ivanja minimalne ostatne bolesti u akutnim...

BIOCHEMIA MEDICA god. 12, br. 3–4, 2002. 97

J. ]uri} i sur. Imunolo{ke metode odre|ivanja minimalne ostatne bolesti u akutnim leukemijama

Pregledni ~lanakReview

IMUNOLOŠKE METODE ODRE\IVANJA MINIMALNEOSTATNE BOLESTI U AKUTNIM LEUKEMIJAMA

Josip ]uri}, Klara Dubrav~i}, Branka Uàrevi}, Drago Batini}

Zavod za imunologiju i Referentni centar za imunodijagnostiku hematoloških i imunoloških bolesti, Klini~ki zavod za

laboratorijsku dijagnostiku KBC Zagreb

SA@ETAK – Kemoterapijski protokoli koji se trenutno koriste u lije~enju akutne leukemije dovode do remisijebolesti u ve}ine bolesnika. Ipak, u mnogih }e bolesnika do}i do relapsa bolesti zbog preostalih leukemijskih stanicakoje se ne mogu otkriti konvencionalnom citomorfologijom, pojave poznate pod nazivom minimalna ostatna bolest(MOB). Pokazalo se da su proto~na citometrija i lan~ana reakcija polimeraze metode koje najviše obve}avaju upogledu odre|ivanja MOB. Proto~nocitometrijsko odre|ivanje MOB zasniva se na otkrivanju imunofenotipskihkombinacija leukemijskih stanica koje se ne nalaze na normalnim krvotvornim stanicama koštane srì. Ovatehnika moè dosegnuti razinu osjetljivosti 10–5 i trenutno se moè primijeniti u najmanje dvije tre}ine bolesnika sakutnom leukemijom. Nekoliko studija pokazalo je da se pra}enjem MOB u hematološkim malignim bolestimamoè predvidjeti klini~ki ishod bolesti. U bolesnika s akutnom limfoblasti~nom leukemijom, odre|ivanje MOB jekorisno za procjenu ranog odgovora na terapiju i predvi|anje relapsa.

Klju~ne rije~i: akutna leukemija, imunofenotipizacija, minimalna ostatna bolest, proto~na citometrija

Adresa za dopisivanje:Josip ]uri}, dr. med., Zavod za imunologiju, Klini~ki zavod za

laboratorijsku dijagnostiku KBC Zagreb - Rebro, Kišpati}eva 12,10000 Zagreb; Tel. 23 88 336 Fax 23 12 079.

E-mail: [email protected]

MINIMALNA OSTATNA BOLEST

Protokoli koji se trenutno koriste u lije~enjuakutnih leukemija (AL) dovode do remisije bo-lesti u ve}ine bolesnika (1). Uvo|enje alogene iautologne transplantacije krvotvornih mati~nihstanica (KMS) dodatno je produìlo trajanje re-misije (2). Ipak, u velikog broja bolesnika s ALdo}i }e do relapsa bolesti, što govori da posto-je}im protokolima nije mogu}e u potpunosti uni-štiti sve maligne stanice (2). Pri postavljanju di-jagnoze akutne leukemije sveukupna tumorskamasa broji do 1012 leukemijskih stanica, a tije-kom lije~enja i uvo|enjem bolesnika u remisijuona se smanjuje (3). Remisija se u bolesnika s ALdefinira klini~kim i laboratorijskim pokazatelji-ma, posebice citomorfološkim nalazom <5% bla-sta u aspiratu koštane srì (tzv. citomorfološkaremisija) (3). Me|utim, budu}i da je donja grani-ca osjetljivosti citomorfologije 1%-5% blasta u

razmazu aspirata koštane srì, ona ne daje po-datak o sveukupnoj preostaloj tumorskoj masi(3). Drugim rije~ima, bolesnici u citomorfološkojremisiji mogu imati razli~it broj leukemijskihstanica, od svega nekoliko, pa do, teoretski, 1010

