MICO

BACTERIAS

Bioq Nora I Costa

Sección Bacteriología TBC Hospital de Infecciosas F.J.M

uñiz

MICO

BACTERIAS: CLASIFICACIÓN

O

rden: Actinomycetales

Familia: M

ycobacteriaceae Género: M

ycobacterium

Integrado por más de 150 especies, que pueden dividirse en 3 grandes grupos:

M

icobacterias patógenas estrictas: �

Complejo M

ycobacterium tuberculosis:

M. tuberculosis, M

. bovis, M. africanum

, M. m

icroti, M. canetti, M

. capreae, M. pinnipedii

Enfermedad: Tuberculosis

�M

. leprae (no cultivable) Enfermedad: Lepra

Micobacterias Am

bientales M

icobacterias no tuberculosas de crecimiento rápido

Micobacterias no tuberculosas de crecim

iento lento Enferm

edad: Micobacteriosis

Micobacterias

M. Tuberculosis com

plejo

•

Parásito estricto •

No tiene toxinas

•Reservorio: el hom

bre infectado. •

Son patógenos verdaderos. •

Se transmite persona a persona.

MN

T

•Son m

uy abundantes en la naturaleza. •

Son habitantes de agua, tierra y alimentos.

•Variable distribución geográfica.

•Pueden contam

inar muestras clínicas.

•Pueden dar reacciones de PPD ¨falsam

ente positivas¨.

•Pueden ser patógenos oportunistas (m

icobacteriosis). •

No se transm

iten persona a persona. •

Frecuentemente son resistentes a las drogas

antituberculosas.

M

icobacterias

Genero Mycobacterium

•Pared celular compleja y rica

en lípidos. 1- Capacidad de ácidorresistencia. 2- Presencia de ácidos m

icólicos con 60 a 90 átom

os de carbono. 3- Elevado contenido G+C : 61 a 71 %

(guanosina+citosina), en su ADN

.

Distribución enfermedades por

Micobacterias

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

Tuberculosis M

icobacteriosis M

.bovis

98.5%

1%

0.5%

Datos de la epidemiología m

undial

Países con mayor carga de TB

Tasas de incidencia de TB 2016

Tasas de TB por jurisdicción. Argentina 2018

Costo de los Tratamientos

OPS

S Tratamiento HRZE 918,32$

MR Tratam

iento ZEKEthCsL 169021$ XDR Tratam

iento LzErMoBe 1027502$

Resistencia a M tuberculosis…

•

Aparece por mutación

genética.

•Selección m

ediante esquem

as terapéuticos erróneos, falta de supervisión terapéutica, falta de adherencia al tratam

iento, mala calidad

de los fármacos.

•Por haber recibido un m

al esquem

a (irregularidad, abandono, m

ala prescripción) RESISTEN

CIA ADQU

IRIDA

•Por haberse contagiado con una cepa resistente (exposición a un foco con tuberculosis resistente)

RESISTENCIA IN

ICIAL

DIagnóstico DIAGN

ÓSTICO

Los procedimientos diagnósticos en el

laboratorio deben realizarse en condiciones de bioseguridad adecuada

Baciloscopía: BSL 2 Cultivo: BSL2, con prácticas de BSL3.

Diagnóstico de M

icobacterias

La confiabilidad en el resultado de un examen

de laboratorio depende de: *

La utilización de una técnica sensible *

Realizada en forma correcta

*Buena m

uestra que provenga del sitio de la lesión que se investiga

*O

btenida en cantidad suficiente *

Colocada en un envase adecuado *

Conservada y transportada correctamente

Métodos de Laboratorio para el

diagnóstico de TB •

Baciloscopía •

Cultivo

Baciloscopía: Coloración de Ziehl-Neelsen

1- Fijar extendido con calor. 2- Cubrir con Fucsina y flam

ear hasta desprender vapores blancos.

3- Lavar 4- Decolorar con Alcohol-HCl 3%

5- Lavar 6- Contracolorear con Azul de M

etileno 2 o 3 minutos.

