jorge luiz freire pinto dna plasmático e urinário em
TRANSCRIPT
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JORGE LUIZ FREIRE PINTO
DNA plasmtico e urinrio em pacientes com cncer de mama - possibilidade de um novo marcador de instabilidade
gentica tumoral induzida por quimioterapia
Tese apresentada Faculdade de
Medicina da Universidade de So
Paulo para obteno do ttulo de
Doutor em Cincias
rea de concentrao: Distrbios do
Crescimento Celular, Hemodinmicos
e da Hemostasia
Orientador: Prof. Dr. Auro Del Giglio
So Paulo 2009
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Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo
reproduo autorizada pelo autor
Pinto, Jorge Luiz Freire DNA plasmtico e urinrio em pacientes com cncer de mama possibilidade de um novo marcador de instabilidade gentica tumoral induzida por quimioterapia / Jorge Luiz Freire Pinto. -- So Paulo, 2009.
Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Departamento de Clnica Mdica.
rea de concentrao: Distrbios do Crescimento Celular, Hemodinmicos e da Hemostasia.
Orientador: Auro Del Giglio.
Descritores: 1.Neoplasias da mama 2.Marcadores biolgicos de tumor 3.Instabilidade de microssatlites 4.Quimioterapia 5.Antineoplsicos alquilantes 6.Segunda neoplasia primria
USP/FM/SBD-339/09
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EPGRAFE
Vs que sois a verdadeira fonte da luz e o princpio supremo da sabedoria, difundi sobre as trevas da minha mente o raio do esplendor, removendo as duplas trevas nas quais nasci: o pecado e a ignorncia.
So Toms de Aquino
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por seu amor inconcebvel, por no se cansar de nos maravilhar
com a sua obra e por ter me oferecido graciosamente a ddiva de observar sua
criao de um ngulo microscpico, porm no menos admirvel.
minha amada esposa Lgia, luz de minha vida e graa divina em meu
caminhar, por seu companheirismo, resignao e toda a ajuda na realizao de
nossos sonhos, o mais sincero agradecimento por todo o amor e exemplo de
competncia e organizao.
Aos meus venerveis pais, Lunder e Graa por todo o empenho, carter,
amor e copiosa caridade crist em minha educao acadmica, moral e
religiosa trs tesouros que nunca me sero roubados.
minha irm Tatiana por seu apoio em todos os momentos vividos
neste trabalho por sua preocupao constante com a realizao deste projeto.
Aos meus cunhados Alexandre, Ramiro, Beatriz, Ana Lcia e Wagner
por toda a amizade e apoio a mim dedicados.
minha av Maria da Graa por todo exemplo de perseverana na vida
apesar de todas as dificuldades, pelo carinho e ateno constantes nestes
ltimos tempos.
s minhas sobrinhas Maria Eduarda e Paula que mesmo ainda
pequeninas iluminam de maneira gigantesca minha vida.
Aos meus sogros Mauro e Marisa por todos os todo o auxilio prestado no
curso deste trabalho e pela prontido em estarem sempre disposio.
A meus avs Geraldo, Maria de Lourdes e Joaquim que da glria de
Deus observam a realizao deste trabalho, sem nunca estarem ausentes.
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Aos avs de minha esposa Jorge, Lcia e Linda por todo o carinho e
ateno dispensados a minha pessoa e todo o exemplo de vida que carregam
em si.
Ao meu orientador Professor Doutor Auro del Giglio, por toda a ateno
dispensada em minha formao, por seu notrio carinho ao ensinar, enfim pelo
mdico, professor e religioso exemplar.
Ao professor Doutor Irineu Tadeu Velasco coordenador responsvel pelo
programa de ps graduao do departamento de cincias mdicas da
Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo pela oportunidade dada,
meus agradecimentos.
s secretrias da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo,
Terezinha, Rose e Anglica por todo o auxlio recebido para a resoluo dos
processos envolvidos neste trabalho.
Ao meu amigo Cezar Gustavo, por partilhar seu ouvido amigo, sua
pacincia e toda a amizade nas horas em que tanto ouviu sobre este trabalho.
Ao meu amigo Fernando Luiz Affonso Fonseca, por toda ajuda no
desenvolvimento tcnico deste trabalho e por todos os conselhos e zelo com
que realiza todos os projetos em que se envolve, tal zelo me serve de
inspirao.
minha amiga farmacutica Fernanda Schindler que tanto me ajudou,
nas muitas vezes em que tive de sair de meu trabalho para as mais diversas
tarefas que este projeto me requisitou, deixo impresso minha sincera gratido.
Ao Dr Shigero Harada, meus agradecimentos pela compreenso e apoio
dado para a realizao deste trabalho.
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Pmela, Patrcia, Renata, Sarah e Viviane que tanto colaboraram na
realizao deste trabalho pelos muitos momentos que entre uma coleta e outra
que partilhamos e por toda a ajuda nestes momentos.
Aos meus amigos do laboratrio de Anlises Clnicas da Faculdade de
Medicina do ABC, Aleksandra, Ana Paula, Cludia, Vivia, Thas, Leuda,
Luciana, Gabriela, Roseli e Simone por todo o apoio prestado para a realizao
deste trabalho.
s minhas amigas da Disciplina de Bioqumica Eloah, Thers, Carolina
e Sabrina por todas as nossas conversas e apuros passados juntos.
s equipes de enfermagem dos Hospitais Mrio Covas, Anchieta e da
Faculdade de Medicina do ABC pela ajuda na coleta das amostras das
pacientes deste trabalho.
estimada Professora Doutora Lucila Heloisa Simardi Santiago por todo
o carinho respeito e amor demonstrados a minha pessoa todos estes anos, por
sua competncia e carter notvel.
professora Doutora Maria Aparecida Silva Pinhal por todas as
orientaes dirigidas a este trabalho em meu exame de qualificao.
Professora Doutora Ligia Ajaime Azallis por toda a ajuda na
observao e nos precisos conselhos sobre a organizao do trabalho em meu
exame de qualificao.
Ao saudoso e inestimvel Professor Doutor Mrio Motidome que tanto
me ensinou sobre a vida acadmica. Sempre lhe serei grato por seus
ensinamentos e que com a realizao deste trabalho possa cumprir sua ltima
orientao Gambat! Gambat.
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A meus amigos Ailton, Francisco, Pricles, Leandro e Jlio pela amizade
mesmo entre um golpe e outro da vida, ainda que por vezes distante.
Ao meu venervel amigo Pe. Flvio de Alcantra, por todas as nossas
discusses e sincera amizade e por uma resposta mais isso voc resolve
fcil! quando o assunto era o presente trabalho.
Aline, Luis Otvio, Renata, Graziela, Danielle, Vanessa, Ana Caroline,
Thelma e Carolina, meus colegas de graduao que sempre me estimularam e
acreditaram em meu potencial para a realizao deste trabalho.
Aos meus amigos da universidade paulista, Enny Fernandes Silva, Alpio
Carmo, Paula Knox, Alessandra Xavier, Luana Cardoso, Margarida, Mercedes
Toledo, Luciana Auad , Eduardo Tarvesa e Luis Barone pelo companheirismo
fundamental a realizao deste trabalho.
Aos meus estimados estagirios Allan, Jssica e Rafael por toda a ajuda
nas horas em que tive de me ausentar por causa deste trabalho.
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SUMRIO
RESUMO
SUMMARY
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
1 INTRODUO ............................................................................. 1
1.1 Epidemiologia do cncer de mama ......................................... 1
1.2 Fatores de risco para o cncer de mama .............................. 2
1.3 Carcinognese mamria ............................................................ 3
1.4 Regies de microssatlites ........................................................ 8
1.4.1 Instabilidade de microssatlites e HNPCC ........... Erro! Indicador no
definido.10
1.4.2 Instabilidade de microssatlites em neoplasia mamria ...................... 11
1.4.3 Instabilidade de microssatlites em clulas sangneas de pacientes
portadoras de carcinoma mamrio. .............................................................. 12
1.5 Avaliaes adicionais da instabilidade genmica .............. 16
1.5.1 DNA plasmtico livre em tumores slidos ....................................... 16
1.5.2 DNA do sedimento urinrio .............................................................. 17
2 OBJETIVOS ................................................................................ 19
3 PACIENTES E MTODOS ...................................................... 20
3.1 Pacientes ..................................................................................... 20
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3.2 Extrao de DNA da frao mononuclear do sangue
perifrico ................................................................................................... 21
3.3 Extrao de DNA plasmtico ................................................. 22
3.4 Extrao de DNA urinrio ........................................................ 23
3.5 Amplificao dos microssatlites ........................................... 24
3.6 Determinao de CEA e CA15. 3Erro! Indicador no definido.27
3.7 Anlise estatstica ...................................................................... 27
4 RESULTADOS ........................................................................... 28
4.1 Descrio das pacientes ............................................................. 28
4.2 Anlise da instabilidade genmica por tipo de tratamento ..... 37
4.2.1Tratamento Adjuvante .......................................................................... 38
4.2.2 Tratamento Neoadjuvante ................................................................... 38
4.2.3 Tratamento Paliativo ............................................................................ 40
4.3 Avaliao do DNA plasmtico ............................................... 40
5 DISCUSSO ............................................................................... 47
6 CONCLUSES .......................................................................... 58
7 REFERNCIAS .......................................................................... 59
8 ANEXOS ...................................................................................... 67
Anexo 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido ................. 67
Anexo 2 - Tabela de avaliao dos dados clnicos ......................... 70
Anexo 3 - Tabela de avaliao dos dados moleculares ................ 71
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RESUMO DNA Plasmtico e Urinrio em paciente com cncer de mama - possibilidade de um novo marcador de instabilidade gentica tumoral induzida por quimioterapia [tese]. So Paulo: Faculdade de medicina, Universidade de So Paulo, 2009.
