metodologÍa para la determinaciÓn de cortisol plasmÁtico en
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METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE CORTISOL PLASMÁTICO EN PECES USANDO LA PRUEBA DE INMUNOENSAYO ENZIMÁTICO (ELISA)
materiales y metodos
Pipeteado de calibracionVolumen
del pipetedo
Balanza analitica
Prueba de elisa
Cada volumen ocupado se peso en un recipiente plastico con previa reduccion de cero de la balanza
Elisa Para el cortisol
Dos juveniles peces
Fueron anestesiado por
inmersion en solucion ms-222
Se les tomo una muestra de
sangre con una jeringa con
heparina para obtener plasma
Centrifgadora a 10.000 xg
durante 5 mint
Se mentuvo en hielo hasta la
determinacion de la concentracion
de cortisol
Prueba de recuperacion
Tre tubos de eppendorf de
1.5 ml
•Se prepararon en una solucion standar de 50, 100 y 200 1ng. Ml y muestra de plama
Mantuvo a temperatua ambiente a 20 C
Prueba de linealidad
( 2.1, 1.4, 1.8, 1.16, ) indicando la dilución de la muestra de plasma de peces se marcaron
•En este caso las soluciones estándar y muestras de plasma, se mezcla 1:1 (v: v)
la primera dilución (1 / 2)
•En consecuencia, 30 l de la dilución 1 / 2 y 30 l de 0 ng / ml de una solución estándar fue tomada y se mezcla en el segundo tubo para preparar la dilución de 1 / 4
Protocolo d ensayo
20 l de cada solución de cortisol en plasma humano estándar (0, 20, 50, 100, 200, 400 y 800 ng.ml-1)
la muestra de plasma de peces fueron agregó por duplicado a la placa
las muestras para la recuperación y la prueba de linealidad se dispensaron en los pozos de los demás.
Soluciones patrón y el pescadomuestras de plasma para la prueba de recuperación fueron analizadas por duplicado
•200 l de enzima conjugado con peroxidasa de rábano
Por último, los pozos se mezcla suavemente en un mezclador de placas en una latidos / min 200-1 durante 10 minutos y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Durante 15 minuto se incubo a temperatura ambiente
La solución de cada pocillo se elimina mediante lavado de la placa tres veces con 400 l de PBS y sacudiendo el contenido en papel absorbente con el fin de eliminar las gotas residuales que podrían afectar la exactitud y precisión del ensayo
La reacción enzimática se visualiza por el cambio de color y fue detenido por la adición de 100 l de 0,5 M de ácido fosfórico (H2PO3)
La intensidad del color es inversamente proporcional a la concentración de cortisol en las muestras. Absorbancia se leyó en un espectrofotómetro a 450 nm en un lector de microplacas dentro de los 10 minutos después de la adición de solución de parada.
curva
Una curva estándar con el fin de calcular la concentración de cortisol de cada muestra de plasma. La curva se traza con la concentración de registro de cada solución estándar con densidad óptica logit. . Para ello, la media de los valores de absorbancia de 20, 50, 100, 200, 400 y 800 ng.ml-1 soluciones estándar se utilizó. La densidad óptica (DO) se calculó como la absorbencia de la solución de cada norma sobre la absorbancia de la solución de patrón cero. Una vez que se determinó OD, la OD logit se calculó mediante la ecuación: Logit OD: log (OD / (100-OD)).