7- Lavar y dejar secar. 8- M

irar en 100X, e informar bacilos/100 cam

pos

Ziehl Neelsen

•M

. tuberculosis: se ven como pequeños

bastones curvados (bacilos) de color rojo, en pares o grupos, sobre un fondo de tonos azulados

Cuantificación del frotis

Coloración de ZN: nro. de BA

AR

obs. a 1000x Inform

e

Ninguno

No se obs. BA

AR

1 a 9 BAA

R en 100 campos

Nro. de bacilos observados.

10 a 99 BAA

R en 100 campos

(+)

1 a 10 BAA

R/cpo. en al menos 50

cpos. obs. (++)

> 10 BAA

R/cpo. en al menos 20

cpos. osb (+++)

Baciloscopia

•

“La calidad

del in

form

e del lab

orato

rio d

e m

icrobiología depende inicialmente de la

calidad

de la m

uestra clín

ica remitid

a”

•En el diagnóstico de TB pulm

onar, el Esputo es la m

ejor muestra del

tracto respiratorio

Calidad de las muestras I

ESPUTO

S

�M

uestra de elección: mucopurulenta o m

ucosa �

Espontáneo o inducido. �

Spot vs Overnight (53 %

vs 85%)

�

Los esputos salivosos, no son buenas muestras, pero

no deben descartarse, porque aun así pueden contener bacilos

Esputos ¿Cuántas m

uestras procesamos?

Realizar estudio seriado para una m

ayor rentabilidad

La baciloscopía directa aporta: ~

1ra. Muestra: 80%

de positivos ~

2da. Muestra: 95 %

de positivos m

arcado incremento de la positividad

~3ra. M

uestra: 100% de positivos

Baciloscopia •

Conservación esputo (En heladera) •

No hay m

ucho problema si los conservam

os hasta 1 sem

ana, porque aunque los bacilos no sean viables, se colorean.

•N

o enviar extendidos!!! En extendidos fijados hay entre 30 a 40%

de bacilos viables. En preparados coloreados, no hay bacilos viables

Baciloscopía

Rápida �

Fácil de realizar �

Bajo costo �

Detecta la mayoría de los casos infecciosos

� Especificidad: 96-99%

�

Son necesarios entre 5.000 y 10.000 BAAR/ml. de

muestra para ser BK+, por eso la lim

itación más

importante es su baja sensibilidad

•

RECORDAR!!! se necesitan < de 10 bacilos para

transmitir la infección

S:70%

E:99.8%

Baciloscopía

•Especificidad 96-99%

•

Falsos positivos: M

icobacterias ambientales

Hongos N

ocardia Rayaduras Suciedad

•

En un país de alta o mediana endem

ia, más del

99% de las BK+ son TB

DIAGNÓ

STICO DE CERTEZA!!!!

La gran limitación de esta técnica (ZN

) es su relativa baja sensibilidad

Influenciada por 3 factores: 1ro. Con lo avanzado de la enferm

edad: �

Sens. 80-90% con patrón cavitario en Rx de tórax

�Sens. 50-80%

si tiene infiltrados �

Sens. < 50% en form

as nodulares o masas

2do. Calidad de la muestra y de la coloración

3ro. Tiempo que dedica el operador en observar el frotis

Baciloscopía Perm

ite…

•Categorizar el grado de avance de la enferm

edad en el m

omento del diagnóstico

•Interrum

pir la cadena de transmisión

¾

tratamiento

¾

aislamiento del paciente internado

•M

onitorear la evolución del tratamiento

CULTIVO

•La baciloscopía detecta el 70-80%

de los casos •

El cultivo el 20-30 % restante.

•Entre los casos de tuberculosis extrapulm

onar el aporte del cultivo al diagnóstico es m

uy variable según la localización de la patología.

Si se considera el total

de casos con diagnóstico de tuberculosis

pulmonar confirm

ado bacteriológicam

ente…

Calidad de las muestras II

• BAL �

es importante centrifugar estas m

uestras previa realización de los directos, para m

ejorar la calidad de las mism

as. �

Evaluar celularidad.

•CO

NTEN

IDO GÁSTRICO

(solo en niños) �

BAAR no patógenos, baciloscopίa con reserva, debe haber abundantes bacilos.

