IDENTIFIKACIJA SEKUNDARNIH

METABOLITA

ANALIZA SEKUNDARNIH METABOLITA

Hromatografija na tankom sloju (TLC)

Volatilni sekundarni metaboliti

GC/MS analizom Rt, RI, upoređivanjem spektara

Nevolatilni sekundarni metaboliti

HPLC uz upotrebu različitih detektora

“ukupni” spektrofotometrijski, fluorimetrijski...

2

3

TLC

Sracionarna faza – silika gel, celuloza, Al2O3.....

Mobilna faza - Npr - toluen:etilacetat (97:3) za EO

Detekcija - UV 365 nm i 254 nm

- anisaldehid/sulfatna kiselina

- vanilin/sulfatna kiselina

- jod/škrob

- fosfomolibdenska kiselina

4

TLC

Hromatografirani su slijedeći uzorci navedenim redoslijedom:

1. esencijalno ulje uzorka 2 (dvp)

2. esencijalno ulje uzorka 2 (hd)

3. headspace uzorka 2

4. headspace uzorka 3

5. geraniol

6. nerol

7. linalil acetat

5

DETEKCIJA - UV 365 nm DETEKCIJA - UV 254 nm

TLC - hromatogrami

6

Detekcija - Detekcija -

anisaldehid/sulfatna kiselina vanilin /sulfatna kiselina

TLC - HROMATOGRAMI

7

Detekcija - jod/škrob Detekcija -

fosfomolibdenska kiselina

TLC - HROMATOGRAMI

8

DVODIMENZIONALNA TLC - HROMATOGRAMI

EO-destilacija vodenom parom headspace tehnika

Detekcija - anisaldehid/sulfatna kiselina

Glavni cilj svih hromatografskih metoda je što bolje

razdvajanje komponenata uzorka u što kraćem vremenu.

Da bi se postigao ovaj efekat potrebno je izabrati

odgovarajuću kolonu, (dimenzija, stacionarna faza) i primjeniti

adekvatne hromatografske parametre kako bi se stvorili uslovi

za što niži limit detekcije.

9

Gasna hromatografija omogućava visoku rezoluciju,

analizu spojeva u tragovima

Upotrebljava se u analizi Esencijalnih ulja

Pesticida

Droga

Polutanata

...

10

GASNA HROMATOGRAFIJA (GC)

Kapilarne kolone,

(dužina 25-50 m sa unutrašnjim dijametrom 0.20– 0.32 mm i debljinom filma stacionarne faze od 0.25 mm).

Stacionarna faza može biti

polarna- spojevi se razdvajaju na osnovu njihove polarnosti, što rezultira različitim vremenom zadržavanja komponenata u koloni

nepolarna - dolazi do separacije zbog različitih tačaka ključanja

Esencijalna ulja sastoje od terpena i njihovih derivata koji imaju slične tačke ključanja, eluiraju se u vrlo uskom rasponu na nepolarnim kolonama. Da bi se prevazišao ovaj limit, analitička metoda se modificira primjenom sporijeg rasta temperature u pećnici, kako bi se proširio eluacioni opseg komponenata ulja.

11

GC Osnovni kriterij za identifikaciju kada se koriste detektori koji ne daju

informaciju o strukturi jesu retencioni indeksi. Sistem retencionih indeksa baziran je na činjenici da je svaki analit definisan pozicijom između dva susjedna alkana u homolognom nizu.

Metoda računanja RI bazira se na logaritamskoj jednačini koju je razvio Kovats 1958. godine za izotermalne uslove, kao i na jednačini koju su objavili Van den Dool i Kratz 1963. godine koja nema logaritamsku formu, a uzima u obzir temperaturno programirane uslove.

Zavisno od funkcije f(tR), koriste se različiti RI sistemi:

Logaritamska [f(tR) = log tR`], prema Kovatsu

Linearna [f(tR) = tR], što odgovara prijedlogu van den Doola i Kratza.

