bulunmaktadır. Triptofan kan-beyin engelini serbest formda spesifik

olmayan L-amino asit taşıyıcıları aracılığıyla geçmektedir. Triptofan kan

dolaşımında diğer büyük nötral amino asitlerle (BNAA) taşıyıcılar için yarıştığından,

triptofan/BNAA oranı, serotonin sentezi için gerekli beyin triptofan

konsantrasyonunu etkilemektedir (122, 126).

Şekil 2. 9’da verildiği üzere, patolojik olmayan durumlarda triptofan, belli

başlı üç metabolik yoldan birini izlemekte, protein sentezinin yanı sıra kinürenin

sentezi ve serotonin sentezi gibi iki önemli metabolik yolağın öncül molekülü olarak

kullanılmaktadır. Hem periferal hem de merkezi sisteminde triptofan

metabolizmasının esas yolu kinürenin yolağıdır (122).

Şekil 2. 9. Triptofanın metabolik yolakları (122).

Triptofan

Protein sentezi

Kinürenin Seratonin

39

2. 9. 1. Triptofan Metabolizması ve Kinürenin Oluşumu

Triptofan katabolizmasının yaklaşık %99’unu oluşturan oksidatif kinürenin

yolağı, kinürenik asit, antranilik asit, kinolinik asit, pikolinik asit gibi ara ürünlerin

ve nikotinamid adenin dinükleotid (NAD), nikotinamid adenin dinükleotid fosfat

(NADP) gibi koenzimlerin sentezinin gerçekleştiği önemli bir metabolik yoldur

(Şekil 2. 10), (122, 126, 127).

Şekil 2. 10. Triptofan metabolizmasının oksidasyon (kinürenin) yolu (127).

40

Triptofan, diyetle alındığında kan dolaşımına geçerek, albümine bağlanır.

Kan-beyin engelinden öncelikle bağlı olmayan, serbest triptofan geçer. Ancak

triptofanın kan-beyin engelindeki taşıyıcılara ilgisi albümine olan afinitesinden daha

yüksek olduğundan, kan-beyin engeline yakın bulunan ve albümine bağlı triptofanın

albüminden ayrılarak beyne geçişi mümkündür (122, 128).

Periferal kinürenin kan beyin engelinden BNAA (histidin, izolösin,

metiyonin, fenilalanin, tirozin, valin gibi) taşıyıcılar ile merkezi sinir sistemine geçer.

Beyinde glia hücreleri tarafından alınır ve burada metabolize olarak 3-

hidroksikinürenin (3-HK), kinolinik asit (KUİN) gibi nöroaktif triptofan

metabolitlerine dönüşür (129, 130).

Triptofanın kinürenine dönüşümünde başlangıç ve hız kısıtlayıcı basamak

triptofanın N-formil-kinürenine oksidasyonudur. Oksidasyon, karaciğerde triptofan

(2,3)-dioksijenaz (TDO) veya ekstrahepatik dokuda IDO ile katalizlenmektedir.

Kinürenin başta glutamat reseptör antagonisti kinürenik asit (KİNA) ve glutamat

reseptör agonisti KUİN olmak üzere nörotransmitterlere etki eden birçok metabolitin

sentezinde de anahtar bileşiktir (16, 122, 131).

2. 10. Kinürenin Yolağı

Kinürenin, 1927 yılında Kotake tarafından izole edilmiş, aynı yıl Butenandt

ve arkadaşları tarafından yapısı aydınlatılmıştır. Sadece karaciğerde bulunan ve

memelilerde keşfedilen ilk indüklenebilen enzim sistemi olan TDO, substratı olan

triptofanın yanı sıra histidin, kinürenin ve çok az oranda da tirozin ve fenilalaninle

indüklenmektedir. Aktif indükleyicilerin verilmesiyle TDO düzeyleri birkaç saat

içinde artmakta, bileşiklerin uzaklaştırılmasıyla düzeyler 15-20 saat içinde normale

dönmektedir.

Hidrokortizon, TDO aktivitesini kontrol düzeyine göre 5-10 kat

artırabilmektedir (132). Tüberküloz, lösemi, mesane kanseri gibi çeşitli hastaların

idrarında farklı triptofan metabolitlerinin düzeylerinin yüksek bulunmasına karşın, bu

41

hastaların karaciğerinde TDO aktivitesinin yükselmemesi triptofan katabolizmasında

TDO’nun tek enzim olmayacağını düşündürmüş, 1963’te Hayaishi ve arkadaşları

triptofanı karaciğer dışındaki dokularda kinürenine çeviren ikinci bir enzimi izole

etmişlerdir. Geniş bir substrat spektrumuna sahip olan bu enzim, D-, L-triptofan,

triptamin, 5-hidroksitriptofan ve seratonin gibi indolamin türevlerine etki

edebildiğinden indolamin 2,3-dioksijenaz olarak adlandırmıştır (133, 134).

Triptofan (2,3)-dioksijenazın aksine IDO, triptofan ve glukokortikoidlerle

indüklenmemektedir (132). Her iki enzim de bir “hem” proteinidir. Enzimin

aktivasyonu için ferrik demiri ferroz forma dönüştürerek, triptofan ve moleküler

oksijenin enzimin aktif merkezine bağlanmasını hızlandıracak süperoksit anyon

radikali gereklidir (16, 135). Her iki enzim aynı reaksiyonu katalizlese de TDO ve

IDO salgılanmasının farklı dokularda olması, farklı biyolojik rolleri yansıtmaktadır.

Normal şartlarda hepatik kinürenin yolağı aktiftir ve sağlıklı dokularda IDO

salgılanması oldukça düşüktür. Ancak, immün aktivasyona, inflamasyona ve

enfeksiyona bağlı olarak IDO salgılanması artarak ekstrahepatik kinürenin yolağının

baskın hale gelmesine neden olmaktadır. IDO, immün yanıtta aktif rol oynarken,

TDO’nun bu süreçte rolü olduğuna dair deliller yok denecek kadar azdır (11, 132,

136).

2. 11. Kinüreninin Triptofana Oranı (Kyn/Trp) ve Önemi

Normal şartlarda kinürenin konsantrasyonu, serum triptofan düzeylerine

bağlıdır. Triptofanın diyetsel alımının azalmasına bağlı olarak endojen triptofan

düzeyleri de azalacağından kinürenin düzeyleri de düşük gözlenecektir. Kyn/Trp

oranı; yani TDO ve IDO’nun ilk ürününün konsantrasyonunun, bu enzimlerin

substratının konsantrasyonuna oranı, triptofan yıkımının ve IDO aktivitesinin uygun

bir göstergesidir. Kyn/Trp oranına immün aktivasyon belirteçlerinin eşlik etmesi, bu

orandaki artışın, özellikle IDO aktivasyonuna bağlı olduğunu doğrular niteliktedir

(137, 138). Fuchs ve arkadaşları tarafından sağlıklı kişilerde yapılan çalışmada

ortalama triptofan konsantrasyonu 73,0 ± 14,9 μmol/L, kinürenin konsantrasyonu

42

1,92 ± 0,58 μmol/L ve Kyn/Trp ise 26,9 ± 8,10 mol/mmol olarak ölçülmüştür

(138).

Yapılan çalışmalar, HIV enfeksiyonu, (139) sistemik lupus eritematozus,

(140) Alzheimer, (141) Huntington (142) ve Parkinson (143) gibi nörodejeneratif

hastalıklarda, majör depresyon (144) ve kanser gibi hastalıklarda triptofan

konsantrasyonunun azaldığını, kinürenin ve diğer triptofan katabolitlerinin

konsantrasyonunun arttığını göstermektedir (145).

2. 12. İndolamin 2,3-dioksijenaz

Kotake ve Masayama, triptofanın N-formilkinürenine dönüşümünü

katalizleyen enzimi, 1936’da izole etmiş ve triptofan pirolaz olarak

isimlendirmişlerdir. Bu enzim daha sonra triptofan 2,3-dioksijenaz olarak

adlandırılmıştır (16, 132, 135).

İndolamin 2,3-dioksijenaz, intraselüler olarak konstitütif indüklenebilir

formda plasenta, akciğer, ince ve kalın barsak, kolon, dalak, mide ve beyinde

sentezlenmektedir. IDO, dendritik hücrelerde, monosit ve makrofajlarda,

eozinofillerde, fibroblastlarda, epitel hücrelerde, vasküler düz kaslarda, endotel

hücrelerde ve bazı tümör hücrelerinde INF-ã ile indüklenmektedir. Sentezlendiğinde

lokal dokudaki triptofanı tüketerek kinürenin oluşumunu artırmaktadır. Doğal immün

effektör mekanizmayı temsil eden IDO’nun konstitütif olarak sentez edildiği ve

mukoz membranlarda hızla indüklenerek intrasellüler ve ekstrasellüler

organizmaların büyümesini inhibe ettiği in vitro olarak gösterilmiştir (132). IDO,

immün yanıtın diğer doğal elemanları gibi adaptif immün sistem tarafından da

düzenlenmektedir. IDO, hem doğal hem de adaptif immün yanıtta T hücreleri

tarafından üretilen ve en güçlü indükleyicisi olan INF-γ dışında, enfeksiyonlar

esnasında üretilen TNF-α, INF-α/-β, IL-10, sitotoksik T lenfositle ilişkili antijen-4 ile

de indüklenmektedir (146-148). IDO, pek çok biyokimyasal yolakta önemli rolü olan

ve prostetik grup olarak hem içeren monomerik bir proteindir ve 403 amino asitten

oluşur (16, 124).

43

İndolamin 2,3-dioksijenazın immün regülasyondaki rolü oldukça karışık

olmakla birlikte iki temel fonksiyonu ön plandadır (135):

i) İndolamin 2,3-dioksijenaz, triptofan metabolizmasının immünodüzenlenme

yolağında periferal toleransın normal efektörüdür. İmmün tolerans ve atak arasındaki

dengeyi etkileyerek uygun immün yanıtın oluşmasına yardım etmektedir.

ii) İndolamin 2,3-dioksijenazın kazanılmış immün toleransta esansiyel rol

oynadığı, T hücreleri ile etkileşerek ve triptofan düzeylerini tüketerek tümörlerin

immün sisteme tolerans geliştirmesine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Murray

ve arkadaşları tarafından 2007’de keşfedilen ve IDO-2 olarak adlandırılan enzimin

biyolojik rolü tam aydınlatılamamış olmakla birlikte, T hücre yanıtını baskılayarak

tümör hücrelerinde gelişen immün toleransta rol oynadığı düşünülmektedir (149,

150).

2. 13. Triptofan Yıkımını Etkileyen Etmenler

İndolamin 2,3-dioksijenaz aktivitesinin, sigara içenlerde içmeyenlere oranla

daha düşük olduğu bulunmuştur. Serum IDO aktivitesi serum kotinin

konsantrasyonuyla ters orantılıdır. İmmün düzenleyici enzim IDO, T-hücre

aktivitesini baskılamaktadır. Sonuç olarak immünosupresif IDO aktivitesi sigara içen

bireylerde azalmaktadır. IDO-bağımlı immünosupresyondaki azalma, sigara içmenin

immün düzenleyici etkisinden kaynaklanabileceği bildirilmiştir (65).

Triptofan analoglarının IDO üzerine etkisinin araştırıldığı bir çalışmada,

IDO’nun enzimatik aktivitesini inhibe eden 1-metil-triptofan (1-MT) ve

metiltiohidantoin-triptofanın ve IDO substratı olan triptofanın INF-γ ile IDO

indüksiyonunu transkripsiyonel düzeyde baskıladığı görülmüştür. Böylece triptofanın

kendisinin de IDO üzerinde etkisinin olabileceği gösterilmiştir (151).

Klinik çalışmalarda, triptofan ile yarışarak kompetetif inhibisyon yapan 1-

MT’ın IDO eksprese eden tümör hücrelerinin gelişme ve büyümesini yavaşlattığı,

44

ancak gerileme olmadığı gösterilmiştir (152). Daha da önemlisi IDO-2’nin de

spesifik bir inhibitörü olan 1-MT ile engellenmesi antitümör aktiviteyle

sonuçlanmaktadır. Bu sonuçlar, IDO inhibisyonunun kanser tedavisinde terapötik bir

etkisinin olabileceğini göstermiştir (150).

Koroner kalp hastalığı riskini azaltıcı ve lipit düşürücü etkileri için tedavi

amacıyla kullanılan statinlerini antiinflamatuar özelliklerinin olduğu ve immün yanıtı

değiştirdiklerine dair bulgular oldukça yenidir. Atorvastatinin in vitro T

hücresi/makrofaj sistem üzerine etkisi ile statinlerin hücresel immün yanıtta T-hücre

aktivasyonunu inhibe ettiğini gösteren veriler uyumlu bulunmuştur. Atorvastatinin

monositik hücrelerde doğrudan INF-γ aracılıklı yolağı inhibe ettiği gösterilmiştir.

Sonuçta hem neopterin sentezini, hem de triptofan yıkımunu inhibe ettiği

bulunmuştur (153).

Bakterisit, fungusit ve antiviral aktivite gösteren N-klorotaurin uzun ömürlü

oksidanların ana komponenti olduğundan, savunma sisteminde önemli bir role

sahiptir. İnsan periferal kan mononükleer hücrelerinde neopterin oluşumu ve

triptofan yıkımına etkisi araştırıldığında N-klorotaurinin INF-γ azalması ile IDO

aktivasyonunu baskıladığı ve neopterin oluşumunu azalttığı gösterilmiştir (154).

Klomipramin, INF-γ salınımını azaltırken, imipramin ve trisiklik

antidepresanlar IL-10 üretimini artırırlar. Trisiklik antidepresanların, bazı

proinflamatuar sitokinlerin üretimini baskıladığı bildirilmiştir. Sertralin ve fluoksetin

INF-γ üretimini azaltır (155).

Meloksikam ile tedavi sonrası idrar neopterin düzeylerinde hafif bir azalma

gözlenirken, serum neopterin, triptofan ve kinürenin düzeylerinde anlamlı bir artış

kaydedilmiştir. Kinürenin/triptofan oranında ise hafif bir artış bulunmuştur (156).

Romatoid artrit hastalarında triptofan yüklemesinden sonra artan kinürenin ve

3-HK itrahının pridoksin uygulanmasının ardından azaldığı bildirilmiştir. Hastalık

aktivitesindeki azalmayla da bu yükselmede düşüş kaydedilmiştir (157).

45

Forrest ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada, triptofan düzeylerinin

sağlıklı kontrollere kıyasla anlamlı derecede düşük olduğu romatoid artritli hastalar,

altı ay süreyle metotreksat veya prednizolon ile tedavi edildikten sonra anlamlı

terapötik yanıt alınmış ve metotreksat tedavisi uygulananlarda neopterin

düzeylerinde azalma eğilimi izlenirken triptofan metabolitlerinde bir değişiklik

gözlenmemiştir (158).

2. 14. Triptofan ve Kinürenin Düzeylerinde Değişimler

Kinürenin/triptofan oranı yani kinüreninin konsantrasyonun, TDO ve

IDO’nun substrat konsantrasyonuna oranı triptofan yıkımının göstergesidir.

Triptofan yıkımının, TDO’dan çok IDO aktivasyonundan kaynaklandığını

kanıtlamak için immün sistem aktivasyonunuyla birlikte değerlendirmek

gerekmektedir. Kyn/Trp oranı, neopterin gibi bir immün aktivasyon parametresi ile

ve endojen INF-γ oluşumuyla ilişkili olduğundan dolayı, IDO aktivasyonunun

göstergesidir. Bu nedenle IDO aktivitesinin doğrudan ölçülmesi yerine Kyn/Trp

oranının kullanımı tercih edilmektedir (11).

Makrofajlarda, dermal fibroblastlarda, insan tümör hücrelerinde IDO

indüksiyonu pteridin biyosentezinin anahtar enzimi GTP siklohidrolaz indüksiyonu

ile ilişkilidir. IDO’ın pteridin sentezinde doğrudan rolü olduğu gösterilmese de bu

paralel indüksiyonun INF-γ aracılıklı olduğu düşünülmektedir. Böylece neopterin ve

BH4 sentezi de artmaktadır. İnterferonların potansiyel antikanser ajanlar olduğu ve

tümör hücrelerinin artışını inhibe ettiği hücre kültüründe gösterilmiştir (132).