•O

RINAS

�centrifugar previa realización de los directos

�seriado de 3 m

uestras

•O

tros líquidos: pleural, LCR, articular, abscesos, etc

Calidad de las muestras III

•

BIOPSIAS

En solución fisiológica o agua estéril, sin conservantes. M

acerar el material antes de realizar el directo

•HEM

OCU

LTIVO Y M

ÉDULA Ó

SEA •

5 ml de sangre heparinizada

•Aspiración de m

édula ósea heparinizada •

Muestras que solo tienen valor en pacientes

inmunocom

prometidos

Cultivo M

uy importante!!!

Conservar los materiales en la heladera, y

procesarlos dentro de los 3 días, ya que los bacilos pierden viabilidad.

Tiem

po 0 días

3 días 5 días

7 días

% viables

93%

83%

71 %

63%

Cultivo

•Perm

ite dar seguridad al resultado de la baciloscopía positiva de algunas m

uestras.

•Perm

ite aislar los BAAR presentes en una muestra en

cantidad suficiente como para identificarlos por

métodos bioquím

icos.

•Perm

ite realizar la prueba de sensibilidad en los casos que sea necesaria.

Norm

as para solicitud de cultivo

•

Muestras de esputo con baciloscopías

reiteradamente negativas y con clínica, radiología y/o

epidemiología com

patible con tuberculosis. •

Todas las muestras extrapulm

onares. •

Todas las muestras pediátricas.

•Pacientes con asociaciones m

orbosas. •

Pacientes inmunocom

prometidos.

•Pacientes com

unidades cerradas.

Cultivo

•

Decontaminación y concentración de la

muestra por el M

étodo de Petroff. •

El pellet obtenido de la concentración, es el que se siem

bra en el medio de Löw

enstein Jensen (LJ) y en un m

edio Stonebrink para ver el desarrollo de M

.bovis.

Detección de Micobacterias I

Método convencional: Cultivo en m

edio sólido, a base de huevo entero, sales, glicerol, harina de papa y verde de m

alaquita. Low

enstein-Jensen y Stonebrink

Más de 20 días para obtener desarrollo m

icrobiano

Cultivo en medio sólido

�

Las muestras se incuban a 37C durante 8 sem

anas, con observaciones diarias las prim

eras 48 hs. y luego observaciones sem

anales.

�Registrar tubos contam

inados, no debe ser mayor al

4-5% del total de m

uestras sembradas.

�

Los cultivos positivos se informan en cruces:

�Entre 1 a 9 colonias se inform

a el número exacto

�De 20 a 100 colonias: una cruz

�M

ás de 100 colonias: ++ o +++

Cultivo Ventajas: M

ayor sensibilidad que BK Desvantajas: M

enos accesibles M

ás caro Lento crecim

iento 3-8 semanas

10 a 100 bacilos en toda la m

uestra

U

tilidad del cultivo

Detectar bacilos escasos en distintas muestra

• De lesiones pulm

onares poco avanzadas

• Extrapulm

onares

• Pediatricas

Aislar e identificar BAAR en muestras que pueden

contener micobacterias am

bientales •

Orina, lavado gástrico

Utilidad del cultivo

Aislar y realizar la prueba de sensibilidad de BAAR de m

uestras de pacientes que pueden tener tuberculosis resistente a los antibióticos de prim

era línea con

Mala respuesta al tratam

iento

Historia de tratamiento previo

Inmunosuprim

idos

Vigilancia epidemiológica

NO

RMAS PARA SO

LICITUD DE PRU

EBA DE SEN

SIBILIDAD

•Pacientes con abandono de tratam

iento, recaídas, re-internaciones.

•Todas las m

uestras de pacientes inmunocom

prometidos (HIV

+, oncológicos, en tratamiento con corticoides, diabéticos).

•

Pacientes en contacto con multirresistentes.

•Pacientes que al segundo m

es de tratamiento cum

plido sigan con baciloscopías positivas.

•Pacientes de países con alta tasa de resistencia.

ATB en m

edio sólido �

En Lowenstein Jensen o Middlebrook.

�M

edio base con INH

-SM-EM

B-RFA

�Inóculo inicial de 0.5 escala de M

c Farland, se hacen diluciones 1/10.