1 , ,

, 1 ,

n n R x R n

n

R n tR n

R I R I f t f t

R I

f t f

12

Općenito sistem retencionih indeksa bazira se

na vezi struktura-retenciono vrijeme

(n-alkani i metilni ili etilni esteri masnih kiselina, tj

svaka homologna serija koja predstavlja linearnu

vezu između retencionih vremena i broja

karbonovih atoma)

13

Uz identične uslove se kroz kolonu propušta i smjesa standarda

Komercijalno dostupne serije standarda su definisane

kvalitativno i kvantitativno

14

Linearni indeksi se odnose na teperaturno programirane

analize.

15

RI su mnogo korisniji u kombinaciji sa masenom

spektrometrijom, jer ova kombinacija može biti korisna za

identifikaciju izomera, što je teško kada se upotrebljava

samo spektar masa.

16

Npr.

Razlike u strukturi stereoizomera često imaju jako slične

spektre masa pa je upotreba RI neophodna

Korištenjem RI možemo suziti izbor i odbaciti “pogrešne

pozitivne identifikacije”

17

18

20

40

60

80

100

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

41

55

69

79

93

107

120

133

147

161

170189

204

Farnesene<(E)-beta->

20

40

60

80

100

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

41

55

69

79

93

105

109

120

127

133

147

161

179 189204

Farnesene<(Z)-beta->

(Z) b- Farnesen RI 1440 (E) - b- Farnesen RI 1454

m/z (%) = 41 (100), 55 (24), 69 (96), 79 (25),

93 (54), 105 (10), 109 (7), 120 (22), 127 (1),

133 (26), 147 (5), 161 (21), 179 (1), 189 (2),

204 (4)

m/z (%) = 41 (98), 55 (21), 69 (100), 79

(25), 93 (59), 107 (9), 120 (21), 133 (28),

147 (5), 161 (20), 170 (1), 189 (2), 204 (6)

Brza gasna hromatografija, fast gas chromatography (FGC), koja ima dovoljnu moć razdvajanja u kraćem vremenu, upotrebom adekvatnih kolona i instrumentacije u kombinaciji sa optimiziranim uslovima koji omogućavaju 3-10 puta brže analize. Ova vrsta hromatografije izvodi se u kratkim kolonama 5-10 m, promjera kolone 0.10-0.18 mm, uz hidrogen kao gas nosač, i bržim temperaturnim programom.

S obzirom na brzinu izvođenja analize ovaj vid gasne hromatografije može se podijeliti na

brzu u trajanju 3–12 min,

veoma brza 1–3 min,

ultrabrza manje od 1 min.

19

Najčešće upotrebljavani detektor kod analize volatilnih spojeva

je spektrometar masa

Kombinovani sistem gasna hromatografija/masena

spektrometrija GC/MS, predstavlja najefikasniju tehniku za

separaciju, detekciju i karakterizaciju komponenata u

kompleksnim organskim smjesama.

Spektrometar masa predstavlja osjetljiv i specifičan analitički

instrument, a ujedno i jednu vrstu hemijskog reaktora u kome

se dešava različita razgradnja molekula.

Primjena spektrometrije masa je neophodna pri ispitivanju

strukture supstanci dobijenih sintezom ili izolacijom iz

biljnog materijala,

praćenju metabolizma,

određivanju strukture metabolita.

20

Headspace; 37 komponentata

Esencijalno ulje; 66 komponenata

Satureja montana L.