O cncer de mama a neoplasia com maior mortalidade entre as mulheres. O emprego de agentes alquilantes no tratamento desta neoplasia pode ocasionar o surgimento de instabilidades genmicas. Tais instabilidades podem estar associadas ao desenvolvimento de neoplasias secundrias como, por exemplo, leucemias. A presente tese avaliou a instabilidade de microssatlites em amostras de sangue, sedimento urinrio e plasma de pacientes portadoras de carcinoma mamrio ao diagnstico, 3 e 6 meses aps o incio do tratamento quimioterpico. Tambm foi avaliada a concentrao do DNA plasmtico livre como possvel marcador tumoral junto aos marcadores sricos CEA e CA15.3, empregados no acompanhamento do cncer de mama. Foram avaliadas as regies de microssatlites: Tp53-ALU, Tp53.PCR15.1, BAT 40, BAT26, FMR2 e APC. Entre as 40 pacientes includas no presente estudo 88,57% apresentaram instabilidade de microssatlites na frao mononuclear do sangue perifrico, 85,8% nas amostras de sedimento urinrio e 62,5% no DNA plasmtico livre. No houve concordncia significativa entre as instabilidades encontradas nos trs tipos de amostra. A concentrao de DNA plasmtico livre das pacientes quando comparada s doadoras sadias apresentou correlao estatisticamente significativa (p>0,0001), e em paciente em regimes neoadjuvantes que responderam objetivamente quimioterapia (p=0,02) e no houve correlao com os marcadores sricos CEA e CA15.3.
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SUMMARY Plasmatic and Urinary DNA in patients with breast cancer - possibility of a new tumoral genomic instability marker induced by chemotherapy [thesis]. Sao Paulo: Faculty of Medicine, University of Sao Paulo (Brazil), 2009.
Breast cancer has the major mortality in women among all kind of cancer. The use of alkylating agents at the treatment of this disease is associated with genomic instability. This instability could be associated with the development of secondary cancer, for example, leukemia. The present thesis evaluated microsatellite instability in blood, pellet cells urinary and plasma in patients with breast cancer at diagnosis, 3 and 6 months after the beginning of chemotherapy. There were evaluated also Free Plasmatic DNA concentration as a possible tumoral marker with the serum markers CEA and CA15.3 used in breast cancer follow up. The microsatellites regions assayed were: Tp53-ALU,Tp53.PCR15.1, BAT 40, BAT26, FMR2 e APC.
Among the 40 patients included at the present study 88,57% showed microsallite instability in peripheral mononuclear blood cells, 85,8% in urinary pellet cells samples and 62,5% in Free Plasmatic DNA. There werent statistical significant relationship for the instability found at the three kind of samples assayed. The Free Plasmatic DNA concentration of the patients when compared with healthy donors, showed a statistical significant relationship (p
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LISTA DE ABREVIATURAS
ALDH Aldedo desidrogenase
AML(LMA) Leucemia mielide aguda
ATP Adenosina trifosfato
CA 15.3 Antgeno Carboidrato 15.3
CEA Antgeno Carcinoembrionrio
DNA cido desoxirribonuclico
EDTA cido Diamino Triactico
EGFR Fator de crescimento epidermal
Erb-b2 Receptor do fator de crescimento epidrmico
G Gravidade
HNPCC Cancer colo-retal hereditrio sem polipose
IGFs Fatores de crescimento similares insulina
INCA Instituto Nacional do Cncer
LOH Perda de heterozigosidade
MDR-1 Gene de resistncias a mltiplas drogas
mL Mililitro
L Microlitro
MMR Sistema de reparo do mau pareamento do DNA
MSI Instabilidade de Microssatlites
MSI Instabilidade de microssatlites
NaCl Cloreto de sdio
pb Pares de base
PCR Reao da Polimerase em cadeia
PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas
TGF Fator transformante de crescimento
TGF Fator transformante de crescimento
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Seqncia dos primers e tamanho dos fragmentos das regies de
microssatlites que sero analisadas................................................................20
Tabela 2 Concordncias encontradas entre as amostras de sangue e urina.24
Tabela 3 Concentrao de DNA plasmtico livre em doadoras sadias,
determinado por espectrofotometria..................................................................33
Tabela 4 Concentrao de DNA plasmtico livre nas pacientes ao
diagnstico.........................................................................................................34
Tabela 5 Concentraes de DNA plasmtico em comparao com pacientes
controles Teste t-Student para amostras independentes..................................34
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Modelo de diferenciao celular de clulas progenitoras em clulas
mioepiteliais na presena e na ausncia da protena BRCA1.............................5
Figura 2: Via mitocondrial intrnsica da apoptose..............................................10
Figura 3 - porcentagem de eventos (instabilidade de microssatlites ou LOH)
nos marcadores analisados...............................................................................24
Figura 4 Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na frao
mononuclear do sangue perifrico.....................................................................25
Figura 5 Porcentagem de eventos(instabilidade de microssatlites ou LOH)
nos marcadores analisados na urina.................................................................26
Figura 6 Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na
urina...................................................................................................................26
Figura 7 Porcentagem de acometimento das diferentes regies de
microssatlites no DNA plasmtico...................................................................27
Figura 8 Porcentagem de pacientes com acometimento das diferentes
regies de microssatlites estudadas no DNA plasmtico................................28
Figura 9 Porcentagem de concordncia entre as matrizes analisadas........29
Figura 10 Distribuio dos marcadores de microssatlites concordantes......30
Figura 11 Distribuio do nmero de instabilidades nas diferentes regies de
microssatlites estudadas nos pacientes em neoadjuvncia............................31
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Figura 12 - Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de
pacientes ao diagnstico quando comparadas s doadoras.............................35
Figura 13 - Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de
pacientes com tumores localizados em comparao aos metastticos............36
Figura 14 - Gis de poliacrilamida referentes s amostras de sangue, urina e
plasma para a regio microssatlite TP-53 PCR15.1, de uma paciente em
tratamento neoadjuvante. Ao lado representao grfica dos marcadores CEA
e CA 15.3 e a concentrao de DNA plasmtico livre.......................................37
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1 INTRODUO
1.1 Epidemiologia do cncer de mama
O cncer de mama a neoplasia de maior mortalidade entre as
mulheres tanto em pases desenvolvidos, quanto em desenvolvimento.
Segundo levantamento realizado pelo INCA - Instituto Nacional do Cncer -
no ano 2003, essa neoplasia foi responsvel por 9335 bitos. A incidncia
desse cncer no Brasil, no ano de 2008, foi de 49.400 casos, pouco mais de
20% de todos os cnceres diagnosticados em mulheres, e 10% de todas as
neoplasias (www.inca.gov.br).
A neoplasia mamria apresenta a maior incidncia entre as mulheres
seguida pelo cncer de colo do tero (www.inca.gov.br).
O cncer de mama se apresenta incomum antes dos 35 anos, mas a
partir desta faixa etria, a sua incidncia cresce progressivamente
(www.inca.gov.br).
Na dcada de 60 e 70, observou-se um aumento de dez vezes em
sua incidncia e segundo a American Cancerology Society, uma em cada
dez mulheres apresenta a possibilidade de desenvolver a referida neoplasia
(http://www.cancer.org).
1
http://www.inca.gov.br/http://www.inca.gov.br/http://www.inca.gov.br/
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1.2 Fatores de risco para o cncer de mama
Entre os fatores de risco para o cncer de mama podemos
mencionar principalmente os seguintes:
- idade: cerca de 12,5% dos casos ocorrem antes dos 45 anos de
idade, enquanto dois teros das pacientes possuem 55 anos ou mais ao
diagnstico da neoplasia maligna (http://www.cancer.org).
- mutaes nos genes BRCA1 e 2: Genes que codificam protenas
que modulam o ciclo celular. Segundo a American Cancer Society mulheres
com mutaes nestes genes apresentam chances superiores a 80% de
desenvolverem neoplasia mamria. O desenvolvimento do carcinoma
mamrio nestas pacientes ocorre mais cedo do que em pacientes sem a
referida mutao (http://www.cancer.org).
- histrico familiar: mulheres com uma parente de primeiro grau
acometida pela neoplasia mamria possuem o dobro do risco de
desenvolv-la. Quando so duas parentes de primeiro grau afetadas o risco
quintuplica. Cerca de 25% das pacientes com cncer de mama possuem
histrico familiar (MacMahon, 2006).
- grupo tnico: a neoplasia mamria acomete com maior incidncia
mulheres caucasianas, enquanto mulheres negras apresentam, por causas
ainda no elucidadas, maior tendncia s neoplasias mais agressivas
(MacMahon, 2006).
- paridade: mulheres que apresentam mltiplas gestaes so menos
acometidas quando comparadas s pacientes com uma ou duas gestaes
(MacMahon, 2006).
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- amamentao: Mulheres que amamentam por dois anos apresentam
uma reduo no risco do desenvolvimento da neoplasia mamaria
(http://www.cancer.org).
- exposio hormonal: mulheres com menarca mais jovens so mais
susceptveis ao desenvolvimento da neoplasia mamria. Pacientes em uso
de contraceptivos e em terapia de reposio hormonal tambm possuem
uma elevao de risco, no entanto aps alguns anos do fim desses
tratamentos o risco tende a normalizar (MacMahon, 2006).
- obesidade: especialmente aps a menopausa, pois o tecido adiposo
pode produzir estrgeno quando os ovrios param de faz-lo, aumentando
assim o risco para o carcinoma mamrio (http://www.cancer.org).
1.3 Carcinognese mamria
O entendimento dos processos que ocorrem durante a transformao
do tecido mamrio normal em um carcinoma mamrio permanece
incompleto.
Morfologicamente possvel verificar que pacientes que possuem
hiperplasia ductal atpica, estariam mais sujeitas a desenvolver carcinoma in
situ e por fim a forma invasiva da neoplasia mamria (Singletary, 2002).
O desenvolvimento da neoplasia mamria est relacionado a
alteraes genticas e epigenticas como alteraes de expresso de genes
ou seu silenciamento. A ausncia da funo dos genes supressores de
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tumor e a acelerao do ciclo celular podem levar a uma hiperplasia ductal,
com o acmulo de mutaes ou ainda superexpresso de genes. A
superexpresso do gene ras um dos principais fatores na progresso da
malignidade, mas no no seu surgimento (Singletary, 2002).
O gene supressor de tumor Tp53, conhecido como guardio do
genoma, codifica uma protena que no s regula o ciclo celular, mas
tambm capaz de levar a clula para a morte por apoptose. Apta a ligar-se
ao cido desoxirribonuclico (DNA) em situaes de leso, sinais de
proliferao anmalos, eroso telomrica, hipxia, perda de adeso ou
perda de sinal de sobrevivncia. Esta ligao consegue parar a transcrio
de genes que aceleram o ciclo celular e ainda iniciar a transcrio de outras
protenas de reparo. Desta forma a protena p53 capaz de corrigir erros no
genoma e ainda, se estes erros no forem passveis de correo, impedir a
propagao de clulas com patrimnio gentico alterado atravs da ativao
de vias apoptticas (Singletary, 2002).