Proinflamatuar sitokin INF-γ, çeşitli hücrelerde IDO’ı indükler. IDO aktivasyonu da

triptofan miktarını sınırlandırır. Triptofan, protein sentezi için gerekli olduğundan bu

esansiyel aminoasitin azalması protein biyosentezinin durmasına, sonuçta da patojen

artışının ve hücre proliferasyonunun aksamasına yol açar. Sonuç olarak triptofan

deplesyonu, hücrelerde INF-γ tarafından indüklenen bir savunma mekanizması

olarak düşünülmektedir. Bu mekanizma ile antimikrobiyal ve antitümöral etki

46

görülebileceği, hücre içi patojenlerin veya kanser hücrelerin artışınının

sınırlandırılabileceği düşünülmektedir (11, 159, 160).

Triptofan 2,3-dioksijenaz’ın etkisiyle kan triptofan konsantrasyonun

azalması, kinürenin düzeyinin artmasına neden olur ve buna bağlı olarak da Kyn/Trp

oranı artar; ancak immün aktivasyon göstergelerinin kan düzeyleri

etkilenmemektedir (Tablo 2. 3), (11).

Tablo 2. 3. Triptofan metabolizması ve immün aktivasyon ilişkisi.

Kan düzeylerindeki değişim

Triptofan Kinürenin Kyn/Trp İmmün aktivasyon

göstergeleri

Diyetle

yetersiz alımı ↓ ↓ ↔ ↔

TDO ↓↓ ↑ ↑ ↔

IDO ↓↓ ↑↑ ↑↑ ↑↑

↑ artar, ↓ azalır, ↔ değişmez

İndolamin 2,3-dioksijenaz ise triptofanın kinürenine dönüşümünü stimüle

ederek, kan triptofan düzeylerinin anlamlı düzeyde azalmasına ve kinürenin

konsantrasyonunun artmasına neden olur. Böylece Kyn/Trp oranı ve immün

aktivasyon göstergelerinin kan düzeyleri artar. Bu nedenle, triptofan yıkımı

göstergesi olarak Kyn/Trp oranının değerlendirilmesi bireysel olarak triptofan veya

kinürenin konsantrasyonlarına göre daha uygundur (11, 146).

Yapılan son çalışmalar, IDO’ın tümör ve tümör drenaj lenf düğümlerinde

yüksek düzeyde bulunduğunu göstermektedir (152, 161). IDO’ın tümör kaynaklı

toleransa katkısı vardır (148). IDO’ı inhibe etmek için geliştirilen stratejiler tümör

immünoterapinin etkinliğini artırmada kullanılabilir. IDO inhibitörleri antitümör

immün yanıtın artırılmasında geleneksel kemoterapötik ilaçlar ile kombine

kullanılabilir (148, 162). Yüksek IDO aktivitesi genellikle hastalığın kötü seyri veya

47

ileri derece kanser ile ilişkilendirildiğinden çeşitli kanser türlerinde IDO aracılıklı

toleransın sonlandırılmasının kemoterapinin etkinliğini artırabileceği

düşünülmektedir. Böylece IDO inhibisyonunun kanser ve kronik enfeksiyon

tedavisinde yeni bir terapötik hedef olabileceği bildirilmektedir (125, 163-165).

2. 15. Kan Donörlerinde Yapılan Pteridin Çalışmaları

Ülkemizde, Fişenk ve arkadaşlarının 2005 yılında yaptığı çalışmada

Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Kan Merkezi’ne başvuran 2 760 gönüllü kan

donöründe ELISA ile neopterin düzeyleri ölçülmüş. 141 donörde (% 5,1) neopterin

düzeyi yüksek bulunmuştur. Bu 141 donörün ancak 57’si ileri incelemeye alınmıştır.

Neopterin düzeyi yüksek olan donörlerin 6’sında klinik bulgular saptanırken 7’sinde

viral belirleyicilerde1 HBsAg, 4 Herpes simpleks virüsü-immnoglobulin M (HSV-

IgM), 1 AdV-IgM (Adenovirüs-IgM), 1 RSV-IgM (Respiratuar sinsial virüs-IgM)

pozitiflik bulunmuştur (8).

Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Kan Merkezinde de benzer bir çalışma

yapılmıştır. Kan donörlerinde neopterin düzeylerinin taranması, yüksek düzeylerin

saptandığı donörlerde viral IgM antikorlarına bakılarak olası bir viral enfeksiyonun

araştırılması ve böylece neopterinin kan yolu ile viral bulaş riskini azaltmadaki

değerinin ortaya konulması hedeflenmiştir. Kan merkezine gönüllü olarak kan

vermek için başvuran 18-55 yaş arasındaki 36’sı kadın, 388’i erkek olmak üzere

toplam 424 sağlıklı erişkinde neopterin düzeyleri taranmıştır. Bu çalışmada kan

bağışında bulunmak üzere hastane kan merkezine başvuran donörlerin büyük

çoğunluğunu (%91) erkekler oluşturmuştur. Bu durum, toplumumuzun

sosyopsikolojik değerlerine bağlı olabileceği gibi, kadınlara ait fizyolojik özelliklere

(mensturasyon, gebelik) de bağlı olabilir. Farklı toplumlarda neopterin düzeylerinin

cinsiyet farkı gözetmediğini ifade eden birçok çalışma mevcuttur. Cumhuriyet

Üniversitesi’nde yapılan bu çalışmada kadın ve erkek donörlerin neopterin düzeyleri

arasında istatistiksel olarak fark bulunmamıştır. Buna göre 424 kan donörün

407’sinde (%96) neopterin düzeyi normal sınırlarda, 17’sinde (%4) ise yüksek (>10

nmol/L) olarak saptanmıştır (20, 81, 166-168).

48

Honlinger ve arkadaşları 76 587 kan donörünün 1242’sinde (%1,6) neopterin

düzeylerini yüksek saptamıştır (20).

Schennach ve arkadaşlarının konu ile ilgili Avusturya Innsbruck Kan

Merkezi’nde yaptıkları bir çalışmada, kan donörlerinde yüksek neopterin düzeyi

saptama oranları %2 ile %7,8 arasında bildirilmektedir. Çalışmada fizik muayeneleri

normal, ancak neopterin düzeyleri >10 nmol/L olan 987 donörün 54’ü (%5,5) ile

neopterin düzeyleri normal olan 502 donörün 10’unda (%2) Ebstein-Barr virüsü

(EBV)-IgM pozitifliği bulunmuş ve aradaki farkın önemli olduğu bildirilmiştir. Bu

araştırıcılar, yüksek düzey saptanan kanların transfüzyon için değil albümin veya

diğer ürünlerin üretiminde kullanıldığını ifade etmektedirler. Ayrıca yüksek

neopterin düzeyine sahip kan örneklerini Parvovirüs B-19 ( PV B19) varlığı

yönünden PCR (Polymerase Chain Reaction (Polimeraz zincir reaksiyonu) ile

araştırmışlar ve neopterin düzeyi yüksek olan örneklerin %4’ünde pozitiflik

saptarken, normal olanların hiçbirisinde pozitiflik saptamamışlardır. Araştırıcılar bu

bulgunun, yüksek neopterin konsantrasyonları ile PV B19 enfektivitesi arasında bir

ilişkinin varlığını gösterdiğini ileri sürmüşlerdir. Aynı araştırıcıların bir diğer

çalışmasında, neopterin düzeyleri yüksek bulunan 1060 donörün %7’sinde ve

neopterin düzeyleri normal olan 462 donörünün %2’sinde PV B19-IgM pozitifliği

bulunmuş ve aradaki farkın önemli olduğu ifade edilmiştir (7, 66, 167, 168).

Murr ve arkadaşları, farklı kan grubuna sahip 8288 kan donöründe neopterin

konsantrasyonlarını araştırmışlar. O kan grubuna sahip donörlerde neopterin

konsantrasyonunu A, B, AB kan grubuna sahip donörlere göre daha yüksek tespit

etmişlerdir (169).

Araştırmalarda farklı sonuçların bulunması, çalışılan donör sayısına,

toplumun sosyoekonomik yapısına ve çalışmanın yapıldığı mevsimsel değişikliklere

göre farklılık gösterebileceği düşünülmektedir.

49

Birçok ülkede neopterin ile ilgili yapısal, biyokimyasal, immünolojik, klinik

ve tanısal anlamda çok sayıda araştırma yapılmış olmasına rağmen (13-15, 19, 40,

43, 48, 49, 53, 59-63, 74-76, 84, 85, 88-96, 99, 104-111, 143, 170, 171, 173, 175)

kan donörlerinde yapılan neopterin çalışmalarının sınırlı kaldığı görülmektedir (7, 8,

20, 66, 112, 113, 166-169). Avusturya kan bankalarında neopterin düzeyi yüksek

bulunan kanlar diğer tüm belirleyiciler negatif olma durumunda bile

kullanılmamaktadır. Bu ülkede geniş çaplı taramalarda, kan donörlerinin ortalama

%2-3’ünde neopterin düzeyi yüksek bulunmaktadır (7, 20, 167). Tüm bu yayınlara

rağmen, triptofan yıkımının immün aktivasyon kaynaklı olduğunun neopterin ile

desteklendiği bir araştırma kan dönörlerinde henüz yapılmamıştır.

50

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3. 1. Gereçler

3. 1. 1. Kullanılan Kimyasal Maddeler

Kimyasal Madde Adı Firma Adı

Albümin Sigma

Asetonitril Merck

Dipotasyum hidrojen fosfat Merck

L-kinürenin Sigma

L-triptofan Sigma

Potasyum dihidrojen fosfat Merck

Trikloroasetik asit Sigma

3. 1. 2. Kullanılan Araç ve Gereçler

Cihaz Adı Firma Adı, Modeli

Bilgisayar HP

Buzdolabı Arçelik

Deiyonize distile su cihazı Baunstead

Derin dondurucu Arçelik

Enzim-immünoassay plak okuyucu Spectra Max M2

Enzim-immünoassay plak yıkayıcı Sorin Biomedica

Floresan dedektörü G 1312 A

Hareketli faz süzme düzeneği Neuberger

Kolon (Oktadodesil silikajel C 18 Hichrom

25 cm X 4.6 mm, partikül büyüklüğü 5µ)

Manyetik karıştırıcı Dottingen 7801

Mikrosantrifüj Hettich Universal 30 RF

Neopterin-enzim-immünoassay kiti DRG

51

Otomatik örnekleyici G 1313 A

Otomatik pipetler Eppendorf

Ön kolon (Oktadodesil silikajel C 18) Hichrom

pHmetre Cyberscan pH 500

Pompa G 1311 A

Santrifüj Hettich Universal 30 RF

Terazi Mettler H54, AT201

Terazi Schimadzu Libror EB-330D

Ultrasonik banyo Transsonic 460/H

UV-görünür bölge dedektörü G 1314 A

Vorteks Janke&Kunkel VF 2

Yatay çalkalayıcı Edmond Bühler BH 2

Yazıcı HP laser 1310

Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi HP Agilent 1100

3. 2. Yöntem

3. 2. 1. Kullanılan Çözeltilerin Hazırlanışı

3. 2. 1. 1. Serum Neopterin Analizinde Kullanılan Çözeltiler

Çözeltiler, üretici firmanın hazırladığı uygulama esaslarının yer aldığı

yönergedeki şekilde hazırlandı.

a) Neopterin Enzim Konjugatı: Neopterin enzim konjugat çözeltisi kullanılmadan

önce neopterin enzim seyreltici ile hacim olarak 1:100 oranında seyreltilerek

hazırlandı.

b) Örnek Seyreltici: Kullanıma hazır halde bulunan çözelti.

c) Yıkama Tampon Çözeltisi: Konsantre halde bulunan yıkama çözeltisi

kullanılmadan önce deiyonize su ile 1:10 oranında seyreltildi.

52

d) Renk Substratı (3,3´,5,5´-Tetrametilbenzidin): Kullanıma hazır halde bulunan

substrat çözeltisi.

e) Reaksiyon Durdurma Çözeltisi: Kullanıma hazır halde bulunan seyreltik sülfürik

asit çözeltisi.

f) Neopterin Standart Çözeltileri: 0, 0,5, 1,5, 3, 6, 12, 24 ve 100 ng/ml

konsantrasyonlarında hazır neopterin standart çözeltileri.

g) Kontrol Serumları: Ölçümlerin doğruluğunu kontrol amacıyla üretici firma

tarafından sağlanan, biri negatif diğeri pozitif kontrol olarak kullanılmak üzere,

konsantrasyonları bilinen (0,94 ve 4,9 ng/ml, sırasıyla) 2 adet serum örneği.

3. 2. 1. 2. Serum Triptofan ve Kinürenin Ölçümünde Kullanılan Çözeltiler

a) Asetonitril içeren 0,015 M Potasyum Fosfat Tamponu pH 6,4:

i- 2,04 g potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) tartıldı ve 70 ml/L asetonitril içerecek

şekilde 1000 ml’ye deiyonize suyla tamamlandı.

ii- 2,61 g dipotasyum hidrojen fosfat (K2HPO4) tartıldı ve 70 ml/L asetonitril

içerecek şekilde 1000 ml’ye deiyonize suyla tamamlandı.

iii- Asetonitril içeren 0,015 M KH2PO4 ve 0,015 M K2HPO4 çözeltileri kullanılarak

0,015 M potasyum fosfat tamponu, pH: 6,4 hazırlandı.

b) 0,05 M Potasyum Fosfat Tamponu pH 6,0:

i- 0,68 g KH2PO4 tartıldı ve deiyonize su ile 100 ml’ye tamamlandı.

ii- 0,87 g K2HPO4 tartıldı ve deiyonize su ile 100 ml’ye tamamlandı.

iii- 0,05 M KH2PO4 ve 0,05 M K2HPO4 kullanılarak 0,05 M potasyum fosfat

tamponu, pH: 6,0 hazırlandı.

53

c) 2 M Trikloroasetik Asit: 3,27 g trikloroasetik asit tartıldı, deiyonize suyla

çözülerek hacim 10 ml’ye tamamlandı.

d) 1 mM Kinürenin Standart Çözeltisi: 2,08 mg tartılan L-kinürenin 10 ml

deiyonize suda çözülerek kinürenin standart çözeltisi hazırlandı.

e) 1 mM Triptofan Standart Çözeltisi: 2,04 mg olarak tartılan L-triptofan 10 ml

deiyonize suda çözülerek triptofan standart çözeltisi hazırlandı.

f) Albümin Standart Çözeltisi: 0,7 g albümin tartıldı, deiyonize suyla çözülerek

hacim 10 ml’ye tamamlandı.

3. 3. Çalışma Gruplarının Tanımlanması

Bu tez çalışması Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi, Cerrahi ve İlaç

Araştırmaları Etik Kurulu’nun 17.01.2011 tarih ve DPT 10/01-37 numaralı onayı ile

gerçekleştirilmiş, çalışma süresince Helsinki Bildirgesi ilkeleri takip edilmiştir.

Çalışma grubu Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Erişkin Hastanesi, Kan

Merkezine başvuran kan donörlerinden oluşturulmuştur. Bu tez çalışması toplam 193

katılımcı ile gerçekleştirilmiştir. Katılımcıların demografik özellikleri Tablo 3. 1’de

sunulmuştur.

54

Tablo 3. 1. Katılımcıların demografik özellikleri ve sigara alışkanlıkları.

Yaş (yıl)

Katılımcılar

n Ortalama ± SS* Minimum Maksimum

Toplam

193

33,2 ± 9,6

18

60

Erkek

149

33,5 ± 10,1

18

60

Kadın

44

32,0 ± 7,5

19

47

Sigara İçiyor

100

33,2 ± 9,6

18

59

Sigara İçmiyor

93

33,2 ± 9,6

18

60

*SS, standart sapma

Tez çalışması kapsamında katılımcılar, yaş gruplarına göre; 18-27 yaş, 28-37

yaş, 38-47 yaş ve 48-60 yaş olmak üzere dört alt gruba ayrılmış ve bu yaş alt

gruplarının özellikleri tablo 3. 2’de sunulmuştur.

Katılımcılar kan gruplarına göre de; A, B, O ve AB kan grubu olmak üzere

dört gruba ayrılmıştır. Tablo 3. 3’te kan gruplarına göre katılımcıların demografik

özellikleri sunulmuştur.

55

Tablo 3. 2. Yaş gruplarına göre katılımcıların demografik özellikleri.

Yaş grupları n Yaş (yıl)

Ortalama ± SS*

Cinsiyet

E/K

18-27

64

23,4 ± 2,8

48/16

28-37

60

31,7 ± 3,3

46/14

38-47

52

41,9 ± 3,0

39/13

48-60

17

52,7 ± 3,5

16/1

*SS, standart sapma; E, erkek; K, kadın

Tablo 3. 3. Kan gruplarına göre katılımcıların demografik özellikleri.