20

40

60

80

100

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

39 51 65

77

91

107

115

121128

135

150

+ +

20

40

60

80

100

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

41 5165 77

91

103

119

134

+

10.00 20.00 30.00 40.00 50.00

0.25e6

0.50e6

0.75e6

1.25e6

0.25e6

0.50e6

0.75e6

1.25e6

[SM-HS] TIC #1 [8P07SM] TIC #2

C H3

C H3

CH3

C H3

CH3

C H3

O H

Headspace

Esencijalno ulje

p-cimen

20

40

60

80

100

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

41 51 65

77

91

107 115

121

135

150

+

C H3

O H

CH3

C H3

karvakrol

timol

(37.1 %)

(15.5%)

(59.1%)

(20.1%)

21

Melaleuca alternifolia

čajevac

22

HPLC

Analiza sekundarnih metabolita koji nisu

volatilni najčešće se izvodi HPLC tehnikom uz

upotrebu odgovarajućih kolona i detektora

To su najčeće

Fenoli

Flavonoidi

Kumarini

Antocijanini ....

23

HPLC

Najčešće korištene kolone pri analizi prirodnih produkata su

kolone obrnutih faza gdje su porozne čestice silika gela

presvučene nepolarnim materijalom, a najčešće korištena

otapala za eluiranje su polarne prirode kao što su voda,

metanol, acetonitril, izopropanol.

Dodatkom mravlje, sirćetne kiseline, trifluoroacetatne kiseline,

amonijum acetata ili fosfatnog pufera u mobilnu fazu moguće

je optimizirati separaciju.

Uobičajeno kolone imaju dijametar 1.0–4.6 mm i dužinu 30–

250 mm, dok veličina čestica stacionarne faze varira od 2–7

mm.

24

HPLC

Čestice u slučaju obrnutih faza su presvučene ugljikovodicima

čija dužina lanca može biti od C4–C18. Separacija na obrnutim

fazama je najefikasnija tehnika za separaciju fenolskih spojeva

i to na C18 stacionarnim fazama.

Razdvajanje je moguće izvršiti u izokratskom i gradijentnom

režimu.

Izokratski režim podrazumjeva ravnomjernu mobilnu fazu tokom

razdvajanja, a separacija je dobra za polarnije spojeve.

Gradijentno eluiranje se bazira na modifikaciji organskog otapala, a

najčešće acetonitrila i metanola tokom analize. Ovakav režim rada je

pogodan kada se fenoli nalaze u širokom rasponu polarnosti. Obično je

potrebno više vremena da se stabilizira kolona i može doći do promjena

na baznoj liniji usljed promjena sastava mobilne faze.

25

HPLC

Mora se voditi računa i o pH vrijednosti mobilne faze, gdje

može doći i do parcijalne disocijacije, što rezultira dodatnim

pikovima, širenju i asimetriji pikova, zbog koeluiranja kisele

forme i baznog konjugovanog oblika.

Najčešće korišten pH otopine za razdvajanje fenolskih spojeva

je 2.5–3, kada se razdvajaju kisele forme, a 5–7, kada se

fenolski spojevi razdvajaju u disociranom obliku.

Detekcija komponenata se vrši upotrebom različitihh detektora

26

Određivanje ukupnih fenola

Folin-Dennis (redukcija smjese fosfovolframatno-fosfomolibdatnog

reagensa u prisustvu fenolskih hidroksilnih grupa tirozina, što rezultira

stvaranjem plavog produkta)

Folin-Ciocalteu (Dodatak litijum sulfata sprječava formiranje

precipitata koji bi interferirali u kvantifikaciji utičući na intenzitet boje

nastalih kompleksa. Folin-Ciocalteu reagens je po hemijskom sastavu

heksavalentni fosfomolibdo/fosfovolframatni kiseli kompleks)

2 2 5 3 3 2

2 2 5 3 3 2

3 1 3 5 1 0

3 1 4 4 1 0

H O P O W O M o O H O

H O P O W O M o O H O

7 6 5M o V I žu t A rO H M o V p la v nm

27

Određivanje ukupnih flavonoida

Taloženje sa formaldehidom + Folin Ciocalteu

Metoda sa AlCl3

O

OO H

OH

O H

O H

O

Glu

Ram

O

OO

OH

O

Glu

Ram

Al

O A l+

O

AlCl3

2+

Rutin

28

Metoda sa 2,4-dinitrofenilhidrazinom

Princip ove metode zasniva se na reakciji aldehida i ketona sa

2,4-dinitrofenilhidrazinom.

