israelensis mediante fermentación líquida utilizando
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA
EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD
SINALOA
Producción de Bacillus thuringiensis var
israelensis mediante fermentación líquida
utilizando diferentes medios de cultivo para el
control de mosquitos Culex spp.
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRIA EN
RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
ARTURO LEÓN VALDEZ
GUASAVE, SINALOA; MEXICO DICIEMBRE DE 2014
El trabajo de tesis se desarrolló en el Laboratorio de Bioinsecticidas en el
Departamento de Biotecnologia Agrícola del Centro Interdisciplinario de Investigación
para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad Sinaloa del Instituto Politécnico
Nacional (IPN). Bajo la dirección del Dr. Cipriano García Gutiérrez. El presente
trabajo fue apoyado económicamente por los proyectos SIP 20130074 y 20140490.
El alumno Arturo León Valdez agradece el apoyo económico brindado por el IPN
como becario de BEIFI (Becas de Estímulo Institucional de Formación de
Investigadores), asi como al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT)
por la beca otorgada durante la realización de este trabajo, con clave 488148.
DEDICATORIAS
A Dios
En agradecimiento por dame vida y salud, permitiéndome terminar esta meta: mi
trabajo de tesis.
A mi novia
Noralí R. Gallego. Por acompañarme en los trabajos y ser la persona más
maravillosa, simpre dándome animo para seguir. Todo sea por Japhet y Getsemani.
A mi familia
A mi Madre que no se cansa de pedir a Dios por mí, muchas gracias madre.
A mis hermanos
Gûerito, German, Everardo, Heriberto y mi hermana Eleonor y a sus familias. Por ser
parte de mi preparación apoyándome, tomando responsabilidades extras para lograr
el objetivo. Siempre esforzados y nobles, siempre trabajando.
A mi otra familia
La familia del Laboratorio de Bioinsecticidas con quienes comparti infinidad de
momentos felices, con los que he soñado despierto, con los que puedo hablar
francamente y a los que tendre siempre presente en esta aventura que es mi vida.
.
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Cipriano García Gutiérrez
Por la asesoría brindada, por la paciencia que muestra para trasferir el conocimiento.
A mi comité tutorial
Dra. Claudia Castro Martínez, Dr. César Marcial Escobedo Bonilla, Dr. Hervey
Rodrígues González y M. en C. Eusebio Nava Pérez, por su apoyo y consejos.
A mis compañeros de Laboratorio
Nadia, Claudia, Mónica, Mary Carmen, Diojo, Cosme, Vejar, Mancillas, Ricardo
muchas gracias a todos por su amistad; gracias a Chevy por llevar la cena al
laboratorio, tacos, galletas, sabritas, refrescos, gorditas, carnitas, asi si dan ganas de
hacer cinética jejeje.
A mis compañeros de Maestría
Toñita, Vanesa, José Avila, Joselin, por su apoyo y consejos, muchas gracias.
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE CUADROS ......................................................................................... IV
ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................ V
RESUMEN ............................................................................................................ VI
ABSTRACT .......................................................................................................... VII
I. INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 1
II. ANTECEDENTES ....................................................................................... 3
2.1. Generalidades de mosquitos ...................................................................... 3
2.1.1. Aspectos generales sobre Culex spp .................................................. 4
2.1.2. Taxonomía ........................................................................................... 4
2.1.3. Biología y hábitos de Culex quinquefasciatus ..................................... 5
2.2. Método de control de mosquitos ................................................................. 7
2.2.1. Control cultural..................................................................................... 8
2.2.2. Control químico .................................................................................... 8
2.2.3. Control Biológico .................................................................................. 9
2.3. Control microbiano de plagas ..................................................................... 9
2.3.1. Ventajas ............................................................................................... 9
2.3.2. Desventajas ....................................................................................... 10
2.4. La bacteria Bacillus thuringiensis var israelensis ...................................... 11
2.4.1. Importancia de Bti como bioinsecticida .............................................. 12
2.4.2. Características morfológicas de Bt .................................................... 12
2.4.3. Hábitat y distribución ......................................................................... 13
2.4.4. Fase de esporulación ........................................................................ 13
2.4.5. Factores de virulencia producidos por la bacteria Bti ........................ 13
2.4.6. Modo de acción de la bacteria Bti para el contro de mosquitos ......... 14
2.4.7. Uso de Bacillus thuringiensis ............................................................. 14
2.4.8. Producción de Bacillus thuringiensis ............................................... 15
2.5. Medios de cultivo para la propagación de Bti ........................................... 15
2.5.1. Diseño de medios de cultivo .............................................................. 15
2.5.2. Medios de cultivo locales ................................................................... 17
II
2.5.4. Medio de cultivo a base de caldo de remojo de maíz ........................ 24
2.5.5. Medio de cultivo con base a suero de leche ...................................... 26
2.5.6. Elaboración de un medio de cultivo ................................................... 26
2.5.7. Proceso de producción de biomasa microbiana ................................ 27
2.5.8. Cinética de la fermentación ............................................................... 31
III. JUSTIFICACIÓN....................................................................................... 34
IV. OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 35
4.1. Objetivos específicos ................................................................................ 35
V. HIPÓTESIS .............................................................................................. 35
VI. MATERIALES Y METODOS. ................................................................... 36
6.1. Material biológico ...................................................................................... 36
6.1.1. Obtención de la bacteria Bti ............................................................... 36
6.2. Activación de la cepa de Bti ...................................................................... 36
6.2.1. Pre-inóculo ........................................................................................ 36
6.3. Cuantificación de espora del biofomulado de Bti (UFC/mL) ..................... 36
6.4. Ventana de respuesta biológica ............................................................... 37
6.5. Producción de Bti en diferentes medios de cultivos.................................. 37
6.5.2. Líquido de remojo de maíz ................................................................ 39
6.5.3. Suero de leche................................................................................... 40
6.6. Fermentaciones de la bacteria Bti en matraces ........................................ 40
6.7. Diseño del experimento ............................................................................ 41
6.8. Bioensayos: porcentaje de mortalidad de larvas de Culex spp ................ 41
6.9. Clarificación de melaza ............................................................................. 42
VII. RESULTADOS ......................................................................................... 44
7.1. Propagación de Bti ................................................................................... 44
7.2. Bioensayos, ventana de respuesta biológica ............................................ 44
7.3. Selección de un medio de cultivo para producción de
espora/cristal y biomasa de Bti ................................................................. 44
7.3.1. Producción de Bti en medio de melaza ............................................ 44
7.3.2. Producción de Bti en medio con remojo de maíz .............................. 47
7.3.3. Producción de Bti en medio con suero de leche ................................ 50
III
7.4. Evaluacion del rendimiento del medio M1 variando la
temperatura y agitación ............................................................................ 53
7.5. Prueba de susceptibilidad Bt AC1 vs Culex sp ......................................... 55
VIII. DISCUSIÓN .............................................................................................. 56
IX. CONCLUSIONES ..................................................................................... 58
X. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................... 59
XI. ANEXO I ................................................................................................... 68
IV
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Contenido Pág. 1 Taxonomía del mosquito Cx quinquefasciatus 4
2 Composición de la melaza de caña de azúcar 20
3 Característica de algunos almidones usados en la
industria alimentaria 25
4 Medios de cultivos 38
5 Preparación del reactivo DNS 39
6 Componentes del suero de leche en polvo 40
7 Aleatorización de los tratamientos 41
8 Curva de calibración de azúcares reductores 43
9 Componentes del medio de cultivo con melaza 44
10 Producción de biomasa y consumo de azúcares reductores en el medio con melaza en concentraciones de: 3, 6 y 9 g/L
45
11 Composición del medio con remojo de maíz
48
12 Medio con remojo de maíz, producción de biomasa y consumo de azúcares reductores en concentraciones de 2, 1.5 y 1 g/L
48
13 Composición del medio con suero de leche (M3)
51
14 Medio con suero de leche a concentración de 5, 10 y 15 g/L y producción de biomasa
51
15 Producción de Bti en condiciones diferente con el medio de cultivo melaza 6 g/L
54
16 Prueba de susceptibilidad de larvas de mosquitos Culex sp con BtiAC
55
V
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Contenido Pág.
1 Ciclo de la vida del mosquito 5
2 Estructura química de los temefós 8
3 Descomposición de la sacarosa en glucosa y fructuosa 24
4 Curva de calibración estándar de azúcares reductores (540nm)
43
5 Crecimiento de la bacteria Bti en M1 (3 g/L) a las 72 h 45
6 Crecimiento de la bacteria Bti en M1 (6 g/L) a las 72 h 46
7 Crecimiento de la bacteria Bti en M1 (9 g/L) a las 72 h 47
8 Crecimiento de la bacteria Bti en M2 (1 g/L) a las 72 h 49
9 Crecimiento de la bacteria Bti en M2 (1.5 g/L) a las 72 h 49
10 Crecimiento de la bacteria Bti en M2 (2 g/L) a las 72 h 50
11 Crecimiento de la bacteria Bti en M3 (5 g/L) a las 72 h 52
12 Crecimiento de la bacteria Bti en M3 (10 g/L) a las 72 h 52
13 Crecimiento de la bacteria Bti en M3 (15 g/L) a las 72 h
53
VI
RESUMEN
En Sinaloa la población de mosquitos (Culex spp) ha aumentado
considerablemente desde 2006. Estos insectos transmiten enfermedades como la
malaria y encefalomielitis equina en humanos y animales, por estas razones los
mosquitos se han convertido en un problema de salud pública. Uno de los agentes
de control biológico utilizado en la erradicación de insectos vectores de
enfermedades como los mosquitos, es la bacteria Bacillus thuringiensis var.
israelensis (Bti). Por esta razón, se realizó este trabajo con el objetivo de optimizar la
producción de Bti a nivel de matraz agitado con medios de cultivo económicos a base
de subproductos agroindustriales regionales como la melaza, remojo de maíz y suero
de leche, de estos se evaluó la producción de biomasa (BioM) de bacterias y la
cantidad de unidades formadoras de colonias/mL (UFC/mL) y la actividad insecticida
espora/cristal. Las concentraciones de los medios fueron: (M1) melaza 3, 6 y 9 g/L de
azucares reductores; (M2) remojo de maíz 1, 1.5 y 2 g/L y (M3) suero de leche 5, 10
y 15 g/L. La biomasa y el tiempo de crecimiento exponencial de Bti, asi como las
UFC/mL en las diferentes concentraciones fueron: En M1 con 3 g/L, se obtuvieron 2
g/L de BioM a las 36 h y 1x107UFC/mL; con 6 g/L, 2 g/L de BioM a las 30 h y 1x108
UFC/mL y con 9 g/L 2.24 g/L a las 48 h y 0.8x108 UFC/m. En M2 con 1 g/L se
obtuvieron 1.856 g/L de BioM a las 48 h y 1x105 UFC/mL; con 1.5 g/L, 2.01 g/L a las
48 h y 2x105 UFC/mL y con 2 g/L, 2.13 g/L BioM a las 54 h y 3x106 UFC/mL. En M3
con 5 g/L se obtuvieron 2.108 g/L de BioM a las 72 h y 1x106 UFC/mL; con 10 g/L
2.12 g/L de BioM a las 60 h y 6x107 UFC/mL y con 15 g/L, 2.12 g/L de BioM a las 72
h y 7x106 UFC/mL. De lo anterior se determinó que el mejor medio (M1) fue la
melaza a una concentración de 6 g/L de azúcares reductores, abteniendo 2 g/L de
BioM a las 30 h y 1x108 UFC/mL. En el medio M1 se analizaron las intereacciones de
la temperatura y agitación a nivel matraz, utilizando un diseño factorial 23,
encontrando diferencias estadísticas en la interaccion de 30 ºC, 200 rpm a pH=7
(SAS®, p<0.05) las cuales fueron óptimas para obtener concentraciones máximas de
Bti de 1x108 UFC/mL, con espora cristal suficiente para lograr una mortalidad del
100% de Culex spp (Tukey p<0.05). Con este procedimiento se obtuvo un
bioinsecticida promisorio para el control de este insecto.