leukemijskih stanica (1,2,3,4). Leukemijske sta-nice koje se ne mogu otkriti rutinskom citomor-fološkom analizom biološkog materijala u bole-snika s AL nazivaju se minimalnom ostatnomboleš}u (MOB) (4). Stoga i lije~enje svih bole-snika u citomorfološkoj remisiji istim terapijskimprotokolom moè biti neispravno: u bolesnika svelikim brojem leukemijskih stanica lije~enjemoè biti nedostatno, a u onih s malenim brojemleukemijskih stanica ono moè biti nepotrebno iuzrokovati toksi~ne u~inke (4). Zbog toga je po-trebno raspolagati osjetljivijim metodama odre-|ivanja ostatnih leukemijskih stanica. U prak-ti~nom smislu, analiza MOB moè dati izuzetnovrijedne podatke va`ne za: 1) procjenu u~inko-vitosti uvodne terapije; 2) odre|ivanje individu-alne terapije nakon postizanja remisije; 3) pred-vi|anje relapsa bolesti prije pojave klini~kih zna-kova; 4) otkrivanje leukemijskih stanica u eks-

98 BIOCHEMIA MEDICA god. 12, br. 3–4, 2002.

Imunolo{ke metode odre|ivanja minimalne ostatne bolesti u akutnim leukemijama J. ]uri} i sur.

tramedularnim podru~jima; 5) procjenu kakvo}eautolognog transplantata KMS; 6) procjenu u~in-kovitosti ~iš}enja transplantata KMS od leuke-mijskih stanica; i 7) usporedbu razli~itih terapij-skih protokola (1).

Analiza minimalne ostatne bolesti mogu}a jesamo ako su poznata specifi~na obilje`ja leuke-mijskih stanica na temelju kojih se one razlikujuod normalnih krvotvornih stanica. Na raspola-ganju nam stoji nekoliko metoda koje se zasni-vaju na sljede}im razlikama izme|u normalnih ileukemijskih stanica: 1) nalazu specifi~nih kro-mosomskih aberacija (klasi~na citogenetika i flu-orescentna in situ hibridizacija-FISH); 2) izraà-ju leukemijskih proteina (npr. bcr-abl - Western-blotting); 3) sadràju stani~ne DNA (proto~na ci-tometrija); 4) izraàju neuobi~ajenih imunofeno-tipskih karakteristika (proto~na citometrija); 5)preuredbama gena za receptore limfocita (South-ern-blotting i PCR); i 6) rastu leukemijskih sta-nica in vitro (stani~ne kulture) (5). Iz navedenogje razvidno da postoji velik broj metoda koje sepotencijalno mogu koristiti za odre|ivanje MOB.Prilikom izbora, a prije samog uvo|enja metodeza rutinsko pra}enje i odre|ivanje MOB, svakakotreba voditi ra~una o nekoliko va`nih parame-tara, od kojih se izdvajaju osjetljivost metode (³10–3, što zna~i nalaz jedne maligne stanica na ti-su}u normalnih), specifi~nost metode, stabilnosttraènog obilje`ja tijekom bolesti (~ime se sma-njuje broj la`no negativnih rezultata), reprodu-cibilnost metode, dostupnost metode u laborato-rijskim uvjetima, cijena pretrage, brzina dobi-

vanja rezultata i mogu}nost kvantifikacije rezul-tata (1,3).

Navedenim kriterijima najviše udovoljavajudvije metode, a to su imunofenotipizacija leuke-mijskih stanica proto~nom citometrijom i tehni-ka PCR (Slika 1) (1).