Yaş (yıl)

Kan

grupları

n Ortalama ± SS* Minimum

Maksimum

Cinsiyet

E/K

A

87

33,2 ± 9,5

18

60

69/18

B

32

32,0 ± 7,8

18

47

23/9

O

56

33,6 ± 10,2

18

59

42/14

AB

18

33,3 ± 10,4

22

51

15/3

*SS, standart sapma; E, erkek; K, kadın

56

Daha sonra, Rh pozitif ve negatif olmak üzere katılımcılar tekrar iki alt gruba

ayrılmıştır; bu alt grupların demografik özellikleri Tablo 3. 4’te verilmiştir.

Tablo 3. 4. Rh pozitif ve negatif olmasına göre katılımcıların demografik

özellikleri.

Yaş (yıl)

Katılımcılar

n

Ortalama ± SS*

Minimum

Maksimum

Cinsiyet

E /K

Rh (+) 175 33,3 ± 9,5 18 60 132/43

Rh (-) 18 32,3 ± 10,9 18 51 17/1

*SS, standart sapma; E, erkek; K, kadın

Çalışmaya dahil olan kan donörlerinde herhangi bir patolojinin olup olmadığı

ve ilaç kullanım durumları da sorgulanmış, ancak sağlıklı gönüllüler kan donörü

olabildiği için, bu sorgulama sonuçlarında hepatit-B yüzey antikoru pozitif olan bir

kan donörü dışında katılımcılarda değerlendirmeye alınacak herhangi bir sağlık

sorunu ile karşılaşılmamıştır.

3. 4. Serum Örneklerinin Hazırlanması

Her bir donörden alınan 5-6 ml kan örneği, 15 dakika 3000 devir/dakika

santrifüj edildi. Serum örnekleri ayrıldı ve çalışma gününe kadar -20oC’de saklandı.

Neopterinin ışığa duyarlı olma özelliği nedeniyle serum örneklerinin ayrılması,

saklanması ve ölçüm aşamalarında gün ışığından korunmasına özen gösterildi.

57

3. 5. Yöntemler

3. 5. 1. Serum Neopterin Düzeylerinin Belirlenmesi

Antikor kaplı olmayan ELISA plağı kuyucuklarına 25 µl standart veya serum

örneği veya kontrol serumu ilave edildi. Enzim konjugatı çözeltisinden plak

kuyucuklarına 100 µl ilave edildi. Plak ışıktan korunarak oda ısısında yatay

çalkalayıcıda 200 devir/dakika’da 2 saat tutuldu. İnkübasyondan sonra

kuyucuklardaki çözeltiler uzaklaştırıldı ve plak, yıkama çözeltisi ile 3 kere yıkandı.

Her bir kuyucuğa 100 µl renk substrat çözeltisi eklendi ve plak oda sıcaklığında,

ışıktan korunarak, yatay çalkalayıcıda 200 devir/dakika hızda 30 dakika inkübe

edildi. Kuyucuklara 100 µl reaksiyon durdurma çözeltisi ilave edildi. 450 nm dalga

boyunda ELISA plak okuyucuda optik dansiteler ölçüldü.

3. 5. 2. Sonuçların Hesaplanması

Sonuçlar değerlendirilirken neopterin düzeylerine karşılık gelen optik dansite

değerleri kullanılarak kalibrasyon doğrusu hazırlandı ve serum örneklerindeki

neopterin konsantrasyonları hesaplandı.

3. 5. 3. Serum Triptofan ve Kinürenin Düzeylerinin Belirlenmesi

Her bir serum örneği 0,05 M fosfat tamponu, pH: 6,0 ile 1:1 oranında

seyreltildi. 2 M trikloroasetik asit çözeltisi ilave edilerek protein çöktürme işlemi

yapıldı. Tüpler vortekslenmeyi takiben 10 dakika süreyle 13000 devir/dakika’da

santrifüjlendi. Süpernatanlar viallere aktarılarak 25 µl hacimde YPSK enjeksiyonu

yapıldı. Hareketli faz olarak asetonitril içeren potasyum fosfat tamponu kullanıldı ve

0,8 ml/dk akış hızında ölçümler yapıldı (138).

Triptofan düzeylerinin belirlenmesinde floresan dedektör (eksitasyon 285 nm,

emisyon 365 nm), kinürenin düzeylerinin saptanmasında ise ultraviyole dedektör

58

(360 nm) kullanıldı. Her iki ölçüm eş zamanlı yapıldı ve triptofan ve kinürenin

düzeyleri mol/L olarak hesaplandı.

İndolamin 2,3-dioksijenaz aktivitesini ifade etmek için, her bir örnekteki

kinürenin konsantrasyonunun, o örnekteki triptofan konsantrasyonuna oranı

(Kyn/Trp) kullanıldı.

3. 5. 4. Triptofan ve Kinürenin Ölçümleri için Yöntemin Validasyon

Çalışmaları

3. 5. 5. Yöntemin Geri Kazanım Oranının İncelenmesi

Rastgele seçilen serum örneklerindeki triptofan ve kinürenin düzeyleri

belirlendi. Aynı örneklere 0, 5, 25 ve 50 µM triptofan standart çözeltileri ve 0, 1, 5

ve 10 µM kinürenin standart çözeltileri ilave edilerek yöntemin geri elde etme

yüzdesi hesaplandı.

3. 5. 6. Yöntemin Tekrarlanabilirliğinin (Kesinliğinin) İncelenmesi

Aynı serum örneği kullanılarak, aynı gün yapılan ölçümler ile gün içi

varyasyon katsayısı (VK) bulundu. Aynı yöntemin farklı tarihlerde uygulanması

sonucu saptanan ölçümlerin sonuçları kullanılarak günler arası % VK değerleri

hesaplandı.

3. 5. 7. Yöntemin Duyarlılığının İncelenmesi

Triptofan ve kinürenin için saptanabilir alt limit (nitel limit, NTL) ile

hesaplanabilir alt limit (nicel limit, NCL) hesaplandı (172).

59

3. 5. 8. Triptofan ve Kinürenin Standart Kalibrasyon Doğrularının

Hazırlanması ve Sonuçların Hesaplanması

1 mM standart triptofan ve kinürenin çözeltilerinin çeşitli konsatrasyonlarına

karşılık gelen pik yükseklikleri kullanılarak kalibrasyon doğrusu hazırlandı.

Triptofan ve kinürenin kalibrasyon doğru denklemleri kullanılarak serum

örneklerindeki triptofan ve kinürenin konsantrasyonları ve IDO aktivitesi hesaplandı.

3. 6. İstatistiksel Değerlendirme

Ölçümler sonucunda elde edilen veriler, SPSS 11.5 istatistik yazılımı

kullanılarak değerlendirildi. Çalışma grubunda yer alan bireyleri yaşları, ortalama

değerler ve standart sapma (SS) ile, diğer sonuçlar ortalama değerler ve standart hata

(SH) ile gösterildi. Kalibrasyon doğrularının hazırlanmasında ve hesaplarda

regresyon analizi kullanıldı. Gruplar arası ortalamaların karşılaştırılması parametrik

olmayan Mann Whitney-U testi ile yapıldı. Yaş, cinsiyet, sigara içme alışkanlığı, kan

grupları, Rh pozitif ve negatif olma durumu ile triptofan, kinürenin, neopterin

konsantrasyonları ve Kyn/Trp oranı arasındaki ilişki Spearman korelasyon katsayısı

kullanılarak incelendi.

p<0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

60

4. BULGULAR

Çalışmaya %22,8’i kadın (n=44), %77,2’si erkek (n=149) olmak üzere

toplam 193 kan donörü dahil edilmiştir.

4. 1. Neopterin Düzeyleri

Neopterin düzeyleri 3.5.1.’de anlatıldığı üzere, ELISA kit kullanma talimatı

ile yapılan ölçümlerle elde edilen kalibrasyon doğrusu kullanılarak hesaplanmıştır

(Şekil 4. 1). Serum neopterin konsantrasyonları nM olarak sunulmuştur.

Şekil 4. 1. Neopterin kalibrasyon doğru örneği.

4. 2. Triptofan ve Kinürenin Düzeyleri

Triptofan ve kinürenin standart çözeltileri kullanılarak eş zamanlı elde edilen

pik örnekleri Şekil 4. 2’de verilmiştir. Şekil 4. 3’de ise rastgele seçilen bir serum

örneğine ait triptofan ve kinürenin kromatogramları gösterilmiştir.

Konsantrasyon (ng/ml)

61

Şekil 4. 2. Triptofan ve kinürenin standartlarına ait kromatogramlar.

(A): Triptofan standart örneği, (B): Kinürenin standart örneği.

Triptofan, λeks: 285 nm, λem: 365 nm; Kinürenin, λ: 360 nm. Hareketli faz:

%70 (h/h) asetonitril içeren 0,015 M potasyum fosfat tamponu, pH: 6,4. Akış hızı:

0,8 ml/dk.

Şekil 4. 3. Serum örneğine ait kromatogramlar.

(A): Triptofan örnek piki, (B): Kinürenin örnek piki.

Triptofan A Alıkonma zamanı 14 dk

Kinürenin B Alıkonma zamanı 8,7 dk

Triptofan A Alıkonma zamanı 13 dk

Kinürenin B Alıkonma zamanı 8,1 dk

62

Triptofan, λeks: 285 nm, λem: 365 nm; Kinürenin, λ: 360 nm. Hareketli faz:

hacim olarak %70 asetonitril içeren 0,015 M potasyum fosfat tamponu, pH: 6,4. Akış

hızı: 0,8 ml/dk.

4. 3. Triptofan ve Kinürenin Standart Kalibrasyon Doğru Örnekleri

Çeşitli konsantrasyonlarda hazırlanan standart triptofan ve kinürenin

çözeltileri ile kalibrasyon doğrusu hazırlanmıştır (Şekil 4. 4). Validasyon çalışmaları

ile tüm serum örneklerindeki triptofan ve kinürenin düzeyleri, ilgili kalibrasyon

doğrusuna ait denklem kullanılarak hesaplanmıştır.

y = 0,7564x + 0,1603R2 = 1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

Triptofan (uM)

Pik

Yük

sekl

iği

Şekil 4. 4. Triptofan (A) ve kinürenin (B) standartlarına ait kalibrasyon doğruları.

B

A

B

y = 0,404x + 0,0297R2 = 1

0123456789

0 5 10 15 20 25

Pik

Yük

sekl

iği

Kinürenin (uM)

63

4. 4. Triptofan ve Kinürenin Ölçümleri için Uygulanan Yöntemin Validasyon

Çalışmaları

4. 4. 1. Geri Kazanım Oranının İncelenmesi

Rastgele seçilen serum örneğine belirli miktarda triptofan ve kinürenin

standart çözeltilerinden ilave edilerek bu örneklerdeki triptofan ve kinürenin

düzeyleri YPSK yöntemi ile belirlendi ve yöntemin geri kazanım oranı hesaplandı.

Yüzde geri kazanım oranları Tablo 4. 1 ve Tablo 4. 2’de verilmiştir.

Tablo 4. 1. Triptofan için YPSK yönteminin geri kazanım yüzdesi.

TRİPTOFAN (µM)

Örnek

Örnek

Düzeyi

Eklenen

Standart

Miktarı

Beklenen

Düzey

Saptanan

Düzey

% Geri

Kazanım

Serum

30,48 0 30,48 30,48 _

Serum + St1

30,48 5 35,48 36,23 102,11

Serum + St2

30,48 25 55,48 55,89 100,73

Serum + St3

30,48 50 80,48 79,98 99,37

Ortalama geri kazanım ± SS = %100,7 ± 1,4

64

Tablo 4. 2. Kinürenin içinYPSK yönteminin geri kazanım yüzdesi.

KİNÜRENİN (µM)

Örnek Örnek

Düzeyi

Eklenen

Standart

Miktarı

Beklenen

Düzey

Saptanan

Düzey

% Geri

Kazanım

Serum

1,45

0

1,45

1,45 _

Serum + St1

1,45

1

2,45

2,30

93,87

Serum + St2

1,45

5

6,45

5,98

92,71

Serum + St3

1,45

10

11,45

11,09

96,85

Ortalama geri kazanım ± SS = %94,5 ± 2,1

4. 4. 2. Yöntemin Tekrarlanabilirliğinin (Kesinliğinin) İncelenmesi

Rastgele seçilen serum örnekleri ile aynı gün ve farklı günlerde aynı

koşullarda YPSK yöntemi ile triptofan ve kinürenin düzeyleri ölçülerek gün içi ve

günler arası ölçümlerin tekrarlanabilirliği incelendi.

Gün içi ve günler arası ölçümlerin % varyasyon katsayısı (VK) aynı gün ve

farklı günlerde üç kez ölçüm yapılarak değerlendirilmiş ve sırasıyla Tablo 4. 3 ve 4.

4’te verilmiştir.

65

Tablo 4. 3. Gün içi ölçümlere ait varyasyon katsayıları.

Gün içi, % VK

Triptofan (µM) Kinürenin (µM)

Örnek Ortalama ± SS

% VK Ortalama ± SS

% VK

1. Serum

57,10 ± 0,69 % 1,20 2,45 ± 0,02 % 0,620

2. Serum

65,67 ± 0,51 % 0,77 2,90 ± 0,02 % 0,524

3. Serum

64,25 ± 0,70 % 1,09 2,17 ± 0,01

% 0,460

Ortalama VK ± SS = % 1,02 ± 0,2 Ortalama VK ± SS=% 0,53 ± 0,1

Tablo 4. 4. Günler arası ölçümlere ait varyasyon katsayıları.

Günler arası, % VK

Triptofan (µM) Kinürenin (µM)

Örnek Ortalama ± SS

% VK Ortalama ± SS

% VK

1. Serum 50,78 ± 0,11 % 0,22 2,08 ± 0,02 % 0,96

2. Serum 50,93 ± 0,22 % 0,43 2,14 ± 0,02 % 0,93

3. Serum 48,62 ± 3,09 % 6,36 2,19 ± 0,13 % 5,93

Ortalama VK ± SS = % 2,34 ± 3,5 Ortalama VK ± SS = % 2,61 ± 2,9

66

4. 4. 3. Yöntemin Duyarlılığının İncelenmesi

Triptofan ve kinürenin için saptanabilir alt limiti ifade eden nitel limit (NTL)

ve nicel limit (NCL) incelenmiş ve yöntemin duyarlılığını gösteren bu değerler Tablo

4. 5’te sunulmuştur.

Tablo 4. 5. Triptofan ve kinürenin için nitel limit ve nicel limit.

Yöntemin Duyarlılığı Triptofan (µM) Kinürenin (µM)

NTL 3,18 0,98

NCL 9,65 2,97

4. 5. Katılımcıların Neopterin, Kinürenin ve Triptofan Düzeyleri

Tez çalışmasındaki tüm kan donörlerinin serum örneklerinde belirlenen

triptofan, kinürenin ve neopterin düzeyleri ile IDO aktivitesi (Kyn/Trp) Tablo 4. 6’da

sunulmuştur. Aynı tabloda cinsiyete ve sigara alışkanlığının olup olmamasına göre

neopterin, triptofan ve kinürenin konsantrasyonları ve IDO aktivitesi gösterilmiştir.

67

Tablo 4. 6. Katılımcıların serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin

düzeyleri.

Ortalama ± SH

(Minimum - Maksimum)

n

Triptofan

(µmol/L)

Kinürenin

(µmol/L)

Kyn/Trp

(mol/mmol)

Neopterin

(nmol/L)

Katılımcılar 193

64,8 ± 0,9

(17,8 - 100,6)

2,4 ± 0,04

(0,4 - 4,2)

37,2 ± 0,7

(17,2 - 76,4)

8,0 ± 0,3

(2,8 - 36,8)

Erkek 149

66,0 ± 0,9

(40,4 - 100,6)

2,5 ± 0,05

(1,2 - 4,2)

38,0 ± 0,8

(21,2 - 76,4)

7,9 ± 0,3

(3,0 - 22,6)

Cin

siyet

Kadın 44

60,5 ± 2,0*

(17,8 - 82,0)

2,1 ± 0,1*

(0,4 - 3,5)

34,5 ± 1,5*

(17,2 - 57,4)

8,4 ± 0,9

(2,8 - 36,8)

Var 100

64,5 ± 1,1

(42,9 - 100,6)

2,4 ± 0,06

(1,2 - 3,9)

37,3 ± 1,02

(21,2 - 68,0)

8,2 ± 0,5

(3,0 - 36,8)

Siga

ra Yok 93

65,1 ± 1,3

(17,8 - 100,6)

2,4 ± 0,07

(0,4 - 4,2)

37,0 ± 1,0

(17,2 - 76,4)

7,9 ± 0,4

(2,8 - 20,3)

Erkek katılımcılara göre, * p<0,05

68

Cinsiyetin triptofan, kinürenin, neopterin düzeyleriyle ve IDO aktivitesiyle

ilişkisi değerlendirilmiştir. Triptofan ve kinürenin düzeylerinin ve IDO aktivitesinin

kadınlarda erkeklere göre daha düşük olması istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur

(p<0,05). Neopterin düzeylerinin kadınlarda daha yüksek bulunması ise istatistiksel

olarak anlamlı değildir (p>0,05), (Bkz Şekil 4. 5).