VII
ABSTRACT
In Sinaloa the population of mosquito (Culex spp) has considerably increased since
2006. This insect transmits diseases as malaria and equine encephalomyelitis in
humans and animals. These reasons make consider that mosquitoes have become a
public health problem. One of the biological control agents used in the eradication of
insect diseases vector such as mosquitoes, is the bacterium Bacillus thuringiensis
var. israelensis (Bti). In order to optimize the production of Bti using regional
agroindustrial products as molasses, corn soaking water, and cheese whey, they
were used to produce Bti in shaker flask level to obtain crystal spores using the follow
concentrations, in molasses medium (M1) the amount 3, 6 and 9 g/L of reducing
sugars; in corn soaking medium (M2) 1, 1.5 and 2 g/L, and in (M3) the cheese whey
medium 5, 10, and 15 g/L of whey powder. Also was assessed the production of
bacterium biomass (BioM) and the UFC/mL quantity, as well as the spore/crystal
insecticide activity. The medium concentrations were: (M1) molasses 3, 6 and 9 g/L of
reducing sugars; (M2) corn soaking 1, 1.5 and 2 g / L, and (M3) cheese wey 5, 10
and 15 g/L. The biomass and exponential Bti growth time, as well the CFU/mL by
concentration were: In M1 to 3 g/L were obtained 2 g/L BioM in 36 h and 1x107
CFU/mL; to 6 g/L, 2 g/L BioM in 30 h and 1x108 CFU/mL; to 9 g/L, 2.24 g/L BioM in
48 h and 0.8x108CFU/mL. In M2 to 1 g/L, 1.856 g/L BioM in 48 h and 1x105 CFU/mL;
to 1.5 g/L, 2.01 g/L BioM in 48 h and 2x105CFU/mL and to 2 g/L, 2.13 g/L BioM in 54
h and 3x106 CFU /mL. In M3 to 5 g/L, 2.108 g/L BioM in 72 h and 1x106 CFU/mL;
to10 g/L, 2.12 g/L BioM in 60 h and 6x107CFU/mL and to 15 g/L, 2.12 g/L BioM and
7x106 CFU/mL. The better medium was molasses M1 at concentration 6g/L of
reducing sugars, obtaining 2 g/L BioM in 30 h and a maximum Bti concentration of
1x108 CFU/mL. The intereaction level between temperature and shaker flask were
analyzed using a factorial design 23 , The statistical difference were found in the
interaction of 30 ° C, 200 rpm at pH = 7 (SAS, p <0.05) these condition were sufficient
to produce 1x108 CFU/mL to achieve 100% of larvae mosquito Culex sp mortality
(tukey p<0.05). With this procedure was possible produce a bioinsecticide to control
of this insect.
1
I. INTRODUCCIÓN
Los insecticidas químicos han representado una alternativa para el control de
numerosos insectos plaga en la agricultura, así como también contra insectos
vectores de enfermedades que afectan a los humanos. El uso de los químicos fue
incrementándose debido a su eficacia para controlar dichas plagas. Sin embargo, el
uso de estos insecticidas ha ocasionado serios problemas, tales como la
contaminación ambiental, enfermedades en la salud humana e importante daño en el
sistema inmune (Devine y Furlong., 2007; Bravo et al., 2011).
Desde principios del siglo XX surgió el control biológico, como una forma de
combate a las plagas. Este cual tiene como ventaja ser muy eficaz y no causa daños
al ambiente. El control biológico se basa en la utilización de otras especies de
organismos y/o sus productos para reducir la población de plaga, las cuales pueden
actuar como; organismos depredadores, competidores, parasitos y/o patógenos.
Dentro de las estrategias usadas frecuentemente se aplican formulaciones de
bioinsecticidas que se componen de organismos vivos y sus productos tóxicos. Se ha
propuesto que los insecticidas microbiales sean un sustituto de los insecticidas
químicos. Por esto Bacillus thuringiensis variedad israelensis (Bti) se ha utilizado
ampliamente para el control de larvas de mosquitos, debido a que presenta una alta
selectividad dentro de las especies de insectos. Este es el bioinsecticida que ha
tenido más éxito para el control de insectos y representa el 2% de los insecticidas
biológicos y químicos en el mercado (Raymond et al., 2010).
Durante muchos años los investigadores han enfocado su trabajo a la búsqueda
de una manera más efectiva y barata para la producción de Bti. Los resultados de los
estudios de las fermentaciones nos permiten maximizar el proceso de producción de
la bacteria. No obstante, las condiciones físicas y químicas son las variables más
importantes para la optimización del crecimiento del microorganismo (Prabakaran y
Balaraman., 2006).
2
Bacillus thuringiensis var israeliensis (Bti) es el bioinsecticida biológico más
aplicado en el mundo y se utiliza para controlar diversos insectos que afectan a la
agricultura, la actividad forestal y para el combate de insectos que transmite
patógenos en humanos y animales. Bti se ha utilizado para el control de mosquitos
solo o en combinación con la bacteria Bacillus sphaericus logrando bajar las altas
poblaciones de Culex sp en humedales (Wirth et al., 2001). En Brasil se han
implementado programas dirigidos a controlar la proliferación de larvas de mosquitos
Culex quinquefasciatus mediante la eliminación de criaderos y una aplicación
bimestral de Bacillus sphaericus. Con estas medidas se ha detectado un descenso
gradual significativo de este insecto (Marina et al., 2011).
Es posible utilizar medios de cultivos baratos, para desarrollar nuevas células
Bti en fermentadores que proporcionen las condiciones adecuadas (Ghribi., 2007;
Prabakaran., 2006). En cada sustrato la temperatura, el pH, la concentración de
azúcares y el potencial hídrico, pueden cambiar debido a las condiciones reológicas
del medio. En este trabajo se pretende conocer las condiciones óptimas para
producir Bti como bioinsectidas a nivel de laboratorio, utilizando medios de cultivos
económicos como melaza, remojo de maíz y suero de leche, complementados con
sales minerales bajo este criterio en este trabajo se pretende conocer las condiciones
óptimas para producir Bti como bioinsectidas a nivel de laboratorio, utilizando
melaza, remojo de maíz y suero de leche, y sales minerales. Además se evaluará la
cepa con el mejor rendimiento del complejo espora/cristal, que tenga a demás,
actividad insecticida contra larvas del mosquito Culex sp.
3
II. ANTECEDENTES
2.1. Generalidades de mosquitos
Los artrópodos son el grupo más grande de animales vivientes que incluyen más
de tres cuartas partes de todas las especies animales existentes. Los artrópodos
comprenden 17 clases, 99 órdenes, aproximadamente 2140 familias y más de un
millón de especies (Soulsby., 1987., Brisola 2001).
Los dípteros son uno de los órdenes dominantes de insectos en la mayoría de
los hábitats. El número de especies que constituyen este orden es enorme, son
benéficas para el funcionamiento de los ecosistemas como polinizadoras, parásitas y
depredadoras, e importantes en los procesos de descomposición y reciclaje de
nutrientes. Las actividades de un número relativamente pequeño de estas especies
causan un impacto mucho mayor que cualquier otro grupo de insectos en el hombre
y otros animales (McGavin., 2002).
Dentro de los dípteros se encuentran los mosquitos, que son animales
hematófagos de importancia médica y veterinaria porque causan daños y son
vectores de enfermedades a gran variedad de especies de aves y mamíferos. Los
daños y enfermedades que transmiten pueden ser muy serias Ejemplos son el
dengue y la malaria (Travi y Montoya., 1994). La amplia distribución de C.
quinquefasciatus tanto en el hemisferio norte como en el sur expone a esta especie a
una variedad de climas y condiciones que son un reto para su supervivencia (Salazar
y Moncada., 2004). En Colombia, C. quinquefasciatus se distribuye por casi todo su
territorio nacional en altitudes que van desde los 0 hasta los 3000 msnm (Becerra.,
1992).
Desde mediados del siglo XX países como Estados Unidos, Brasil, Perú,
Argentina, Costa Rica, Jamaica, Etiopía, Cuba y Colombia) han hecho estudios sobre
el ciclo de la vida de mosquitos. Dichos estudios aportaron conocimientos sobre el
comportamiento de los estadíos inmaduros, longevidad, preferencias alimenticias de
los adultos y conducta sexual. También se obtuvieron datos para establecer planes
de control (Becerra, 1992).
4
2.1.1. Aspectos generales sobre Culex spp
Los mosquitos del género Culex spp. son reconocidos a nivel mundial debido
a su importancia médica. Algunas especies del género Culex se relacionan como
vectores en la transmisión de enfermedades como el virus del Oeste del Nilo,
oropuche, encefalitis y filariasis. Dichas especies incluyen Cx. pedroi, Cx. ocossa y
Cx. vmerifer. Los mosquitos de Culex están asociados a ambientes diversos y se
considera que su distribución ha variado altitudinalmente en relación con los
humanos y las actividades que implican su desplazamiento y la ocupación de nuevos
hábitats (Seminarios ciencias básicas., 2012).
2.1.2. Taxonomía
Los mosquitos se ubican taxonómicamente en el Orden Díptera, Suborden
Nematocera y familia Culicidae. Esta familia consta de más de 3500 especies
distribuidas en tres familias. Cuatro familias de insectos contienen especies que son
vectores. De estas, la familia Culicidae es la que más se ha podido reproducir en el
laboratorio (Travi y Montoya., 1994).
Reyno Animalia
Phylum Arthropoda
Clase Insecta
Suborden Nematocera
Superfamilia Culiciodea
Familia Culicidae
Subfamilia Culicinae
Género Culex
Especie C. quinquefasciatus (Say 1823)
Cuadro 1. Taxonomía del mosquito Cx
quinquefasciatus
5
2.1.3. Biología y hábitos de Culex quinquefasciatus
Esta es la especie de mosquito más frecuentemente encontrado en el ambiente
humano, tanto urbano como rural. Además de los caracteres propios del género, los
imagos hembra presentan algunas características definidas. Los adultos presentan
habitos nocturnos y durante el día reposan en sitios con poca luminosidad (Cupp et
al., 1994). En cuanto a la distribución, estas especies abarcan las zonas tropical y
subtropical. Su rango de dispersión no excede un radio de vuelo de más de 500 m,
pero excepcionalmente puede alcanzar varios kilómetros (Cupp et al., 1994). Los
mosquitos se encuentran en todo el mundo con excepción de los lugares que son
permanentemente fríos, tres cuartos de todas las especies de mosquitos viven en el
trópico húmedo y zonas subtropicales (Clements., 1992).
Figura 1. Ciclo de vida de mosquitos Culex spp.
6
2.1.3.1. Huevos
Tras la postura los huevos flotan en el agua y forman una especie de balsa que
los mantiene unidos sobre la superficie. Son de contorno oval, elíptico y elongado
dotados de simetría bilateral. Presentan una capa que se denomina exocórion, que le
da protección al huevo. En la extremidad anterior se observa un orificio que
corresponde al micrópilo (Forattini., 1965; McGavin., 2002). La duración del
huevecillo es de 489 h y miden aproximadamente 48 mm (Salazar y Moncaba, 2004).
2.1.3.2. Larva
El aspecto de las larvas es elongado y vermiforme, el cuerpo también se divide en
cabeza, tórax y abdomen. Las dos primeras partes tienen un aspecto globoso, en
cuanto a la última, es alargada y constituida por 9 segmentos. La superficie del
cuerpo larval presenta numerosas y variadas cerdas, aisladas o en grupos y
dispuestas simétricamente. La distribución de esas cerdas es importante para la
clasificación taxonómica. Presenta en la cabeza una cápsula cefálica formada por
tres placas, a medida que se desarrollan los estadios larvales se van diferenciando
cada una de estas partes. Los ojos están situados lateralmente y poseen un aspecto
de pequeña mancha oscura. El tórax también presenta tres partes y el abdomen es
elongado y está dividido en nueve segmentos más o menos cilíndricos. El último es
conocido como segmento anal. El segmento VIII es el más evidente para realizar la
identificación de culicinos, presenta un sifón respiratorio en posición ventrolateral y
tiene una hilera de espinas denominadas puente sifonal. El último segmento
corresponde a la porción anal, que forma un ángulo en relación al resto del abdomen.
La cabeza es más ancha que larga, la antena posee la seta 1-X formando un
abanico, que aparece en la segunda mitad muy separada de otras setas antenales,
que están cerca del extremo. Poseen las setas formando un peine en el sifón
(Forattini., 1965). La larva mide alredor de 1-12 mm de longitud y tiene una duración
de 5 a 7 días (Salazar y Moncaba, 2004).
7
2.1.3.3. Pupa
Representa un organismo móvil con dos partes esenciales, el cefalotórax y el
abdomen. La primera parte es de aspecto redondo y se conecta con el abdomen que
posibilita la locomoción veloz en medios acuáticos. En este estadio ocurren
transformaciones profundas que llevan a la formación del adulto. Presenta
estructuras denominadas trompas respiratorias por medio de las cuales realiza
intercambio de gases. Tiene en la extremidad distal del abdomen las paletas
natatorias las cuales le permiten desplazarce (Forattini., 1965). La pupa tiene una
duración de 2 a 3 días (Salazar y Moncaba., 2004).
2.1.3.4. Adulto
Los mosquitos son insectos pequeños y frágiles, con patas largas y delgadas, un
par de alas, y un par de balancines o salterios en forma de perilla (Viedma., 1985).