NAÊLA IMUNOLOŠKOG ODRE\IVANJAMOB

Maligne stanice akutnih i kroni~nih leukemi-ja dugo su vremena bile smatrane malignim’’dvojnicima’’ nezrelih i zrelih stanica normalnehematopoeze, odnosno dràlo se da izraàvajuleukocitne diferencijacijske biljege (LDA) prispo-dobive odre|enom stadiju razvoja normalnih kr-votvornih stanica (2). Ti su biljezi smješteni namembrani stanice, u citoplazmi ili u stani~noj je-zgri, a otkrivaju se s pomo}u specifi~nih mono-klonskih protutijela. Za razliku od biljega iz su-stava HLA (engl. human leucocyte antigens), kojisu jedinstveno svojstvo jedinke unutar vrste,LDA se istovjetno nalaze na leukocitnim subpo-pulacijama u svih jedinki iste vrste. Oni mogubiti specifi~ni za stani~nu lozu (npr. B-limfocite),stupanj diferencijacije stanice ili odraàvaju po-sebna biološka svojstva stanica (aktivaciju i pro-liferaciju). Prema me|unarodnoj klasifikaciji, sviLDA razvrstani su u 266 CD-skupina (engl. clus-ters of differentiation) (6). Pojam imunofenotipozna~ava ustrojstvo CD-biljega odre|ene popula-cije stanica, pri ~emu jednaku va`nost ima ipozitivan i negativan nalaz odre|enog biljega.Leukemijske stanice do izvjesnog stupnja opo-našaju imunofenotipske karakteristike normal-nih krvotvornih stanica, a to onemogu}ava nji-hovo jednostavno otkrivanje me|u brojnim nor-malnim krvotvornim stanicama. Ipak, leukemij-ske stanice ~esto pokazuju odstupanja od uobi-~ajnih imunofenotipova normalnih stanica, a tupojavu nazivamo aberantnim ili neuobi~ajenimimunofenotipovima (2). Odstupanje imunofeno-tipa leukemijskih stanica od normalnog pred-stavlja, u stvari, leukemijsko obilje`je (engl. leu-kemia-associated immunophenotype, LAI) i metaje imunološkog odre|ivanja minimalne ostatnebolesti (2).

Aberacije imunofenotipa leukemijskih stanicase mogu svrstati u sljede}e oblike (Tablica 1): 1)kri`nu ekspresiju biljega dviju ili više loza (npr.istodobni izraàj biljega mijeloidne i jedne odlimfocitnih loza); 2) asinkronu ekspresiju biljegaunutar iste loze (tj. istodobna ekspresija dvaju iliviše biljega koji karakteriziraju razli~ite stupnje-ve diferencijacije stanica); 3) prekomjernu eks-

S l i k a 1. Osjetljivost metoda za odre|ivanje mini-malne ostatne bolesti tijekom lije~enja bo-lesnika s akutnom leukemijom (prema ref.5)

F i g u r e 1. Sensitivity of methods for detection ofminimal residual disease during therapyof patients with acute leukemia (accord-ing to ref. 5)



presiju biljega s obzirom na stupanj diferen-cijacije stanica; 4) neizraàj biljega (kada se tonormalno o~ekuje); i 5) ektopi~ni izraàj biljega(1,2).

PROTO^NA CITOMETRIJA I MOB

U~inkovitost analize MOB s pomo}u imuno-loške fenotipizacije omogu}ila je metoda proto~necitometrije. Radi se o osjetljivoj metodi analizeheterogenih stani~nih populacija, kao što je ko-štana sr`, na na~elu multiparametrijske analizestanica obiljeènih s pomo}u dva, tri ili više spe-cifi~nih monoklonskih protutijela od kojih je sva-ko konjugirano s razli~itom fluorescentnom bo-jom. Budu}i da je osjetljivost imunofenotipizacijeu otkrivanju MOB na razini do 10–5 (tj. jedna le-ukemijska stanica na 100.000 stanica koštanesrì) (2,7), to zna~i da se pri odre|ivanju MOBjednim od leukemijskih obilje`ja mora analiziratii do nekoliko stotina tisu}a stanica. Konvencio-nalnim pristupima, kao što su UV-mikroskopijaili imunocitokemija, to je nemogu}e posti}i.

AKUTNA LIMFOIDNA LEUKEMIJA (ALL)B-LIMFOCITNE LOZE

Postoji nekoliko pristupa imunofenotipizacijikrvotvornih stanica u cilju otkrivanja i kvanti-fikacije MOB u ALL B-limfocitne loze. Prvi se te-

melji na koekspresiji jednog ili više biljega T-loze(npr. CD2, CD3, CD5 i CD7) ili mijeloidne loze(CD13, CD15, CD33 i CD65) na leukemijskimstanicama B-imunofenotipa (Tablica 2). Premapojedinim autorima, navedene aberacije prisutnesu u oko 70% bolesnika s ALL B-loze (1,2).