454851545760636669

Erkek Kadın

Trip

tofa

n (u

M)

1,51,71,92,12,32,52,7

Erkek KadınK

inür

enin

(uM

)

0

2

4

6

8

10

Erkek Kadın

Neo

pter

in (n

M)

25

28

31

34

37

40

Erkek Kadın

Kyn

/Trp

(mik

rom

ol/m

mol

)

Şekil 4. 5. Cinsiyete göre serum triptofan (p=0,036), kinürenin (p=0,001), neopterin

(p=0,861) ve Kyn/Trp (p=0,038) konsantrasyonlarının karşılaştırılması (* p<0,05).

Tüm katılımcılarda, sigara içmenin ölçülen parametrelere etkisi araştırıldı.

Sigara içmenin triptofan, kinürenin ve neopterin düzeylerini ve IDO aktivitesini

değiştirmediği bulunmuştur (tümü, p>0,05), (Bkz Şekil 4. 6).

* * *

69

50

55

60

65

70

Var Yok

Trip

tofa

n (u

M)

1

1,3

1,6

1,9

2,2

2,5

2,8

Var Yok

Kin

üren

in (u

M)

566778899

1010

Var Yok

Neo

pter

in (n

M)

2527293133353739

Var Yok

Kyn

/Trp

(mik

rom

ol/m

mol

)

Şekil 4. 6. Sigara içme alışkanlığının serum triptofan (p=0,539), kinürenin (p=0,916),

Kyn/Trp (p=0,828) ve neopterin (p=0,723) konsantrasyonlarına etkisi (tümü,

p>0,05).

Yaş gruplarına göre katılımcıların ortalama triptofan, kinürenin ve neopterin

konsantrasyonları ve Kyn/Trp oranı Tablo 4. 7’de verilmiştir.

Yaş grupları arasında parametrelerdeki değişikliklere bakıldığında; triptofan

(p=0,411) ve kinürenin (p=0,059) düzeylerindeki yaşa bağlı değişiklik istatistiksel

olarak anlamlı bulunmamıştır. Buna rağmen IDO aktivitesindeki (p=0,005) yaşa

paralel artış, neopterin düzeylerindeki (p=0,032) 38-47 yaş grubuna kadar yaşın

artışına paralel gözlenen artış anlamlı bulunmuş ve neopterin düzeylerindeki 48-60

yaş grubundaki azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (Bkz Şekil 4. 7).

70

Tablo 4. 7. Yaş gruplarına göre triptofan, kinürenin ve neopterin

konsantrasyonları ve Kyn/Trp oranı.

Ortalama ± SH

(Minimum - Maksimum)

Yaş alt

gruplarına

göre

katılımcılar

n

Triptofan

(µmol/L)

Kinürenin

(µmol/L)

Kyn/Trp

(mol/mmol)

Neopterin

(nmol/L)

18-27 64

66,7 ± 1,4

(42,9 - 94,7)

2,2 ± 0,06

(1,4 - 3,7)

34,2 ± 1,1

(22,0 - 61,3)

7,1 ± 0,5

(2,8 - 20,3)

28-37 60

63,8 ± 1,8

(17,8 - 100,6)

2,4 ± 0,1

(0,4 - 3,9)

37,2 ± 1,4

(17,2 - 68,0)

8,1 ± 0,5*

(3,1 - 18,3)

38-47 52

65,2 ± 1,4

(47,4 - 100,6)

2,5 ± 0,1*

(1,5 - 4,2)

39,1 ± 1,3*

(23,1 - 67,2)

9,2 ± 0,8*

(3,5 - 36,8)

48-60 17

63,2 ± 3,1

(45,3 - 87,3)

2,6 ± 0,2*

(1,3 - 4,1)

41,6 ± 2,8*

(26,2 - 76,4)

7,5 ± 0,7

(3,8 - 15,4)

18-27 yaş grubuna göre, * p<0,05

Triptofan düzeylerinde, yaş grupları arasındaki değişiklik istatistiksel olarak

anlamlı bulunmamıştır (tümü, p>0,05).

Kinürenin düzeyleri 18-27 yaş grubuna göre, hem 38-47 yaş grubunda

(p=0,009) hem de 48-60 yaş grubunda (p=0,045), istatistiksel olarak anlamlı

yüksek bulunmuştur.

71

Neopterin düzeyleri 18-27 yaş grubuna göre, 28-37 yaş grubunda (p=0,036)

ve 38-47 yaş grubunda (p=0,006), istatistiksel olarak anlamlı yüksek

bulunmuştur.

Yaş grupları arasında Kyn/Trp oranına bakıldığında, 18-27 yaş grubuna göre,

38-47 yaş grubunda (p=0,001) ve 48-60 yaş grubunda (p=0,007), istatistiksel

olarak anlamlı yüksek bulunmuştur.

4045

505560

6570

18-27 28-37 38-47 48-60

Trip

tofa

n (u

M)

0,5

1

1,5

2

2,5

3

18-27 28-37 38-47 48-60

Kin

üren

in (u

M)

0

2

4

6

8

10

18-27 28-37 38-47 48-60

Neo

pter

in (n

M)

20

25

30

35

40

45

50

18-27 28-37 38-47 48-60

Kyn

/Trp

(mik

rom

ol/m

mol

)

Şekil 4. 7. Yaş grupları arasında serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin

konsantrasyonlarının karşılaştırılması, * p<0,05; 18-27 yaş grubuna göre.

* * * * * *

72

Katılımcıların kan gruplarına göre ortalama triptofan, kinürenin ve neopterin

konsantrasyonları ve Kyn/Trp oranı Tablo 4. 8’de verilmiştir.

Tablo 4. 8. Kan gruplarına göre triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin

konsantrasyonları.

Kan gruplarında, triptofan, kinürenin, neopterin düzeylerindeki ve IDO

aktivitesindeki değişiklikler istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (tümü,

p>0,05), (Bkz Şekil 4. 8).

Ortalama ± SH

(Minimum - Maksimum)

Katılımcılar

n

Triptofan

(µmol/L)

Kinürenin

(µmol/L)

Kyn/Trp

(mol/mmol)

Neopterin

(nmol/L)

A Rh (+/-) 81/6

65,3 ± 1,2

(42,9 -100,6)

2,5 ± 0,1

(1,3 - 4,2)

38,2 ± 1,1

(23,1 - 76,4)

8,4 ± 0,5

(3,2 - 22,6)

B Rh (+/-) 28/4

63,3 ± 2,6

(17,8 - 100,6)

2,2 ± 0,1

(0,4 - 3,5)

34,9 ± 1,6

(21,2 - 54,1)

6,6 ± 0,5

(2,8 - 14,5)

AB Rh (+/-) 16/2

67,8 ± 1,9

(57,1 - 80,2)

2,2 ± 0,1

(1,5 - 3,2)

33,4 ± 1,9

(20,2 - 47,5)

8,1 ± 0,7

(3,5 - 15,0)

O Rh (+/-) 50/6

63,8 ± 1,6

(23,2 - 89,2)

2,4 ± 0,1

(0,4 - 3,8)

38,1 ± 1,4

(17,2 - 67,2)

8,2 ± 0,6

(3,0 - 36,8)

73

40

45

50

55

60

65

70

A B AB O

Trip

tofa

n (u

M)

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

A B AB O

Kin

üren

in (u

M)

0123456789

10

A B AB O

Neo

pter

in (n

M)

10

15

20

25

30

35

40

A B AB O

Kyn

/Trp

(mik

rom

ol/m

mol

)

Şekil 4. 8. Kan grupları arasında serum triptofan, kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin

konsantrasyonlarının karşılaştırılması (tümü, p>0,05).

Katılımcıların Rh pozitif ve negatif olmasına göre ortalama triptofan,

kinürenin ve neopterin konsantrasyonları ve Kyn/Trp oranı Tablo 4. 9’da verilmiştir.

74

Tablo 4. 9. Rh pozitif ve negatif olmasına göre katılımcıların serum triptofan,

kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin konsantrasyonları.

Katılımcıların Rh pozitif ve negatif olmasına göre serum triptofan, kinürenin,

Kyn/Trp ve neopterin konsantrasyonları arasındaki değişiklikler istatistiksel olarak

anlamlı bulunmamıştır (tümü, p> 0.05) (Bkz Şekil 4. 9).

50

55

60

65

70

Rh (+) Rh (-)

Trip

tofa

n (u

M)

1

1,5

2

2,5

3

Rh (+) Rh (-)

Kin

üren

in (u

M)

02468

10

Rh (+) Rh (-)

Neo

pter

in (n

M)

20

25

30

35

40

45

Rh (+) Rh (-)Kyn/

Trp

(mik

rom

ol/m

mol

)

Şekil 4. 9. Rh pozitif ve negatif olmasına göre katılımcıların serum triptofan,

kinürenin, Kyn/Trp ve neopterin konsantrasyonlarının karşılaştırılması (tümü,

p>0,05).

Ortalama ± SH

(Minimum - Maksimum) Katılımcılar n Triptofan (µmol/L)

Kinürenin (µmol/L)

Kyn/Trp (mol/mmol)

Neopterin (nmol/L)

Rh (+) 175 64, 7 ± 0,9 (17,8 - 100,6)

2,4 ± 0,1 (0,4 - 4,2)

36,9 ± 0,8 (17,2 - 76,4)

8,1 ± 0,3 (2,8 - 36,8)

Rh (-) 18 65,6 ± 2,1

(52,3 - 87,1)

2,6 ± 0,1

(1,6 - 3,6)

40,0 ± 2,5

(26,6 - 67,2)

7,3 ± 0,7

(3,8 - 16,1)

75

Tüm katılımcılarda yaş ile triptofan (Şekil 4. 10), kinürenin (Şekil 4. 11),

Kyn/Trp oranının (Şekil 4. 12) ve neopterin (Şekil 4. 13) düzeylerinin değişip

değişmediği araştırılmıştır.

y = -0,0527x + 66,546R2 = 0,0019

020406080

100120

0 10 20 30 40 50 60 70

Yaş (Yıl)

Tri

ptof

an (u

M)

Şekil 4. 10. Yaş ile serum triptofan değişimi.

y = 0,0136x + 1,9184R2 = 0,045

0

1

2

3

4

5

0 10 20 30 40 50 60 70

Yaş (Yıl)

Kin

üren

in (u

M)

Şekil 4. 11. Yaş ile serum kinürenin değişimi.

76

y = 0,2467x + 28,899R2 = 0,0577

0

20

40

60

80

100

0 10 20 30 40 50 60 70

Yaş (Yıl)

Kyn

/Trp

(mik

rom

ol/m

mol

)

Şekil 4. 12. Yaş ile serum Kyn/Trp oranının değişimi.

y = 0,055x + 6,1839R2 = 0,0155

05

10152025303540

0 10 20 30 40 50 60 70

Yaş (Yıl)

Neo

pter

in (n

M)

Şekil 4. 13. Yaş ile serum neopterin değişimi.

Triptofan düzeyleri ile yaş arasında bulunan negatif ilişkinin istatistiksel

olarak anlamlı olmadığı saptanmıştır (p>0,05). Neopterin ve kinürenin düzeyleri ve

IDO aktivitesinin yaş ile pozitif ilişki gösterdiği saptanmıştır. Kinürenin (p=0,004)

ve neopterin (p=0,012) düzeylerindeki ve IDO aktivitesindeki (p<0,001) yaşa paralel

artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (Tablo 4. 10).

77

Tablo 4. 10. Yaş ile ölçülen parametreler arasındaki ilişki.

Parametreler

rs

p

Yaş-Trp

-0,088

0,226

Yaş-Kinürenin

0,208

0,004

Yaş-Kyn/Trp

0,249

< 0,001

Yaş-Neopterin

0,181

0,012

Yaş alt gruplarına göre katılımcılarda ölçülen parametreler arasındaki ilişki

değerlendirildiğinde (Tablo 4. 11);

18-27 yaş grubunda neopterin ile kinürenin ve triptofan ile kinürenin arasında

pozitif ve istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki bulunmuştur (p<0,05). Buna

rağmen, neopterin ile triptofan ve neopterin ile Kyn/Trp oranı arasındaki

pozitif ilişki istatistiksel olarak anlamlı değildir (p>0,05).

28-37 yaş grubunda neopterin ile kinürenin, Kyn/Trp oranı ve triptofan ile

kinürenin arasında pozitif ve istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05) bir ilişki

bulunmuştur, neopterin ile triptofan arasındaki pozitif ilişki ise istatistiksel

olarak anlamlı bulunmamıştr (p>0,05).

38-47 yaş grubunda neopterin ile kinürenin ve Kyn/Trp oranı arasında ve

triptofan ile kinürenin arasında pozitif bir ilişki olduğu saptanmıştır. Ancak

sadece neopterin ile Kyn/Trp oranı arasındaki bu ilişki istatistiksel olarak

anlamlı bulunmuştur (p<0,05). Neopterin ve triptofan arasındaki negatif ilişki

de istatistiksel açıdan anlamlı bulunmuştur (p<0,05).

78

48-60 yaş grubunda neopterin ile kinürenin ve Kyn/Trp oranı arasında ve

triptofan ve kinürenin arasında pozitif bir ilişki bulunmuştur. Bununla beraber

yalnızca triptofan ile kinürenin arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı

bulunmuştur (p<0,05). Neopterin ve triptofan arasındaki negatif ilişkinin ise

istatistiksel açıdan anlamlı olmadığı bulunmuştur (p>0,05).

Tablo 4. 11. Yaş gruplarında parametreler arasındaki ilişki.

Neopterin-

Trp

Neopterin-

Kyn

Neop-

Kyn/Trp

Trp-Kyn Yaş alt

gruplarına

göre

katılımcılar rs (p)

18-27

0,098 (0,442)

0,254 (0,043)*

0,181 (0,153)

0,256 (0,042)*

28-37

0,101 (0,445) 0,579 (<0,001)* 0,541 (<0,001)* 0,397 (0,002)*

38-47

-0,390 (0,004)* 0,093 (0,513) 0,346 (0,012)* 0,205 (0,145)

48-60

-0,181 (0,486) 0,132 (0,613) 0,331 (0,195) 0,520 (0,033)*

* p<0,05

Tüm katılımcılarda ölçülen parametreler arasındaki ilişki değerlendirilmiştir.

Neopterin ile hem kinürenin, hem de Kyn/Trp oranı arasında ve triptofan ile

kinürenin düzeyleri arasında pozitif ve istatistiksel olarak anlamlı (p<0,05)

bir ilişki, neopterin ile triptofan arasında ise negatif ve anlamlı olmayan bir

ilişki olduğu belirlenmiştir (p>0,05).

79

Kadınlarda ve erkeklerde ölçülen parametreler arasındaki ilişki

değerlendirildiğinde, neopterin ile triptofan arasında hem erkeklerde hem de

kadınlarda negatif ve istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki

bulunmuştur (p>0,05). Erkek ve kadınlarda neopterin ile kinürenin ve

Kyn/Trp oranı arasında, triptofan ve kinürenin düzeyleri arasında pozitif bir

ilişkinin olduğu ve bu ilişkinin istatistiksel olarak anlamlı olduğu saptanmıştır

(p<0,05), (Tablo 4. 12).

Tablo 4. 12. Cinsiyete göre parametreler arasındaki ilişki.