A mutao no gene tp53 bem como a ineficincia de sua funo leva
a uma hiperproliferao e acmulo de alteraes genmicas contribuindo
para a tumorignese (Singletary, 2002; Fonseca et al.,2004).
J foram descritas ainda associaes das mutaes do TP-53 como
um fator de retroalimentao negativo para a trombospondina que possui
uma atividade anti-angiognica in vivo, e com a expresso do gene de
resistncia a mltiplas drogas chamado MDR-1 (Devita et al.,1993;
Singletary, 2002).
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Morfologicamente possvel verificar a mutao no TP-53 em
tumores benignos e em fibroadenomas com aumento de proliferao epitelial
(Singletary, 2002).
Adicionalmente os fatores de crescimento, apresentam papel
importante na alterao do crescimento celular na carcinognese mamria.
A famlia dos receptores para fatores de crescimento como o EGFR
(epidermal growth factor receptor), pode estar superexpressa como, por
exemplo, o C-erb-B2 (Singletary, 2002).
O Erb-b2 uma protena transmembrana com funo tirosina quinase
que se liga a fatores de crescimento desencadeando uma srie de reaes
que levam ao crescimento celular (Browne et al.,2009).
O aumento de sua expresso em pacientes com carcinomas
primrios, ou ainda em tumores benignos com taxa de 25% pode ser
considerado um fator de risco para o desenvolvimento de leses invasivas
(Fonseca et al.,2002; Browne et al.,2009).
A superexpresso de Erb-b2 no observada em clulas displsicas,
fato que pode servir como indicador da transformao entre a displasia e o
carcinoma ductal in situ (Singletary ,2002; Browne et al.,2009).
O receptor Erb-b2 e sua sinalizao j so inclusive alvos para a
teraputica oncolgica, tanto o uso de anticorpos monoclonais quanto
inibidores de tirosina quinase ativadas subsequentemente (Browne et al.,
2009).
Tambm merecem destaque no desenvolvimento do cncer de mama
os fatores de crescimento como o TGF (transforming growth factor ), e os
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IGFs (Insulin like growth factors). s tumores tambm podem ser
estimulados paracrinamente pelo TGF ( transforming growth factor ) e o
fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF. A regulao da sntese e
liberao desses produtos mediada pelo estrgeno, sendo importante no
desenvolvimento dos tumores que apresentem receptores para o referido
hormnio (Devita et al.,1993).
O gene brca1 e brca2 esto envolvidos na gnese de tumores
mamrios em pacientes mais novas e seus tumores so geralmente
basalides,de rpido crescimento, no expressam receptores de estrgeno
progesterona e Erb-B2, e alta imuno-expresso de marcadores de
diferenciao mioepitelial. A hiptese de carcinognese se baseia na
desregulao do processo de auto-renovao das clulas pluripotentes
presentes no tecido mamrio (Foulkes, 2004).
Neste modelo as protenas BRCA1 e 2 agiriam como reguladores da
diferenciao das clulas progenitoras mamrias. Estas protenas
direcionariam o desenvolvimento das clulas em clulas mioepiteliais ou em
clulas luminais. Em modelos in vitro sua importncia foi observada na
alterao de clulas progenitoras de clulas luminais, que no expressam
receptores de estrgeno, em clulas que s expressam. A mutao do
BRCA 1 simulada pela sua ausncia de expresso levou a acmulo de
clulas que no possuam receptores de estrgeno (Liu et al., 2008).
Ainda se observou em tecido mamrio de pacientes portadoras de
mutaes no BRCA1, a presena da aldedo desidrogenase (ALDH), um
marcador de clulas tronco indicando a no diferenciao do tecido mamrio
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(Figura 1). Tal achado pode corroborar para o papel do BRCA 1 na
carcionognese mamria (Liu et al., 2008).
Figura 1: Modelo de diferenciao celular de clulas progenitoras em clulas mioepiteliais na presena e na ausncia da protena BRCA1 Adaptado de Liu 2008.
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1.4 Regies de microssatlites
As regies de microssatlites so repeties tandem de nmero
variado em cada indivduo caracterizadas por seu tamanho de um a seis
nucleotdeos: [A]n representao de uma repetio mononucleotdica, [AT]n
uma repetio dinucleotdica e assim sucessivamente (Dietmaier et al.,1997).
As regies microssatlites no codificam protena, e esto
amplamente distribudas pelos cromossomos humanos sendo portanto
representativas da estabilidade genmica (Dietmaier et al., 1997).
As regies de microssatlites esto inseridas no genoma para ajudar
na regulao de genes prximos s mesmas, tais genes encontram-se entre
essas regies, entre eles podemos citar: ilgf, e2f-f e bax, que so genes
codificadores de protenas ligadas ao crescimento e morte celular. Esse
genes se apresentam mutados em tumores que apresentam instabilidade
genmica caracterizada como instabilidade de microssatlites (MSI do ingls
Microsatellite Instability) (Lawes et al.,2003).
As alteraes nas regies microssatlites adjacentes aos genes
supracitados poderiam gerar um desequilbrio entre ciclo celular e apoptose
caracterstico do desenvolvimento de neoplasias (Lawes et al.,2003).
Dada a natureza destas repeties, essas regies esto mais sujeitas
a erros do maquinrio de replicao celular que muitas vezes no capaz
de copi-las fielmente ocasionando erros de replicao. Esses erros so
ocasionados por inseres ou delees de nucleotdeos nessas regies,
acarretando a instabilidade de microssatlites. Para prevenir a perpetuao
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destes erros existe um complexo sistema de reparo genmico conhecido
como genes de reparo do DNA (mismacht repair sistem-MMR). Esse sistema
enzimtico possui a funo de verificar a fidelidade da fita de DNA recm-
sintetizada com a fita me (Dietmaier et al., 1997).
O reparo do mau pareamento envolve complexos proticos que
possuem homologia com os complexos MutS e Mut L encontrados na
bactria Escherichia coli. Nos seres humanos esses complexos so
compostos por heterodmeros. No complexo MutS podemos mencionar as
protenas MSH2, MSH3 e MSH6. Suas funes podem ser distintas pelos
erros que corrigem, o complexo MutS formado por MSH2 e MSH 6
reconhece inseres de apenas uma base nitrogenada, enquanto os erros
maiores de duas a seis bases nitrogenadas so reconhecidos pelo complexo
MutS composto por MSH2-MSH3 (Buermeyer et al.,2001).
Para a exciso do erro necessrio que o complexo MutS interaja
com o complexo MutL. Este complexo tem funo ATPsica e est ligado a
exciso do fragmento que possui o erro e a ressntese desta regio. Os
heterodmeros descritos do complexo MuL so: Mut MLH1 e PMS2, MutL
MLH1 e PMS1 e MutL MLH1 e MLH3. Os heterodmeros MutS e MutL
interagem entre si, bem como os complexos MutS e MutL . Foi verificado
que o complexo MutL est implicado no crossing over ocorrido durante a
meiose das clulas (Kondo, 2001; Buermeyer et al.,2001).
Tal sistema corrige os erros encontrados na fita atravs de sua
atividade exonuclesica, e prossegue com o ciclo celular. Em situaes em
que os erros encontrados no so corrigveis o sistema de reparo aciona via
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p53 uma srie de reaes em cascata de sinais celulares que levaro a
morte celular por apoptose. Em situaes em que a expresso dos genes de
reparo do DNA est diminuda ou silenciada, as clulas passam a acumular
erros de replicao o que permitiria o acmulo de mutaes (Lawes et
al.,2003; Dietmaier et a., 1997; Young et al.,2003).
1.4.1 Instabilidade de microssatlites e HNPCC
A instabilidade de microssatlites foi estudada primeiramente em
casos de cncer de colo retal hereditrio no-polipose do ingls HNPCC
(hereditary non polyposis colonretal cancer). A importncia da instabilidade
destas regies genmicas est intimamente ligada a carcinognese e a
mutaes de diferentes genes de reparo do DNA. Em outros tipos de
tumores a instabilidade de microssatlites aparece em menor porcentagem
dos casos (Aaltonen et al.,1993; Anbazhagan et al.,1999 ; Ionov et al.,1993;
Lawes et al.,2003 ; Thibodeau et al.,1993).
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1.4.2 Instabilidade de microssatlites em neoplasia mamria
A incidncia de instabilidades de microssatlites apresenta uma
grande variao na literatura de 3 a 30% (Halford et al.,2003; Anbazhagan
et al.,1999; Benachenhou et al.,1999; Fujii et al.,1998). As discrepncias
encontradas podem ser explicadas por diferenas nas anlises bem como o
nmero de regies avaliadas, a natureza das repeties dos microssatlites
analisados. Alm de caractersticas clnicas distintas entre as pacientes
includas nestes estudos entre algumas caractersticas pode-se mencionar a
idade das pacientes e a natureza uni ou bilateral da neoplasia mamria.
(Fujii et al.,1998; Iwase et al.,1997). Paulson e Wild observaram um pior
prognstico em pacientes que possuam instabilidade de microssatlites
(Paulson et al., 1996; Wild et al., 2004).
Fu e colaboradores descreveram que a instabilidades de
microssatlite no brao curto do cromossomo 3, ainda que em leses pr-
cancerosas possui grande importncia no desenvolvimento do tumor
mamrio e se correlaciona com pouca diferenciao do carcinoma mamrio
(Fu et al., 2007).
A instabilidade de microssatlites foi observada como possvel
marcador de progresso em carcinomas invasores, correlacionando se ainda
com idade, metstases , grau histolgico e tamanho do tumor (Kim et al.,
2004; Pizzi et al., 2002).
Pizzi e colaboradores demonstram uma diminuio da expresso da
protena P53 nos tumores que apresentavam instabilidade de
microssatlites . No mesmo estudo se observou a troca da populao celular
11
-
que expressava a P53 pela que possua instabilidade de microssatlites. A
instabilidade se correlacionou ainda com estgios avanados da doena
(Pizzi et al., 2002).
1.4.3 Instabilidade de microssatlites em clulas sangneas de pacientes
portadoras de carcinoma mamrio.
O tecido sanguneo no est envolvido diretamente com a
tumorignese mamria. Contudo, certos tipos de tratamento incluindo
agentes alquilantes, como a ciclofosfamida, podem induzir em clulas
normais instabilidade genmica nas regies de microssatliltes. Fonseca e
colaboradores demonstraram uma incidncia maior do fenmeno em
pacientes que fizeram uso de regimes contendo agentes alquilantes frente a
pacientes que no empregaram tais agentes em seu tratamento (Fonseca et
al., 2005).