Se les puede distinguir de las moscas de agua, típulas y otros insectos de dos alas,
por su alargada probóscide, las venas de las alas están cubiertas de escamas que
rodean el margen posterior de las mismas. Las claves que siguen referentes a
mosquitos adultos se aplican solamente a las hembras. En el macho las antenas son
ramificadas, y sencillas en la hembra. Los palpos de las hembras son muy cortos y
largos en el macho (Forattini., 1965). Los adultos duran alredor de 10 a 60 días de
vida depende de las condiciones climáticas y las hembras pueden ovipositar de 30 a
350 huevos fértiles en su vida.
2.2. Método de control de mosquitos
Debido a la importancia de los mosquitos como vectores de enfermedades, se les ha
combatido ampliamente e incluso se han realizado campañas como la que dirigió la
comisión nacional para la erradicación del paludismo (CNEP) en México, utilizando
principalmente insecticidas. Aunque se mantuvieron a densidades muy bajas por
varios años, actualmente existen regiones del país donde tienen problemas de
enfermedades por algún tipo de mosquito, figurando principalmente el problema del
dengue.
8
En distintos países se han empleado programas para lograr la disminución de la
población de este insecto, principalmente los del género Culex spp y la especie
Aedes aegypti. Del 2003 al 2011 en Brasil se implementó programas dirigidos a
controlar la proliferación de larvas de mosquitos C. quinquefasciatus mediante la
eliminación de criaderos y una aplicación bimestral de Bacillus sphaericus. Se ha
detectado un descenso gradual significativo (Marina et al., 2011).
2.2.1. Control cultural
Existen organizaciones generalmente de orden público como la secretaria de
salud que en conjunto con el ayuntamiento y grupos sociales organizan campañas
para el control del mosquito. El control cultural tiene como objetivo concientizar a las
personas a evitar la formación de criaderos de moscos dentro y fuera de su casa y
también evitar muebles, llantas u otro objeto viejos en cual el mosco se pueda
reproducir satisfactoriamente. La campaña de descacharrización ha tenido buenos
resultados porque la idea de este tipo de acciones es evitar nichos para la
reproducción de los moscos (Hoyos et al., 2006).
2.2.2. Control químico
La sustancia química que más es utilizada para el control del mosquito se le
conoce comercialmente como Abate, su nombre es Temefós (Fernández., 2007).
El temefós es un plaguicida organofosforado no sistemático que actúa por
contacto e ingestión. Interfiere en la conexión de los impulsos nerviosos por la
inhibición de la colinesterasa. Su nombre químico es 0,0,0,0’-tetrametil-0,0’-tio-di-p-
fenileno, Nº CAS 3383-96-8, fórmula global C16H20O6P2S3. Peso molecular:
466.48.g/mol.
Figura 2. Estructura química de los temefós
9
Este plaguicida se presenta en la forma de cristales blancos o incoloros. El
punto de fusión es 30.5 ºC y su densidad relativa es de 1.32. Es soluble en bicloruro
de etileno, acetonitrilo, tetracloruro de carbono, éter y tolueno, pero muy poco soluble
en agua e insoluble en metilciclohexano y hexano. Su presión de vapor es igual a
8.62x10-10 mm Hg a 25 ºC. Se hidroliza con ácidos fuertes y bases. Esta sustancia
química se descompone al ser calentada a temperaturas entre los 120 y 125º C o al
ser quemada, produciendo vapores tóxicos que incluyen óxidos de fósforo y azufre
(en línea: www.rap-al.org., 2014).
2.2.3. Control Biológico
Debido a una conciencia más ecológica por el cuidado de paisajismos y por
humedales importante, se ha considerado e intensificado el uso de bioinsecticidas a
bases de bacterias y hongos para el control de microorganismo plaga. Diversos
microrganismos son capaces de controlar una población de insecto que se clasifique
como plaga. Las altas densidades de mosquitos se han controlado con bacterias del
genero Bacillus. Existen muchos casos de éxito de la bacteria Bacillus thuringiensis
var israelensis y B. sphaericus sobre el control de moscos (Desneux et al., 2010).
2.3. Control microbiano de plagas
El control biológico de plagas se realiza también utilizando agentes
microscópicos (depredadores, parásitos y microorganismos). A este último tipo de
control biológico se le denomina control microbiano de plagas y enfermedades de
patógenos en plantas (Agüera et al., 1996).
2.3.1. Ventajas
Las ventajas del control microbiano de plagas y enfermedades son las
siguientes: su alto grado de especificidad, poco o nulo efecto sobre los organismos
benéficos, bajo poder residual que no perturba el medio ambiente, distribución
horizontal debido a la capacidad de los agentes biológicos para multiplicarse y
dispararse con permanencia por largo tiempo, utilidad en el manejo integrado de
10
plagas, compactibilidad con otras prácticas culturales, facilidad para aplicarse con los
equipos convencionales utilizados para los agroquímicos, menor estímulo al
desarrollo de resistencia de plagas, alto potencial de multiplicación y alto
potencialidad para su reproducción masiva (Badii et al,. 1996).
Según Emmert y Handelsman., 1999 entre las bacterias Gram-positivas,
Bacillus y Streptomyces presentan propiedades de resistencia al calor y a la
desecación, debido a que forman esporas. Estas esporas permiten hacer
formulaciones exitosas, las cuales se pueden presentar como polvos secos. Con lo
anterior se eliminarían los problemas al ser almacenados durante mayor tiempo y
diseñar fermentaciones en algún momento dado.
Los organismos antagonistas logran diferentes modos de acción para el control
de insectos plaga. Los mecanismos de biocontrol se clasifican de la siguiente
manera: Competencia, parasitismo/predación, antibiosis e inducción a la resistencia
(Baker y Cook., 1989).
2.3.2. Desventajas
Las desventajas del control microbiano de plagas están relacionadas
fundamentalmente con aspectos económicos, pero también incluyen aspectos
sociales, legales y técnicos. Económicamente la mayoría de los insecticidas
microbianos están en desventaja con respecto a los insecticidas químicos, ya que
sus costos de producción son más elevados y el número de especies de hospederos
es estrecho (Khachatourians., 1986). Por estas razones es necesario elaborar
diferentes productos para diversas especies de plagas. Socialmente el control
microbiano de plagas es menos aceptado por desconocimiento. Además para que se
ejecute una aplicación exitosa, es necesario poseer suficiente capacitación técnica
(Khachatourians., 1986).
Hay dificultades para proteger legalmente a los bioinsecticidas, ya que las
cepas silvestres no son patentables y existen restricciones para su registro como
insecticidas. Desde el punto de vista técnico es importante resolver la problemática
11
de la corta vida de anaquel de los formulados, con base al microorganismo terminado
y la estandarización del producto. El incremento de la persistencia del producto
biológicamente activo en el medio, la reproducción del tiempo requerido para matar o
disminuir el efecto negativo del insecto plaga, y la determinación de las condiciones
favorables para la acción del patógeno (Fernández y Juncosa., 2002).
Es posible aislar organismos antagonistas de las plagas en forma simple, pero
su introducción a los ambientes complejos como la rizósfera (la capa de interacción
entre el tejido vegetal de las raíces y la solución suelo) o el filoplano (relación entre la
superficie foliar y la microflora), se dificulta ya que hay muy poca información
disponible sobre las características que debe tener el ecosistema para que el
organismo logre sobrevivir y ser activo como agente controlador. Sin embargo, en el
mundo existen más de 80 productos de biocontrol de patógenos los que han sido
formulados a base de hongos, tales como los géneros Gliocladium, Beauveria, y
Trichoderma, o bacterias como Pseudomonas spp y Bacillus spp. (Elósegui y
Elizondo., 2010).
2.4. La bacteria Bacillus thuringiensis var israelensis
La bacteria Bacillus thuringiensis var israelensis (Bti) como agente de control
biológico de insectos fue aislado por primera vez en Japón en 1901 por Ishiwata
como patógeno del gusano de seda, Bombyx mori (Lepidoptera, Bombycidae)
causándole la enfermedad de sotto (Aizawa., 2001).
En 1911 Berliner en Alemania aisló la misma bacteria a partir de larvas del
lepidóptero Anagasta kuelniella, la palomilla de la harina del mediterráneo. Berliner
realizó la siguiente descripción formal de esta bacteria: bacilo gram positivo que
presenta un cristal paraesporal de naturaleza proteica, endospora y flagelos
peritricos en distintas fases de su ciclo de crecimiento; la denominó B. thuringiensis,
en honor a la región Alemana de donde se aisló: Thuringia, (Mohammedi et al.,
2006).
12
2.4.1. Importancia de Bti como bioinsecticida
La bacteria B. thuringiensis es el microorganismo más extendido y utilizado
comercialmente como bioinsecticida en todo el mundo. Bt es la bacteria
entomopatógena más ampliamente utilizado como biopesticida, ya sea sola o en
combinación con otros pesticidas químicos. Su importancia radica en su toxicidad
contra larvas de insectos-plagas de los órdenes Lepidóptera, Coleóptera Díptera,
Himenóptera, Ortóptera, y contra otros organismos como ácaros, platelmintos y
nemátodos. Incluso ha mostrado actividad contra células cancerígenas, leucémicas y
contra protozoos de importancia médica como Giardia lamblia (Kunstler., 1882).
Desde fines de la década de los 30’s se han utilizado preparaciones con base
en Bt como insecticidas orgánicos o bioinsecticidas. En la actualidad se conocen más
de 100 formulaciones en el mercado mundial aplicándose alrededor de 10000
toneladas anualmente en el planeta, siendo Dipel unas de las marcas más utilizadas
(Garcia., 2008).
2.4.2. Características morfológicas de Bt
La bacteria Bt es Gram positiva y tiene la capacidad de formar esporas, posee
una variedad de plásmidos, algunos de los cuales codifican para proteínas con
actividad insecticida. La célula vegetativa mide 1 a 1.2 µm de ancho y de 3 a 5 µm de
largo; se agrupa en cadenas de 2 a 3 células. Son Gram positiva, aerobias y
esporógenas durante su cultivo (Iriarte y Caballero., 2001; Ramos et al., 2004); la
bacteria Bt tiene características muy parecidas a otras especies del género Bacillus.
La principal diferencia entre especies de Bacillus radica en la formación de uno o
más cuerpos paraesporales cristalinos de naturaleza protéica adyacentes a la
espora, los cuales pueden llegar a representar entre el 20% y el 30% del peso seco
total del esporangio, los cuerpos cristalinos se forman durante la fase de
esporulación (Ibarra., 2005).
13
2.4.3. Hábitat y distribución
Bt es una bacteria que está presente en el ambiente y se encuentra distribuida
en todo el mundo, la habilidad de esporular le permite una elevada capacidad de
resistencia al calor y a la sequedad (Iriarte y Caballero., 2001).
2.4.4. Fase de esporulación
La esporulación es un proceso de respuesta ante la falta de elementos
nutricionales o condiciones físico-químicas que amenazan la reproducción del
microorganismo. Las fases de crecimiento que presenta un microorganismo en una
fermentación son las siguientes: a) Fase de adaptación o fase lag, b) Fase
exponencial, c) Fase estacionaria y d) Fase de lisis celular o muerte. Algunos
productos de interés se asocian con algunas de las fases de crecimiento tal es el
caso de Bt que produces toxinas simultáneamente a la formación de esporas,
formando uno o varios cristales paraesporales de naturaleza protéica, que pueden
representar ente un 20% y un 30% del peso seco del esporangio (Iriarte y Caballero.,
2001).
2.4.5. Factores de virulencia producidos por la bacteria Bti
La bacteria Bti ha desarrollado una serie de factores de virulencias que le
permiten infectar a los insectos blanco con mayor eficiencia; entre estos factores se
encuentran fosfolipasas, proteasas, quitinasas, α-exotoxinas o exotoxinas
termolábiles, las δ-exotoxinas las cuales son análogas de ATP y las proteínas VIP,
que son proteínas insecticidas que se producen en la fase vegetativa del crecimiento.
Las proteínas VIP se han cristalizado y contienen un dominio semejante al sitio activo
de proteínas con actividad de ribosilación de ATP. Se propone que los factores de
virulencia ayudan a la bacteria en la infección del insecto. Se ha reportado que en
algunos casos la mezcla esporas/cristal mata mucho más eficientemente que los
cristales solo (Diego et al., 2008).