Neopterin-

Trp

Neopterin-

Kyn

Neop-

Kyn/Trp

Trp-Kyn Katılımcılar

(n)

rs (p)

Toplam (193)

-0,076 (0,293) 0,361 (<0,001)* 0,399 (<0,001)* 0,266 (<0,001)*

Kadın (49)

-0,151 (0,327) 0,344 (0,022)* 0,480 (0,001)* 0,319 (0,035)*

Erkek (144)

-0,041 (0,621) 0,380 (<0,001)* 0,370 (<0,001)* 0,227 (0,005)*

* p<0,05

Sigara içme alışkanlığına göre ölçülen parametreler arasındaki ilişki

araştırıldığında ise (Tablo 4. 13);

Sigara içen katılımcılarda, neopterin ile kinürenin, Kyn/Trp oranı arasında,

triptofan ile kinürenin arasında pozitif ve istatistiksel açıdan anlamlı bir ilişki

saptanmıştır (p<0,05), neopterin ile triptofan arasında ise negatif ve

istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki saptanmıştır (p>0,05).

80

Sigara içmeyen katılımcılarda ise, sigara içenlerdekine benzer bir durumun

söz konusu olduğu belirlenmiştir. Neopterin ile kinürenin, Kyn/Trp oranı

arasında, triptofan ve kinürenin arasında pozitif ve istatistiksel olarak anlamlı

bir ilişki bulunurken (p<0,05), neopterin ile triptofan arasında negatif ve

istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki saptanmıştır (p>0,05), (Tablo 4.

13).

Tablo 4. 13. Sigara içme alışkanlığına göre katılımcılarda belirlenen

parametreler arasındaki ilişki.

Neopterin-Trp

Neopterin-Kyn Neop-Kyn/Trp Trp-Kyn

rs (p)

Sigara içen

katılımcılar

-0,189 (0,060)

0,360 (<0,001)* 0,456 (<0,001)* 0,228 (0,022)*

Sigara

içmeyen

katılımcılar 0,049 (0,638) 0,341 (0,001)* 0,307 (0,003)* 0,271 (0,009)*

* p<0,05

Rh pozitif ve negatif olarak ayrılan katılımcılarda belirlenen parametreler

arasında herhangi bir ilişkinin olup olmadığı saptanmıştır (Tablo 4. 14).

Rh (+) katılımcılarda; neopterin ile kinürenin, Kyn/Trp oranı arasında ve

triptofan ile kinürenin arasında istatistiksel anlamlı pozitif bir ilişki

bulunmuştur (p<0,05). Neopterin ile triptofan arasında ise negatif ve

istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki olduğu belirlenmiştir (p>0,05).

Rh (-) katılımcılarda; neopterin ile triptofan arasında negatif, neopterin ile

kinürenin, Kyn/Trp oranı arasında ve triptofan ile kinürenin arasında

istatistiksel olarak anlamlı olmayan pozitif bir ilişki bulunmuştur (tümü,

p>0,05).

81

Tablo 4. 14. Rh (+) ve (-) durumuna göre katılımcılarda belirlenen

parametreler arasındaki ilişki.

Neopterin-Trp Neopterin-

Kyn

Neop-Kyn/Trp Trp-Kyn

Katılımcılar rs (p)

Rh (+)

-0,075 (0,326) 0,374 (<0,001)* 0,408 (<0,001)* 0,270 (<0,001)*

Rh (-)

-0,147 (0,561) 0,113 (0,656) 0,190 (<0,450) 0,131 (<0,604)

* p<0,05

Kan gruplarında parametreler arasındaki ilişki değerlendirildiğinde (Tablo 4. 15);

A kan grubuna sahip olanlarda neopterin ile kinürenin, Kyn/Trp oranı

arasında, triptofan ve kinürenin arasında pozitif ve istatistiksel olarak anlamlı

bir ilişki bulunmuştur (p<0,05); neopterin ile triptofan arasında negatif ve

istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki bulunmuştur (p>0,05).

B kan grubuna sahip olan bireylerde neopterin ile kinürenin, Kyn/Trp oranı

arasında ve triptofan ile kinürenin arasında pozitif bir ilişki bulunmuştur.

Neopterin ve kinürenin ve Kyn/Trp oranı arasında istatistiksel açıdan anlamlı

(p<0,05) bir ilişki olmasına rağmen, triptofan ve kinürenin arasındaki ilişki

istatistiksel olarak anlamlı değildir (p>0,05). Neopterin ve triptofan arasında

ise negatif ve istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir ilişki belirlenmiştir

(p>0,05).

O kan grubuna sahip olanlarda ise B kan grubundaki benzer şekilde neopterin

ile kinürenin, Kyn/Trp oranı arasında ve triptofan ile kinürenin arasında

pozitif bir ilişki bulunmuştur. Neopterin ve kinürenin ve Kyn/Trp oranı

82

arasında istatistiksel açıdan anlamlı (p<0,05) bir ilişki olmasına rağmen,

triptofan ve kinürenin arasındaki ilişki anlamlı değildir (p>0,05). Neopterin

ve triptofan arasında ise negatif ve istatistiksel olarak anlamlı olmayan bir

ilişki olduğu belirlenmiştir (p>0,05).

AB kan grubuna sahip olanlarda neopterin ile triptofan, kinürenin ve Kyn/Trp

oranı arasında, triptofan ve kinürenin arasında pozitif bir ilişki olduğu

bulunmuştur Ancak parametreler arasındaki bu ilişkilerin istatistiksel olarak

anlamlı olmadığı saptanmıştır (tümü, p>0,05).

Tablo 4. 15. Kan gruplarında parametreler arasındaki ilişki.

Neopterin-

Trp

Neopterin-Kyn Neop-Kyn/Trp Trp-Kyn Kan

grubuna

göre

katılımcılar rs (p)

A

-0,129 (0,234)

0,317 (0,003)*

0,354 (0,001)*

0,282 (0,008)*

B

-0,010 (0,956)

0,527 (0,002)*

0,517 (0,002)*

0,313 (0,081)

O

-0,099 (0,469)

0,283 (0,034)*

0,434 (0,001)*

0,247 (0,066)

AB

0,207 (0,411)

0,228 (0,362)

0,221 (0,378)

0,018 (0,945)

* p<0,05

4. 6. Ölçülen Parametrelerin Normal Sınırlara Göre Değerlendirilmesi

Çalışmaya alınan 193 kan donörünün 188’inde (%97,4) neopterin düzeyi

normal sınırlarda (3,7-19 nmol/L), 5’inde (%2,6) ise yüksek (>19 nmol/L)

bulunmuştur. Neopterin düzeyi yüksek olanların 3’ünün (%2,0) erkek, 2’sinin (%4,5)

kadın olduğu saptanmıştır (Tablo 4. 16).

83

Tablo 4. 16. Neopterin düzeylerinin cinsiyete göre dağılımı.

Neopterin düzeyi

Yüksek

n (%)

Normal

n (%)

Toplam

n (%)

Toplam

5 (2,6)

188 (97,4)

193 (100)

Kadın

2 (4,5)

42 (95,5)

44 (100)

Erkek

3 (2,0)

146 (98,0)

149 (100)

Kan donörlerinin 171’inde (%88,6) triptofan düzeyi normal sınırlarda (73 ±

15 mol/L), 22’sinde (%11,4) ise yüksek (>78 mol/L) bulunmuştur. Triptofan düzeyi

yüksek olanların 18’inin (%12,1) erkek, 4’ünün (%9,1) kadın olduğu saptanmıştır

(Tablo 4. 17).

Tablo 4. 17. Triptofan düzeylerinin cinsiyete göre dağılımı.

Triptofan düzeyi

Yüksek

n (%)

Normal

n (%)

Toplam

n (%)

Toplam

22 (11,4)

171 (88,6)

193 (100)

Kadın

4 (9,1)

40 (90,9)

44 (100)

Erkek

18 (12,1)

131 (87,9)

149 (100)

193 kan donörünün 118’inde (%61,1) kinürenin düzeyi normal sınırlarda

(1,92 ± 0,58 µmol/L), 75’inde (%38,9) ise yüksek (>2,5 µmol/L) bulunmuştur.

Kinürenin düzeyi yüksek olanların 65’inin (%43,6) erkek, 10’unun (%22,7) kadın

olduğu saptanmıştır (Tablo 4. 18).

84

Tablo 4. 18. Kinürenin düzeylerinin cinsiyete göre dağılımı.

Kinürenin düzeyi

Yüksek

n (%)

Normal

n (%)

Toplam

n (%)

Toplam

75 (38,9)

118 (61,1)

193 (100)

Kadın

10 (22,7)

34 (77,3)

44 (100)

Erkek

65 (43,6)

84 (56,4)

149 (100)

Çalışmaya alınan 193 kan donörünün 94’ünde (%48,7) Kyn/Trp oranı normal

sınırlarda (26,9 ± 8,1 mol/mmol), 99’unda (%51,3) ise yüksek (>35) bulunmuştur.

Kyn/Trp oranı yüksek olanların 84’ünün (%56,4) erkek, 15’inin (%34,1) kadın

olduğu saptanmıştır (Tablo 4. 19).

Tablo 4. 19. Kyn/Trp oranının cinsiyete göre dağılımı.

Kyn/Trp oranı

Yüksek

n (%)

Normal

n (%)

Toplam

n (%)

Toplam

99 (51,3)

94 (48,7)

193 (100)

Kadın

15 (34,1)

29 (65,9)

44 (100)

Erkek

84 (56,4)

65 (43,6)

149 (100)

85

5. TARTIŞMA VE SONUÇ

Neopterin, T lenfositleri tarafından salgılanan INF-γ uyarımı ile

monosit/makrofajlar ve dendritik hücrelerinden GTP-siklohidrolaz I enzimi aracılığı

ile sentezlenen, konjuge olmayan bir pteridindir (9).

İmmün sistem aktivasyonunda anahtar rol oynayan neopterinin, biyolojik

sıvılardaki düzeylerinin ölçülmesi ile enfeksiyon hastalıkları, otoimmünite, kanser

hastalıkları, organ nakillerinde, nörolojik ve kardiyovasküler hastalıklar başta olmak

üzere pekçok durumda klinik olarak değer taşıyan bir parametre haline gelmiştir

(113).

Neopterin, viral enfeksiyonlarda semptomlar başlamadan önce inkübasyon

döneminde yükselmesi nedeniyle kan bankacılığında ayrı bir öneme sahiptir (8-10,

20, 112, 113, 118, 173).

Bu konuda ilk çalışma, Avusturya’da Innsbruck Üniversitesi Kan

Merkezi’nde gerçekleştirilmiştir. Honlinger ve arkadaşları, 1986-1988 yılları

arasında 76 587 kan donöründe HBsAg, ALT, TPHA ve anti-HIV testleri ile birlikte

neopterin düzeylerini de araştırmışlardır (20). Neopterin düzeyi >10 nmol/L olarak

bulunan 1242 donörden 650’si (%52,3) 4 hafta boyunca takip edilmiştir. İzlem

sonunda 435 (%66,9) donörde neopterin düzeyinin normale döndüğü ancak 215

(%33) donörde yüksek değerlerin devam ettiği görülmüştür. İleri tıbbi incelemeye

alınan 215 donörden 123’ünde (%57) çeşitli enfeksiyon hastalıkların varlığı dikkati

çekmiştir. Bunların; 83’ünde influenza, 6’sında akut toksoplazma, 6’sında akut

tonsilit, 4’ünde sinüzit, 4’ünde granülom, geri kalanlarda prostat, enterit ve diğer

enfeksiyonlar saptanmıştır. Bu geniş kapsamlı çalışmada, neopterin düzeyi yüksek

olanlarda değişik inflamatuar ve kanser hastalıkları da ayrıca saptanmıştır. Elde

edilen bulgular üzerine Alman Hekimler Birliği, transfüze edilecek kanlarda

neopterin düzeylerinin taranması önerisini, ulusal kan bankası klavuzlarına

eklemişlerdir. Daha sonra, Avusturya Hükümeti tarafından kanunlaştırılan bu

uygulama ile 1993 yılından bu yana Avusturya’daki kan bankalarında bütün kan

86

donölerine rutin neopterin taraması yapılması ve diğer tüm belirleyicileri negatif olsa

bile neopterin düzeyi yüksek olanların kanları, transfüzyonda kullanılmaması

sağlanmıştır (167).

Avusturya’da aynı merkezde Schennach ve arkadaşlarının 1998 yılında

54.402 kan donörü üzerinde yaptıkları retrospektif çalışmada ise, donörlerin 328’inde

(%0,6) ELISA ile ve 19’unda (%0,035) PCR ile HCV pozitifliği saptanmıştır.

Yapılan bu incelemede, ELISA pozitif örneklerin % 13,4’ünde, PCR pozitif

örneklerin ise %36,8’inde neopterin düzeyinin yüksek olduğu belirlenmiştir.

Araştırıcılar, HCV-PCR pozitifliği ile yüksek neopterin düzeyi arasında istatistiksel

olarak anlamlı bir ilişki olduğunu rapor etmişlerdir. Sadece akut ve semptomatik

HCV enfeksiyonlarında değil, ribonükleik asit (RNA) pozitif asemptomatik kronik

taşıyıcılarda da neopterin düzeyinin arttığını bildirmişlerdir. Bu çalışmada, kan

bağışında neopterin taramasının enfeksiyon riskini azaltmaya katkıda bulunduğu

vurgulanmıştır (66).

Organizmadaki olası değişlikleri önceden belirlemek için özellikle rutin

analizlerde, erken ve güvenilir biyogöstergelerin kullanımına ihtiyaç vardır. Primer

ve/veya sekonder gelişebilecek sağlıkla ilgili olumsuzlukları ve ekonomik kayıpları

azaltmada ve hatta önlemede etkili olabilecekleri düşünülmektedir. Bilindiği üzere,

sadece uygun biyogöstergelerle erken ve doğru tanı ve de etkin tedavi sağlanabilir.

Bu nedenle 1988’den bu yana Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ) yeni ve etkin

biyogösterge çalışmalarını desteklemektedir (174).

Kan transfüzyonunda donör sorgulaması ve rutin tarama testleri

uygulanmasına rağmen, transfüzyonla bulaşan enfeksiyonların tamamen ortadan

kaldırılması mümkün olmamıştır. Kan donörlerinde yapılan geniş kapsamlı

çalışmalar ile hücresel immün yanıtın erken ve duyarlı bir belirleyicisi olan neopterin

düzeylerinin, kan donörlerinde taranmasıyla kan transfüzyonlarının güvenirliliğinin

artırılması sağlanabileceği bildirilmektedir. (66, 166).

87

İnterferon-γ, hem monosit ve makrofajlardan neopterin salınımını uyarır, hem

de triptofanın, kinürenin yolağı vasıtasıyla yıkımını sağlayan IDO’ yu indükler. Bu

nedenle hücresel immün aktivasyonun eşlik ettiği hastalıklarda artmış neopterin

oluşumuna paralel olarak, artmış triptofan yıkımı görülmektedir. Neopterin

konsantrasyonlarının ölçümü ve Kyn/Trp oranının tayini immün aktivasyonun

derecesinin hassas bir şekilde belirlenmesine ve birbirlerini desteklemesine olanak

tanımaktadır (41, 175).

Kan donörlerinin neopterin ve kinürenin ve triptofan düzeylerinin

belirlenmesinde kullanılan yöntemlerden yüksek performanslı sıvı kromatografisi,

çok sayıda örneğin hızlı bir şekilde analizinde veya acil sonuç gereken durumlarda

her zaman avantajlıdır. Analiz maliyetinin düşük, uygulanabilirliğinin kolay ve

güvenirliliğinin yüksek olması gibi önemli tercih nedenleri vardır. Buna ilave olarak,

tek bir enjeksiyon ile birden fazla bileşiğin analizinin yapılabilmesine olanak

sağlamaktadır. Ancak tez kapsamında serum örneklerinde neopterin düzeylerinin

belirlenmesinde, yüksek protein içeriği nedeni ile doğrudan yüksek performanslı sıvı

kromatografisine enjeksiyon yapılamayacağı için, bu yöntem tercih edilememiştir.

Serum neopterin düzeylerinin belirlenmesi için, kan örneklerine uygulanması

gereken ön işlemler zaman tüketimi ve maliyet açısından klinik laboratuar

uygulamalarında dezavantajdır. Bu nedenle sunulan proje kapsamında serum

neopterin düzeylerinin belirlenmesi için ELISA yöntemi, üretici firmanın deney

yönergesi doğrultusunda uygulanmıştır. IDO aktivitesinin belirlenmesi için serum

triptofan ve kinürenin konsantrasyonları, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile

sırasıyla floresans ve ultraviyole dedektörleri kullanılarak eş zamanlı ölçülmüştür.

Belirlenen nitel ve nicel limit değerlerinin düşük olması, uygulanan yöntemin

duyarlılığının yüksek olduğunu göstermiştir. Bu çalışmada geri kazanım oranı

triptofan için yaklaşık %100,7 kinürenin için ise %94,5 olarak bulunmuştur. Gün içi

ve günler arası varyasyon katsayılarının düşük ve kararlı olduğu saptanmıştır.