Corroborando com o dado supracitado observou se que em
pacientes com instabilidade de microssatlites a expresso da protena de
reparo hMSH2 estava diminuda (Fonseca et al., 2005).
Um modelo in vitro na linhagem celular MCF-7 foi criado para
averiguar a reduo da expresso da protena de reparo hMSH2
apresentando instabilidade de microssatlites, confirma os dados
observados em pacientes (Marsicano et al., 2008).
12
-
As leses ao DNA geradas por agentes alquilantes como os
monoaductos so idetificadas pelo sistema de reparo genmico que via P53
encaminha as clulas para apoptose, via intrnsica (figura 2) (Jin, 2005).
Em clulas com expresso deficiente das protenas de reparo no h
acionamento da P53 acumulando alteraes genmicas. Uma das principais
hipteses para essa diminuio na expresso das molculas de reparo a
metilao do promotor dos genes que codificam tais protenas (Li et al.,
2002).
Tal fenmeno epigentico j foi observado no HNPCC. Strazzullo e
colaboradores observaram ausncia de metilao do gene hMLH1 em
pacientes com expresso normal, enquanto 23% das amostras com
deficincia de expresso apresentavam o promotor do referido gene
metilado (Strazzullo et al., 2003).
13
-
Figura 2: Via mitocondrial intrnseca da apoptose (Jin, 2005). Frente leso genmica encontrada, a P53 ativa a transcrio do complexo noxa/puma que ir inibir as protenas de manuteno da permeabilidade da membrana mitocondrial (Bcl) e ainda ativar a transcrio do gene bax desencadeando o extravasamento do material mitocondrial que ativar a via das caspases.
Alm da classe dos agentes alquilantes outras drogas antineoplsicas
empregadas no tratamento do carcinoma mamrio como as antraciclinas e
os inibidores de topoisomerase foram implicados no aumento do risco para
leucemia mielide aguda e sndrome mielodisplsica aps tratamento (Le
Deley et al.,2007).
14
-
Esta instabilidade gentica induzida pelo tratamento em tecidos no
comprometidos com o tumor primrio poderia explicar a incidncia de
leucemias agudas e ou mielodisplasias secundrias que acometem cerca de
5% das pacientes com carcinoma mamrio aps o tratamento quimioterpico
(Casorelli et al.,2003; Leoni et al.,1999; Bernard-Marty et al.,2003).
A instabilidade encontrada nas clulas sanguneas poderia ocorrer
tambm no tumor, fato que acarretaria na quimioresistncia do tumor frente
s drogas alquilantes (Bernard-Marty et al.,2003).
As protenas de reparo podem encaminhar as clulas, inclusive as
tumorais, para apoptose, com a reduo da expresso destes genes , a
ligao do frmaco ao DNA permaneceria sem que a clula fosse
encaminhada para a morte. Watanabe e colaboradores demonstraram que
depsitos tumorais extirpados de pacientes com carcinoma ovariano
resistentes a tratamento com cisplatina tinham instabilidade de
microssatlites e reduo do gene hMLH1, mesmo em casos nos quais os
tumores primrios no exibiam este achado antes do tratamento
quimioterpico (Watanabe et al.,2001).
15
-
1.5 Avaliaes adicionais da instabilidade genmica
1.5.1 DNA plasmtico livre em tumores slidos
A presena de cidos nuclicos livres na circulao descrita desde a
dcada de 70 (Leon et al.,1977), contudo sua associao com doenas de
origem neoplsica foi atestada no final da dcada de 1980 (Stroun et
al.,1989).
A origem do DNA livre na circulao no foi totalmente elucidada,
porm acredita-se que estes cidos nuclicos sejam oriundos de clulas
tumorais que sofreram necrose. Tal processo permitira que as molculas de
DNA permanecem integras na circulao, diferentemente do DNA
condensado encontrado em clulas apoptticas (Ziegler et al.,2002, Wang et
al.,2003).
Em pacientes sadias, o DNA plasmtico livre possivelmente o DNA
oriundo da apoptose das clulas, condensado e de pequeno comprimento, j
em pacientes portadoras de neoplasia esta amostra seria enriquecida por
DNA necrtico, de autlise ou ainda de catstrofe mittica, processos de
morte encontrados nas neoplasias e que liberam DNA mais integro (Umetani
et al., 2006).
O DNA plasmtico livre poderia ento fornecer informaes sobre a
condio genmica do tumor primrio (Johnson, 2002; Silva et al.,1999),
estas informaes seriam teis na avaliao gentica dos tumores primrios,
pois fenmenos como a instabilidade de microssatlites esto associados a
16
-
um pior prognstico e a resistncia aos agentes quimioterpicos (Watanabe
et al.,2001).
importante tambm ressaltar que a concentrao desses cidos
nuclicos na circulao est associada ao pior prognstico. Sozzi e
colaboradores avaliaram em pacientes portadores de melanoma e cncer de
pulmo, a concentrao de DNA plasmtico livre e a instabilidade de
microssatlites e observou pior prognstico em pacientes com elevao na
concentrao da molcula na circulao (Sozzi et al.,2001,Taback et
al.,2001).
Em tumores mamrios Umetani e colaboradores avaliaram por meio
da regio de microssatlite ALU, a integridade do DNA plasmtico, como
biomarcador para progresso da doena e metstase linfonodal. Desta
forma possvel distinguir o DNA apopttico do necrtico, sendo o ltimo um
marcador potencial para a deteco do DNA neoplsico no sangue (Umetani
et al.,2006).
1.5.2 DNA do sedimento urinrio
A amostra do sedimento urinrio, matriz de fcil acesso, cujo emprego
ainda se faz necessrio avaliar. Possuiria esta amostra o mesmo perfil de
instabilidade gentica do sangue sendo, portanto uma alternativa ainda
menos invasiva. Em trabalhos prvios j foram observados na urina
componentes de leso do estresse oxidativo do DNA por metablitos do
tabaco (Gackowski et al.,2003).
17
-
A concentrao do DNA urinrio foi empregada como marcador de
morte celular e de nefrotoxicidade. Em modelos experimentais,
camundongos expostos gentamicina, observa-se uma elevao na
concentrao de DNA da urina (Lul et al.,1990).
Li e colaboradores observam ainda que o aumento da excreo de
cidos nuclicos pela urina pode estar relacionada reao de rejeio do
enxerto em pacientes que foram submetidos a transplantes renais (Li et
al.,2005).
Botezatu, em um modelo animal, observou que os cidos nuclicos
liberados no plasma atravessam a barreira renal e chegam urina. Foi
avaliada por meio da seqncia ALU humana, e que o DNA polimrico foi
excretado na ordem de 0,06% em at trs dias (Botezatu et al.,2000). Em
humanos, foi possvel detectar seqncias do cromossomo Y em mulheres
que receberam sangue de homens (Botezatu et al.,2000).
Serdyuk e colaboradores empregaram a reao da polimerase em
cadeia (PCR) na deteco do DNA urinrio. Ainda avaliaram possveis
mutaes no gene k-ras no DNA urinrio em pacientes com cncer de clon
(Serdyuk et al.,2004).
18
-
2 OBJETIVOS
1. Analisar a instabilidade gnica em amostras de sangue, plasma e
urina de pacientes portadoras de carcinoma mamrio por meio da reao da
polimerase em cadeia analisando a instabilidade de microsatlites ao
diagnstico, trs e seis meses de tratamento quimioterpico.
2. Relacionar a instabilidade gnica encontrada nas diferentes
amostras entre si, com a evoluo clnica das pacientes.
3. Relacionar a concentrao de DNA plasmtico livre com os
marcadores sorolgicos utilizados na abordagem clnica do cncer de mama
(CEA e CA 15.3) e com a resposta ao tratamento quimioterpico.
19
-
3 PACIENTES E MTODOS
3.1 Pacientes
Foram includas 40 pacientes portadoras de cncer de mama, com
confirmao de diagnstico, encaminhadas ao Centro de Estudos em
Pesquisa Oncolgica da Faculdade de Medicina do ABC, Hospital Estadual
Mrio Covas e do Complexo de Alta Complexidade em Oncologia do
Hospital Anchieta.
As pacientes recrutadas no poderiam ter feito uso de qualquer
tratamento clnico antineoplsico prvio. Tambm no houve qualquer
interveno no tratamento proposto pelo oncologista.
As pacientes includas poderiam estar em tratamento adjuvante,
sendo a primeira amostra colhida antes da primeira infuso quimioterpica
aps a cirurgia.
As pacientes cujo tratamento foi classificado pelo clnico como
neoadjuvante ou paliativo, tambm forneceram as amostras imediatamente
antes da primeira infuso medicamentosa.
Aps assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido,
aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Medicina do
ABC e pela Comisso de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa da
diretoria clnica dos Hospital das Clnicas e da Faculdade de Medicina da
Universidade de So Paulo - CAPPesq, ingressaram no presente projeto.
Foram colhidos 20.0 mL de sangue total por meio de venopuno com anti-
20
-
coagulante EDTA. As amostras colhidas foram ao diagnstico, trs e seis
meses aps tratamento proposto pelo oncologista clnico. Alm das
amostras de sangue, foram colhidas tambm amostras de urina (amostra
isolada), no mesmo intervalo de tempo em que foi efetuada a coleta de
sangue. A urina foi colhida aps anti-sepsia do trato gnito-urinrio.
3.2 Extrao de DNA da frao mononuclear do sangue
perifrico
Aps coleta de sangue, as amostras foram homogeneizadas para
realizao de contagem de glbulos brancos totais e contagem diferencial.
Para a extrao de DNA da frao mononuclear do sangue perifrico, foi
utilizado o kit GFX (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, USA) e o protocolo
seguido foi: A 100L de sangue total adicionar 500 L da soluo extratora,
incubar a mistura por cinco minutos a temperatura ambiente, sob agitao.
Aps a incubao a mistura foi vertida sobre a coluna de separao do kit
acoplada a um tubo coletor de volume 2 mL. Seguiu-se com uma
centrifugao realizada na microcentrifuga Eppendorf 5415 C a 6800 G por 1
minuto. O contedo eludo no tubo coletor foi descartado. Adicionou-se a
coluna 500 l de soluo extratora e centrifugou-se o conjunto a 6800 G por
1 minuto e descartou o material eludo no tubo coletor. Para a lavagem da
coluna adicionou-se 500l de soluo de lavagem, tampo Tris-EDTA e
etanol absoluto, e centrifuga-se a 20800 G por 3 minutos e o material eludo
21
-
foi descartado do tubo coletor a fim de limpar a coluna de interferentes e
melhorar a pureza do DNA a ser eludo na etapa seguinte. A eluio do DNA
consistiu na adio de 50l de tampo Tris-EDTA a 70C sobre a coluna
centrifugou-se 6800 G por 1 minuto e foi concluda a extrao do DNA da
amostra.