14
2.4.6. Modo de acción de la bacteria Bti para el contro de mosquitos
La bacteria Bt tiene un ciclo de vida que comprende la formación de endosporas
cuando las condiciones del medio en que se encuentra son adversas. La endospora
es una forma de resistencia frente a situaciones de estrés ambiental como la
desecación o la falta de nutrientes, entre otros. La cualidad importante de Bt como
bioinsecticida radica en la producción de toxinas llamadas “cry y cyt” durante la
esporulación, estos producen cristales que son de origen protéico. Cuando son
ingeridos por un insecto se activan por escisión proteolítica. El extremo N terminal se
escinde en todas las proteínas y en algunas de ellas se escinde una extensión del
extremo C terminal. Una vez activada la endotoxina, se une al epitelio del intestino y
provoca la lísis celular que conduce a la muerte. Esta región activa de la endotoxina
delta se compone de tres dominios estructurales. El primer dominio N-terminal
helicoidal está implicado en la inserción de la membrana y formación de poros. El
segundo y tercer dominio están implicados en la unión al receptor. En la mayoría de
los lepidópteros las protoxinas se solubilizan en las condiciones alcalinas del
intestino medio del insecto (Schnepf et al., 1998).
2.4.7. Uso de Bacillus thuringiensis
Ventajas y desventajas
El 2% del mercado mundial de pesticida está satisfecho con los biopesticidas;
Bt domina el 95% de las ventas de este tipo de producto. Su éxito en la agricultura se
debe a varios factores, pero los más importantes son alta especificidad hacia el
insecto blanco y su inocuidad para mamíferos, otros vertebrados, plantas e inclusive
otros insectos benéficos. Las toxinas de esta bacteria se han utilizado como
bioinsecticidas en la agricultura durante los últimos cuarenta años, principalmente en
cultivos de hortalizas y cereales (Bravo et al., 2011).
El estrecho abanico de huéspedes ocasiona que no se cuente con toxinas para
cada plaga que afecta la actividad humana. El reducido tiempo de permanencia de
las toxinas en el ambiente hace necesario un profundo conocimiento de la biología y
comportamiento de la plaga que se quiere controlar, ya que una toxina puede ser
15
activa para los estadios larvarios, pero disminuir su actividad o incluso no ser toxica
para los adultos; por lo tanto, se deben seleccionar los tiempos y formas de
aplicación de estos productos insecticidas (Bravo et al., 2011).
2.4.8. Producción de Bacillus thuringiensis
Uno de los aspectos más importantes del bioinsecticida con base en Bt, es su
producción masiva con alto grado de toxicidad para insectos considerados plagas en
ambientes agrícolas y urbanos. Para producir grandes volúmenes se diseñan medios
de cultivo con diferentes composición química. El proceso de producción se inicia
con la preparación del inóculo, el cual se propaga en un medio de cultivo. Este medio
puede ser sólido, líquido o puede emplearse un sistema mixto (Hernández., 2003).
Con la propagación en medio sólido se busca obtener una presentación en polvo con
medios inertes que no afectan el crecimiento de dicha bacteria, pero Bt también se
puede propagar en fermentadores en medios líquidos que contengan una fuente de
carbono y sales orgánicas e inorgánicas, donde las bacterias crecen
satisfactoriamente. Una ventaja del uso de medios líquidos es que estos involucran
una tecnología de propagación en tanques agitados que es bien conocida en la
industria farmacéutica, por lo que este conocimiento puede ser aplicado a la
producción masiva del microorganismo (Hernández., 2003).
2.5. Medios de cultivo para la propagación de Bti
2.5.1. Diseño de medios de cultivo
El diseño de un medio de fermentación tiene como finalidad la elección de los
componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos
correspondientes al proceso a desarrollar. Con tal objeto se deben tener en cuenta
todos aquellos aspectos relacionados con el microorganismo, con el proceso y con
los sustratos a ser empleados, como son los requerimientos nutricionales del
microorganismo y algunos específicos del proceso de fermentación, la disponibilidad
real de los componentes y consideraciones sobre las materias primas (Pirt., 1975).
16
Otros aspectos que también son importantes se refieren a todos los procesos y
operaciones previas y posteriores a la etapa de fermentación y al conocimiento de
los mecanismos bioquímicos como iones fosfatos que regulan la formación de
algunos metabolitos indispensable para el desarrollo de las bacterias. La preparación
de medios para el proceso de fermentación es una etapa fundamental para asegurar
la productividad de los organismos (Escobar., 2004). Los componentes de los medios
constituyen los efectos externos de naturaleza química que desempeñan un rol
esencial en los procesos ya que deben satisfacer los requerimientos del crecimiento
y de formación de productos así como suministrar energía para la síntesis de
metabolitos y para el mantenimiento celular. No obstante, las necesidades de
nutrientes de los microorganismos varían considerablemente (Escobar., 2004).
Los nutrientes necesarios se pueden agrupar en las siguientes categorías:
a. Macronutrientes; agregados en cantidades de gramos por litro que están
representados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
b. Micronutrientes o elementos trazas; representados por las sales de Fe, Mn,
Mo, Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro.
c. Factores de crecimiento; que están constituidos generalmente por
componentes orgánicos suministrados en baja concentración y que no son
sintetizados ni metabolizados por las células, sino que son incorporados a las
estructuras celulares y de función metabólica específica, como vitaminas,
algunos aminoácidos y ácidos grasos no saturados.
Atendiendo a su estado, los medios de cultivo pueden presentarse como medios
líquidos o medios sólidos que contienen agar, el cual gelifica por debajo de 45° C. y
cuya concentración de uso es de 1.5%; y medios semisólidos que generalmente
contienen un agar a una concentración del 0.7% (French y Hebert., 1982).
Si atendemos a su composición pueden ser: medios sintéticos; que contienen
fuente de carbono, fuente de nitrógeno, sales que proporcionan iones y demás
elementos tales como estimuladores del crecimiento y medios complejos que
17
contienen ingredientes de composición no definida tales como extracto de levadura,
peptona e infusión de sangre. Los medios de cultivos también se pueden catalogar
en las categorías que se describen a continuación (French y Hebert., 1982).
2.5.1.1. Medios ricos en nutrientes
Medios de enriquecimiento complejos con aditivos para favorecer el crecimiento y
desarrollo de determinados microorganismos y particularmente a los heterótrofos
exigentes. Por ejemplo, el agar sangre, agar dextrosa, peptona y agar con quitina
entre otros.
2.5.1.2. Medios selectivos
Los cuales son diseñados para favorecer el crecimiento específico de un
determinado microorganismo o un grupo microbiano.
a). Medios diferenciales que, proporcionan la distinción microbiana de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.
SDA, SDA mas peptona y levadura de cerveza.
b). Medios de mantenimiento, semejantes a los de crecimiento óptimo pero
que no favorece el crecimiento rápido y prolífico que deriva en la muerte
temprana de las células en cultivo. PDA, LB, agar agua.
2.5.2. Medios de cultivo locales
2.5.2.1. Melaza
En México, las 15 entidades federativas productoras de azúcar generan
melaza de caña. Sin embargo, Veracruz, Jalisco, San Luis Potosí, Chiapas y Nayarit
concentraron en el 2010 el 68.7% de la producción Nacional. En los últimos años, el
precio de la melaza de caña a demostrado tendencia a la alza. Entre enero de 2005
a julio de 2011, el precio al mayoreo se incrementó un 112.0%, al pasar de 1200 a
2544 pesos por tonelada (Financiera Rural, 2011).
En nuestra región la melaza se adquiere de una manera fácil y a precios tan
accesibles como $2.50 por kg. De cada kg de melaza se obtienen dos litros de
18
melaza hidrolizada, Con los cuales se preparan alrededor de 130 L de medio para el
crecimiento de Bt. Para hidrolizar la melaza se aplica un proceso de hidrólisis por vía
acida aplicando calor (Basanta et al., 2007).
2.5.2.2. Remojo de maíz
Según cifras de SAGARPA (2014) la superficie sembrada de maíz en el ciclo
agrícola otoño-invierno del año 2013, fue alrededor de 497 mil ha, en los que
destacan los municipios de: Culiacán, Los Mochis, Guasave, La Cruz de Elota y
Mazatlán con una producción de maíz de 3627777.51 ton/ha, con un valor en la
industria de 3,315 pesos por tonelada.
El maíz es el cultivo con mayor presencia de siembra en nuestra zona,
utilizando tierra de cultivo y temporal en la región. El maíz se puede usar como una
fuente de carbono en medios de cultivo para bacterias y hongos. Su crecimiento
como medio a base de almidón de maíz, resulta fácil y económico. Por cada kilo de
maíz se pueden obtener 10 L de medio. Agregando los aditamentos y llevando a
cabo los procesos de gelatinización el valor final por litro de medio oscila en 0.35
pesos/L.
2.5.2.3. Suero de leche
En todo México se desarrolla la producción de leche, del 2005 a 2010 se
concentró en los estados de Jalisco, Coahuila, Durango y Chihuahua aportando un
45% de la producción nacional. Sinaloa ocupa el 20vo lugar en la producción de
leche (Sagarpa., 2012). Al cierre del año de 2012 la producción de leche de vaca
llegó a 10'946,015 de kilolitros; 2.07% más que en 2011. Para el año de 2013, el
servicio de estadística pecuaria del SIAP/SAGARPA ha publicado el programa anual
donde se establece una meta de producción de 10’942,034 kilolitros, es decir, se
estima una disminución de 0.04% respecto a 2012 (Sagarpa., 2012).
El suero es un subproducto de la industria del queso. Aproximadamente se
produce 9 Kg de suero por cada Kg de queso producido, Estados Unidos genera 1.2
millones de toneladas de suero por año. El suero contiene proteínas globulares que
permanecen en el suero tras la acidificación de la leche a pH=4.6 o por la acción de
19
la renina, no interviene en la formación de la cuajada, razón por la cual también se le
denomina proteínas séricas (Shahbazi et al., 2005; Magda et al., 2008).
Algunos negocios utilizan el suero de leche como aditivo en los biofertilizantes o
compostas, este tipo de biofertilizante es empleado en la agricultura orgánica. Sin
embargo el suero de leche se considera como un subproducto con poco valor,
incluso se puede obtener gratis. Para este estudio se utilizó suero de leche en polvo,
el proceso de deshidratación se llevó a cabo en los laboratorios de CIIDIR-IPN
Unidad Michoacán. El costo estimado del suero de leche líquido oscila alrededor de
0.4 pesos/L de medio para Bti. Tomando en cuenta la conservación del producto y
procesos previos como la precipitación de caseína que pudiera contener en exceso.
Esta proteína al momento de esterilizar el medio forma agregados que no son
deseables en un medio de cultivo líquido para bacterias y/o hongos.
2.5.3. Medio de cultivo a base de melaza de caña de azúcar
En muchos trabajos se ha utilizado la melaza en la propagación de bacterias y
hongos, siendo ésta la principal fuente de carbono (Enshasy et al., 2008).
Las melazas o mieles finales, suelen ser definidas por muchos autores como los
residuos de la cristalización final del azúcar, de los cuales no se puede obtener más
azúcar por métodos físicos. El proceso de evaporación y cristalización del azúcar
usualmente se repite tres veces hasta el punto en el cual el azúcar invertido y la alta
viscosidad de las melazas ya no permiten una cristalización adicional de la sacarosa
(Enshasy et al., 2008).
La melaza es una mezcla compleja de sacarosa, glucosa, fructuosa, rafinosa,
sales, compuestos solubles en álcali y sustancias reductoras no fermentables. Estos
compuestos no fermentables son principalmente caramelos libres de nitrógeno
producidos por el calentamiento mediante el proceso y las melanoidinas (Reaccion
de Maillard) que contienen nitrógeno derivadas a partir de productos de
condensación del azúcar y compuestos aminados (Honig., 1974; Ariza y Gonzales.,
1997).
20
Cuadro 2. Composición de la melaza de caña de azúcar (Ariza y González., 1997).
COMPONENTES CONSTITUYENTES CONTENIDO
Componentes
mayores
Materia seca 78%
Proteínas 3%
Sacarosa 60-63%
Azúcares reductores 3-5%
Sustancias disueltas
(diferentes sustancias) 4-8%
Agua 16%
Grasas 0.4%
Cenizas 9%
Contenido de
minerales
Calcio 0.74%
Magnesio 0.35%
Fósforo 0.08%
Potasio 3.67%
Contenido de
aminoácidos
Glicina 0.10%
Leucina 0.01%
Lisina 0.01%
Treonina 0.06%
Valina 0.02%
Colina 600 ppm
Niacina 48.86 ppm
Contenido de
vitaminas
Ácido Pantoténico 42.90 ppm
Piridoxina 44 ppm
Riboflavina 4.40 ppm
Tiamina 0.88 ppm
2.5.3.1. Composición
La composición de las melazas es muy heterogénea y puede variar
considerablemente dependiendo de la variedad de caña de azúcar, suelo, clima,
período de cultivo, entre otros. Por otro lado, la melaza de caña se caracteriza por
21
tener grados Brix o sólidos disueltos totales de 68-75% y un pH de 5.0 - 6.1 (Castro.,
1993).