�Se siem

bra -3,-5,-6 en tubo control y con drogas.

�Se hace el recuento de colonias (28 días)

�M

ás del 1% se considera resistente.

Laboratorio en el control de tratamiento

• Prueba de sensibilidad a fárm

acos de primera

línea (H,R,S,E). •

Ofrecida a los pacientes antes m

encionados •

Es primordial detectar la m

ultirresistencia o la resistencia a R

• En los casos de fallas o fracasos terapéuticos es posible hacer la prueba de sensibilidad directa( BK ++ o +++)

• Prueba de sensibilidad indirecta ( escasa cantidad de bacilos)

Controles

•A todos los pacientes positivos en tratam

iento se les realizarán controles baciloscópicos al 2º, 4º y 6º m

es.

•Si la baciloscopía del 2º m

es resultara positiva, se cultivará la m

uestra para identificación y sensibilidad.

•En el caso de pacientes internados se les realizará una baciloscopía sem

anal como control para poder

externarlos.

•M

icroscopia de Fluorecencia LED M

ejora de M

icroscopía

•U

so de Medio Líquido

•N

itratasa, Fagos. MO

DS M

ejora de cultivo y DST

ID rápida

Biología m

olecular

Tiras de ID

Diag de Mtc y m

utaciones que determinen

R (R y/o H). X pert, M

DR

Nuevas Herram

ientas

Métodos aceptados por O

PS

AURAM

INA- RO

DAMIN

A

Tan eficaz como la

coloración de ZN

Se basa en el mism

o principio de la ácido-alcohol-resistencia M

. tuberculosis: se ven com

o pequeños filam

entos amarillos

fluorescentes sobre fondo verde

SISTEMAS DESARRO

LLADOS PARA LA DETECCIÓ

N

PRECOZ DEL DESARRO

LLO DE M

ICOBACTERIAS

Métodos que detectan consum

o de O2:

•M

GIT 960 Fluorom

étrico (Becton Dickinson)

MGIT 960

•

Método autom

atizado de m

onitoreo continuo que detecta el consum

o de oxígeno por parte de las m

icobacterias que desarrollan en la m

uestra. Así se activan los sensores de fluorescencia y se detectan en el equipo las m

uestras positivas.

MGIT 960

•Lectura autom

atizada de cultivos •

Monitorean autom

áticamente

tubos indicando crecimiento

•Aum

enta la sensibilidad •

Reduce a la mitad el tiem

po de detección de desarrollo del bacilo

•N

o Identifica Complejo M

tuberculosis

•Perm

ite conocer el perfil de resistencia a drogas antituberculosas

•Botella con tapa, m

ejora bioseguridad pero aporta m

ayor contam

inación

MGIT 960

•Los tubos donde se inoculan las m

uestras son plásticos y a rosca por lo que no hace falta jeringa y aguja para inocular las m

uestras reduciendo riesgos en el personal que las m

anipula, aunque son observadas mayores

tasas de contaminación.

•Código de barras.

• Link a sistem

as de gestión de laboratorio

Ventajas de los medios líquidos

•M

ayor sensibilidad que los medios sólidos.

•M

ayor rapidez de detección que los medios

sólidos.

ZN +++

ZN ++

L-Jensen 17 días

20 días

Bactec 6 días

11 días

MB/Bact

7 días 13 días

MGIT

5 días 10 días

Inconvenientes o desventajas

•M

ayores tasas de contaminación (se calcula una tasa de

contaminación aceptable de 4%

, aunque es algo superior en el caso de M

GIT 8%).

•Aporte eléctrico continuo

•Dificultad para reconocer cultivos m

ixtos (Incapacidad de observar m

orfología de las colonias) •

Incapacidad de realizar recuento de colonias •

Muy caros

•Bioseguridad???