3.3 Extrao de DNA plasmtico
A alquota de 10.0 mL de sangue total colhido com EDTA, foi
submetida centrifugao a 670 g por dez minutos, transferiu-se o plasma
separado para um tubo seco, seguindo-se de uma segunda centrifugao a
1250 g por dez minutos, deste material 1ml foi coletado para a extrao.
Esta primeira centrifugao foi necessria para evitar que as clulas
nucleadas do sangue se rompam e a segunda centrifugao para que o
excesso de protenas seja removido do plasma e no interferisse na
extrao (Stemmer et al.,2003; Zieger et al.,2003).
A extrao foi feita utilizando o kit GFX TM (Amersham Pharmacia
Biotech, Inc, USA) seguindo o seguinte protocolo adaptado:
Em 1ml de amostra foram adicionados a 500l de soluo extratora e
incubada a temperatura ambiente por 10 minutos com agitao ocasional.
Essa mistura foi eluda cinco vezes pela mesma coluna do kit centrifugando-
a 6800 G por 1 minuto e o material presente no tubo coletor descartado.
Aps esse processo seguiu-se o protocolo original do kit. Adicionou-se a
coluna 500 l de soluo extratora e centrifugou-se o conjunto a 6800 G por
22
-
1 minuto e descartou-se o material eludo para o tubo coletor. Para a
lavagem da coluna adicionou-se 500l de soluo de lavagem e centrifuga-
se a 20800 G por 3 minutos e novamente descartou-se o eludo no tubo
coletor a fim de limpar a coluna de interferentes e melhorar a pureza do DNA
a ser eludo na etapa seguinte. A eluio do DNA consistiu na adio de
20l de gua MiliQ a 70C sobre a coluna e centrifugou-se 6800 G por 1
minuto e concluindo a extrao do DNA da amostra.
3.4 Extrao de DNA urinrio
As amostras de urina foram centrifugadas para obteno do
sedimento urinrio. O sedimento foi avaliado em Cmara de Neubauer para
a classificao dos achados celulares. Aps contagem o sedimento foi
ressuspendido em 1.0 mL de soluo salina e foram efetuadas vrias
lavagens com a mesma soluo para evitarmos contaminao com bactrias
que so freqentemente encontradas em amostras urinrias. O DNA urinrio
foi extrado utilizando o kit GFX TM (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, USA),
seguindo o protocolo adaptado para essa finalidade.
Essas amostras foram centrifugadas a 1300 G por 10 minutos para
que ocorresse a sedimentao das clulas presentes na urina. Aps a
centrifugao o sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido
em 1ml de soluo salina (0,9% de NaCl) para a lavagem e submetido a
23
-
nova centrifugao a 1300 G por 10 minutos. O precipitado de clulas
ressuspendido novamente em 1ml de salina e procedeu-se com a extrao.
Ao material celular adicionou-se 500 l de soluo extratora
encubou-se por 10 minutos a temperatura ambiente. Foi adicionada
mistura na coluna do kit. Seguiu-se com uma centrifugao realizada a 6800
G por 1 minuto. O contedo eludo no tubo coletor foi descartado. Adicionou-
se a coluna 500l de soluo extratora e centrifugou-se o conjunto a 6800 G
por 1 minuto e descartou-se o material eludo no tubo coletor. Para a
lavagem da coluna adicionou-se 500l de soluo de lavagem e centrifugou-
se a 20800 G por 3 minutos e descartou-se o eludo no tubo coletor a fim de
limpar a coluna de interferentes e melhorar a pureza do DNA eludo na etapa
seguinte. A eluio do DNA consistiu na adio de 200ml de tampo Tris-
EDTA a 70C sobre a coluna centrifugou-se 6800 G por 1 minuto e
concluindo a extrao do DNA .
3.5 Amplificao dos microssatlites
Em nossos experimentos foram realizadas amplificaes por meio da
reao da polimerase em cadeia (PCR) para as seqncias de
microssatlites TP53-ALU, TP53-PCR15.1, BAT 40, BAT 26, APC e FMR2.
A regio TP53-ALU uma regio microssatlite pentanucleotdica e a
regio TP53.PCR15.1 apresenta-se como uma regio dinucleotdica ambas
ligadas a regies reguladoras do gene p53.
24
-
As regies BAT 40 e BAT 26 so mononucleotdicas e j foram
empregadas em trabalhos anteriores no estudo de instabilidade genmica
induzida por quimioterapia ( Fonseca et al., 2005).
A regio APC foi amplamente estudada nos casos de HNPCC uma
regio dinucleotdica cujas alteraes esto presentes tanto em tumores de
alta bem como os de baixa instabilidade de microssatlites.
A regio FMR2 uma repetio pentanucleotdica ligada ao
cromossomo X.
As reaes de PCR empregadas nos trs tipos de amostra, sangue,
plasma e urina sero realizadas com os seguintes reagentes: 1,5 l de DNA
purificado (nas amostras de sangue e plasma) e 3,0 l de DNA purificado
(nas amostras de urina) 2 l de cada primer a 10pmol 3,0 l de
desoxinucleotdeos, dATP, dCTP, dGTP e dTTP, a 200mM 0,45 l de MgCl2
50M , 3,0 l do tampo Tris-HCl 10X, e 0,2 l da enzima Taq polimerase o
volume final foi de 25 l, sendo o volume restante completo por gua
deionizada autoclavada.
Sempre que foram realizadas as reaes de PCR, uma mistura de
todos os reagentes excluindo-se o DNA foi submetida a condies de
reao para servir como controle negativo.
As amostras foram levadas ao termociclador (MJ Research PTC200,
USA) e seguiram as seguintes etapas: 1 ciclo de denaturao de 5 minutos a
94C, e depois 35 ciclos de 1 minuto de denaturao a 94C, 1 ciclo de
anelamento a 63C por 1minuto, 1 ciclo de 72C de extenso por 10 minutos.
25
-
Regio de
microssatlite
Seqncia Tamanho
(pb)
TP53-ALU GCA CTT TCC TCA ACT CTA CA 400
AAC AGC TCC TTT AAT GGC AG
TP53.PCR15.1 AGG GAT ACT ATT CAG CCC GAG GTG 103-105
ACT GCC ACT CCT TGC CCC ATT C
BAT40 ATT AAC TTC CTA CAC CAC AAC 80-100
GTA GAG CAA GAC CAC CTT G
BAT26 TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC 80-100
AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C
FMR2 CGG TTA TCC CAG TTC GGC GTC TCT GGG AT 172
TCC ACC TCC CGC TCA GTC AGA CTG CGC T
APC ACT CAC TCT AGT GAT AAA TCG 96-122
AGC AGA TAA GAC AGT ATT ACT AGT T
Tabela 1: Sequncia dos primers e tamanho dos fragmentos das regies de
microssatlites analisadas.
Aps a confirmao da amplificao dos marcadores em gel de
agarose 2 %, as amostras foram denaturadas com formamida e incubadas a
94C por 5 minutos e analisadas em uma eletroforese com a utilizao do
equipamento GenePhor (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) em gis
previamente preparados GebeGel Excel 15/24 (Pharmacia Boitech, Uppsala
Sweden) esse gel possibilitou uma maior resoluo, de 6pb, em fragmentos
de 50 a 200 pb. Aps corrida eletrofortica, o gel foi corado com nitrato de
prata utilizando o aparelho Hoefer Automated Gel Stainer (Pharmacia
Boitech, Uppsala Sweden), seguindo o protocolo de colorao do fabricante.
26
-
3.6 Determinao de CEA e CA15.3
As amostras de soro obtidas conforme descrito no inicio dessa sesso,
foram submetidas ao estudo para determinao de CEA e CA 15.3. Essa
determinao foi realizada por meio de mtodo quimioluminescente
utilizando reagentes da marca Siemens. As leituras foram realizadas com
auxilio do aparelho IMMULITE 1000 seguindo as normas do fabricante e as
boas prticas laboratoriais em anlises clnicas.
3.7 Anlise estatstica
Foi realizado o teste t de Student para a obteno das correlaes
entre a concentrao de DNA plasmtico livre entre as pacientes e o grupo
controle. Tambm foram construdas curvas ROC para avaliar a
especificidade e sensibilidade da concentrao do DNA plasmtico livre
quando comparados os grupos controle e pacientes e ainda pacientes com
tumores localizados e tumores metastticos.
Os eventos observados no presente trabalho foram contabilizados
para a obteno das freqncias absoluta e relativa.
27
-
4 RESULTADOS
4.1 Descrio das pacientes
As 40 pacientes includas neste estudo apresentaram mdia de idade
de 52,7 (36-78) (mediana de 52) anos ao diagnstico da neoplasia mamria.
Entre as pacientes uma optou por no colher mais amostras para o
estudo, porm no retirou o consentimento.
Quanto ao tratamento quimioterpico das pacientes elegveis para
anlise, 11 pacientes (27,5%) foram submetidas terapia neoadjuvante, 16
pacientes (40%) fizeram uso de terapia adjuvante, 4 (10%) cujo tratamento
foi considerado paliativo.
Dentre as pacientes includas 3 (7,5%) participaram de um estudo
clnico da eficcia do tratamento pr cirrgico neoajuvante com o agente
antiestrognico chamado fulvestrant, contudo tais pacientes possuam ao
diagnstico estadios classificados como operveis.
Os regimes de quimioterpicos empregados foram combinaes de
antraciclinas, inibidores de formao de microtbulos e agentes alquilantes.
Estes regimes foram: Adriamicina e Ciclofosfamida, Adriamicina
Cliclofosfamida e Paclitaxel, Fluorouracil Epirrubicina e Ciclofosfamida,
Fluorouracil Adriamicina e Ciclofosfamida .
Os agentes alquilantes, no caso a ciclofosfamida, descritos como
indutores de instabilidade genmica em pacientes (Fonseca et al.,2005) e
28
-
em clulas em cultura (Marisicano et al.,2008) estavam presentes em
92,5%(37) das pacientes do presente estudo.
No presente trabalho as pacientes forneceram 3 amostras de sangue,
de urina e de plasma, nos tempos descritos na seo pacientes e mtodos.