2.5.3.2. Azúcares
Los principales azúcares en la melaza son la sacarosa (60%-63% en peso), la
glucosa o dextrosa (6% - 9% en peso), y la fructuosa (5% - 10% en peso). La glucosa
y fructosa constituyen la mayor porción de los azúcares reductores encontrados en
los análisis. El contenido de glucosa y fructosa puede variar a causa de la hidrólisis
de la sacarosa la cual se da en condiciones de pH ácido y altas temperaturas
(Castro., 1993).
2.5.3.3. No azúcares
Los no azúcares están compuestos por 33% de sustancias inorgánicas (Fe++, K+,
Na+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, As3+, Cd2+, Hg+, Pb+, y Cl-, NO3-, SO2
-), 42% de sustancias
nitrogenadas (aminoácidos, péptidos, colorantes) y 25% de sustancias orgánicas
libres de nitrógeno como ácidos carboxílicos, alcoholes, fenoles, ésteres, vitaminas,
gomas y dextranos (Castro., 1993).
2.5.3.4. Cenizas
En general la composición de las cenizas de las melazas es cualitativamente
similar a la del jugo del cual se obtienen éstas. Casi todos los análisis publicados
muestran que el contenido de potasa varía alrededor de 40% del peso total de la
ceniza; el contenido de cal es de 10% al 20%, el de sulfatos varía entre el 10% y el
20%, y las sales de magnesio, sodio, aluminio, la sílice, los cloruros, fosfatos y los
óxidos de hierro, corresponden al resto del contenido de cenizas (Castro 1993).
2.5.3.5. Compuestos nitrogenados
Los compuestos nitrogenados están constituidos principalmente por
aminoácidos mono y dibásicos, amidas ácidas, betaínas y pequeñas cantidades de
peptonas y nitratos. Cuando los azúcares reductores, glucosa y fructosa, son
22
sometidos a los procesos de clarificación, se producen varias reacciones, siendo la
más importante la de los aminoácidos con estos azúcares. En esta reacción se
forman productos coloreados como las melanoidinas y los residuos fermentables a
los cuales se les ha encontrado un contenido aproximado de 68% de nitrógeno
combinado con melazas. El nitrógeno total de las melazas varía entre 0.4% y 1.5%
del peso total de la melaza (Castro., 1993).
2.5.3.6. Ácidos
El ácido aconítico, es el más abundante de los ácidos orgánicos presentes en la
caña y se acumula en las melazas representando aproximadamente el 6% del peso
de sólidos en la melaza, mientras que los ácidos málico y cítrico están presentes en
cantidades apreciables y el ácido fórmico está presente como producto de
descomposición. La mayoría de los ácidos son utilizados como fuente de carbonos
por los microorganismos y no presentan problemas de inhibición de crecimiento
(Castro., 1993).
2.5.3.7. Vitaminas
En las melazas se encuentran vitaminas resistentes a la acción del calor y de
los álcalis. La niacina, el ácido pantoténico y la riboflavina, que son importantes para
el crecimiento microbiano pueden estar presentes en cantidades significativas
mientras que otras vitaminas están en cantidades muy pequeñas (Castro., 1993).
2.5.3.8. Fenoles y compuestos volátiles
Los fenoles presentes en las mieles finales provienen de la parte fibrosa de la
caña; éstos se derivan de los ácidos hidroxicinámico y perahidroxibenzóico. Es
necesario tener en cuenta que desde el punto de vista de la fermentación algunos
fenoles son indeseables ya que a concentraciones de 0.5% presentan actividad
inhibitoria sobre el crecimiento de los microorganismos. Los ácidos fenólicos que
mayor actividad bacteriostática han demostrado son el cloragénico, el p-cumárico y
23
el ferúlico; estos dos últimos son capaces de inhibir totalmente el crecimiento de
algunas bacterias (Castro., 1993).
2.5.3.9. Procedimiento de clarificación
La sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres, por lo
que carece de poder reductor. Dado que es común utilizar este azúcar en procesos
fermentativos su determinación por el método ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)
requiere de hidrolisis ya sea por la vía enzimática o la ácida para la obtención de sus
azúcares reductores que componen al disacárido; glucosa y fructosa (figura 3). El
proceso se llama inversión de la sacarosa o hidrólisis de sacarosa. El propósito de
hidrolizar es descomponer la sacarosa en sus dos monosacáridos glucosa y fructosa,
para que estén disponibles en el medio de cultivo cómo fuente de carbono. La
hidrolisis también separa residuos o lodos que trae el producto desde su elaboración.
La técnica más común para conocer la concentración de azucares reductores es el
método DNS y se evidencia por medio de la lectura de la absorbancia en el
espectrofotómetro, el cual se basa en la aplicación de la Ley de Beer-Lambert
(Miller., 1959).
La hidrólisis consiste en la oxidación de la glucosa, sin embargo la glucosa en
solución acuosa se encuentra en su forma cíclica, es muy estable y por lo tanto no
reacciona. Es necesario aplicar calor para que el anillo se abra dejando expuesto el
aldehído, lo cual da lugar a una reacción de oxidación (Miller., 1959).
También es necesario proporcionar un medio alcalino para la oxidación de la
glucosa, esto es posible gracias a la adición de NaOH. En solución acuosa el NaOH
se ioniza liberando Na+ y OH- al medio. En esta oxidación el carbono del grupo
aldehído del monómero se convierte en un ácido carboxílico por la pérdida de
hidrógenos y la ganancia de oxígeno se obtiene de esta forma el ácido glucónico. Por
otro lado, el ácido 3,5-dinitrosalicílico es reducido gracias a la acción del tartrato de
sodio y potasio y de la oxidación de la glucosa. El ácido pierde una de sus
configuraciones de 3 o 5 principalmente es la 3 por ser más reactiva, quedando ácido
3-amino-5-nitrosalicílico el cual produce una coloración amarilla. La coloración es
24
proporcional a la coloración de la glucosa. Luego la reacción se frena con hielo,
haciendo que la molécula de glucosa se cierre y adquiera de nuevo su configuración
piranosa (Routh et al., 1990).
Figura 3. Descomposición de la sacarosa en glucosa y fructuosa
2.5.4. Medio de cultivo a base de caldo de remojo de maíz
Después de la celulosa, el almidón es probablemente el polisacárido más
abundante e importante desde el punto de vista comercial. El almidón es una mezcla
de dos polisacáridos muy similares a la amilosa y la amilopectina, polímero de α-
glucosa en el que los monómeros se encuentran enlazados por enlaces 1-4 y
ocasionalmente se ramifican formando un enlace adicional 1-6 (Badui. 2006). Se
encuentra en los cereales, tubérculos y en algunas frutas como reserva energética.
Alimentos como el maíz tierno y las papas tienen alrededor del 15% de almidón, los
cereales pueden llegar a tener el 70% de almidon (Badui. 2006) Bajo condiciones de
gelificacion se púede obtener almidon disuelto obteniendo el remojo de maiz
proporcionando una fuenta de carbono para producción de bioinsecticidas.
2.5.4.1. Composición
De todos los componentes del grano del maíz, el almidón es el sustituyente
principal, es la sustancia de reserva alimenticia predominante en las plantas. Tanto el
almidón como los productos de la hidrolisis de almidón, constituye la mayor parte de
los carbohidratos digerible de la dieta habitual.
25
Está compuesto por dos polímeros distintos, la amilasa y la amilopectina, dos
polisacáridos muy similares constituidos por glucosa, presentando regiones
cristalinas en capas alternadas debido a sus constituyentes (Badui. 2006).
El remojo de maíz esta compuesto por polisacáridos mencionados y su
proporción varía de acuerdo a la optimización del proceso en el que somete. Por
ejemplo las temperaturas de gelificacion, tiempo al que se somete cada componente.
La cantidad de almidón contenida en un grano de maíz comparando con otras
fuentes de carbono se muestra el cuadro 3.
2.5.4.2. Amilosa
La amilosa es un polímero esencialmente lineal formado en promedio de 500 a
600 unidades de D-glucosa por enlaces α-(1,4), con una baja proporción de enlaces
α-(1,6), repartidas en cadenas que van de 1 a 20, de acuerdo con el número de
ramificaciones presentes en la molécula (Badui. 2006).
2.5.4.3. Amilopectina
La amilopectina se diferencia de la amilosa en que contiene ramificaciones que
le dan una forma similar a la de un árbol, las ramas están unidas al tronco central
(semejante a la amilosa) por enlaces α-(1,6), localizados cada 15-25 unidades
lineales de glucosa (Badui. 2006).
Cuadro 3.- Característica de algunos almidones usados en la industria alimentaria (Badui.,
2006).
Tipo de almidón Amilopectina
(%) Amilosa (%)
Temperatura de
gelatinización
Tamaño del gránulo
(Micras)
Maíz 69-74 26-31 62-72 5-25
Maíz rico en amilosa 20-45 55-80 67-80 5-25
Papa 73-77 18-27 58-67 5-100
Arroz 83 17 62-78 2-5
Tapioca 82 18 51-65 5-36
Maíz céreo 99-100 0-1 67-74 5-25
Sorgo céreo 99-100 0-1 67-74 5-25
Trigo 76 24 58-64 11-41
26
2.5.5. Medio de cultivo con base a suero de leche
El suero es un subproducto de la industria del queso. Aproximadamente se
produce 9 Kg de suero por cada Kg de queso producido, Estados Unidos genera 1.2
millones de toneladas de suero por año. El suero contiene proteínas globulares que
permanecen en el suero tras la acidificación de la leche a pH=4.6 o por la acción de
la renina, no interviene en la formación de la cuajada, razón por la cual también se le
denomina proteínas séricas (Shahbazi et al., 2005; Magda et al., 2008).
2.5.5.1. Composición
El suero está compuesto principalmente por lactosa (4.5-5%), proteínas (0.6-0.8%),
lípidos (0.4-0.5%), sales (0.7%) y un elevado contenido en lisina, triptófano y cisteína
que son aminoácidos azufrados que le confieren un excelente valor nutricional y una
composición equilibrada (Magda et al., 2007).
2.5.6. Elaboración de un medio de cultivo
Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por
agitación y calentamiento ligero en agua destilada. Los medios que contienen el
agente gelificante se suelen hervir durante 1 minuto para conseguir su disolución,
aunque en la mayor parte de los medios hay que calentar, y evitar
sobrecalentamientos. Posteriormente se procede a la esterilización del medio. En
algunos casos existen componentes lábiles que no pueden añadirse en el medio de
cultivo deshidratado y que será necesario esterilizarlo por separado e incorporarlo
después al medio de forma aséptica (Albdernour et al., 1994).
El pH de los medios de cultivo se ajusta durante su elaboración. Sin embargo,
la calidad del agua que se utiliza en la hidratación de los medios o los medios no
recientes pueden modificar el pH, por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si
fuera necesario. En algunos casos se puede ajustar el pH después de la
esterilización en condiciones asépticas y utilizando soluciones ácidas o básicas
estériles. En los medios sólidos la medición del pH se hace a 45 - 50ºC, mientras que
en los líquidos se hace a temperatura ambiente. Los medios que presentan pH
27
menores de 5, puede presentar una mala gelificación, presentando una consistencia
blanda, debido a la hidrólisis que se presenta en condiciones ácidas y altas
temperatura.
El método más comúnmente utilizado para la esterilización es el calor húmedo.
Sin embargo, hay ingredientes en algunos medios que no mantienen sus
propiedades si se someten a temperaturas altas.
2.5.7. Proceso de producción de biomasa microbiana
La producción comercial de biomasa microbiana puede ser dividida en dos
procesos principales: la producción de levadura de panificación y la producción de
proteína unicelular para alimentación animal y humana (Amicarelli, et al., 2006).
Hay cuatro grupos de fermentaciones de interés comercial:
1. Procesos en los que el producto de interés es el propio microorganismo
2. Procesos para la obtención de enzimas
3. Producción de metabolitos microbianos
4. Procesos de transformación
La biomasa se expresa en g/L y es utilizada como referencia de un buen medio
de cultivo buscando un factor de rendimiento ideal a 1, esto quiere decir que el peso
de sustrato consumido es igual al peso de células formadas (Caicedo et al., 2001).
Existe una variedad de métodos para monitorear la producción de biomasa,
pueden ser por diferencia de peso o peso seco por medición de un compuesto
químico producido. Es posible conocer el factor de rendimiento si monitoreamos la
fuente de carbono en este caso la glucosa, para lo cual se emplean métodos que nos
permiten conocer las diferentes concentraciones del medio limitante en los diferentes
tiempos de la fermentación. El método DNS es el más comúnmente utilizado (Miller,
1989; Godoy., 2002).
28
2.5.7.1. Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento
bacteriano
En todo proceso de fermentación existen factores físicos y químicos que ponen
en riesgo la producción de microorganismos, en los procesos aeróbicos, el oxígeno
junto con el sistema de mezclado son los factores más importantes para el diseño y
construcción del equipo, desde el punto de vista técnico, económico y fisiológico
(James, 1985).