Flavoni i izoflavoni sa dvostrukom vezom između C2-C3, ne

daju pozitivnu reakciju, dok flavanoni npr. naringin, naringenin i

hesperetin, formiraju hidrazone čiji je maksimum apsorpcije na

495 nm.

Zbog selektivnosti reakcija flavonoida sa

AlCl3 i 2,4-dinitrofenilhidrazinom, bilo bi dobro određivati

sadržaj specifičnih grupa flavonoida po obje metode, a njihova

suma bi dala realniju vrijednost za sadržaj ukupnih flavonoida.

29

METODE ODREĐIVANJA ANTOCIJANINA

pH - diferencijalna metoda,

bazira se na mjerenju

apsorpcije na jednoj valnoj

dužini, obično između 490-

550 nm, što je daleko od

uobičajene valne dužine na

kojoj se nalazi maksimum

apsorpcije za ostale fenole, a

koji apsorbuju u UV području.

Mjerenje se vrši pri različitom

pH; pri pH 1 su u obliku

obojenih oksonijum soli, dok

pri pH 4.5 su prisutni kao

bezbojni hemiketali

30

VANILINSKI TEST

Ovaj test specifičan je za proantocijanine, flavan-3-ol i

dihidrokalkone koji imaju jednostruku vezu na pozicijama

C2-C3.

O

OH

O

CH3

+

OOH

O H

O H

O H

O H

O

OH

O H

CH 3

OOH

O H O H

O H

O H

O H

O

OH

CH 3

OOH

O H O H

O H

O H

O H

H+

Flavan-3-olvanilin

prelazni spoj crveno obojeni produkt reakcije

31

U zdravom organizmu postoji ravnoteža između nastajanja

slobodnih radikala i antioksidativne odbrane samog organizma

Slobodni radikali nastaju pucanjem veza unutar molekula u

stanicama našeg organizma, pod uticajem različitih faktora, kao

što su: pušenje, izloženost ionizirajućem zračenju, UV zrakama,

zagađenom zraku, kao posljedica metaboličkih procesa te upala

Slobodni radikali u lančanoj reakciji stvaraju nove nestabilne molekule, što

rezultira stvaranjem sve većeg broja slobodnih radikala koji oštećuju

stanice organizma.

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

32

Antioksidansi neutraliziraju slobodne radikale donirajući

im svoj elektron te na taj način prekidaju lančanu

reakciju «krađe» elektrona drugim molekulama,

donirajući im svoj elektron, antioksidansi ne postaju

nestabilni

33

Oksidativni stres predstavlja pretjeran debalans reaktivnih

oksigenovih ili nitrogenovih vrsta, npr. superoksid anion,

hidrogen peroksid, hidroksil radikal ili peroksinitrit, u odnosu na

antioksidativni kapacitet, što vodi oksidaciji različitih

biomolekula, kao što su enzimi, proteini, DNA i lipidi.

Antioksidativni ˝kapacitet˝ označava učinkovitost, snagu,

potencijal i aktivnost neke čiste hemijske supstance da spriječi

oksidaciju neke druge supstance.

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

34

Pro-oksidans je supstanca koja može izazvati oksidativna

oštećenja na različitim biološkim biomakromolekulama kao što

su nukleinske kiseline, lipidi, proteini itd.

Antioksidans je supstanca koja može efikasno reducirati pro-

oksidans, pri čemu kao produkti nastaju supstance koje

nemaju štetno djelovanje.

Antioksidansi se definišu kao spojevi koji mogu odgoditi,

inhibirati ili spriječiti oksidaciju „hvatanjem“ slobodnih radikala

i smanjiti oksidativni stres.