29
-
Das 40 pacientes includas neste estudo 35 foram elegveis para
avaliao da instabilidade genmica avaliada pelas regies de
microssatlites. Analisamos os marcadores de instabilidade de
microssatlites citados na seo materiais e mtodos do sangue perifrico,
urina e plasma de 35 pacientes.
As pacientes foram consideradas elegveis para a anlise quando
possuam pelo menos 2 coletas. A primeira amostra foi considerada padro
comparativo para as demais amostras obtidas durante o tratamento
sistmico.
Dessa maneira, o critrio empregado na anlise consistia em avaliar
os fragmentos gerados por PCR em gel de poliacrilamida ao diagnstico
(amostra 0) e sua alterao durante o estudo (nas amostras 3 e 6 meses).
As pacientes com apenas 1 coleta no foram avaliadas pois no eram
passveis de avaliao comparativa que o objetivo desse estudo.
Aps a anlise dos gis de poliacrilamida observamos que
aproximadamente 88,57%(31) das pacientes avaliadas apresentaram pelo
menos uma alterao gentica seja ela perda de heterozigosidade (LOH) ou
instabilidade de microssatlites (MSI) no sangue perifrico. Nas amostras de
sedimento urinrio e plasma foram encontradas estas alteraes em pelo
menos uma amostra em 80% (28) dos pacientes.
As figuras 3 e 4 mostram o nmero de eventos de instabilidade
genmica encontrado no sangue perifrico. As instabilidades nas regies
BAT 26, BAT 40 apresentaram-se em maior nmero nas pacientes.
30
-
16,84
18,95
12,63
16,84
14,7415,79
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU
% de eventos por marcador de microssatlite no sangue perifrico
Figura 3: Porcentagem de eventos (instabilidade de microssatlites e/ou LOH) nos marcadores analisados.
Ao analisar a porcentagem de pacientes que apresentaram
instabilidade genmica avaliadas pelas regies de microssatlite,
importante ressaltar que embora 88,57 % das pacientes apresentarem
instabilidade genmica, dos 6 marcadores avaliados, o mais expressivo foi o
BAT 26 e menos foi o FMR2 (Figuras 3 e 4).
31
-
40,00
45,71
31,43
40,00
34,29 37,14
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
50,00
BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU
% de pacientes com instabilidade genmica na FMSP
Figura 4: Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na frao mononuclear do sangue perifrico(FMSP).
A figura a seguir (Figura 5) apresenta a porcentagem de pacientes e
eventos de instabilidade genmica na urina das pacientes do presente
trabalho. Das pacientes, 85,8%(29) apresentaram instabilidade genmica.
Nas amostras de urina foi possvel observar uma significativa diminuio do
nmero de eventos quando comparada com a frao mononuclear do
sangue perifrico. O perfil do acometimento dos marcadores de
microssatlites tambm mostrou-se diferente. Observa-se que as Fraes
ALU e FMR2 so as que demonstraram menor reduo na amostra das
clulas do sedimento urinrio.
32
-
4,21
7,37
21,05
8,42
11,58
17,89
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU
% de eventos de instabilidade genmica na urina
Figura 5: Porcentagem de eventos (instabilidade de microssatlites e/ou LOH) nos marcadores analisados na urina.
11,43
28,57
42,86
20,00
31,43
42,86
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
45,00
BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU
% de pacientes com instabilidade genmica na urina
Figura 6: Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na urina.
33
-
A concordncia entre as amostras de sangue total e de plasma foi
baixa (14,7%) em relao s alteraes observadas nas 6 regies de
microssatlites estudadas. Quanto ao nmero de pacientes. O DNA
plasmtico apresentou mais instabilidades genmicas quando comparado
urina (figuras 7 e 8).
11,58
16,84 16,84
6,32
8,429,47
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU
% de eventos de instabilidade genmica nas amostras de plasma
Figura 7: Porcentagem de acometimento das diferentes regies de microssatlites no DNA plasmtico.
34
-
25,71
34,29
40,00
20,00 20,0022,86
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU
% de pacientes com instabilidade genmica no plasma
Figura 8: Porcentagem de pacientes com acometimento das diferentes regies de microssatlites estudadas no DNA plasmtico.
Embora o nmero de eventos encontrado em porcentagem no seja
muito diferente entre os marcadores de instabilidade de microssatlite,
(figuras 1 a 8) a concordncia do mesmo evento biolgico da instabilidade
de microssatlites (figura 9) no foi observada.
35
-
7,37
14,74
8,42
1,05
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
sangue-urina sangue-plasma plasma-urina sangue-urina-plasma
% de concordncia entre os eventos
Figura 9: Porcentagem de concordncia entre as matrizes analisadas.
Sobre o acometimento das regies analisadas, nota-se que a regio
FMR2 ligada ao cromossomo X foi a mais afetada (figura 10), entre as
concordantes.
36
-
% dos marcadores de instabilidade gentica concordantes
10,34
24,14
37,93
13,79
6,9013,79
BAT40BAT26FMR2TP53PCR15.1APCALU
Figura 10: Distribuio dos marcadores de microssatlites concordantes.
4.2 Anlise da instabilidade genmica por tipo de tratamento
As pacientes foram agrupadas com a finalidade de observar o nmero
de eventos de instabilidade genmica, as alteraes da concentrao do
DNA plasmtico. Para a avaliao da resposta ao tratamento os registros
mdicos das pacientes foram revisados para a classificao das pacientes
com base nos exames clnicos, laboratoriais e anatomopatolgicos.
37
-
4.2.1Tratamento Adjuvante
Das 16 pacientes submetidas a quimioterapia adjuvante, apenas 4
(25%) no apresentaram instabilidade genmica na frao mononuclear do
sangue perifrico. Tal dado compatvel com trabalhos anteriores de nosso
grupo de estudo (Fonseca et al., 2005).
A mdia de eventos por paciente afetada na frao mononuclear do
sangue perifrico foi de 2,83 eventos por paciente, ou seja, quase 3
instabilidades no painel de microssatlites.
Nmero similar foi encontrado nas anlises da urina destas pacientes
2 (12,5%) pacientes estveis e 87,5% afetadas com mdia de 2,28
instabilidades por paciente afetada.
No plasma, tambm 4 pacientes no possuam instabilidade
genmica, 12 pacientes apresentaram mdia de instabilidades genmicas de
2,58.
Em relao concentrao do DNA plasmtico nestas pacientes foi
constatado que, embora em nveis mais elevados do que em pacientes livres
de doena, a concentrao ao longo dos tempos de coleta diminua ou se
mantinha sem alteraes significativas.
4.2.2 Tratamento Neoadjuvante
Entre as 11 pacientes classificadas como quimioterapia neoadjuvante
nenhuma apresentou painel de microssatlites estvel no sangue perifrico.
38
-
Quanto distribuio do nmero de regies afetadas as pacientes estavam
amplamente distribudas.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
1 regio 4regies 7regies 10regies 13regies
Pacientes em Neoadjuvancia
Figura 11: Distribuio do nmero de instabilidades nas diferentes regies de microssatlites estudadas nas pacientes em neoadjuvncia.
Ao se verificar a instabilidade gnica no DNA plasmtico apenas 2
pacientes eram estveis. As amostras de plasma com instabilidade gnica
apresentavam em mdia 2,33 instabilidades por paciente.
Foi observada instabilidade gnica na urina de 9 das 11 pacientes,
sendo que cada paciente afetada apresentou em mdia 2,44 eventos.
Em relao ao DNA plasmtico foi observado que sua concentrao
tende a diminuir aps a cirurgia. Apenas 1 paciente apresentou elevao na
concentrao do DNA plasmtico.
39
-
Quando avaliada a segunda amostra (3 meses) as pacientes que
responderam ao tratamento quimioterpico apresentaram um aumento na
concentrao de DNA plasmtico livre em comparao ao grupo de
pacientes que no responderam ao tratamento (p=0,02).
4.2.3 Tratamento Paliativo
Entre as 4 pacientes em terapia paliativa 25% no apresentaram
instabilidade genmica no sangue perifrico. As pacientes com instabilidade
gentica apresentaram em mdia 3 instabilidades.
4.3 Avaliao do DNA plasmtico
No presente trabalho foram includas 10 mulheres doadoras livres de
doena com idade inferior a 30 anos e sem histrico de cncer familiar para
validar a tcnica de extrao do DNA plasmtico livre.
Tais determinaes tambm tinham por finalidade verificar se existia
diferena entre as pacientes portadoras de neoplasia mamria e mulheres
ss. As doadoras eram mulheres com idade inferior a 30 anos e sem
histrico de cncer na famlia.
As amostras foram processadas como descrito na sesso pacientes e
mtodos.
Conforme o descrito na literatura as concentraes de DNA
plasmtico livre encontrado nestas doadoras foi inferior quando comparada
40
-
s pacientes. A mdia da concentrao entre as doadoras foi de 0,12g/mL,
concentraes semelhantes foram encontradas por Stemmer (Stemmer et
al.,2003).
Os resultados obtidos por espectrofotometria so apresentados na
tabela a seguir:
Doadoras [DNA]g/mL
D1 0,2
D2 0,0
D3 0,1
D4 0,1
D5 0,2
D6 0,2
D7 0,1
D8 0,1
D9 0,2
D10 0,0
Tabela 2: Concentrao de DNA plasmtico livre em doadoras sadias, determinado por espectrofotometria.
41
-
Paciente [DNA]
g/mL Paciente [DNA] g/mL
MG 42 EGS 25 MNL 16 FJLS 12 VP 50 LSP 0
SMJ 18,3 MSS 20 RSB 30 MLX 30 OS 27 ASM 2
GRF 3 VMG 26 LAMJ 1 MMS 19 NM 37 ABV 12 MAL 0 ICJ 14 NT 20 GPS NA AC 27 RCS 12
DBS 42 LPN 12 FMP 42 IAS 13 MIS 4 MNC 60 NGS 11,3 MSFL 36
SMSS 22,9 AG 30 JF 3 MJO 18
NNP 35 INC 1,3 ESN 0 MB 12
Tabela 3: Concentrao de DNA plasmtico livre nas pacientes ao
diagnstico.