Drugi pristup temelji se na otkrivanju asin-kronog izraàja biljega (npr. izraàj biljega zreli-jih B-stanica CD20 na nezrelim CD45neg. B-sta-nicama), otkrivanju neizraàja jednog od biljegaloze (npr. CD45), kao i otkrivanju prekomjernogizraàja biljega za odre|eni diferencijacijski stu-panj (npr. biljezi CD10 i/ili CD34). Za njihovo od-re|ivanje koriste se standardizirane kombinacijemonoklonskih protutijela koje su sastavljene natemelju iskustva mnogobrojnih laboratorija. Pa-neli protutijela koji se trenutno predlaù u tra-ènju aberantnog profila jesu sljede}i: TdT/CD10/CD19, CD10/CD20/CD19, CD34/CD38/CD19, CD34/CD22/CD19 i CD19/CD34/CD45 (8).Ako su prisutne, leukemijske stanice se prika-zuju unutar tzv. “praznih prostora” koji se nalazeizvan normalnog diferencijacijskog puta B-limfo-cita koštane srì za odre|enu kombinaciju pro-tutijela (Slika 2 i Slika 3) (8). S pove}anjem brojakorištenih panela pove}ava se i udio bolesnika ukojih se nalaze imunofenotipske aberacije. Kori-štenjem ~etiri do pet navedenih panela udio bo-lesnika s otkrivenim aberacijama leukemijskihstanica iznosi do 98% bolesnika, a s dva do tripanela taj udio iznosi 78% bolesnika (8). Ovisno o

Ta b l i c a 1. U~estalost aberantnih imunofenotipova u akutnim leukemijama (ref. 1,2)

Ta b l e 1. The frequency of aberrant immunophenotypes in acute leukemia (ref. 1,2)

Aberacija B-ALL T-ALL AML

Kri`na ekspresija (%) 70 50 70

Asinkrona ekspresija (%) 10 25 40

Prekomjerna ekspresija ili neizraàj biljega (%) 60 0 15

Ukupno (%) 80-90 90-100 70-80

T a b l i c a 2. Specifi~ne imunofenotipske aberacije leukemijskih stanica i njihova u~estalost u pojedinim oblicimaakutne leukemije (prema ref. 6,11 i 12)

T a b l e 2. Specific aberrant immunophenotypes of leukemic cells and their frequencies in different types of

acute leukemia (according to refs. 6, 11 and 12)

Aberacija B-ALL T-ALL AML

Kri`na ekspresija biljega CD2, CD13, CD33 CD13, CD15, CD33 CD2, CD5, CD7, CD19, CD22

Asinkrona ekspresija biljega CD34+CD22+CD20- CD1+CD5+CD3c+ CD117+CD33+HLADR-CD34+CD22+CD20+ CD1+CD3+TCR+ CD34+CD117+CD33+HLADR-CD34+CD22-CD20+ CD4+CD8+CD3c+ CD34-CD14-CD15-CD33+

Prekomjerna ekspresija biljega CD10, CD34, CD20 CD7 CD33, CD34, CD117, HLADR

Ektopi~ni imunofenotip CD3+TdT+ stanice ukoštanoj srì ili krvi



S l i k a 2A. Proto~nocitometrijska analiza MOB u uzorku koštane sr`i bolesnika s ALL B-loze tijekom remisije.Postupak za identifikaciju mononuklearnih stanica (a) i svih CD19+ stanica (loza B-limfocita) (b).

F i g u r e 2A. Flow cytometric analysis of MRD in bone marrow sample of a patient with B-lineage ALL duringremission. The procedure for the identification of mononuclear cells (a) and CD19+ cells (B-lympho-cyte lineage) (b).



S l i k a 2B. Analiza diferencijacijskih biljega izdvojenih CD19+ B-stanica koštane sr`i s pomo}u dijagnosti~kihtrostrukih kombinacija biljega.

F i g u r e 2B. Analysis of differentiation markers of gated CD19+ bone marrow B-cells by means of diagnostictriplet marker combinations.



na|enoj aberaciji leukemijskih stanica pri po-stavljanju dijagnoze, za svakog se bolesnika od-re|uje specifi~na kombinacija protutijela koja sepotom koristi tijekom pra}enja bolesnika. Me|u-tim, i prvi i drugi pristup imaju nekoliko nedo-stataka: 1) analiza je mogu}a samo u bolesnikakoji imaju izraène aberacije fenotipa; 2) analizazahtijeva izvorni dijagnosti~ki uzorak; i 3) imu-nofenotipske promjene zbivaju se u 10%-15% slu-~ajeva tijekom bolesti, pa mogu dovesti do la`nonegativnih rezultata (tragaju}i za izvornim feno-tipom previde se leukemijske stanice »novog« fe-notipa) (9,10).