En los organismos unicelulares tales como bacterias, levaduras o mohos, el
oxígeno generalmente se incorpora a un estado intermediario de la molécula de
oxígeno disuelto para llevar a cabo cualquier reacción oxidativa dentro de la célula.
Cuando el aire es burbujeado en un medio líquido previamente mantenido a cierto
nivel de agitación se produce una reducción instantánea del poder de absorción
(Wang et al., 1979).
En un cultivo aireado, la velocidad de transferencia de oxígeno en el caldo de
fermentación debe ser al menos igual a la demanda de oxígeno del microorganismo
por lo tanto, un caldo de fermentación es considerado adecuadamente oxigenado
sólo si el suministro de oxígeno es mayor que la demanda por parte del
microorganismo (Brawer., 1987).
Se puede considerar al oxígeno disuelto como un nutriente análogo a otros
nutrientes disueltos como pueden ser la glucosa, los aminoácidos y las sales
inorgánicas, pero hay una gran diferencia entre ellos, y ésta es que la solubilidad del
oxígeno es extremadamente limitada en comparación con la de los otros nutrientes.
En medio líquido la solubilidad del oxígeno es 6000 veces más baja que la de la
glucosa (Stanbury et al., 1995).
Uno de los parámetros más importantes en un proceso de fermentación es el
mezclado o agitación, ya que el medio de fermentación debe contener cantidades de
oxígeno disuelto homogéneas, debido principalmente a que muchos de estos
procesos se llevan a cabo bajo condiciones de limitación de oxígeno. Para lograr que
29
los microorganismos sean mantenidos en suspensión, es necesaria una pequeña
fracción de la agitación total (James, 1985; Galindo, et al., 2007).
En un fermentador agitado convencional, la agitación tiene las siguientes
funciones básicas:
a) Asegurar homogeneidad del cultivo a través del macromezclado
b) Promover transferencia de masa interfacial por medio de macromezclado
c) Promover un área superficial grande para la transferencia de masa
d) Promover la transferencia de calor
Estas funciones requieren de gasto de energía mecánica, la cual es
suministrada por el movimiento de uno o varios impulsores. Esta energía es
usualmente disipada como calor (Wang et al., 1979).
2.5.7.2. Trasferencia de oxígeno en matraces con medio de cultivo
La importancia de conocer las capacidades de trasferencia de oxígeno en
condiciones de matraz con agitación a nivel laboratorio, no está necesariamente
relacionada con el proceso de escalamiento. En cambio, un conocimiento cuantitativo
de lo que se presenta en la agitación del matraz, puede ayudar significativamente
para evaluar la importancia de la trasferencia de oxigeno (Wang et al., 1979). El
oxigeno permite el crecimiento rápido de los microorganismos aeróbicos que es parte
fundamental para su metabolismo. La agitación provee una homogenización en los
medios de cultivos liquidos garantizando la trasferencia de oxigeno a la celula en
cualquier área del medio.
2.5.7.2.1. Producción de Bti en matraz con agitación
Es importante considerar todos los aspectos de la fermentación. La agitación
tiene que ver en la absorción de oxígeno, estudiar también los volúmenes más
30
comúnmente utilizados en un matraz, así como el tipo de movimiento empleado. En
este sentido, se considera que un volumen total de 500 mL del matraz agitado es un
sistema representativo de una fermentación. La máxima capacidad de absorción de
oxígeno de un matraz agitado que tiene un recorrido total de rotación de 2.54 cm
tiene mejores resultados con velocidades de 200 hasta 700 rpm, obteniendo un
absorción de oxígeno de hasta 100 mM/L. Con el uso de baffles dentro del matraz
hay un aumento de 2.5 veces en el índice de absorción (Wang et al., 1979).
Conforme se aumenta el volumen del líquido disminuye el área de trasferencia
de oxígeno interfacial por unidad de volumen de la solución. Así como el grado de
turbulencia. Como una de las consecuencias, la tasa de absorción de oxigeno
volumétrico se ve afectada cuando se incrementa el volumen del caldo de cultivo en
el matraz agitado. El comportamiento cuantitativo sin baffles dentro del matraz de
500 ml operando a 400 rpm con diferente volumen de líquido, presenta un índice de
absorción muy bajo. Se debe mencionar que la disminución de la tasa de absorción
con el incremento del líquido no es directamente proporcional (Wang et al., 1979).
Generalmente la fermentación en matraces se lleva acabo con volúmenes bajos no
rebasando el 50% de la capacidad del matraz, esto le permite una trasferencia de
oxigeno.
2.5.7.2.2. Condiciones de pH y temperatura
Las variables más estudiadas que influyen en la velocidad de cambio de los
sistemas microbianos son: pH, temperatura y en sistemas aerobios, la concentración
de oxígeno disuelto. El pH de acuerdo con Jackson (1970) se considera como una de
las propiedades químicas más importantes debido al significativo efecto que ejerce
tanto sobre las características físicas como las químicas, biológicas y el rendimiento
de los cultivos (Guigon et al. 1989; Saña et al., 1996; Cepeda., 1999). El pH puede
determinar desde el punto de vista biológico el tipo de organismo que se desarrolle
sobre un medio, debido a su significativa influencia sobre la disponibilidad de
nutrientes.
31
La temperatura de una fermentación aerobia afecta la solubilidad del oxígeno y
el coeficiente de transferencia de masa. La solubilidad del oxígeno cae cuando la
temperatura aumenta. Por lo tanto, la diferencia de concentraciones para la
transferencia de oxígeno se reduce. Al mismo tiempo, el coeficiente de transferencia
de masa (KL) se incrementa a causa de que la difusión del oxígeno en la película del
líquido se incrementa. El efecto neto de la temperatura sobre la transferencia de
oxígeno depende del rango de temperaturas considerado. De esta forma, la
velocidad de transferencia de oxígeno aumentará conforme la temperatura se
incremente de 10 °C a 40 °C. Arriba de los 40 °C la solubilidad del oxígeno disminuye
significativamente afectando la velocidad de transferencia de oxígeno (Doran, 1995).
2.5.8. Cinética de la fermentación
Los estudios cinéticos son necesarios para entender el comportamiento de
cualquier fermentación y en general, consisten en la medición o estimación de las
velocidades de síntesis celulares, de formación de productos y de los efectos del
medio ambiente sobre las velocidades (Röels y Kossen, 1978).
Los microorganismos crecen en un amplio espectro de entornos físicos y
químicos de ahí que, su crecimiento y otras actividades fisiológicas son una
respuesta a su entorno físico-químico. La cinética de la fermentación describe el
crecimiento y el producto formado por microorganismos, no solo el crecimiento de
células activas, sino también las actividades de restricción de muerte celular, ya que
muchos productos de la fermentación que son de interés comercial se producen
después de que el crecimiento se ha detenido (fase estacionaria) (Wang et al., 1979).
Algunos autores (Röels y Kossen, 1978) clasifican los productos en las siguientes
categorías:
Productos no asociados al crecimiento
Producto asociado al crecimiento
Producto parcialmente asociado al crecimiento
32
2.5.8.1. Modelo de crecimiento microbial cinético no estructurado
Los modelos cinéticos no estructurados son los modelos más sencillos
empleados para la descripción de sistemas microbianos. La cantidad de
microorganismos se expresa mediante el término de biomasa o población microbiana
en unidades abstractas de vida, ignorándose la estructura interna de la célula que
compone la biomasa, pues se considera toda la población homogénea (Quintero,
1981).
Los tiempos de duplicación de la masa pueden ser diferentes del tiempo de
duplicación celular por que la masa celular puede aumentar sin un incremento en el
número de células. Sin embargo, si en un entorno determinado el intervalo entre la
masa celular o el número de duplicaciones es constante con el tiempo, el organismo
está creciendo en una tasa exponencial (Quintero, 1981).
División de bacterias por fisión durante el ciclo de crecimiento de la célula. La
división duplica la masa y la cantidad de todos los componentes de la célula. Antes
de la fisión se sintetizan la pared y la membrana celular y las células madres se
dividen en dos células hijas idénticas, cada una de las cuales crece exactamente
como la célula original. En consecuencia, generalmente no es posible asignar una
edad a una bacteria, excepto dentro del contexto de una duplicación simple. Por lo
tanto, hacer referencia a un cultivo viejo o joven, se refiere al tiempo de permanencia
en un frasco o en un agitador y no a la edad de las células que envejecen (Wang et
al., 1979).
2.5.8.2. Parámetros cinéticos
Durante el crecimiento celular la velocidad específica de crecimiento está
relacionada con la concentración de sustrato, mediante la ecuación de Monod
(1949).
µ= Velocidad específica de crecimiento
33
µmax = Velocidad específica máxima de crecimiento
Ks = Constante de saturación
S = Sustrato
2.5.8.3. Rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx/s)
Por cada gramo de sustrato consumido se forma gramos de biomasa, a esta
proceso se le llama factor de rendimiento y se conoce como la variación de la
biomasa con respecto al tiempo entre la variación del sustrato. Se expresa con la
siguiente ecuación (Monod, 1949).
(
)
Dónde:
Yx/s= Rendimiento de biomasa por sustrato consumido (g/g)
= La producción o acumulación de biomasa en el trascurso del tiempo
= Consumo o disminución del sustrato respecto al tiempo
34
III. JUSTIFICACIÓN
En Sinaloa, desde el año 2006 la población del mosquitos (Culex spp.) es
recurrente, por lo que se utiliza insecticidas químicos para el control de este insecto.
Una de las alternativas para el control biológico de la plaga de mosquito es la
bacteria Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti), Para la producción económica de
la bacteria Bti en laboratorio es necesario optimizar un medio de cultivo económico
que permita su propagación con fines de uso como agente de control biológico de
mosquitos. Por esta razón y dado que en el estado se pueden obtener fuentes de
medio de cultivo a partir de melaza, remojo de maíz y suero de leche, que son
productos agroindustriales regionales que se pueden utilizar como fuentes de medio
de cultivo para la producción de la bacteria para usarla en el control del insecto.
35
IV. OBJETIVO GENERAL
Optimizar un medio de cultivo para la producción de Bacillus thuringiensis var.
israelensis en fermentación líquida en matraz para evaluación de su patogenicidad
contra larvas de mosquitos Culex sp.
4.1. Objetivos específicos
1. Seleccionar un medio de cultivo con la mayor producción de biomasa de Bti,
en condiciones estándar a partir de diferentes subproductos agroalimentarios.
2. Evaluar a nivel matraz el medio con mejor rendimiento de biomasa y estudiar
el efecto de la temperatura y la velocidad de agitación para la producción de
Bti.
3. Determinar la actividad insecticida mediante la determinación de la dosis -
porcentaje de mortalidad y el tiempo letal de larvas de Culex sp.
V. HIPÓTESIS
La producción de Bti utilizando diferentes medios de cultivo basados en
subproductos agroindustriales (melaza, suero de leche y remojo de maíz), permitirá
obtener una producción del complejo espora/cristal suficiente para el control de
mosquitos Culex sp.
36
VI. MATERIALES Y METODOS.
6.1. Material biológico
6.1.1. Obtención de la bacteria Bti
Se usó una cepa de colección de Bacillus thuringiensis var israelensis Bti
código (BtiAC) del laboratorio de bioinsecticidas del CIIDIR Sinaloa, identificada y
caracterizada morfológicamente.
6.2. Activación de la cepa de Bti
Se preparó medio de cultivo agar bacteriológico en combinación con el medio
LB según la recomendación del fabricante para obtener volúmenes mayor a 500 mL.
Se esterilizó a 121°C por 15 min y posteriormente gelificado en cajas petri y bajo
condiciones de asepsia se llevó a cabo la resiembra de la bacteria Bti poniéndose en
incubación para su crecimiento con una temperatura controlada de 30°C.
6.2.1. Pre-inóculo
Se preparó medio LB de acuerdo a las recomendaciones del fabricante (Sigma),
posteriormente se esterilizó a 121°C por 15 min en matraz de 250 mL, se inoculó a
partir de un desarrollo de la bacteria en placas petri conteniendo el medio agar
bacteriológico-Luria Bertani. Después de 48 h se determinaron las concentraciones
de UFC/mL.
6.3. Cuantificación de espora del biofomulado de Bti (UFC/mL)
Para determinar el número de espora por mL del bioformulado de Bti se
prepararon diluciones en serie para facilitar el conteo en placas. La primera dilución
se obtuvo trasfiriendo con una micropipeta estéril la cantidad de 1 mL del
bioformulado a un tubo de ensayo con 9 mL de agua estéril, se agitó durante 1min en
un vortex; de la dilución se tomó 1 mL y se colocó en 9 mL de agua estéril
obteniéndose la segunda dilución. De la segunda dilución se sembró la bacteria en
cajas petrí que contenían medio agar bacteriológico con medio LB, se incubo por 20
37
h y se contaron las colonias formadas durante ese periodo de tiempo. La
concentración de UFC/mL del bioformulado se calculó multiplicando la suma del
número de colonias por el inverso del número de las diluciones empleadas.