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

35

Određivanje (antioksidativne aktivnosti) AOA

Metode bazirane na prenosu elektrona, eng. Electron Transfer (ET)

Metode bazirane na prenosu atoma hidrogena, eng. Hydrogen Atom

Transfer (HAT)

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

2 3

3 2

/ /

/ /

R O O A H A rO H R O O A H A rO H

A H A rO H H O A A rO H O

R O O H O R O O H H O

/ /R O O A H A rO H R O O H A A rO

36

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST

Svaki antioksidans prati različit uticaj koncentracije, pa se

antiradikalska aktivnost definiše kao količina potrebnog

antioksidansa da smanji početnu koncentraciju radikala na

50% ili kao ekvivalenti nekog standarda.

Rezultati se izražavaju kao (inhibiciona koncentracija) IC50,

minimalna koncentracija potrebna da izvrši 50%-tnu

inhibiciju radikala.

37

METODE

Neke od najčešće upotrebljavanih metoda za

određivanje antioksidacijske aktivnosti su;

DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

ABTS (2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)

ORAC (Oxygen radical absorbance capacity)

RP (Reducing power)

FEROZIN (helatacija)

38

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST –

DPPH

Originalna DPPH (2,2-difenilpikrilhidrazil) metoda predstavljena je prije više od 50 godina, kao metoda za mjerenje antioksidativne aktivnosti, podijeljena u dva tipa. ako je poznata hemijska priroda antioksidansa, pa se mogu

testirati specifični spojevi ili grupe,

drugi gdje je moguće posmatrati inhibiciju nekih prirodnih oksidativnih procesa

Da bi se odredila antioksidativna aktivnost specifičnih spojeva ili ekstrakata koji reaguju sa stabilnim DPPH• u metanolnom rastvoru, prati se smanjenje apsorbanse na karakterističnoj valnoj dužini.

Upotreba stabilnog slobodnog radikala DPPH je prvi put

opisana i razvijena 1958. godine ispitivajući kinetičke

parametre reakcije DPPH radikala sa cistein hidrohloridom.

Molekula DPPH je okarakterisana kao stabilni slobodni

radikal sa mogućnošću delokalizacije nesparenog elektrona

preko molekule kao cjeline, tako da molekula ne dimerizira,

kao što bi to bio slučaj kod većine drugih slobodnih

radikala.

U reakciji sa antioksidansom, DPPH radikal se

reducira do odgovarajućeg hidrazina mijenjajući boju

u žutu koja potiče od hromofornih grupa.

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST - DPPH

DPPH

(1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)

max = 517 nm

IC50

U radikalskoj formi DPPH• apsorbuje

na 517 nm, ali nakon redukcije

antioksidansom ili nekom

radikalskom vrstom apsorpcija na toj

talasnoj dužini nestaje.

Radikal ima ljubičastu boju zbog

nesparenih nitrogenovih elektrona i

nakon reakcije sa antioksidansom

radikal se reducira u DPPH-H formu

koja je žute boje.

42

0 0% / 1 0 0

tA A A A A

ABTS (2,2'-AZINO-BIS(3-ETILBENZTIAZOLIN-6-SULFONSKA KISELINA)

ABTS je prvi put upotrebljen za određivanje antioksidativne aktivnosti 1993.

godine.

Prvostepena reakcija generisanog ABTS radikal katjona sa antioksidantom

rezultira nastankom jednoelektronski oksidiranim produktom antioksidanta. U

zavisnosti od strukture nastalog produkta moguća je dimerizacija

jednoelektronski oksidiranog produkta antioksidanta ili reakcija sa još jednom

molekulom ABTS radikal katjona.

Jako je bitno naglasiti da sličnost mehanizma ABTS radikal katjona sa

antioksidantom i DPPH radikala sa antioksidantom nije potpuna. Predloženi

mehanizam važi samo u slučajevima kada je koncentracija radikal katjona reda

mmol/L. Pored koncentracionog faktora koji determinira mehanizam reakcije, tu

je i uticaj pH medija.