A avaliao estatstica comparativa entre os dois grupos nos
forneceu um valor de p
-
DNA (0 meses) DNA (3 meses) DNA (6 meses)Controles Mdia DP 0,15 0,05 --- ---
Adjuvante Mdia DP P 20,29 13,8
0,007 27,38 25,6
0,042 32,8 13,9
0,001
Neoadjuvante Mdia DP P 27,47 15,5
< 0,0001 31,08 22,8
0,023 30,75 22,3
0,002
Paliativo Mdia DP P 15,00 15,3
0,276 37,33 31,8
0,086 35,75 22,1
0,008
Geral Mdia DP P 14,96 2,6 < 0,0001
24,41 4,4 < 0,0001
18,42 3,4 < 0,0001
Tabela 4: Concentraes de DNA plasmtico(g/mL) das pacientes portadoras de cncer de mama em comparao com doadoras sadias durante o perodo do estudo. Teste t-Student para amostras independentes.
Com base nesta correlao estatstica foi construda uma curva ROC
para avaliar a concentrao de DNA plasmtico em pacientes com
carcinoma mamrio e as doadoras saudveis, para avaliar seu emprego na
deteco da atividade tumoral (figura 12). Nesta anlise obtivemos uma
sensibilidade de 96,87% e uma especificidade de 100% e um p< 0,001.
43
-
Figura 12: Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de pacientes ao diagnstico quando comparadas s doadoras.
Com relao ao tipo de tratamento no se observou correlaes
estatsticas significativas quando comparou-se a concentrao do DNA
plasmtico em pacientes que apresentaram metstases distncia com as
pacientes com tumores localizados(p=0,233) (figura 13).
44
-
Figura 13: Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de pacientes com tumores localizados em comparao aos tumores metastticos.
Em relao concentrao de DNA plasmtico livre e os marcadores
CEA e CA15.3 no se observou nenhuma correlao significante, tambm
no verificamos nenhuma correlao entre as instabilidades de
microssatlites e os marcadores sricos conforme exemplifica a figura 14 a
seguir.
45
-
Figura 14: esquerda avaliao dos Gis de poliacrilamida nos tempos 0, 3 e 6 meses referentes s amostras de sangue, urina e plasma para a regio microssatlite TP-53 PCR15.1. direita a representao grfica dos marcadores CEA(ng/mL), CA15.3(U/mL) e a concentrao de DNA plasmtico(g/mL) livre avaliados no mesmo perodo. Paciente em tratamento neoadjuvante que realizou 4 ciclos de adriamicina e ciclofosfamida (AC) e 4 ciclos de paclitaxel(T).
Conforme observado na figura acima a presena de LOH na regio
TP53-PCR15.1 na amostra de sangue no tempo 6 e na urina no tempo 3,
enquanto que a amostra de plasma permaneceu estvel, exemplificando a
no concordncia entre os tipos de amostra quando avaliada a instabilidade
genmica.
46
-
5 DISCUSSO
No presente trabalho, observamos o surgimento de instabilidade
genmica atravs da avaliao das regies de microssatlites em todos os
tipos de amostras colhidas, sangue, plasma e urina.
Na frao mononuclear do sangue perifrico a incidncia encontrada
de 92,5% das pacientes se encontra de acordo com os resultados obtidos
por Fonseca e colaboradores (Fonseca et al., 2005).
O surgimento de instabilidade de microssatlites no sangue perifrico
indica uma ineficincia do sistema de reparo do DNA, os agentes alquilantes
podem reduzir a expresso gnica de protenas de reparo como o hMSH2
(Fonseca et al., 2005). Em modelos experimentais, linfcitos expostos
agentes alquilantes tambm se verifica a diminuio da expresso de tal
protena de reparo (Marsicano et al., 2008) concomitante ao aparecimento
de instabilidade genmica (MIS e LOH).
A homogenidade entre a quantidade de eventos encontrados em
nossos resultados valida o emprego das regies escolhidas mostrando seu
direcionamento para o estudo de instabilidade de microssatlites na frao
mononuclear do sangue perifrico (Fonseca et al., 2005).
Tais instabilidades em clulas da frao mononuclear podem estar
relacionadas gnese de leucemias secundrias. As leucemias secundrias
apresentam mais frequentemente instabilidade de microssatlites e
aberraes cromossmicas (Visani et al., 2000). Visani e colaboradores
associam a exposio prvia a agentes alquilantes como um fator de risco
47
-
no desenvolvimento destas leucemias, tal fato nos permite avaliar a
presena das instabilidades genticas, aqui representadas pelas regies de
microssatlite como um indicador de genotoxicidade em longo prazo, visto
que tais leucemias surgem no perodo de 5 a 10 anos aps o trmino do
tratamento (Visani et al., 2000).
A leucemia mielide aguda (t-AML) a mais associada ao tratamento
com agentes alquilantes, como a ciclofosfamida. E o risco de seu
desenvolvimento eleva-se de 1 a 2 anos tendo sua maior incidncia entre 5
e 10 anos, aps este perodo o risco diminui (Le Deley et al., 2008).
Adicionando-se ao efeito leucemognico da ciclofosfamida as
pacientes com cncer de mama so muito frequentemente tratadas com
combinaes de antraciclinas, como a adriamicina, e agentes alquilantes. Le
Deley e colaboradores avaliaram o risco do desenvolvimento de leucemias e
sndromes mielodisplsicas em pacientes com cncer de mama tratadas
com antraciclinas. Verificaram que estas apresentam um risco relativo
superior a 3 vezes quando comparadas com outras pacientes (Le Deley et
al., 2008).
Estas leucemias secundrias so geralmente precedidas por
sndromes mielodisplsicas, so resistentes ao tratamento e apresentam
pior prognstico.
O surgimento de instabilidades genticas em um tecido no
comprometido com a carcinognese como a frao mononuclear nos
permite uma nova abordagem sobre os regimes quimioterpicos e as suas
implicaes (Leone et al., 2002; Marsicano et al., 2008).
48
-
No apenas as mutaes em regies gnicas alvo mas tambm os
fenmenos epigenticos como a hipermetilao de regies promotoras dos
genes supressores de tumor, ou ainda a deacetilao de histonas
contribuem no desenvolvimento de leucemias secundrias. De modo que j
se observou a metilao nos genes das protenas do sistema de reparo do
DNA. A hipermetilao do promotor do gene hMLH1 pode estar relacionada
com o silenciamento e consequentemente com o surgimento das
instabilidades de microssatlites observadas nos resultados do presente
trabalho. (Leone et al., 2002). A ineficincia do sistema de reparo encontrado
pela medida da instabilidade de microssatlites nos permitiria entender em
parte a gnese das translocaes e delees encontradas nas leucemias
secundrias (Leone et al., 2002).
Pode-se aventar a hiptese de que as regies promotoras dos genes
de reparo ou ainda de seus fatores de transcrio estejam hipermetiladas,
justificando a diminuio da expresso de tais protenas consequentemente
gerando as instabilidades de microssatlites. Tal fenmeno epigentico
possui tamanha relevncia que novos esquemas teraputicos implementam
agentes desmetilantes com a finalidade de previnir o surgimento de tal
fenmeno (Leone et al., 2002).
Sobre as amostras de sangue, ainda se faz necessrio questionar seu
emprego como padro de comparao com o tumor, realizado
principalmente para os casos de HNPCC, visto que essas regies
apresentam variaes devido ao tratamento o que comprometeria sua
fidelidade com a estabilidade gentica (Fonseca et al., 2005).
49
-
Ainda nesse estudo, nos propusemos a avaliar o acometimento de
diferentes matrizes biolgicas expostas ao tratamento sistmico. Dessa
maneira, verificamos que os resultados obtidos em amostras de sedimento
urinrio apresentaram pouca concordncia quando comparados com os
resultados da frao mononuclear. Talvez, a exposio de diferentes
matrizes biolgicas ao tratamento sistmico nos permita avaliar diferentes
resultados de instabilidade genmica mostrando que cada clula possui sua
suscitibilidade a genotoxicidade e ainda essa verificao pode refletir
diferentes interpretaes quanto a funcionalidade do sistema de reparo do
DNA e do envolvimento epigentico.
Das pacientes avaliadas, 62,5% dessas apresentaram instabilidade
de microssatlites na anlise do sedimento urinrio, tal dado nos mostra que
a matriz avaliada pode apresentar menor sensibilidade quando comparada
com a frao mononuclear do sangue perifrico quando utilizado o mesmo
painel de marcadores de microssatlites. Assim, sugere-se que os
marcadores poderiam ser complementados com outros para serem usados
nas amostras do sedimento urinrio. Ressalta-se que estes marcadores
haviam sido validados para anlise da instabilidade genmica na frao
mononuclear do sangue perifrico de mulheres com cncer de mama
(Fonseca et al., 2005).
Molina e colaboradores reportam o emprego da instabilidade de
microssatlites no diagnstico do cncer de bexiga com uma elevada
sensibilidade, no entanto empregando um painel de microssatlites diferente
do usado em nossa avaliao e ainda no referido trabalho so estudadas
50
-
clulas diretamente relacionadas com a carcinognese no estudo com
cncer de bexiga (Molina et al., 2003).
As instabilidades de microssatlites encontradas no cncer de bexiga
demonstram papel importante na carcinogenese sendo apontadas como um
possvel achado precoce de diferenciao celular em leses pr-malignidade,
pois so encontradas em estgios iniciais da neoplasia (Zulueta et al.,1993).
A Ciclofosfamida, agente alquilante presente nos regimes de 80% das
pacientes, se apresenta como um fator de risco estabelecido para o cncer
de bexiga. Travis e colaboradores descreveram que doses cumulativas de
ciclofosfamida de 50g acarretam em um aumento de 14,5 vezes mais
chance do desenvolvimento do cncer de bexiga (Travis, 2006).
A ciclofosfamida empregada nos regimes antineoplsicos, aps
ativao heptica e reaes subseqentes biotransformada em
aldosfosfamida e acrolena, o primeiro composto possui atividade contra as
clulas neoplsicas e o segundo um potencial causador de cistite
hemorrgica (Hardman et al., 1996).
Cox e colaboradores relatam que a acrolena capaz de inibir a
enzima DNA metilase, interrompendo a metilao e consequentemente
silenciamento gnico, o mesmo composto ainda capaz de se ligar ao
prprio DNA formando aductos que impossibilitam a metilao dos cidos
nuclicos (Cox et al., 1988).
Desta forma a gnese das instabilidades genmicas nas amostras de
sedimento urinrio pode ser oriunda da hipometilao do DNA, um evento
epigentico mais freqente em regies repetitvas como os microssatlites
51
-
(Ehrlich et al., 2002). Tal achado corrobora com a pouca concordncia
encontrada em nosso trabalho entre as amostras do sedimento urinrio e o
sangue perifrico indicando diferentes mecanismos para as instabilidades de
microssatlites encontradas (Ehrlich et al., 2002; Leone et al., 2002). Esta
diferena de origem das instabilidades genticas encontradas tambm
poderia ajudar a explicar a razo pela qual encontramos pacientes com
painel de microssatlites normal no sangue perifrico e instvel no
sedimento urinrio (Ehrlich et al., 2002).