Mevcut araştırmalar (67, 176) ve bölümümüzde daha önceden yapılan

pteridin çalışmaları (5, 36, 67, 70, 156, 171, 176) dikkate alındığında, neopterin

düzeylerinin normal sınırları, yetişkinler için 3,7-19 nmol/L olarak belirlenmiştir.

88

Buna göre, araştırmaya dahil olan 193 kan donörünün 188’inde (%97,4) neopterin

düzeyi normal sınırlarda, 5’inde (%2,6) ise yüksek düzeyde saptanmıştır. Serum

triptofan düzeylerinin normal sınırları yetişkinler için 73 ± 15 mol/L olarak

alınmıştır. (11). Kan donörlerinin 171’inde (%88,6) triptofan düzeyi normal

sınırlarda, 22’sinde (%11,4) ise yüksek bulunmuştur. Kinürenin için normal sınırlar

1,92 ± 0,58 µmol/L olarak kabul edilmiştir (11, 179). Buna göre 193 kan donörünün

118’inde (%61,1) kinürenin düzeyi normal sınırlarda, 75’inde (%38,9) ise yüksek

saptanmıştır. Yüksek kinürenin düzeyinin bu bireylerde ortalama >2,5 µmol/L

olduğu bulunmuştur. Kyn/Trp düzeylerinin normal sınırları 26,9 ± 8,1 mol/mmol

olarak ele alındığında ise, 193 kan donörünün 94’ünde (%48,7) Kyn/Trp oranı

normal düzeylerde, 99’unda (%51,3) ise yüksek bulunmuştur (11, 66).

Çalışmanın yapıldığı süre zarfında, %22,8 kadın katılımcının donör olarak

başvurduğu anlaşılmaktadır. Bununla beraber, sunulan bu tez çalışması kapsamında,

cinsiyetin triptofan yıkımına ve neopterin düzeylerine etki ettiği; kadınlarda,

neopterin düzeylerinin erkeklere göre daha yüksek, triptofan ve kinürenin

düzeylerinin ve bunların temsil ettiği IDO aktivitesinin ise daha düşük olduğu

bulunmuştur. Bu değişikliklerin büyük olasılıkla, hormonal durumla ilişkili

olabileceğini gösteren çalışmalar ile uyumlu olduğu anlaşılmıştır (4, 11). Ancak,

neopterin düzeylerinin cinsiyetler arası farklılık göstermediğini de bildiren

çalışmalarda mevcuttur (6, 156, 177).

Sigara içme durumunun, katılımcılarda belirlenen neopterin, triptofan,

kinürenin düzeyleri ve IDO aktivitesine etki etmediği proje kapsamında

bulunmuştur. Bu sonuçtan farklı olarak, Pertovaara ve arkadaşlarının yaptığı

çalışmada, sigara içenlerde içmeyenlere oranla daha düşük IDO aktivitesinin olduğu

belirlenmiştir. Bu durumun nikotinin ana metaboliti olan kotinin konsantrasyonuyla

ters orantılı olduğu bildirilmiştir (65). Schennach ve arkadaşlarının binden fazla

katılımcı ile yaptıkları bir çalışmada sigara içenlerde neopterin konsantrasyonlarının

da içmeyenlere oranla daha düşük olduğu rapor edilmiştir (66). Sigaranın, neopterin

konsantrasyonuna etkisi konusunda çelişkili sonuçlar mevcuttur. Bazı araştırmacılara

göre sigara içme ile neopterin düzeyleri arasında hiçbir ilişki bulunmazken, bazı

89

araştırmacılara göre sigarayı bırakmış veya hiç sigara içmemiş kişilere kıyasla sigara

içenlerde daha düşük neopterin düzeyleri saptanmıştır (64, 176).

Yaş ile ölçülen parametrelerin değişimi incelendiğinde, yaş ile triptofan

negatif, diğer parametreler pozitif ilişki göstermiştir. Yaş aralığının ölçülen

parametrelere etkisini araştırmak amacıyla katılımcılar yaş gruplarına ayrılmıştır.

Triptofan düzeylerinde yaşa bağlı değişiklik bulunmuştur. Kinürenin ve neopterin

düzeylerinde ve IDO aktivitesinde yaşa bağlı paralel artış bulunmuştur. Neopterinin

yaşla değişimi konusunda yapılan pek çok çalışmada farklı sonuçlar elde edilmekle

birlikte, neopterin düzeylerinin yaşla değişim gösterdiği bildirilmiştir (4, 67-70, 176).

Murr ve arkadaşları A, B, AB, O kan grubuna sahip 8 288 kan donöründe

neopterin konsantrasyonlarını araştırmışlar ve O kan grubuna sahip donörlerde

neopterin konsantrasyonunun A, B, AB kan grubuna sahip donörlere göre daha

yüksek olduğunu bildirmişlerdir (169). Sunulan bu tez çalışmasında ise neopterin

düzeyi yüksek olan 5 donörün 4’ünün A ve bir kişinin O kan grubunda olduğu

belirlenmiştir. Ülkemizde yapılan benzer bir çalışmada da neopterin düzeyi yüksek

olan 17 donörün 7’sinin A kan grubuna, 7’sinin O kan grubuna, 3’ünün ise B kan

grubuna sahip olduğu bildirilmiştir (166).

Tez çalışması kapsamında katılımcıların Rh pozitif ve negatif durumunun

serum neopterin, triptofan, kinürenin ve Kyn/Trp konsantrasyonlarına etkisi olup

olmadığı da araştırılmıştır. Ancak Rh durumunun ölçülen bu parametrelere etkisi

arasında istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır.

Fişenk ve arkadaşlarının 2005 yılında aynı merkezde yaptıkları çalışmada,

neopterin konsantrasyonunun yüsek olma durumu, %5,1 oranında rapor edilmiştir.

2760 dönorde yürütülen bu çalışmada, katılımcılardaki neopterin düzeylerinin 0,7-

62,1 nmol/L (ortalama 6,05 ± 3,27 nmol/L) olduğu ve %94,9 katılımcının neopterin

düzeylerinin <11 nmol/L olduğu bildirilmiştir (8). Sunulan bu tez çalışması

kapsamında katılımcılarımızın %2,6 oranında yüksek neopterin düzeyine sahip

olduğu bulunmuştur. Bu uygulamalar ülke geneline yansıtılırsa, tüm bağış kanlarının

90

%2,6’sının kullanım dışı bırakılması gerektiği düşünülebilir. Kan bağışının

yaygınlaşmadığı ve bu konuda yeterince bilincin geliştirilmediği ülkemiz için bu

oran, yüksektir. Bununla beraber, son yıllarda gelişmiş ülkelerde büyük ilgi toplayan,

ancak rutin uygulamada ekonomik yük getiren nükleik asit testlerinin, gelişmekte

olan ülkeler için uygulanması uzak bir olasılık gibi gözükmektedir. Kan

transfüzyonunda güvenilirliğin artırılması için rutin neopterin taraması, nükleik asit

testlerine göre çok daha az maliyet ve iş gücüne neden olmaktadır. Neopterin

taraması ile serolojik testlerle saptanamayan mutant suş enfeksiyonlarının, yalancı

negatif sonuçlara neden olabilecek teknik ya da uygulayıcı (teknik elaman)

hatalarının, virüs enfeksiyonları başta olmak üzere diğer birçok enfeksiyon varlığının

belirlenmesiyle donör kanlarının azami güvenilirliği sağlanabilecektir.

Sonuç olarak,

Bu çalışma kapsamında, 193 kan donöründe IDO aktivitesi hesaplanmasında

kullanılan kinürenin ve triptofan düzeyleri yüksek performanslı sıvı

kromatografisi yöntemiyle ölçülmüş, serum neopterin düzeyleri ELISA

yöntemi ile belirlenmiştir.

Kan bağışlayıcılarındaki triptofan yıkımındaki değişikliklerin immün sistem

kaynaklı olduğu neopterin düzeyleri ile gösterilmiştir.

Yaşla birlikte triptofan yıkımı ve serum neopterin düzeyleri paralel artış

göstermiştir.

Kadınlardaki neopterin konsantrasyonlarının erkeklere göre yüksek olduğu,

bununla beraber triptofan düzeylerinin düşük ve kinürenin yolağının ise daha

az etkin olduğu saptanmıştır.

Sigara kullanımının, neopterin düzeylerine ve triptofan yıkımına etki

etmediği belirlenmiştir.

91

Sıfır ve A kan grubuna sahip insanlarda/katılımcılarda serum neopterin

düzeylerinin diğer gruplara sahip olanlara göre daha yüksek olduğu

bulunmuştur. Ancak bu farklılık, istatistiksel olarak anlamsızdır.

>19 nmol/L’nin üzerindeki serum neopterin konsantrasyonu yüksek neopterin

düzeyi olarak kabul edildiğinde, neopterin konsantrasyonu %2,6 bireyde

yüksek bulunmuştur. Triptofan ve kinürenin konsantrasyonları sırasıyla

%11,4 ve %38,9 oranında normal değerlerin üzerinde olduğu saptanmıştır.

193 katılımcının %51,3’ünde IDO’yu temsil eden kinüreninin triptofana oranı

yüksek bulunmuştur.

Neopterin düzey tarama testlerinin diğer ölçümlere göre daha ucuz olması ve

özel eğitimli teknik bir elemana gereksinim duyulmaması gibi nedenlerle kan

bankalarında rutin uygulamaya alınması gerektiği önerilmektedir. Bu sayede

erken tanı ve tedavinin gerçekleştirilmesi sağlanacak ve kontamine kanın

kullanılmasına engel olunarak hem sağlık açısından katma değer hemde ileri

sağlık harcamaları önlenerek ekonomik kazanımlar sağlanacaktır.

Dolayısıyla, ülkemiz kan merkezlerinde uygulanan rutin testlerle birlikte

neopterin düzeylerinin de taranması enfeksiyon geçişinin azaltılmasına

katkıda bulunarak, nakledilen kanların daha güvenli olmasını sağlayacaktır.

92

KAYNAKLAR

1. Dünya Sağlık Örgütü Yayını. (2001). Kanın klinik kullanımı el kitabı. 2. Gül, M., Çıragil, P., Ara, M., Doğramacı, N. (2006). Gönüllü ve gönüllü

olmayan kan donörlerinde HBV, HCV, HIV ve sifiliz tarama test sonuçlarının

değerlendirilmesi. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Dergisi, 36, 35-39. 3. Werner-Felmayer, G., Golderer, G., Werner, E.R. (2002). Tetrahydrobiopterin

biosynthesis, utilization and pharmacological effects. Current Drug

Metabolism, 3(2), 159-173. 4. Wachter, H., Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Weiss, G., Werner, E.R.,

Werner-Felmayer, G. (1992). Neopterin, biochemistry, methods, clinical

application, Walter de Gruyter, Berlin, New York. 5. Baydar, T., Palabıyık, S., Şahin, G. (2009). Neopterin-günümüzün popüler

biyogöstergesi mi? Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 29(5), 1280-1291. 6. Werner, E.R., Bichler, A., Daxenbichler, G., Fuchs, D., Fuith, L.C., Hausen,

A., Hetzel, H., Reibnegger, G., Wachter, H. (1987). Determination of neopterin

in serum and urine. Clinical Chemistry, 33, 62-66. 7. Schennach, H., Murr, C., Gaecher, E., Mayersbach, P., Schonitzer, D., Fuchs,

D. (2002). Factors influencing serum neopterin concentrations in a population

of blood donors. Clinical Chemistry, 48, 643-645. 8. Fişenk, B.I., Us, D., Özcebe, O., Hasçelik, G. (2005). The value of increased

neopterin levels in reducing transfusion-transmitted virus infections: Detection

of a donation from a HBsAg positive chronic carrier by screening of neopterin

in Turkish blood donors. Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 37, 599-

604. 9. Hoffmann, G,. et al. (2003). Potential role of immune system activation

associated production of neopterin derivatives in humans. Inflammation

Research, 52, 313-321.

93

10. Hoffmann, G.,Schobersberger, W. (2004). Neoptein-a mediator of the cellular

immune system. Pteridines, 15(3),107-112. 11. Schröcksnadel, K., Wirleitner, B., Winkler, C., Fuchs, D. (2006). Monitoring

tryptophan metabolism in chronic immune activation. Clinica Chimica Acta,

364(1-2), 82-90. 12. Birdsall, T.C. (1998). 5-hydroxytryptophan: a clinically-effective serotonin

precursor. Alternative Medicine Review, 3(4), 271-280. 13. Widner, B., Laich, A., Sperner-Unterweger, B., Ledochowski, M., Fuchs, D.

(2002). Neopterin production, tryptophan degradation, and mental depression

what is the link? Brain, Behavior and Immunity, 16(5), 590-595. 14. Russo, S., Kema, I.P., Fokkema, M.R., Boon, J.C., Willemse, P.H., de Vries

E.G., den Boer J.A., Korf, J. (2003). Tryptophan as a link between

psychopathology and somatic states. Psychosomatic Medicine 65(4), 665-671. 15. Torres, M.I., López-Casado, M.A., Lorite, P., Ríos, A. (2007). Tryptophan

metabolism and indoleamine 2,3-dioxygenase expression in coeliac disease.

Clinical and Experimental Immunology, 148(3), 419-424. 16. King, N.J., Thomas, S.R. (2007). Molecules in focus: indoleamine 2,3-

dioxygenase. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology,

39(12), 2167-2172. 17. Champe, P.C., Harvey, R.A. (1994). Biochemistry Lippincotts-Illustrated

Rewiews, J.B. Lippincott Company. 18. Cesur, S. (2005). Enfeksiyonların izleminde kullanılan bir belirleyici:

Neopterin. Mikrobiyoloji Bülteni, 39, 251-260. 19. Reibnegger, G., Fuchs, D., Grubauer, G. (1984). Neopterin excretion during

incubation period, clinical manifestation and reconvalescence of viral infection,

In: Pfleiderer W, Wachter H, Curtius HC (eds). Biochemical and Clinical

Aspects of Pteridines, Berlin-New York: Walter de Gruyter, 433-447.

94

20. Honlinger, M., Fuchs, D., Hausen, A. (1989). Serum neopterin determination

for the additional safeguarding of blood transfusions. Our experiences with

76,587 blood donors. Dtsch Med Wochenschr; 114, 172-176. 21. Deniz, G., Akdiş, M., Aktaş, E., Blaser, K., Akdiş, C.A. (2002). Human NK1

and NK2 subsets determined by purification of IFN-gamma-secreting and IFN-

gamma-nonsecreting NK cells. European Journal of Immunology, 32(3), 879-

84. 22. Başaran, N., Shubair, M., Ündeğer, Ü., Canpinar, H., Kars, A. (2002).

Alterations in immune parameters in foundry and pottery workers. Toxicology,

178(2), 81-88. 23. Ündeğer, Ü., Başaran, N., Canpinar, H., Kansu, E. (1996). Immune alterations

in lead-exposed workers. Toxicology, 109(2-3), 167-172. 24. Junqueria, L.C., Carneiro, J., Kelley, R.O. (1993). Temel Histoloji, Editör:

Aytekin, Y., Solakoğlu, S., Barış Kitabevi, İstanbul. 25. Akay, M.T. (2006). Genel Histoloji, Palme Yayıncılık, Ankara. 26. Erganis, O., İstanbulluoğlu, E. (1993). İmmünoloji, Mimoza Yayınları, Konya. 27. Müftüoğlu, E., Bolaman, Z., Bilgir, O., Ertop, S. (1993). İmmünoloji, Saray

Medikal Yayıncılık, İzmir. 28. Galin, J.L., Snyderman, R. (1999). Inflammation: Basic Principles and Clinical

Correlates. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins. 29. Medzhitov, R., Janeway, C. (2000). Innate immunity. The New England

Journal of Medicine 343, 338-344. 30. Sperner-Unterweger, B. (2005). Immunological aetiology of major psychiatric

disorders evidence and therapeutic implications. Drugs, 65(11), 1493-1520. 31. Burger, A.R., Warren, P.R. (1998). Possible immunogenetic basis for autism.

Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews, 4, 137-

141. 32. İnterferon.. http://en.wikipedia.org/wiki/Interferon. Erişim 13 Aralık 2011

95

33. Bilgehan, H. (1987). Temel Mikrobiyoloji ve Bağışıklık Bilimi, Barış

Yayınları, İzmir. 34. Baban, N. (1995). Klinik Biyokimya, İstanbul Üniversitesi Basımevi, İstanbul. 35. Oettl, K., Reibnegger, G. (1999). Pteridines as inhibitors of xanthine oxidase:

structural requirements. Biochimica et Biophysica Acta, 1430, 387-395. 36. Baydar, T., Şahin, G. (1994). Folat düzeylerini etkileyen faktörler. Türkiye

Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 14, 48-61. 37. Hyland, K., Howells, D.W. (1988). Analysis and clinical significance of

pterins. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications,

429, 95-121. 38. Hamerlinc, F.F.V. (1999). Neopterin: a review. Experimental Dermatology, 8,

167-176. 39. Foxton, R.H., Land, J.M., Heales, S.J.R. (2007). Tetrahydrobiopterin

availability in Parkinson’s and Alzheimer’s disease; potential pathogenic

mechanisms. Neurochemical Research, 32, 751-756. 40. Fuchs, D., Weiss, G., Reibnegger, G., Wachter, H. (1992). The role of

neopterin as a monitor of cellular immune activation in transplantation,

inflammatory, infectious and malignant disease. Critical Reviews in Clinical

Laboratory Sciences, 29, 307-341. 41. Huber, C., Fuchs, D., Hausen, A. (1983). Pteridines as a new marker to detect

human T cells activated by allogeneic or modified self major histocompatibility

complex determinants. The Journal of Immunology, 130, 1047-1050. 42. Huber, C., Batchelor, J.R., Fuchs, D. (1984). Immune response-associated

production of neopterin. release from macrophages primarily under control of

interferon gama. The Journal of Experimental Medicine, 160, 310-316. 43. Margreiter, R., Fuchs, D., Hausen, A. (1983). Neopterin as a new biochemical

marker for diagnosis of allograft rejection. Experience based upon evaluation

of 100 consecutive cases. Transplantation, 36, 650-653.

96

44. Thony, B., Auerbach, G., Blau, N. (2000). Tetrahydrobiopterin biosynthesis,

regeneration and functions. Biochemical Journal, 347(1), 1-16. 45. Al-Rashed, M. (2001). Serum ve ürin neopterin düzeylerinin HPLC’de

ölçülmesi, Doktora Tezi, Gülhane Askeri Tıp Akademisi Askeri Tıp Fakültesi

Biyokimya ve Klinik Biyokimya Anabilim Dalı Başkanlığı, Ankara, 21-46. 46. Bjelakovic, G., Jevtovic-Stoimenov, T., Bjelakovic, B., Stojanovic, I. (2004).

Biochemical functions and clinical importance of unconjugated pteridines.

Facta Universitatis, 11(2), 49-54. 47. Duch, D.S., Bowers, S.W., Woolf, J.H. (1984). Biopterin cofactor biosynthesis:

GTP cyclohydrolase, neopterin and biopterin in tissues and body fluids of

mammalian species. Life Sciences, 35, 1895-1901. 48. Melichar, B., Solichovi, D. Freedman, R.S. (2006). Neopterin as an indicator of

immune activation and prognosis in patients with gynecological malignancies.

International Journal of Gynecological Cancer Society, 16(1), 240–252. 49. Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Werner, E.R., Dierich, M.P., Wachter,

H. (1988). Neopterin as a marker for activated cell-mediated immunity:

application in HIV infection. Immunology Today, 9, 150–155. 50. Wede, I., Baier, B.G., Wachter, H., Fuchs, D. (1995). Effects of neopterin and

7,8-dihydroneopterin on luminol–dependent chemiluminescense induced by

reactive intermediates formed from hydrogen peroxide, chloramine-t,

hypochloride and nitrite. Pteridines, 6-35. 51. Fuchs, D., Baier, B.G., Wede, I., Wachter, H. (1997). Reactive oxygen and

apoptosis, oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defences.

Scandalios J, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,139-167. 52. Kojima, S., Icho, T., Kajiwara, Y., Kubota, K. (1992). Neopterin as an

endogenous antioxidant. FEBS Letters, 304(3-4), 163-166. 53. Murr, C., Fuith, L.C., Widner, B., Wirleitner, B., Baier-Bitterlich, G., Fuchs, D.

(1999). Increased neopterin concentrations in patients with cancer: indicator of

oxidative stres? Anticancer Research, 19, 1721-1728.

97

54. Widner, B., Baier-Bitterlich, G., Wede, I., Wirleitner, B., Fuchs, D. (1998).

Neopterin derivatives modulate the nitration o tyrosine by peroxynitrite.

Biochemical and Biophysical Research Communications, 248(2), 341-346. 55. Wöll, E., Weiss, G., Fuchs, D., Lang, F., Wachter, H. (1993). Effect of

pteridine derivatives on intracellular calcium concentration in human

monocytic cells. FEBS Letters, 318(3), 249-52. 56. Weiss, G., Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Werner, E.R., Werner-

Felmayer, G. (1993). Neopterin modulates toxicity mediated by reactive

oxygen and chloride species. FEBS Letters, 321(1), 89-92. 57. Fuchs, D., Stahl-Hennig, C., Gruber, A., Murr, C., Hunsmann, G., Wachter, H.

(1994). Neopterin-its clinical use in urinalysis. Kidney International

Supplement, 46(47), 8-11. 58. Fuchs, D., Werner, E.R., Wachter, H. (1992). Soluble products of immune

activation: Neopterin. In: Rose NR, De Macario EC, Fahey JL, Friedman H,

Penn GM, eds. Manual of Clinical Laboratory Immunology. 4th ed.

Washington DC: American Society for Microbiology, 251-255. 59. Yeğen, A., Yurt, S., Işık, N., Yaman, N., Yiğitbaş, B.A., Uzun, H., Koşar, A.F.

(2007). Aktif akciğer tüberkülozu ve sekel akciğer tüberkülozu ayrımında

neopterinin yeri. Solunum, 9(2), 67-74. 60. Rao, G.N., Cotlier, E.. (1985). Biosynthesis of neopterin, sepiapterin, and

biopterin in rat and human ocular tissues. Investigative Ophthalmology and

Visual Science, 26(5), 768–770. 61. Schobersberger, W., Suman, G., Mittermayr, M., Griesmacher, A.,

Falkensammer, G., Greie, S. (2006). Muscle trauma and immune activation

after a downhill marathon (tyrolean speed marathon). Pteridines, 17, 121-128. 62. Van Amsterdam, J.G.C., Opperhuizen, A. (1999). Nitric oxide and biopterin in

deppression and stres. Psychiatry Research, 85, 33-38.

98

63. Frick, B., Neurauter, N., Diez-Ruiz, A., Schroecksnadel, K., Wirleitner, B.,

Leblhuber, F. ve Fuchs, D. (2003). Neopterin and oxidation products in the

blood of patients with various forms of dementia. Pteridines, 14, 88-93. 64. Diamondstone, L., Tollerud, D.J., Fuchs, D. (1994). Factors influencing serum

neopterin and β2-microglobulin levels in a healty diverse population. Journal

of Clinical Immunology, 14, 368-374. 65. Pertovaara, M., Heliövaara, M., Raitala, A., Oja, S.S., Knekt, P., Hurme, M.

(2006). The activity of the immunoregulatory enzyme indoleamine 2,3-

dioxygenase is decreased in smokers. Clinical and Experimental Immunology,

145(3), 469-473. 66. Schennach, H., Murr, C., Gachter, E., Mayersbach, P., Schönitzer, D., Fuchs,

D. (2002). Association between neopterin production and other parameters in a

population of blood donors. Pteridines, 13, 133-139. 67. Arat-Altındağ, Z.Z., Şahin, G. (1993). Neopterin ve klinik önemi. Türkiye

Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 13, 224–230. 68. Burns, D.N., Nourjah, P., Wright, D.J., Minkoff, H., Landesman, S. Rubinstein,

A. (1999). Changes in immune activation markers during pregnancy and

postpartum. Journal of Reproductive Immunology, 42(2), 147-165. 69. Schennach, H., Murr, C., Larcher, C., Streif, W., Pastner, E., Zaknun, D.

(2002). Neopterin concentrations in cord blood: a single-cohort study of paired

samples from 541 pregnant women and their newborns. Clinical Chemistry,

48(11), 2059-2061. 70. Girgin, G. (2010). Çocuklarda pteridin yolağının değerlendirilmesi.

F.Toksikoloji Doktora Tezi, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü,

Ankara. 71. Plata-Nazar, K., Luczak, G., Borkowska, A., Delinska-Galinska, A., Kozielska,

E., Marek, K., Korzon, M. (2007). Reference standard of serum neopterin

concentration in healthy children. Pteridines, 18, 19-24.

99

72. Satoh, T., Brown, L.M., Blattner, W.A., Maloney, E.M., Kurman, C.C., Nelson,

D.L. (1998). Serum neopterin, beta-2-microglobulin, soluble interleukin-2

receptors, and immunoglobulin levels in healthy adolescents. Clinical

Immunology and Immunopathology, 88(2), 176-182. 73. Berdowska, A., Zwirska-Korczala, K. (2001) Neopterin measurement in

clinical diagnosis. Journal of Clinical Pharmacy Therapeutics, 26, 319-329. 74. Godai, K., Uemasu, J., Kawasaki, H.. (1991). Clinical significance of serum

neopterins in patients with chronic renal disease. Clinical Nephrology, 36, 141-

146. 75. Oda, K., Arai, T., Nagase, M. (1999). Increased serum and urinary neopterin in

nephrotic syndrome indicate cell-mediated immune dysfunction. American

Journal of Kidney Diseases, 34, 611-617. 76. Weiss, M.F., Rodby, R.A., Justice, A.C., Hricik, D.E. (1998). Free pentosidine

and neopterin as marker of progression rate in diabetic nephropathy. Kidney

International, 54, 193-202. 77. Murr, C., Widner, B., Wirleitner, B., Fuchs, D. (2002). Neopterin as a marker

for immune system activation. Current Drug Metabolism, 3, 175-187. 78. Schroecksnadel, K., Murr, C., Winkler, C.,Wirleitner, B., Fuith, L.C., Fuchs, D.

(2004). Neopterin to monitor clinical pathologies involving interferon-γ

production. Pteridines, 15, 75-90. 79. Nichol, C.A., Smith, G.K., Duch, D.S. (1985). Biosynthesis and metabolism of

tetrahydrobiopterin and molybdopterin. Annual Review of Biochemistry, 54,

729-764. 80. Ledochowski, M., Murr, C., Widner, B., Fuchs, D. (2001) Inverse relationship

between neopterin and immunoglobulin E. Clinical Immunology, 98, 104-108. 81. Fuchs, D., Weiss, G., Wachter, H. (1993). Neopterin, biochemistry and clinical

use as a marker for cellular immune reactions. International Archives of Allergy

and Immunology, 101, 1-6.

100

82. Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G. (1990). Distinct neopterin excretion

patterns after vaccination. Pteridines, 2, 147-149. 83. Stahl-Hennig, C., Fendrich, C., Lüke, W., Widner, B., Hunsmann, G., Fuchs,

D. (2002). Urinary neopterin indicates early infection and disease progression:

model studies with simian and human immunodeficiency viruses in macaques.

Pteridines, 13, 1-9. 84. Hull, M., Pasinetti, G.M., Aisen, P.S. (2000). Elevated plasma neopterin levels

in Alzheimer disease. Alzheimer Disease and Associated Disorders, 14(4), 228-

230. 85. Altındağ, Z.Z., Şahin,G., Özyılkan, E., Işımer, A., Telatar, H. (1994). Urinary

neopterin level in familial Mediterranean fever. La Presse Medicale, 23, 718. 86. Millner, M., Franthal, W., Thalhammer, G.H., Berghold, A., Aigner, R.M.,

Füger, G.F., Reibnegger, G.(1998). Neopterin concentrations in cerebrospinal

fluid and serum as an aid in differentiating central nervous system and

peripheral infections in children. Clinical Chemistry, 44(1), 161-167. 87. Rolfs, A., Mühlschlegel, F., Jansen-Rosseck, R., Martins, A.R., Bedaque, E.A.,

Tamburus, W.M. (1995). Clinical and immunologic follow-up study of patients

with neurocysticercosis after treatment with praziquantel. Neurology, 45(3/1),

532-538. 88. Giovannoni, G., Lai, M., Kidd, D., Thorpe, J.W., Miller, D.H., Thompson, A.J.

(1997). Daily urinary neopterin excretion as an immunological marker of

disease activity in multiple sclerosis. Brain, 120 (1), 1-13. 89. Howells, D.W., Strobel, S., Smith, I., Levinsky, R.J., Hyland, K. (1989).

Central nervous system involvement in the erythrophagocytic disorders of

infancy: The role of cerebrospinal fluid neopterins in their differential diagnosis

and clinical management. Pediatric Research, 28, 116-119. 90. Cattell, R.J., Hamon, C.G.B., Corbett, J.A., Lejeune, J., Blair, J.A. (1989).

Neopterin:biopterin ratios in Down syndrome. Journal of Neurology

Neurosurgery and Psychiatry, 52, 1015-1016.

101

91. Licastro, F., Chiappeli, M., Porcellini, E.,Ruscica, M., Corsi, M.M. (2005).

Neopterin levels and immune activation in the blood of children with Down’s

syndrome. Pteridines, 16, 35-9. 92. Mehta, P.D., Patrick, B.A., Dalton, A.J., Patel, B., Mehta, S.P., Pirtilla, T.,

Coyle, P.K. (2005). Increased serum neopterin levels in adults with Down

syndrome. Journal of Neuroimmunology, 164, 129-133. 93. Mota Pinto, A., Todo-Born, A., Vale Pereira, S., Alves, V., Santos Rosa, M.

(2006). The evaluation of neopterin and antioxidants in long lasting asthma.

Revista Portuguesa de Pneumologia, 12(6), 669-682. 94. Mota Pinto, A., Todo-Born, A., Vale Pereira, S., Alves, V., Santos Rosa, M.

(2007). Elevated neopterin levels in non-allergic asthma. Pathophysiology

14(1), 35-39. 95. Horak, E., Murr, C., Streif, W., Schroecksnadel, K., Schennach, H. ve Fuchs,

D. (2006). Association between neopterin in cord blood, urinary neopterin in

early childhood and the development of atopic dermatitis, asthma and hay

fever. Pediatric Allergy and Immunology, 17(1), 11-16. 96. Reibnegger, G., Fuchs, D., Fuith, L.C., Hausen, A., Werner, E.R., Werner-

Felmayer, G., Wachter, H. (1991). Neopterin as a marker for activated cell-

mediated immunity: Application in malignant diseases. Cancer Detection

Prevention, 15(6), 483-490. 97. Neopterin (http://www.neopterin.net/neopterin_e.pdf). Erişim 13 Aralık 2011. 98. Umut, G. (2006). Serum neopterin ve CRP düzeylerinin araştırılması. Biyoloji

Yüksek Lisans Tezi, Dumlupınar Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Konya. 99. Durukan, H., A., Hürmeriç, V., Akgül, E., Ö., Erdem, Ü., Kılıç, S., Erbil, K.,

Bayraktar, Z. (2004). Üveitli olgularda idrar neopterin seviyesi ile hastalık

aktivitesi arasındaki ilişkinin değerlendirilmesi, Medical Network Oftalmoloji,

11(3), 238-242. 100. Budavari, S., O'Neil, M. J., Smith, A., Heckelman, P. E. (1989). In The Merck

Index, 11th ed. Merck and Co., Rahway, NJ, 6136.

102

101. Ogiwara, S., Kiuchi, K., Nagatsu, T., Teradaira, R., Nagatsu, I., Fujita, K.,

Sugimoto, T. (1992). Highly sensitive, specific enzyme-linked immunosorbent

assay of neopterin and biopterin in biological samples. Clinical Chemistry,

38(10), 1954-1958. 102. Mayersbach, P., Augustin, R., Schennach, H., Schönitzer, D., Werner, E.R.,

Wachter, H., Reibnegger, G. (1994). Commercial enzyme-linked

immunosorbent assay for neopterin detection in blood donations compared with

RIA and HPLC. Clinical Chemistry, 40(2), 265-266. 103. Bichler, A., Fuchs, D., Hausen, A., Hetzel, H., Reibnegger, G., Watcher, H.

(1983). Measurement of urinary neopterin in normal pregnant and non-pregnant

women and in women with benign and malignant genital tract neoplasms.