Da bi se to ograni~enje izbjeglo, razvijaju sedodatni pristupi za odre|ivanje MOB. Jedan odnjih temelji se na hipotezi da prisutnost ostatnihleukemijskih stanica remeti diferencijaciju nor-malnih stanica hematopoeze (9,10). Zbog toga sepove}ava udio nezrelih B-stanica u odnosu naudio u normalnoj koštanoj srì. Odjeljak nezrelihB-stanica odre|uje se s pomo}u kombinacija pro-tutijela CD10/CD20/CD19 i CD10/CD34/CD19, a~ine ga stanice imunofenotipa CD10+CD20- iCD10+CD34+. Broj nezrelih B-stanica i pra}enjediferencijacijskog puta ispitivanih B-stanica s po-mo}u navedenih biljega korišteno je za analizuprognosti~kog zna~aja MOB u djece s ALL (9,10).

Na kraju, analiza MOB je mogu}a i otkriva-njem kimeri~nih proteina prepisanih s fuzioni-ranih gena koji su nastali kromosomskim trans-lokacijama (BCR-ABL, E2A-PBX1 i MLL-AF4)(1). Protutijela specifi~na za ove proteine mogubiti korisna u traganju za minimalnom ostatnomboleš}u. Do sada su proizvedena dva protutijela.Jedno od njih je protutijelo s oznakom 7.1 kojespecifi~no prepoznaje antigen NG2 (proteoglikans hondroitin-sulfatom), a ujedno obiljeàva leu-kemijske stanice s translokacijom 11q23 (1). Dru-go protutijelo je KOR-SA3544, a prepoznaje leu-kemijske blaste s translokacijom t(9;22), odnosnos izraàjem kimeri~nog proteina bcr-abl. Budu}i

da ovo protutijelo reagira i s mijeloidnim stani-cama, ono se koristi samo u kombinaciji s pro-tutijelom za limfoidne progenitore (1). Dijagno-sti~ka vrijednost navedenih protutijela u otkri-vanju MOB još je uvijek predmet istraìvanja.

AKUTNA LIMFOIDNA LEUKEMIJAT-LIMFOCITNE LOZE

U zdravih se osoba kombinacija jednog odpan-T biljega (CD2, CD3, CD5 ili CD7) i jezgri-nog enzima terminalne deoksinukleotidil-tran-sferaze (TdT) rijetko nalazi na stanicama izvantimusa. U perifernoj krvi ili koštanoj srì ta sekombinacija biljega nalazi na malenom broju sta-nica (0,02%-0,3%), pri ~emu one nikad ne izraà-vaju biljeg zrelih T-limfocita (CD3), ve} drugepan-T biljege (CD2 ili CD7) (2). Traènje ektopi~-nih dvostruko pozitivnih stanica CD3+TdT+ ukoštanoj srì ili perifernoj krvi ~ini osnovu zaodre|ivanje MOB u T-ALL (2). Ako je TdT koddijagnoze slabo izraèn, mogu}e je primijenitikombinaciju biljega nezrelih stanica CD34 i bilje-ga CD3. Na ovaj na~in mogu}e je odrediti MOB u90% slu~ajeva T-ALL (2). Bitno je spomenuti daje kombinacija CD3/TdT stabilna tijekom bolestii pojavljuje se i u relapsu bolesti, a to smanjujemogu}nost la`no negativnih rezultata (2).

Analiza minimalne ostatne bolesti u T-ALLmogu}a je i na osnovi kri`ne ekspresije mijelo-idnih biljega (CD13, CD15, CD33 itd.), asinkroneekspresije biljega (npr. koekspresija CD34 i CD3)i prekomjerne ekspresije biljega (npr. CD7). Kaoi u slu~aju ALL B-loze, leukemijske stanice po-drijetlom od T-limfocitne loze pojavljuju se naproto~nocitometrijskim prikazima unutar tzv.“praznih prostora” koji se nalaze izvan diferen-cijacijskog puta normalnih stanica T-limfopoeze(2).