Nos regimes de altas doses de ciclofosfamida o agente uroprotetor
metexano largamente empregado para evitar leses na bexiga, por meio
da neutralizao da acroleina por seus radicais sulfidrila (Hardman et al.,
1996; Cox et al., 1988).
Foi possvel verificar que em pacientes que no apresentaram
instabilidade genmica no sangue perifrico apresentaram instabilidade nas
amostras de urina. Ainda em pacientes com instabilidade genmica na
frao mononuclear do sangue apresentaram um perfil de instabilidade
genmica diferente, o que nos permite afirmar que as clulas do trato genito
urinrio so afetadas de maneira diferente pelos regimes quimioterpicos.
Com os avanos nas tcnicas diagnsticas e no aumento da
sobrevida dos pacientes com neoplasias primrias se faz necessria uma
nova abordagem dos riscos em longo prazo dos tratamentos empregados.
Devido genotoxicidade avaliada pela instabilidade das regies de
microssatlites encontradas nas matrizes estudadas no presente trabalho,
permite-se aventar a hiptese de que agentes citoprotetores como a
52
-
Amifostina poderiam ser empregados para evitar o surgimento deste
fenmeno, tal avaliao foi observada em culturas de clulas de cncer de
mama (Marsicano et al., 2008). Neste trabalho os linfcitos tratados com
Amifostina no apresentaram instabilidade de microssatlite quando
expostas ao melphalano (agente alquilante que no necessita de
metabolismo de primeira passagem).
Os resultados encontrados para as amostras de DNA plasmtico
foram mais discordantes do que a urina em relao ao sangue perifrico. As
discordncias dos eventos encontrados entre o plasma e a frao
mononuclear nos isolam da possibilidade da contaminao do plasma por
DNA do sangue perifrico. Essa diferena entre os perfis de instabilidade de
microssatlites destas amostras pode ser explicada pela origem do DNA. O
DNA avaliado na frao mononuclear do sangue tem origem nas clulas do
sangue e no est relacionado com o tumor primrio, j o DNA plasmtico
apresenta sua origem no tumor, refletindo portanto, o comportamento da
neoplasia primria frente ao tratamento.
Contudo, a no reproduo da homogenidade dos eventos
observados tanto na urina quanto no plasma sugere que o painel estudado
no sangue perifrico no seja o mais adequado para as outras duas matrizes
avaliadas.
importante notar que o DNA presente em baixas concentraes em
indivduos sadios pode ser oriundo de apoptose e lise celular, contudo
Umetani avaliou seqncias repetidas e observou que os fragmentos de
DNA plasmtico oriundos de apoptose no apresentam mais de 200 pares
53
-
de base, fato que nos permite avaliar com segurana seqncias maiores do
que esta neste tipo de amostra (Umetani et al.,2006).
Schwarzenbach e colaboradores reportam 50% de perdas de
heterozigosidade ao analisar no plasma, a instabilidade de microssatlites
em loci que apresentam alteraes especficas nos tumores
(Schwarzenbach et al.,2004).
Assim como Schwarzenbach, encontramos em nosso trabalho mais
instabilidades genmicas de LOH do que de MSI, contudo observamos uma
maior incidncia da MSI nas amostras de plasma (Schwarzenbach et
al.,2004).
Possivelmente a anlise da instabilidade genmica encontrada no
DNA plasmtico livre reflita o surgimento de quimioresistncia por parte do
tumor primrio. Adicionalmente poderamos aventar que os genes de reparo
das clulas tumorais no conseguiriam encaminhar estas clulas para a
morte celular aps a ligao dos agentes alquilantes fita de DNA.
Ao avaliarmos as mdias de concentrao do DNA plasmtico das
amostras com instabilidade genmica com as que no apresentam tal
fenmeno no encontramos diferena significativa. Desta forma possvel
aventar que o aumento da concentrao do DNA plasmtico seja um
fenmeno do prprio desenvolvimento tumoral, ao passo que o surgimento
de instabilidades de microssatlite neste tipo de amostra componha uma
avaliao da genotoxicidade dos tratamentos anti-neoplsciosintra tumoral
(Schwarzenbach et al.,2004).
54
-
As concentraes de DNA plasmtico livre encontrado nas amostras
tanto estveis quanto instveis, embora possuam concentraes parecidas
podem divergir quanto integridade do material genmico liberado na
circulao. Umetani e colaboradores propem que a integridade do DNA
plasmtico um marcador para a progresso dos tumores e ainda para
metstase linfonodal (Umetani et al.,2006).
Trabalhos anteriores como o de Schawrzenbach, ao avaliar os
marcadores sricos frente concentrao de DNA plasmtico tambm no
obtiveram correlaes entre estes parmetros (Schwarzenbach et al.,2004).
No caso do CEA e CA 15.3 so antgenos carboidratos que se
encontram na superfcie celular, o CA 15.3 inclusive da superfcie do tecido
epitelial de mama, esses se apresentam aumentados frente ao crescimento
tumoral. J o DNA plasmtico livre liberado no plasma pelos tumores
devido a fenmenos como a necrose, a morte por desprendimento anoikis,
colapso mittico e a morte celular devido ao dos tratamentos
antineoplsicos.
A no concordncia entre as instabilidades genmicas observadas
nas diferentes amostras prope uma genotoxicidade diferente em cada
matriz celular avaliada, seja ela a frao mononuclear do sangue perifrico,
a urina ou ainda o DNA plasmtico de origem tumoral (Umetani et al., 2006).
Contudo, a concordncia encontrada nos marcadores pode nos
remeter a uma maior sensibilidade das regies avaliadas. A regio FMR2
(localizada no cromossomo X) que apresentou uma concordncia de 37,98%
entre as matrizes analisadas poderia ser mais suscetvel ao genotxica
55
-
dos agentes alquilantes empregados no tratamento das pacientes (Deitmeier
et al., 1997).
Sobre a concentrao do DNA plasmtico podemos observar uma
diferena significativa entre sua concentrao quando avaliamos doadoras
sadias e pacientes portadoras de carcinoma mamrio ao diagnstico (p<
0,001), tal averiguao permite avaliar a liberao de DNA plasmtico como
uma ferramenta diagnstica, ou ainda como uma via de acesso biologia
tumoral.
Nas amostras do presente trabalho colhidas durante o tratamento de
pacientes submetidas terapia neoadjuvante, foi obtida uma correlao de
p=0,02 quando comparou-se a concentrao do DNA plasmtico livre das
pacientes que responderam ao tratamento em relao ao grupo de pacientes
que no responderam ao tratamento.
Novos estudos que avaliem a composio e integridade deste DNA
possibilitaro novas avaliaes sobre a cintica da liberao dos cidos
nuclicos.
Sobre o aumento da concentrao do DNA plasmtico livre aps o
incio do tratamento quimioterpico neoadjuvante poderia ser interpretado
como o DNA de clulas tumorais mortas pelo tratamento quimioterpico
liberadas na circulao sanguinea , desta forma no refletindo a progresso
da doena, mas como resultado da terapia citotxica. Este fato permite
cogitar o uso do DNA plasmtico livre como avaliador da resposta
teraputica no tumor.
56
-
A caracterizao deste DNA em necrtico ou apopttico proposta por
Umetani e colaboradores pode ser de grande importncia na avaliao do
DNA liberado pelo tumor a fim de identificar o DNA liberado devido ao
tratamento e o liberado pelo prprio crescimento tumoral (Umetani et al.,
2006; Frattini et al., 2008).
Frattini associa a elevao do DNA plasmtico livre em pacientes com
doena recorrente em casos de cncer de colo retal. No mesmo trabalho o
seguimento dos pacientes foi maior frente ao realizado em nossas
avaliaes, portanto novos estudos que acompanhem as pacientes por
maiores perodos de tempo podero verificar se tal achado tambm pode ser
empregado em casos de carcinoma mamrio (Frattini et al., 2008).
Com base nos resultados do presente trabalho pode-se observar um
padro distinto da genotoxicidade induzida pela terapia antineoplsica nas
trs matrizes avaliadas, frao mononuclear do sangue perifrico, sedimento
urinrio e DNA plasmtico livre. Tais diferenas esto relacionadas tanto
origem do DNA avaliado, quanto aos mecanismos envolvidos e as
conseqncias destas alteraes genticas.
Quanto s implicaes das concentraes do DNA plasmtico
podemos aventar seu emprego como um potencial marcador de resposta
teraputica e no de crescimento tumoral como os marcadores sricos.
Estudos de caracterizao deste DNA podero fornecer informaes sobre a
resistncia aos regimes antineoplsicos.
57
-
6 CONCLUSES
1. Foram encontradas instabilidades genmicas nas regies de
microssatlites analisadas nas amostras de sangue, sedimento urinrio e
plasma das pacientes includas neste estudo.
2. As instabilidades nas regies de microssatlites encontradas nas
diferentes amostras no concordam entre si, sugerindo uma vulnerabilidade
genmica distinta entre os tipos de matrizes analisadas.
3. A concentrao de DNA plasmtico livre no se correlacionou com
os marcadores sricos CEA e CA15.3 usados na abordagem clnica do
cncer de mama. O aumento da concentrao do DNA plasmtico em
pacientes que responderam objetivamente quimioterapia neoadjuvante
poder se constituir em um novo marcador para casos em neoadjuvncia.
Estudos confirmatrios esto em curso para averiguar esta possibilidade.
58
-
7 REFERNCIAS
Aaltonen L, Peltomaki P, Leach F, Sistonen P, Pylkanen L, Mecklin J, Jarvinen H, Powell S Jen J, Hamilton S, Petersen G, Kinzler K, Vogelstein B, De la Chapelle A. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science. 1993; 260: 812-816. American Cncer Society diponvel em: http://www.cancer.org/docroot/ CRI/content/CRI_2_4_2X_What_are_the_risk_factors_for_breast_cancer_5.asp ltimo acesso em 03/06/2008. Anbazhagan R, Fujii H, Gabrielson E. Microsatellite instability is uncommon in breast cancer. Clin Cancer Res. 1999; 5:839-44. Benachenhou N, Guiral S, Gorska-Flipot,I, Labuda D, Sinnett D. Frequent loss of heterozygosity at the DNA mismatch-repair loci hMLH1 a