ABTS

Prednosti upotrebe ABTS radikal katjona u određivanju

antioksidativne aktivnosti su njegova topivost u vodi

metoda je jednostavna i ne zahtjeva skupu opremu,

ABTS radikal katjon reaguje brzo sa većinom antioksidanata,

ABTS radikal katjon se može koristiti u velikom rasponu pH,

ABTS je rastvorljiv u vodi i organskim rastvaračima, pri čemu ne utiče na jonsku

silu, omogućujući određivanje antioksidativne aktivnosti hidrofilnih i hidrofobnih

antioksidanata,

ANTIOKSIDATIVNA AKTIVNOST - ABTS

ABTS

(2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfonska kiselina)

max = 743 nm

S

N

NH4

+ + SO

3

-

C2

H5

N N

N

SSO

3

- + NH

4

+

H5

C2

-e-

+e-

S

N

NH4

+ + SO

3

-

C2

H5

N N

N

SSO

3

- + NH

4

+

H5

C2

ABTS

O

C H3

OH

CH3

C H3

C H3

COOH

Trolox

S

N+

NH4

+ + SO

3

-

C2

H5

N N

N

SSO

3

- + NH

4

+

H5

C2

H O

C H3

O

CH3

C H3

C H3

COOH+

.+ABTS

.+ABTSH

45

0 0% / 1 0 0

tA A A A A

RP (REDUCING POWER)

Određivanje antioksidativne aktivnosti nekih spojeva redukcijom

Fe(III) jona je prvi put opisana 1989. Zasnovana je na redukciji

[Fe(CN)6]3- antioksidantom. Pri tome, antioksidant donira elektron

centralnom metalnom jonu redukujući ga prema reakciji:

Nastali produkt (redukovana forma) apsorbira u vidljivom dijelu

spektra.

Upravo praćenje promjene apsorpcije na 700 nm daje podatke o

sposobnosti antioksidanta da redukuje Fe(III) jon do dvovalentnog

jona koji obrazuje obojeni kompleks stabilizacijom sa Fe(III) jonima.

RP-MO

Redukcija Mo(VI) kao metoda evaluacije antioksidativne aktivnosti prvi put je upotrebljena 1998. godine. Mehanizam reakcije antioksidanta i Mo(VI) jona zasniva se na transferu elektrona, pri čemu se formira Mo(V) jon koji apsorbuje u vidljivom dijelu spektra.

Za razliku od fericijandine metode, nastali produkt Mo(V) jona, je već sam po sebi obojen te nije potrebno dodavati reagens koji će sa istim nagraditi kompleks koji apsorbuje u vidljivom dijelu spektra (695 nm).

Mo(VI) + AH Mo(V) + AH+

FRAP

Ova metoda spada u reakcije u kojima dolazi do prenosa elektrona, gdje se

spoj trovalentnog željeza koristi kao oksidans u reakciji sa 2,4,6-tripiridil-s-

triazinom (TPTZ). Redoks potencijal ove feri soli je ~0.70 V, što je slično

potencijalu ABTS•+ od 0.68 V, tako da nema velike razlike između ove dvije

metode, osim pH vrijednosti koja je neutralna kod ABTS•+ metode, a kisela

kod FRAP.

Pripremanje oksidansa svodi se na reakciju TPTZ u acetatnom puferu sa

FeCl3, nakon reakcije sa antioksidansom mjeri se apsorpcija na 593 nm.

N

N

N

N

N

N

Fe(III)

N

N

N N

N

NN

N

N

N

N

N

Fe(II)

N

N

N N

N

N

-e

+ antioksidans

FRAP

Nedostaci ove metode su u tome tome što se navedeni kompleks formira pri

određenoj pH vrijednosti od 3.6, što je mnogo niže od fizološkog pH,

nedovoljna je osjetljivost na antioksidanse koji imaju –SH grupu, kao npr.

glutation, ograničeno je i mjerenje antioksidacijske sposobnosti u vodenom

mediju.