IDEN

TIFICACIÓN

BIOQ

UÍM

ICA DE M

ICOBACTERIAS

M

archa mínim

a

• M

ICROSCO

PIA ( presencia de cuerda) •

TBc ID (inmunocrom

atografía) •

Tiempo de positividad del cultivo

•Características de las colonias

TBc ID (MGIT BD)

M

étodos aceptados por la OM

S M

étodos de las proporciones en medio Low

estein- Jensen

•Cerca del 90%

de TBMR detecta la M

R en 3 sem

anas ( prueba directa) •

Para asegurar que el bacilo es sensible 40 días

•La pruebas de sensibilidad a S y E son m

enos reproducibles con cualquier m

étodo que se considere

•La resistencia a estas drogas no está significativam

ente asociada a fracaso con esquem

as de primera línea

•N

o es recomendable introducir m

étodos alternativos a los validados por el m

omento

• En nuestro país el 90%

de las cepas R a rifampicina , son

tambien R a isoniacida.

Se han desarrollado métodos rápidos y económ

icos para hacer un screening que acelere la detección de Resistencia a R (e H )

Para laboratorios habituados a la prueba de sensibilidad en Lowenstein

–Jensen. Para laboratorios con entrenamiento en m

icrobiología general y bioseguridad adecuada.

NITRATASA

FAGOS

Nuevos m

étodos fenotípicos rápidos para detección de M

R o resistencia a R

Técnicas basadas en la detección de viabilidad bacilar

Método de la N

itratasa •

No dependen de equipam

iento sofisticado ni reactivos costosos. El procedim

iento es similar al del m

étodo convencional y em

plea el mism

o medio sólido.

• Capacidad que tienen los bacilos para reducir el nitrato a nitrito m

ientras están viables •

Su incorporación a la rutina no altera sustancialmente la carga de

trabajo en los laboratorios que realizan pruebas de sensibilidad. •

Se ha comprobado su utilidad en la detección de resistencia a

isoniacida, rifampicina y etam

butol en el término de 10 días con una

eficiencia mayor a 98%

en comparación con el patrón de oro.

• En un estudio realizado en nuestro país, el m

étodo de la nitratasa tam

bién resultó adecuado para la detección de resistencia a drogas cuando fue aplicado directam

ente a muestras de esputo con BK +++

MO

DS M

étodos colorimétricos

•

Se basan en la capacidad que tienen los bacilos viables, luego de la exposición a una droga, para reducir indicadores de color añadidos al m

edio de cultivo. •

La presencia de bacilos resistentes se detecta por un cambio de color del

indicador. •

Dos indicadores, resazurina y MTT (3-[4,5-dim

ethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium

bromide), han sido am

pliamente evaluados en un

microm

étodo. •

Con ambos indicadores se detecta resistencia a isoniacida, rifam

picina y etam

butol en 10 días con una eficiencia mayor a 98%

. •

La implem

entación de estos métodos requiere buenas condiciones y

prácticas rigurosas de bioseguridad, por lo que en nuestro medio su

implem

entación sería posible a nivel de laboratorio de referencia.

Nuevas herram

ientas diagnosticas en las redes de laboratorios de tuberculosis en Latinoamérica.

Barrera L, Montoro E. O

PS 2006 1(1)

OPS ha recom

endado la prueba de nitratasa para detectar rápidam

ente resistencia a rifampicina e

isoniacida en Latinoamerica

OPS /O

MS producen recom

endaciones en base al análisis de publicaciones y revisión sistem

ática de resultados de validación en los escenarios donde tienen que ser em

pleados a cargo de expertos independientes de la industria

Prueba de sensibilidad de fármacos de

segunda línea

•M

étodos aceptados por la OM

S

�M

étodos de las proporciones en medio

Lowestein- Jensen

•El ensayo e interpretación de resultados de las pruebas presentan alto grado de dificultad

Orientación para evaluar la resistencia a drogas de segunda

línea O

MS, Ginebra , julio 2007

Se recomienda seguir el siguiente algoritm

o

R e H (incorporar algún m

étodo rápido en lo posible)

E y S

Z fluoroquinolonas (OFX

) kanam

icina (o amicacina) y

capreomicina

En laboratorios m

uy experim

entados bajo un program

a de control de calidad externo conducido por un laboratorio supranacional

Conclusiones

• En general, las pruebas de sensibilidad a distintas drogas difieren en confiabilidad y reproducibilidad.

•Las pruebas de sensibilidad a R son las m

ás reproducibles seguidas por las de sensibilidad a H.