OPIS SLIKA Slika 2A. U prvom koraku prikuplja se 15000 stanica koštane srì, nakon ~ega se postavlja ograda (gate) okomononuklearnih stanica (a) i CD19+ mononuklearnih stanica (b). Biljeg CD19 otkriva se s pomo}u monoklonskog protutijelakonjugiranog s fluorescentnom bojom Per-CP (“tre}a boja”) Uzorak se ponovno propušta kako bi se prikupilo 25000 CD19+stanica za dodatnu analizu diferencijacijskih biljega.

Slika 2B. Analiza diferencijacijskih biljega ogra|enih CD19+ stanica izvodi se s pomo}u trostrukih kombinacija protutijela(CD10/CD34/CD19, CD10/CD20/CD19, TdT/CD10/CD19, CD22/CD34/CD19 i CD45/CD34/CD19) rabe}i dvoparametrijskeprikaze fluorescencije (FL1-FITC vs. FL2-PE). Raspodjela normalnih prethodni~kih B-stanica predstavljena je to~kastimprikazom, dok su “prazna polja”, koja odgovaraju imunofenotipovima aberantnih leukemijskih stanica, prikazana sivimkrugovima i ozna~ena velikim slovima A-F.

FIGURE LEGENDS Figure 2A. In a first step, a total number of 15000 bone marrow cells are acquired followed by gatingof mononuclear cells (a) and CD19+ mononuclear cells (b). Marker CD19 is identified using monoclonal antibody conjugated toPerCP fluorescent dye (“third color”). The sample is run again to collect 25000 CD19+ cells for additional analysis of differen-tiation-related markers.

Figure 2B. The analysis of differentiation-related markers on gated CD19+ cells is done by means of triple-antibody combinations(CD10/CD34/CD19, CD10/CD20/CD19, TdT/CD10/CD19, CD22/CD34/CD19 i CD45/CD34/CD19) using two-parameter fluorescencedisplays (FL1-FITC vs FL2-PE). The distribution of normal precursor B-cells is represented as dots whereas “empty spaces”, corre-sponding to aberrant leukemic immunophenotypes, are shown as gray circles denoted by capital letters A-F.



Kona~no, postojanje tumor-specifi~nih antige-na koji su rezultat kromosomskih aberacija po-ve}ava broj potencijalnih meta za odre|ivanjeminimalne ostatne bolesti. Jedan od njih je pro-tein TAL1 koji je izraèn na leukemijskim sta-nicama kao produkt fuzijskog gena SIL-TAL (2).

AKUTNA MIJELOIDNA LEUKEMIJA (AML)

Aberacije imunofenotipa mogu se na}i u 70%-80% bolesnika s AML (2). Kri`na ekspresijaantigena T-loze (npr. CD2, CD4 ili CD7), B-loze(CD19) ili enzim TdT nalazi se u 40%-70% bo-lesnika (2). Na leukemijskim stanicama ~esto senalaze i kombinacije biljega kao što suCD15+CD34+, CD56+CD34+ te CD15+CD117+,a predstavljaju asinkronu ekspresiju biljega kojase ne nalazi na stanicama normalne koštane srì(Tablica 2). Na leukemijskim stanicama moè sena}i i prekomjerna ekspresija pojedinog CD-bi-ljega, obi~no CD13, CD14, CD15 i CD33 (2). Pre-ma nekim istraìvanjima, u bolesnika koji su ti-jekom remisije u trajanju od najmanje 4 mjesecaimali više od 0,2% aberantnih stanica u aspiratukoštane srì došlo je do relapsa AML unutar raz-doblja od 1-7 mjeseci (bez la`no pozitivnih rezul-tata) (11). Dio bolesnika (10%) s negativnim na-lazom tako|er je ušao u relaps bolesti, što uka-zuje na mogu}nost la`no negativnih nalaza tije-kom pra}enja MOB. Kao i u slu~aju ALL B-loze, iu bolesnika s AML i translokacijom 11q23 pri-mjenjuje se analiza MOB s pomo}u mono-klonskog anti-NG2 protutijela 7.1. Za razliku odALL, u bolesnika s AML ~esto se ve} pri dijagnozina|e nekoliko fenotipski razli~itih leukemijskihsubpopulacija, što moè oteàti izbor najpriklad-nijih biljega za odre|ivanje MOB (2).