N

N

N

N

N

N

Fe(III)

N

N

N N

N

NN

N

N

N

N

N

Fe(II)

N

N

N N

N

N

-e

+ antioksidans

FEROZIN

Za razliku od metoda redukcije jona prelaznih metala, metoda helatacije zasniva se

na konkurentskoj reakciji helatacije Fe(II) jona od strane heteroatoma antioksidanta i

bidentatnog liganda ferozina.

Kada molekula helatacijom „zarobi“ neku vrstu koja može producirati reaktivne vrste

(npr. radikale), inhibiran je proces nastajanja istih. Upravo na ovoj pretpostavci

bazirana je ova metoda. Ukoliko molekula koja je predmet istraživanja ima dobre

helatirajuće osobine, okupirat će koordinacionu sferu Fe(II) jona, te tako onemogućiti

ulazak bidentatnog liganda ferozina.

Cjelokupan proces konkurentskih reakcija molekule antioksidanta i ferozina kao

liganda moguće je pratiti spektrofotometrijski, jer kompleks Fe(II) jona sa ferozinom

apsorbuje u vidljivom dijelu spektra sa maksimumom apsorpcije na oko 562 nm.

ORAC

ORAC metoda određivanja antioksidativne aktivnosti prvi put je

opisana 1993. godine. Ova metoda mjeri oksidativnu

degeneraciju molekule koja ima sposobnost fluorescencije

nakon što se miješa sa generatorom slobodnih radikala

(AAPH za ROO˙, sistem Cu2+-H2O2 za OH˙). Ova metoda je jedinstvena

po tome što se ukupni antioksidativni kapacitet određuje nakon

kompletne reakcije oksidacije supstrata.

U mehanističkom pogledu se ORAC metoda klasificira u metode

određivanja antioskidativne aktivnosti bazirane na HAT mehanizmu, što

znači da u presudnom koraku mehanizma reakcije dolazi do transfera

protona sa molekule antioksidanta na slobodni radikal.

ORAC

Ukoliko se u prethodno opisanom sistemu nalazi molekula

antioksidanta koja ima sposobnost doniranja vodikovog atoma,

inhibira se oksidacija fluoresceina redukcijom nastalih radikala

(ROO˙ ili OH˙).

Upravo na principu kompetitivnih rekacija oksidacije FL i

redukcije slobodnog radikala, bazirano je određivanje

antioksidativne aktivnosti ovom metodom. Obično se uz analizu

potencijalnog antioksidanta ispituje i Troloks.

Iz dobivenog kinetičkog profila (kriva ovisnosti relativnog intenziteta

fluorescencije od vremena), integriranjem površine se rezultati

izražavaju u odnosu na Troloks.

ORAC

Kao prednosti ove metode određivanja antioksidativne aktivnosti navodi se prvenstveno prisustvo vještački stvorenih slobodnih radikala (ROO˙i OH˙) u živim sitemima. Ova činjenica omogućuje dobru komparaciju rezultata dobivenih u in vitro ispitivanjima sa stvarnim procesima u živom sistemu. Od ostalih prednosti ove metode pominju se:

Mogućnost ispitivanja hidrofilnih i hidrofobnih potencijalnih antioksidanata,

Mogućnost automatizacije procesa,

Postoji baza podataka za rezultate dobivene ORAC metodom za različite uzorke,

Visoka osjetljivost,

Može se primjeniti na biološke uzorke i uzorke hrane, pa postaje korisna u medicinskoj dijagnostici i terapeutici i dr.

Kao nedostaci ove metode navodi se znatno veći uticaj rastvarača u odnosu na ostale. Također, metoda znatno duže traje u odnosu na ostale.

54

Sljedeće predavanje;

TERPENI

... 55