Archieves of Gynecology and Obstetrics, 233, 121-130. 104. Tilg, H., Margreiter, R., Scriba, M. (1987). Clinical presentation of CMV

infection in solid organ transplant recipients and its impact on graft rejection

and neopterin excretion. Transplantation, 48, 37-43. 105. Müler, T.F., Vogl, M., Neumann, M.C. (1998). Noninvasive monitoring using

serum amyloid A and serum neopterin in cardiac transplantation. Clinica

Chimica Acta, 276, 63-74. 106. Tilg, H., Vogel, W., Aulitzky, W.E. (1989). Neopterin excretion after liver

transplantation and its value in differential diagnosis of complications.

Transplantation, 48, 594-599. 107. Hempel, L., Körholz, D., Nussbaum, P., Bönig, H., Buradach, S., Zintl, F.

(1997). High interleukin-10 serum levels are associated with fatal outcome in

patients after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplantation, 20,

365-368. 108. Grebe, S.O., Mueller, T.F. (2002). Immune monitoring in organ transplantation

using neopterin. Current Drug Metabolism, 3, 189-202. 109. Chin, G.K., Adams, C.L., Carey, B.S., Shaw, S., Tse, W.Y., Kaminski, E.R.

(2008). The value of serum neopterin, interferon-gamma levels and interleukin-

103

12B polymorphisms in predicting acute renal allograft rejection. Clinical

Experimental Immunology, 152(2), 239-44. 110. Weimer, R., Süsal, C., Yildiz, S., Staak, A., Pelzl, S., Renner, F., Dietrich, H.,

Daniel, V., Kamali-Ernst, S., Ernst, W., Padberg, W., Opelz, G. (2006). Post-

transplant sCD30 and neopterin as predictors of chronic allograft nephropathy:

impact of different immunosuppressive regimens. American Journal of

Transplantation, 6(8), 1865-1874. 111. Tilg, H., Königsrainer, A., Krausler, R., Aulitzky, W.E., Margreiter, R.,

Reibnegger, G., Wachter, H., Huber, C. (1992). Urinary and pancreatic juice

neopterin excretion after combined pancreas-kidney transplantation.

Transplantation, 53(4), 804-808. 112. Honlinger, M., Fuchs, D., Reibnegger, G. (1992). Neopterin screening and

acute cytomegalovirus infections in blood donors. Journal of Clinical

Investigation, 70, 63. 113. Fuchs, D., Wachter, H., Schonitzer, D. (1992). Neopterin and blood

transfusion. Deutsch Medicine Wochenschr, 117, 1578-1579. 114. Bilgen, H. (2005). Kan bağışçılarının ‘donörlerin’ seçimi. İstanbul Üniversitesi,

Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Sürekli Tıp Eğitimi Etkinlikleri, Sempozyum Dizisi

No: 44, (15-42). 115. Seifried, E., Roth, W.K. (2000). Optimal blood donation screening. British

Journal of Haematology, 109, 694-698. 116. Van der Poel, C.L., Seifried, E., Schaasberg, W.P. (2002). Paying for blood

donations: Still a risk? Vox Sanguinis, 83, 285-293. 117. Blejer, J.L., Carreras Vescio, L.A., Salamone, H.J. (2002). Risk of

transfusional-transmitted infections. Medicina B Aires, 62, 259-278. 118. Ward, J.W., Holmberg, S.D., Allen, J.R. (1988). Transmission of human

immunodeficiency virus by blood transfusions screened as negative for HIV

antibody. The New England Journal of Medicine, 318, 473-478.

104

119. Vrielink, H., Reesink, H.W. (1998). Transfusion-transmissible infections.

Current Opinion in Hematology, 5, 396-405. 120. Kan bağışları. (http://www.saglik.gov.tr/TR/belge/1-7772/kizilay-ve-kan-

bagislari.html. Erişim 13 Aralık 2011. 121. Kan bankaları. (http://www.kanver.net/index.php?id=2. Erişim 18 Aralık 2011. 122. Richard, D.M., Dawes, M.A., Mathias, C.W., Acheson, A., Hill-Kapturczak,

N., Dougherty, D.M. (2009). L-Tryptophan: basic metabolic functions,

behavioral research and therapeutic indications. International Journal of

Tryptophan Research, 2, 45-60. 123. Textbook of Biochemistry (4th ed). Protein Tryptophan, 1224-30. 124. Rutella, S., Bonanno, G., De Cristofaro, R. (2009). Targeting indoleamine 2,3-

dioxygenase (IDO) to counteract tumour-induced immune dysfunction: from

biochemistry to clinical development. Endocrine, Metabolic and Immune

Disorders Drug Targets, 9(2), 151-177. 125. Eccleston, D. (1993). L-tryptophan and depressive illness: a valuable adjunct to

therapy? Psychiatrie Bulletin, 17, 223-224. 126. Michael, A.F., Drummond, K.N., Deden, D., Anderson, J.A., Good, R.A.

(1964). Tryptophan metabolism in man. Journal of Clinical Investigation,

43(9), 1730-46. 127. Grohmann, U., Fallarino, F., Puccetti, P. (2003). Tolerance, DCs and

tryptophan: much ado about IDO. Trends Immunology, 24(5), 242-8. 128. McMenamy, R.H., Oncley, J.L. (1958). The specific binding of L-tryptophan to

serum albumin. The Journal of Biological Chemistry, 233(6), 1436-1447. 129. Schwarcz, R., Pellicciari, R. (2002). Manipulation of brain kynurenines: glial

targets, neuronal effects, and clinical opportunities. The Journal of

Pharmacology and Experimental Therapeutics, 303(1), 1-10. 130. Wichers, M.C., Maes, M. (2004). The role of indoleamine 2,3-dioxygenase

(IDO) in the pathophysiology of interferon-alpha-induced depression. Journal

of Psychiatry and Neuroscience, 29(1), 7-11.

105

131. Scott, T., Eagleson, M. (1988). Concise Encyclopedia Biochemistry 2.ed New

York, 613. 132. Taylor, M.W., Feng, G. (1991). Relationship between interferon-γ, indoleamine

2,3-dioxygenase, and tryptophan catabolism. FASEB Journal, 5, 2516-22. 133. Shimizu, T., Nomiyama, S., Hirata, F., Hayaishi, O. (1978). Indoleamine 2,3-

dioxygenase. Purification and some properties. The Journal of Biological

Chemistry, 253, 4700-6. 134. Yamazaki, F., Kuroiwa, T., Takikawa, O., Kido, R. (1985). Human

indoleamine 2,3-dioxygenase. Its tissue distribution and characterization of the

placental enzyme. The Biochemical Journal, 230, 635-8. 135. Thackray, S.J., Mowat, C.G., Chapman, S.K. (2008). Exploring the mechanism

of tryptophan 2,3-dioxygenase. Biochemical Society Transactions, 36(6), 1120-

3. 136. Badawy, A.A.B., Morgan, C.J., Turner, J.A., Dougherty, D.M., Marsh, D.M.,

Mathias, C.W. (2007). Assessment of the kynurenine pathway in humans: I.

Normal plasma values, ethnic differences and their clinical implications.

International Congress Series, 1304, 335-43. 137. Fuchs, D., Möller, A.A., Reibnegger, G., Stöckle, E., Werner, E.R., Wachter,

H. (1990). Decreased serum tryptophan in patients with HIV-1 infection

correlates with increased serum neopterin and with neurologic/psychiatric

symptoms. Journal of Acquired Immune Deficient Syndrome, 3, 873-6. 138. Widner, B., Werner, F.R., Schennach, H., Wachter, H., Fuchs, D. (1997).

Simultaneous measurement of serum tryptophan and kynurenine by HPLC.

Clinical Chemistry, 43, 2424-6. 139. Fuchs, D., Möller, A.A., Reibnegger, G., Werner, E.R., Werner-Felmayer, G.,

Dierich, M.P. (1991). Increased endogenous interferon-gamma and neopterin

correlate with increased degradation of tryptophan in human immunodeficiency

virus type 1 infection. Immunology Letters, 28, 207-12.

106

140. Widner, B., Sepp, N., Kowald, E., Ortner, U., Wirleitner, B., Fritsch, P. (2000).

Enhanced tryptophan degradation in systemic lupus erythematosus.

Immunobiology, 201, 621-30. 141. Widner, B., Leblhuber, F., Walli, J., Tilz, G.P., Demel, U., Fuchs, D. (2000).

Tryptophan degradation and immune activation in Alzheimer’s disease.

Journal of Neural Transmission, 107, 343-53. 142. Leblhuber, F., Walli, J., Jellinger, K., Tilz, G.P., Widner, B., Laccone, F.

(1998). Activated immune system in patients with Huntington’s disease.

Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 36, 747-50. 143. Widner, B., Leblhuber, F., Fuchs, D. (2002). Increased neopterin production

and tryptophan degradation in advanced Parkinson’s disease. Journal of

Neural Transmission, 109, 181-9. 144. Maes, M., Scharpe, S., Meltzer, H.Y., Okayli, G., Bosmans, E., D’Hondt, P.

(1994). Increased neopterin and interferon-gamma secretion and lower

availability of L-tryptophan in major depression: further evidence for an

immune response. Psychiatry Research, 54, 143-60. 145. Schroecksnadel, K., Winkler, C., Fuith, L.C., Fuchs, D. (2005): Tryptophan

degradation in patients with gynecological cancer correlates with immune

activation. Cancer Letters, 223, 323-9. 146. Mellor, A.L., Munn, D.H. (2004). IDO expression by dendritic cells: tolerance

and tryptophan catabolism. Nature Review Immunology, 4(10), 762-74. 147. Szanto, S., Koreny, T., Mikecz, K., Glant, T.T., Szekanecz, Z., Varga, J.

(2007). Inhibition of indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan

catabolism accelerates collagen-induced arthritis in mice. Arthritis Research

and Therapy, 9(3), R50. 148. Munn, D.H., Mellor, A.L. (2007). Indoleamine 2,3-dioxygenase and tumor-

induced tolerance. Journal of Clinical Investigation, 117, 1147-54.

107

149. Ball, H.J., Yuasa, H.J., Austin, C.J.D., Weiser, S., Hunt, N.H. (2009).

Indoleamine 2,3-dioxygenase-2; a new enzyme in the kynurenine pathway.

International Journal of Biochemical Cell Biology, 41, 467-71. 150. Zelante, T., Fallarino, F., Bistoni, F., Puccetti, P., Romani, L. (2009).

Indoleamine 2,3-dioxygenase in infection: the paradox of an evasive strategy

that benefits the host. Microbes and Infection, 11(1), 133-141. 151. Okamoto, T., Tone, S., Kanouchi, H., Miyawaki, C., Ono, S., Minatogawa, Y.

(2007). Down-regulation of the indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)

transcription by tryptophan and its analogue. Cytotechnology, 54, 107-113. 152. Curti, A., Trabanelli, S., Salvestrini, V., Baccarani, M., Lemoli, R.M. (2009).

The role of indoleamine 2,3-dioxygenase in the induction of immune tolerance:

focus on hematology. Blood, 113(11), 2394-2401. 153. Neurauter, G., Wirleitner, B., Laich, A., Schennach, H., Weiss, G., Fuchs, D.

(2003). Atorvastatin suppresses interferon-gamma-induced neopterin formation

and tryptophan degradation in human peripheral blood mononuclear cells and

in monocytic cell lines. Clinical and Experimental Immunology, 131(2), 264-

267. 154. Wirleitner, B., Neurauter, G., Nagl, M. ve Fuchs, D. (2004). Down-regulatory

effect of N-chlorotaurine on tryptophan degradation and neopterin production

in human PBMC. Immunology Letters, 93(2-3), 143-149. 155. Kuloğlu, M., Önen, S., Aracı, S. (2009). Antidepresanlar, Sitokinler ve İmmün

Sistem. New/Yeni Symposium Journal, 47, 2. www.yenisymposium.net.

Erişim: 13 Aralık 2011. 156. Baydar, T., Girgin, G., Fuchs, D., Inanici, F., Sipahi, H., Erol, O., Şahin, G.

(2008). Pteridine pathway in patients with degenerative diseases during short

time treatment with low dose of meloxicam, as non-steroidal anti-inflammatory

drug. Pteridines, 19, 107-13. 157. Bett, I.M. (1966). Urinary tryptophan metabolites in rheumatoid arthritis and

some other diseases. Annals of the Rheumatic Diseases, 25(6), 556-562.

108

158. Forrest, C.M., Kennedy, A., Stone, T.W., Stoy, N., Darlington, L.G. (2003).

Kynurenine and neopterin levels in patients with rheumatoid arthritis and

osteoporosis during treatment. Advances in Experimental Medicine and

Biology, 527, 287-95. 159. Brandacher, G., Winkler, C., Schroecksnadel, K., Margreiter, R., Fuchs, D.

(2006). Antitumoral activity of interferon-γ involved in impaired immune

function in cancer patients. Current Drug Metabolism, 7(6), 599-612. 160. Löb, S., Königsrainer, A. (2008). Is IDO a key enzyme bridging the gap

between tumor escape and tolerance induction? Langenbeck’s Archives of

Surgery, 393(6), 995-1003. 161. Xiao-qian, L., Xin, W. (2009). Indoleamine 2,3-dioxygenase in tumor induced

tolerance. Chinese Medical Journal, 122(24), 3072-3077. 162. Muller, A.J., Prendergast, G.C. (2005). Marrying immunotherapy with

chemotherapy: why say IDO? Cancer Research, 65(18), 8065-8068. 163. Tan, P.H., Bharath, A.K. (2009). Manipulation of indoleamine 2,3

dioxygenase; a novel therapeutic target for treatment of diseases. Expert

Opinion on Therapeutic Targets, 13(8), 987-1012. 164. Katz, J.B., Muller, A.J., Prendergast, G.C. (2008). Indoleamine 2,3-

dioxygenase in T-cell tolerance and tumoral immune escape. Immunological

Reviews, 222, 206-221. 165. Fernstrom, J.D. (2000). Can nutrient supplements modify brain function? The

American Journal of Clinical Nutrition, 71(6), 1669S-1675S. 166. Yağmuroğlu, A. (2007). Kan transfüzyonunda viral enfeksiyon etkenlerinden

korunmada serum neopterin tespitinin katkısı. Mikrobiyoloji ve Klinik

Mikrobiyoloji Uzmanlık Tezi, Cumhuriyet Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Sivas. 167. Schennach, H., Mayersbach, P., Schönitzer, D. (1994). Increased prevalence of

IgM antibodies to Epstein-Barr virus and Parvovirus B19 in blood donations

with above-normal neopterin concentration. Clinical Chemistry, 40, 2104-2105.

109

168. Schennach, H., Lanthaler, A.J., Mayersbach, P. (2002). Human parvovirus B19

detection in asymptomatic blood donors: Association with increased neopterin

concentrations. The Journal of Infectious Diseases, 186, 1494-1497. 169. Murr, C., Schroecksnadel, K., Schonitzer, D., Fuchs, D., Schennach, H. (2005).

Neopterin concentrations in blood donors differ between ABO blood group

phenotypes. Clinical Biochemistry, 38, 916-919. 170. Yuksekol, I., Ozkan, M., Akgul, O. (2003). Urinary neopterin measurement as

a non-invasive diagnostic method in pulmonary tuberculosis. The International

Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 7, 771-776. 171. Altindag, Z.Z., Baydar, T., Isimer, A., Şahin, G. (2003). Neopterin as a new

biomarker for the evaluation of occupational exposure to silica. International

Archives of Occupational and Environmental Health, 76, 318-322. 172. ICH Harmonised tripartitate Guideline. (November 2005). Validation of

Analytical Procedures: Text and Methodology Q2 (R1). 173. Schennach, H., Hessenberger, G., Mayersbach, P., Schonitzer, D., Fuchs, D.

(2002). Acute cytomegalovirus infections in blood donors are indicated by

increased serum neopterin concentrations. Medical Microbiology and

Immunology, 191, 115-118. 174. IPCS. Biomarkers and risk assessment: concepts and principles. (1993).

Environmental Health Criteria No.155, Geneva: World Health Organization,

International Programme on Chemical Safety. 175. Krause, A., Protz, H., Goebel, K.M. (1989). Correlation between synovial

neopterin and inflammatory activity in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatoid Diseases, 48, 636-40.

176. Sipahi, H. (2011). Geriatrik popülasyonda immün sistem aktivasyonunun

pteridin yolağı ilişkili parametrelerle değerlendirilmesi. F.Toksikoloji Doktora Tezi, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara.

177. Sahin, T.T., Yuksel, O., Girgin, G., Sipahi, H., Dikmen, K., Azili, C., Taneri F, Baydar T. (2009). Is neopterin level a predictive and differential biomarker in patients with thyroid disorders? Journal of Endocrinological Investigations, 32, 147–149.