• los resultados de las pruebas de sensibilidad a E y S son m

ucho menos confiables, aún los obtenidos con los m

étodos patrones.

•A nivel internacional se proponen valores de eficiencia de 97%

y 99%

para las pruebas de sensibilidad a H y R y de 92% para S

y E. •

Eficiencias inferiores a estas exigen un programa de

mejoram

iento de la calidad. •

El método de la nitratasa, los colorim

étricos y el basado en la replicación de bacteriófagos cum

plen con los niveles de eficiencia aceptados para H, R y E, pero no para S.

Métodos M

oleculares

•Am

plificación de ácidos nucleicos

•Hibridación con sondas

Métodos M

oleculares

Métodos m

oleculares

Métodos m

oleculares

¾M

edios líquidos para cultivo y PS

en escenarios con bajos y medios recursos

OM

S ha recom

endado el empleo de

¾P

ruebas moleculares (LIPA

s) para screening rápido de pacientes con riesgo de m

ultirresistencia

http://ww

w.who.int/tb/dots/laboratory/en/index.htm

l

Com

enzando la implem

entación en laboratorios de referencia nacional que cum

plan ciertos requisitos

CONCLU

SIONES…

.. Recordar siem

pre!!!! �

Cuanto menor el núm

ero de bacilos, menor la probabilidad de que

resulte positiva una baciloscopía, un cultivo o una PCR �

El resultado negativo de un método m

icrobiológico no puede ser utilizado para descartar el diagnóstico de TBC.

�

EL DIAGNO

STICO EN

TB ES

Clínico: síndrome de im

pregnación. Radiológico: poco específico Bacteriológico (el de m

ayor especificidad), obtención de muestras de

esputo, punciones, abscesos, LCR, PAMO

y hemocultivos en HIV+.

CASO DE TB: paciente diagnosticado com

o tal por el médico tratante.

La baciloscopía y cultivo continúan siendo los métodos

básicos y certeros para confirmar el diagnóstico de

tuberculosis, por lo tanto deben ser ofrecidos a todos los sintom

áticos

•Los m

étodos de reciente generación no son de aplicación universal, son costosos y tienen

distinta utilidad y precisión.

•La selección e interpretación de sus resultados requiere

interacción estrecha entre neumonólogo/infectólogo y el

microbiólogo de m

anera que , racionalmente, estos m

étodos aporten orientación útil para las decisiones clínicas.

Equipo multidisciplinario

de salud!!!!

CRITERIOS PARA DIAGN

OSTICO

DE ENFERM

EDAD PU

LMO

NAR PO

R MN

T (A.T.S 2007)

•Clínico

• 1 Paciente sintom

ático pulmonar, con opacidades, nódulos cavidades en

Rx, o con bronquiectasia multifocal con m

últiples nódulos en una tom

ografia.

Y •

2 Exclusión de otros diagnósticos.

Microbiológico

•1 Cultivo de por lo m

enos dos esputos, positivos para MN

T. O

•

2 Cultivo positivo para MN

T, de un LBA.

Identificación de MN

T

Identificación de MN

T •

Características fenótipicas, velocidad de crecimiento, pigm

ento, tem

peraturas de crecimiento. ( Grupos de Runyon)

•PRA

•Sondas com

erciales •

Secuenciación de genes ( por lo menos 2: hsp 65, rpo b)

•M

ALDITOFF

Identificación de MN

T Prueba m

olecular: análisis de perfiles de restricción (PRA) Análisis de los productos de restricción con las enzim

as BsteII y HaeII, de un amplicón

de 439 pb correspondientes al gen hsp65

Linea 3: M. intracellulare

Linea 6: M. avium

J. Clin . Microbiol,1993.31:175-178

Pruebas de sensibilidad

•

MAC CIM

a Claritromicina (m

icrodilución)

•M

. kansasii CIM a Rifam

picina (microdilución)

Pruebas de sensibilidad para RGM

•

Probar los siguientes ATB am

icacina,imipenem

, doxiciclina quinolonas, TM

S, cefoxitina claritrom

icina, linezolid tobram

icina (M. chelonae)

MU

CHO

POR H

ACER…

GRACIAS POR SU

ATENCIÓ

N!