6.4. Ventana de respuesta biológica
La toxicidad se determinó por medio de bioensayos, utilizando larvas de
mosquito de C. quinquefasciatus como insecto blanco y después se realizaron las
pruebas con los diferentes medios de cultivo.
Para los bioensayos de virulencia de Bti contra larvas de mosquitos Culex sp,
se replicaron en medio agar bacteriológico y medio LB en cajas Petri a temperatura
de 30 °C por 24 h, para después resguardarla la cepa de Bti a 4 °C en refrigeración,
las cuales serán utilizadas para obtener inóculos y crecer en el medio de cultivo en
estudio.
6.5. Producción de Bti en diferentes medios de cultivos
Para encontrar el mejor medio de cultivo se hizo un experimento con diferentes
concentraciones de las fuentes de carbono: Melaza, remojo de maíz y suero de
leche. Monitoreando la biomasa y las unidades formadoras de colonia (UFC/mL).
Al medio de cultivo se le adicionó sales y minerales para complementar los
requerimientos de la bacteria para su producción.
38
Los medios de cultivo para la fermentación se observa en el cuadro 4.
Cuadro 4. Medios de Cultivos
Componentes Concentración g/L M1 M2 M3
Melaza (M1) 3, 6 y 9 x
Remojo de maíz 1, 1.5 y 2 x
Suero de Leche 3, 6 y 9 x
MgSO4 7H2O 0.12 x x x
MnSO4 H2O 0.0016 x x x
FeSO4 7H2O 0.028 x x x
CaCl2 0.11 x x x
(NH4)2SO4 6 x x x
KH2PO4 6.8 x x x
6.5.1.1. Hidrólisis
La melaza se vertió en agua destilada en proporción 1:1 (v/v), se mezcló hasta
tener una completa disolución, se ajustó el pH a 3.5 con ácido sulfúrico concentrado,
luego se calentó a 90 °C durante 10 min, se retiró del fuego durante 2 min, después
se agregó el 1% (p/p) de sulfato de amonio y de fosfato de amonio. La mezcla se
llevó a 90 °C y se mantuvo durante 10 minutos, se enfrió a temperatura ambiente y
por centrifugación se eliminaron los lodos formados. Posteriormente se realizó un
análisis cuantitativo de azúcares reductores por el método DNS.
6.5.1.2. Técnica del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS)
Para cuantificar los azúcares reductores se utilizó el método DNS, el cual
consiste en una estimación de la reacción de óxido-reducción que se basa en la
capacidad de la glucosa para producir el ácido 3,5-dinitrosalicílico bajo determinadas
condiciones; esta reducción produce una coloración amarilla que se hace más
39
intensa a medida que aumenta la concentración de azúcares reductores. La
preparación del reactico se lleva a cabo como lo indica el cuadro 5.
Cuadro 5. Preparación del reactivo DNS
(Godoy, 2002; Bello et al., 2006)
METODO 3-5 DINITROSALICÏLICO
COMPUESTO CANTIDAD
Agua destilada 1416 mL
Ácido 3-5 Dinitrosalicílico 10.6 g
NaOH 19.8 g
Tartrato de Na y K 30.6 g
Fenol (Fundir a 50 °C) 7.6 mL
Metabisulfito de sodio 8.3 g
A partir de una solución stock de glucosa a concentraciones de 1g/L y por
dilución con agua destilada se preparó una gama de soluciones del azúcar de distinta
concentración. Las diluciones se hicieron en tubos de ensayo con tapa de rosca. Una
vez hechas las mezclas se agitaron bien los tubos para homogenizar la solución.
Posteriormente se adicionaron 3 ml del reactivo DNS, se calentaron los tubos en
agua en ebullición durante 5 min, se enfriaron en hielo y se dejaron reposar no más
de 15 min para evitar la condensación de agua alrededor de los tubos o en la celda.
Se toma nota del valor de absorbancia a 540nm.
6.5.2. Líquido de remojo de maíz
Se obtuvo de granos de maíz quebrantados y mezclados con agua, después se
elevó la temperatura hasta alcanzar la gelatinización, punto en el cual el almidón se
disuelve en el líquido (Badui, 2006). Después la mezcla se sometió a una hidrólisis
del almidón y posteriormente se realizó un análisis para obtener la concentración de
azucares reductores mediante la técnica DNS.
40
6.5.3. Suero de leche
El polvo de suero de leche para preparar el medio de cultivo lo proporcionó el
laboratorio de Nutrición acuícola del departamento de acuacultura CIIDIR-IPN unidad
Sinaloa y contiene los siguientes componentes (cuadro 6).
Cuadro 6. Componentes del suero de leche en polvo
Componentes del suero lácteo Concentraciones porcentuales (%)
Humedad 5.8 ± 0.1
Cenizas 3.5 ± 0.1
Grasas 7.3 ± 0.1
Proteína 76.9 ± 0.5
Carbohidratos 6.5 ± 0.2
6.6. Fermentaciones de la bacteria Bti en matraces
Todos los medios formulados se esterilizaron mediante calor húmedo a
temperatura de 121 °C durante 15 min en un matraz de 500 mL. Se trabajó con 200
mL de medio con melaza, con suero de leche y con remojo de maíz. A los medios
formulados se le adicionaron concentraciones conocidas de sales KH2PO4,
MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O, CaCl2 (cuadro 9). Cada matraz se inoculó con un 20%
del inóculo de Bti con respecto al volumen del medio. El rendimiento de células
viables se comparó con la concentración de células obtenidas con un medio
comercial.
Para cumplir con el primer objetivo se realizaron corridas de Bti con medio de
melaza y sales minerales.
La cepa de Bti se activó con medio LB obteniendo una concentración de 1x108
UFC/mL. Se adicionaron 5 mL del producto obtenido con el medio comercial, a 200
mL de medio con melaza para obtener un pre-inoculo.
41
Cada 3 h se tomaron alícuotas del medio hasta las 24 h. Aunque
posteriormente fue necesario extender el experimento hasta 72 h y las muestras
fueron extraídas cada 6 h. Las muestras se utilizaron para monitorear la producción
de biomasa en peso seco g/L, y el consumo de azúcares reductores se realizó con la
técnica DNS. Las condiciones del cultivo fueron: 200 rpm, temp de 30 °C y pH 7.
6.7. Diseño del experimento
Para realizar los tratamientos del mejor medio de cultivo con diferentes
concentraciones, se realizó una aleatorización de los tratamientos asignándole un
número al azar y posteriormente el número se ordenó de menor a mayor apoyado.
Este trabajo se realizó con el software Excel quedando de la siguiente manera
(Cuadro 7).
Cuadro 7. Aleatorización de los tratamientos
Medio g/L
Clave Numero Aleatorio
M2 2 T5 12
M1 9 T3 17
M3 9 T8 51
M1 3 T1 74
M1 6 T2 75
M3 3 T7 75
M3 3 T9 88
M2 2 T6 90
M2 1 T4 94
Se utilizó un diseño experimental al azar con la finalidad de seleccionar las
concentraciones de las fuentes de carbono y un diseño factorial de 23, para evaluar
la temperatura 25 °C, 30 °C y la agitación 35 °C, y 150, 200, y 250 rpm. Se trató de
mantener constante el pH=7 en todos los casos.
6.8. Bioensayos: porcentaje de mortalidad de larvas de Culex spp
Cada uno de los cultivos en formulado líquido se sometió a bioensayos
preliminares contra larvas de mosquitos Culex sp. de tercer estadio, según la
42
metodología propuesta por De Baja et al., (1990). Los pasos a seguir fueron los
siguientes:
a) Se colocaron 25 larvas de tercer estadío o cuarto temprano de Culex sp. en vaso
de plástico.
b) Se llenaron los vasitos con 148 mL de agua destilada, para completar 150 mL de
volumen de agua.
c) Se preparó la cantidad de vasos de acuerdo a las cuatro diluciones a evaluar. Se
probaron cuatro diluciones de cada medio de cultivo: Melaza, remojo de maíz y suero
de leche, a concentraciones de 105, 106, 107 y 108 UFC/mL, cada una con dos
repeticiones.
d) El control consistió en cuatro vasos con 10 larvas c/u conteniendo solo agua
destilada.
e) Se agregó la cantidad correspondiente de cultivo total, o diluciones de éste,
conteniendo el complejo espora/toxina, a cada uno de los vasos usando micropipeta
o pipeta, según fuera necesario.
f) Después de aplicar el volumen correspondiente, las larvas se mantuvieron durante
24 h a una temperatura de 25 ± 2°C y a una humedad relativa (HR) 70 a 80 %. Al
término de este tiempo se registró el número de larvas vivas y muertas en cada
dilución de los diferentes medios a diferentes concentraciones de mosquito.
6.9. Clarificación de melaza
Previo a los diseños de los medios de cultivos con melaza, se llevó a cabo el
proceso de hidrolisis, del cual se obtuvieron 5 L de hidrolizado concentrado. Durante
el proceso la concentración de azúcares reductores totales se incrementó de 110.8 a
394.235 g/L.
Para evaluar la concentración de azúcares se preparó una curva de calibración
(Figura 4) con las cantidades de hidrolizado que se muestra en el cuadro 8.
43
Cuadro 8. Curva de calibración de azúcares reductores
Figura 4. Curva de calibración estándar de azúcares reductores (540nm)
y = 2,3391x - 0,0682 R² = 0,9847
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
Ab
so
rban
cia
Concentración de glucosa g/L
Concentración de glucosa. g/L
Absorbancia540
0 0
0.1 0.146
0.2 0.265
0.3 0.596
0.4 0.814
0.5 1.15
0.6 1.415
0.7 1.722
0.8 1.872
0.9 2.035
1 2.1
SOLUCIÓN MADRE
Cantidad de la solución madre (mL)
Agua destilada (mL)
0 1
0.1 0.9
0.2 0.8
0.3 0.7
0.4 0.6
0.5 0.5
0.6 0.4
0.7 0.3
0.8 0.2
0.9 0.1
1 0
44
VII. RESULTADOS
7.1. Propagación de Bti
La cepa de Bacillus thuringiensis var israeliensis se activó en una primera etapa
en agar bacteriologico, posteriormente se cultivó en líquido en matraces de 500 mL
utilizando el medio de cultivo LB.
7.2. Bioensayos, ventana de respuesta biológica
En el medio de cultivo LB se produjo el complejo espora-cristal, después de 24
h de crecimiento. El conteo de UFC/mL se realizó en seis diluciones y se obtuvieron
concentraciones de 1x105 UFC/mL hasta 1x108 UFC/mL de medio. El porcentaje de
mortalidad de larvas obtenido a las 24 h después de las aplicaciones fue de 100%
valor que corresponde a las concentraciones mayores de 1x105 UFC/mL mientras
que a concentraciones de 1x105 UFC/mL la mortalidad fue del 80%.
7.3. Selección de un medio de cultivo para producción de espora/cristal y
biomasa de Bti
7.3.1. Producción de Bti en medio de melaza
El medio de cultivo a base de melaza, se diseñó como lo indica el cuadro 9.
Cuadro 9. Componentes del medio de cultivo con melaza
Componentes Concentración g/L
Melaza (M1) 3, 6 y 9
MgSO4 7H2O 0.12
MnSO4 H2O 0.0016
FeSO4 7H2O 0.028
CaCl2 0.11
(NH4)2SO4 6
KH2PO4 6.8
45
Cuadro 10.- Producción de biomasa y consumo de azúcares reductores en el medio con
melaza en concentraciones de: 3, 6 y 9 g/L
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti en el medio de melaza
(M1) a una concentración de azúcares reductores totales de 3 g/L, presentó la fase
de crecimiento a las 36 h con una concentración de biomasa de 2 g/L, y una
concentración de células viables de 1x107 UFC/mL, seguida de la fase estacionaria
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo (h)
Crecimiento Bti en M1 3 g/L
Tiempo h Biomasa g/L
Azúcares Red. 3 g/L
Biomasa g/L
Azúcares Red. 6 g/L
Biomasa g/L
Azúcar Red. 9 g/L
0 0.0002 2.95 0.00027 5.89 0.000015 8.9 6 0.1 2.57 0.1123 5.3 0.0085 8.236
12 0.12 1.98 0.4144 4.9 0.069 8.019 18 0.341 1.77 0.978 4.63 0.2606 7.85 24 0.9 1.45 1.5 4.12 1.032 7.403 30 1.44 1.24 1.96 3.88 1.216 7.193 36 2.1 1.1 2 3.3 1.566 6.8 42 2.17 0.83 2.11 2.9 1.824 6.432 48 2.2 0.79 2.23 2.5 2.002 6.267 54 2.28 0.77 2.43 2.3 2.083 6.159 60 2.37 0.73 2.4981 2.2 2.196 6.03 66 2.4 0.7 2.5101 2.2 2.231 5.2 72 2.44 0.7 2.55 2.1 2.24 5.87
Figura 5. Crecimiento de la bacteria Bti en M1 (3 g/L), a las 72 h
46
que se extiende a las 72 h en este tiempo se presentó un crecimiento gradual que se
puede considerar inapreciable.