Alternativni na~in procjene MOB u bolesnikas AML odnosi se na izra~un odnosa izme|u ne-zrelih (CD34+) mijeloidnih i limfoidnih stanica(2). Prema istoj skupini autora, neprimjereno vi-sok odnos izme|u mijeloidnih i limfoidnih CD34+stanica korelira s pove}anom u~estaloš}u relapsabolesti.

KLINI^KI ZNAÂJ ODRE\IVANJAMINIMALNE OSTATNE BOLESTI U

BOLESNIKA S AKUTNOM LEUKEMIJOM

Istraìvanja koja su ra|ena u zadnje vrijemepokazuju da imunološko odre|ivanje MOB u bo-lesnika s ALL ima potencijalnu klini~ku vrijed-nost. Tijekom lije~enja AL, dobar odgovor nauvodno lije~enje (indukciju remisije) predstav-ljen je brojem blasta u perifernoj krvi manjim od1000/µl nakon tjedan dana terapije prednisonom(2). Kao logi~an slijed ovog klini~kog opaànja,

daljnja ispitivanja pokazala su da niska razina ilinemogu}nost detekcije MOB u koštanoj srì na-kon indukcije predstavlja dobar prognosti~ki po-kazatelj, odnosno da je rizik pojave relapsa bo-lesti razmjeran razini MOB (2,12). Na primjer, ubolesnika s ALL u kojih nije otkrivena MOB nakraju indukcijskog lije~enja, trogodišnja kumu-lativna pojavnost relapsa iznosi 7,5%±4%, za ra-zliku od bolesnika s nalazom MOB u kojih onaiznosi 32,5%±10,6% (1). Osim toga, nalaz MOBna kraju indukcije izravno je korelirao s progno-sti~ki nepovoljnim vrstama ALL, kao što su ALLs translokacijom t(9;22) ili preuredbama genaMLL (2). Druga istraìvanja su pokazala da zapredvi|anje tijeka i ishoda bolesti nije dovoljnajedna vremenska to~ka promatranja MOB (npr.na kraju indukcijskog lije~enja), ve} taj nalaztreba kombinirati s nalazom MOB prije po~etkadruge faze lije~enja tj. terapije konsolidacije (2).Negativan nalaz MOB u obje to~ke tijekom lije-~enja govori u prilog dobroj prognozi bolesti, dokintermedijarna (10–3) ili visoka razina (³10–2)MOB u obje to~ke govori u prilog loše prognozebolesti. Bolesnici s nalazom MOB izme|u nave-denih vrijednosti svrstani su u intermedijarnuprognosti~ku skupinu (2). Pojedini autori stogapreporu~uju ~eš}e pra}enje bolesnika u kojih suna|ene ostatatne leukemijske stanice na krajuindukcije, kao i promjenu protokola lije~enja ubolesnika s trajnim nalazom MOB (12). Pra}enjeMOB, nadalje, moè dati i izuzetno vrijedne po-datke za predvi|anje i procjenu u~inkovitostitransplantacije koštane srì: negativan nalazMOB prije transplantacije osnovni je preduvjetza uspješnu transplantaciju krvotvornih mati~-nih stanica (7). Jednom rije~ju, sva dosadašnjaklini~ka istraìvanja ukazuju na potrebu pra}e-nja MOB i uvrštenja ove metode u postoje}e tera-pijske protokole (1-4).

Treba, me|utim, posebno naponeuti da jošuvijek nema odgovora na pitanje pozitivnog na-laza MOB u dijela bolesnika koji su u dugotrajnojremisiji bez znakova bolesti: da li pozitivan nalazMOB u svakoj to~ki mjerenja nagovješ}uje relapsbolesti ili otkriva samo one leukemijske stanice~iji je proliferacijski kapacitet ošte}en prethod-nom kemoterapijom? Pitanja koja treba riješitiodnose se na to~nije odre|enje razine MOB iznadkoje dolazi do relapsa bolesti, odre|enje vre-menskih to~aka analize MOB tijekom lije~enja,kao i na pitanje potrebe kombinirane primjenedvaju ili više testova za otkrivanje MOB (5).

Rad je potpomognut sredstvima iz projekta Mini-starstva zanosti i tehnologije Republike Hrvatske br.214006 »Biološki parametri stanica akutnih miješanih

leukemija«.



IMMUNOLOGICAL DETECTION OF MINIMAL RESIDUAL DISEASE IN ACUTE LEUKEMIA

SUMMARY – Current cytotoxic protocols induce complete remission in most acute leukemia patients. However,many patients eventually relapse due to persistence of residual leukemic cells that are undetectable by conventionalcytomorphology, known as minimal residual disease (MRD). Flow cytometry and polymerase chain reaction haveemerged as the most promising methods for detecting MRD. Flow cytometric detection of MRD is based on the iden-tification of immunophenotypic combinations expressed on leukemic cells but not on normal haematopoietic cells.This technique can reach the sensitivity of 10–5 and can be currently applied to at least two thirds of all patientswith acute leukemia. Several studies have shown that the monitoring of MRD in hematopoietic malignant diseasemay predict clinical outcome. In patients with acute lymphoblastic leukemia, MRD detection is useful for evaluat-ing early response to treatment and for predicting relapse.

Key words: acute leukemia, immunophenotyping, minimal residual disease, flow cytometry

certed action report: flow cytometric immuno-phenotyping of precursor B-ALL with standardizedtriple-stainings. Leukemia 2001;15:1185-92.

19. Lucio P, Parreira A, van den Beemd MWN, van LochemEG, van Wering ER, Baars E, et al. Flow cytometricanalysis of normal B cell differentiation: a frame of ref-erence for the detection of minimal residual disease inprecursor-B-ALL. Leukemia 1999;13:419-27.

10. Ciudad J, San Miguel JF, Lopez-Berges MC, Garcia-Marcos MA, Gonzalez M, VazquezL, et al. Detection ofabnormalities in B-cell differentiation pattern is a use-ful tool to predict relapse in precursor-B-ALL. Br JHaematol 1999;104:695-705.

11. Griesinger F, Piro-Noack M, Kaib N, Falk M,Renziehausen A, Troff C, et al. Leukaemia-associatedimmunophenotypes (LAIP) are observed in 90% of adultand childhood acute lymphoblastic leukaemia: detectionin remission marrow predicts outcome. Br J Haematol1999;105:241-55.

12. Coustan-Smith E, Behm FG, Sanchez J, Boyett JM,Hancock ML, Raimondi S, et al. Immunological detec-tion of minimal residual disease in children with acutelymphoblastic leukaemia. Lancet 1998;351:550-4.

LITERATURA

11. Campana D, Coustan-Smith E. Detection of minimal re-sidual disease in acute leukemia by flow citometry.Cytometry 1999;38:139-52.

12. Szczepa�ski T, Van Dongen JJM. Detection of minimalresidual disease. U: Henderson ES, Lister TA, GreavesMF, ur. Leukemia. 7. izd. Philadelphia: WB Sanders;2002; 249-83.

13. Knechtli CJC, Goulden NJ, Langlands K, Potter MN.The study of minimal residual disease in acute lympho-blastic leukaemia. J Clin Pathol: Mol Pathol1995;48:M65-M73.

14. Campana D, Pui CH. Detection of minimal residual dis-ease in acute leukaemia: methodologic advances andclinical significance. Blood 1995;85:1416-34.

15. Batini} D. Biološko i klini~ko zna~enje detekcijeminimalne ostatne bolesti. Lije~ Vjesn 1999;121:62-3.

16. Mason D, ur. Leucocyte typing VII. Oxford: Oxford Uni-versity Press; 2002.

17. Szczepa�ski T, Orfao A, van der Velden VHJ, SanMiguel JF, van Dongen JM. Minimal residual disease inleukaemia patients. The Lancet Oncol 2001;2:409-17.

18. Lucio P, Gaipa G, van Lochem EG, van Wering ER,Porwit-MacDonald A, Faria T, et al. BIOMED-I con-

ivanja minimalne ostatne bolesti u akutnim...

Documents