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti en el medio de melaza
(M1) a una concentración de azúcares reductores totales de 6 g/L, presenta la fase
de adaptación o fase lag a las 6 h seguido de la fase de crecimiento a las 30 h con
una concentración de biomasa de 2 g/L y una concentración de células viables de
1x108 UFC/mL seguida de la fase estacionaria que se extiende a 72 h, en la cual la
bacteria presenta un crecimiento gradual que se puede considerar inapreciable.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo (h)
Crecimiento Bti en M1 6 g/L
Figura 6. Crecimiento de la bacteria Bti en M1 (6 g/L) a las 72 h
47
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti en el medio de melaza
(M1) a una concentración de azúcares reductores totales de 9 g/L, presenta la fase
lag o de adaptación a las 12 h, la fase de crecimiento en 48 h, con una concentración
de biomasa de 2.24 g/L y una concentración de células viables de 0.8x108 UFC/mL
La pendiente de la fase exponencial tuvo un valor menor que en las concentraciones
3 y 6 g/L.
7.3.2. Producción de Bti en medio con remojo de maíz
Para obtener este medio de cultivo se pesaron 100 g de granos de maíz y con
un mortero se quebrantaron, posteriormente se agregaron a un litro de agua y se
llevó a temperatura de gelatinización. El almidón expuesto al agua pierde su
birrefringencia y se disuelve. Después se llevó a una hidrólisis para separar la
estructura de amilosa y amilopectina en sus monómeros libres. Para el proceso de
hidrólisis se le dieron las siguientes condiciones: 50 °C, 3.4% en volumen de HCl y
un lapso de 7 horas (Torres, 2007). Obteniendo un total de 2 g/L de azucares
reductores. Las condiciones del cultivo para este medio fueron de: 200 rpm, 30 ºC y
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo h
Crecimiento Bti 9 g/L
Figura 7. Crecimiento de la bacteria Bti en M1 (9 g/L) a las 72 h
48
pH=7. El diseño del medio lo describe el cuadro 11 y el rendimiento de esta fuente de
carbono lo señala el cuadro 12.
Cuadro 11. Composición del medio con remojo de maíz
Componentes Concentración g/L
Remojo de maíz 2, 1.5 y 1
MgSO4 7H2O 0.12
MnSO4 H2O 0.0016
FeSO4 7H2O 0.028
CaCl2 0.11
(NH4)2SO4 6
KH2PO4 6.8
Cuadro 12. Medio con remojo de maíz, producción de biomasa y consumo de azúcares
reductores en concentraciones de 2, 1.5 y 1 g/L
Tiempo h Biomasa g/L
Azúcar Red. 1 g/L
Biomasa g/L
Azúcar Red. 1.5 g/L
Biomasa g/L
Azúcar Red. 2 g/L
0 0,00028 0.984 0,00012 1.66 0.00038 1.976
6 0,0087 0.967 0,00234 1.638 0.00789 1.68
12 0,212 0.896 0,0685 1.446 0.0105 1.108
18 0,289 0.745 0,137 1.288 0.187 1
24 0,673 0.654 0,967 1.206 0.774 0.903
30 0,956 0.501 1,197 1.074 1.26 0.797
36 1,2 0.432 1,473 0.659 1.58 0.7102
42 1,523 0.343 1,745 0.614 1.857 0.658
48 1,856 0.265 2,01 0.53 2 0.61
54 1,923 0,205 2,126 0,498 2.213 0.53
60 1,976 0,145 2,2 0,41 2.3 0.47
66 1,985 0,112 2,278 0,348 2.31 0.405
72 1,98 0,107 2,29 0,33 2.33 0.367
49
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo h
Crecimiento Bti M2 1 g/L
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti a una concentración 1
g/L crecida en el M2, presentó la fase de crecimiento de 48 h, con una concentración
de biomasa de 1.856 g/L y una concentración de células viables de 1x105 UFC/mL
seguida de la fase estacionaria que se extendió a 72 h.
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti a una concentración 1.5
g/L crecida en el M2, presentó la fase de crecimiento en 48 h con una concentración
Figura 8. Crecimiento de la bacteria Bti en M2 (1 g/L) a las 72 h
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo h
Crecimiento Bti M2 1.5 g/L
Figura 9. Crecimiento de la bacteria Bti en M2 (1.5 g/L) a las 72 h
50
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
M g
/L
Tiempo h
Crecimiento Bti M2 2 g/L
de biomasa de 2.01 g/L y una concentración de células viables de 2x105 UFC/mL,
seguida de la fase estacionaria que se extiende hasta las 72 h.
En la figura 9 presenta una fase de adaptación de 18 h y de las 18 a las 24 h el
crecimiento exponencial lo lleva a cabo pronunciadamente, después de las 24 h el
crecimiento continua hasta las 72 h pero la pendiente de crecimiento decae como si
fuera dos fase exponencial.
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti a una concentración 2
g/L producida en el M2, presentó la fase de crecimiento en 54 h, con una
concentración de biomasa de 2.13 g/L y una concentración de células viables de
3x106 UFC/mL seguida de la fase estacionaria que se extendió hasta las 72 h.
7.3.3. Producción de Bti en medio con suero de leche
Se trabajó con suero en polvo a diferentes concentraciones (Cuadro13) para
buscar la cantidad adecuada para el crecimiento de Bti. En el proceso de diseño del
medio se presentó precipitación de las proteínas o condensación, esto se debe a las
altas concentraciones de proteínas que al estar en temperatura de esterilización 121
°C forma agregados.
Figura 10. Crecimiento de la bacteria Bti en M2 (2 g/L) a las 72 h
51
Para corregir el problema de la formación de agregados de proteínas se
esterilizaron por separados los componentes; el suero en polvo y la disolución de las
sales que componen el medio, la temperatura de esterilizaciòn fue de 121 ºC durante
un tiempo de 15 min. Las condiciones de cultivo fueron: 30 ºC y 200 rpm, pH=7.
Componentes Concentración g/L
Suero de leche 5, 10 y 15
MgSO4 7H2O 0.12
MnSO4 H2O 0.0016
FeSO4 7H2O 0.028
CaCl2 0.11
(NH4)2SO4 6
KH2PO4 6.8
Cuadro 14.- Medio con suero de leche a concentración de
5, 10 y 15 g/L y producción de biomasa
Biomasa
Tiempo h 5 g/L 10 g/L 15 g/L
0 0.00034 0.000123 0.00002
6 0.0789 0.0756 0.0776
12 0.1578 0.125 0.157
18 1.087 0.697 0.56
24 1.276 1.045 1.211
30 1.356 1.243 1.376
36 1.498 1.364 1.397
42 1.57 1.498 1.563
48 1.706 1.653 1.653
54 1.793 1.7812 1.797
60 1.854 1.979 1.936
66 1.954 2.013 1.949
72 2.108 2.112 1.934
Cuadro 13. Composición del medio con suero de leche
(M3)
52
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti a una concentración 5
g/L producida en el M3 presentó una fase exponencial corta de 12 a 18 h. La
pendiente de crecimiento disminuyó aunque se pudo observar un segundo
crecimiento gradual desde las 24h a las 72h. De esta forma produjo una
concentración de biomasa de 2.108 g/L y una concentración de células viables de
1x106 UFC/mL. La fase estacionaria no se apreció en el medio con suero de leche a
la concentración de 5 g/L.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo h
Crecimiento de Bti en M3 5 g/L
Figura 11. Crecimiento de la bacteria Bti en M3 (5 g/L) a 72 h
Figura 12. Crecimiento de la bacteria Bti en M3 (10 g/L) a 72 h
53
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
Bio
masa (
g/L
)
Tiempo h
Crecimiento de Bti en M3 15 g/L
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti a una concentración 10
g/L producida en el M3, presentó una fase exponencial de 12 a 60 h. Produjo una
concentración de biomasa de 2.12 g/L y una concentración de células viables de
6x107 UFC/mL. La fase estacionaria no se aprecia en esta concentración.
La curva de crecimiento del bioformulado líquido de Bti a una concentración 15
g/L producida en el M3 presentó una fase exponencial de 12 a 24 h. Se produjo una
concentración de biomasa de 2.12 g/L medida a las 72 h y, una concentración de
células viables de 7x106 UFC/mL. La fase estacionaria se presentó a las 60 h.
7.4. Evaluacion del rendimiento del medio M1 variando la temperatura y
agitación
Se realizaron pruebas del medio seleccionado a diferentes condiciones de
temperatura: 25, 30 y 35 ºC, y velocidad de agitación, 150, 200 y 250 rpm, teniendo
como variable de respuesta la biomasa y UFC/mL. El pH se trató de manter en
valores neutros ph=7.
Figura 13. Crecimiento de la bacteria Bti en M3 (15 g/L) a las 72 h
54
Cuadro 15. Producción de Bti en condiciones diferente con el medio de cultivo melaza 6 g/L
Agitación 150 rpm Agitación 200 rpm Agitación 250 rpm
Tiempo (h)
Biomasa 25 °C
Biomasa 30 °C
Biomasa 35 °C
Biomasa 25 °C
Biomasa 30 °C
Biomasa 35 °C
Biomasa 25 °C
Biomasa 30 °C
Biomasa 35 °C
0 0.00013 0.0003 0.00028 0.00026 0.00042 0.00008 0.00075 0.00123 0.00054
6 0.0056 0.0102 0.021 0.0423 0.102 0.0876 0.0301 0.0756 0.07653
12 0.0432 0.0896 0.091 0.1576 0.875 0.187 0.0678 0.125 0.1054
18 0.0874 0.1476 0.135 0.897 1.076 0.589 0.1376 0.697 0.1349
24 0.12 1.167 0.179 1.189 1.213 1.201 0.1434 1.045 1.0233
30 0.143 1.543 1.278 1.277 1.335 1.287 1.001 1.243 1.165
36 1.02 1.637 1.329 1.398 1.534 1.409 1.3065 1.364 1.245
42 1.305 1.71 1.478 1.502 1.754 1.563 1.479 1.498 1.376
48 1.573 1.823 1.543 1.623 1.985 1.643 1.63 1.653 1.436
54 1.723 1.91 1.689 1.79 2.167 1.79 1.793 1.7812 1.612
60 1.789 2.104 1.801 1.894 2.31 1.934 1.9012 1.979 1.713
66 1.8 2.145 1.9 2.109 2.389 1.967 1942 2.013 1.832
72 1.795 2.18 1.91 2.188 2.41 1.972 1.977 2.112 1.84
En el modelo estadístico factorial de 23 (Anexo I) Se obtuvieron los siguientes
resultados.
Se obtuvieron diferencia significativa por lo menos por alguno de los factores o
tratamientos, de acuerdo al análisis de varianza. Se observaron diferencias
significativas en los factores temperatura y velocidad de agitación y en las
interacciones entre ambos factores p<0.05.
En la comparación de medias de factores, en la temperatura (temp) se
observan diferencias significativas entre el nivel 1, 2 y 3 siendo significativamente
mayor el nivel 2 que corresponde a la temperatura igual a 30 ºC. p<0.05.
En la interacción temperatura y velocidad de agitación (30 ºC y 200 rpm), Es
significativamente diferente a las demás interacciones y, proporcionó los mejores
resultados 2.31 g/L de Biomasa.
55
7.5. Prueba de susceptibilidad Bt AC1 vs Culex sp
Cuadro 16. Prueba de susceptibilidad de larvas de mosquitos Culex sp con BtiAC
Medio No. de larvas muertas % de mortalidad de larvas
R1 R2 R3 R4 R5
Control 0 0 0 0 0 0
Medio LB 10 10 10 10 10 100±0
Melaza 10 10 10 10 10 100±0
Suero de leche 10 10 10 10 9 98±0.5
Remojo de maíz 10 10 9 10 9 96±0.57
Se obtuvo buen resultado de mortalidad de larvas con las concentraciones de
1x108 UFC/mL de los medios de cultivo: Medio LB (100%), medio con melaza
(100%), remojo de maíz (98%) y suero de leche (96%). El tiempo promedio de la
muerte de las larvas fue de 3 h en todos los medio de cultivo. Despues de las 24 h se
obtuvo un porcentaje de mortalidad de 100% en el medio comercial LB y el medio
con melaza. El segundo mejor fue el medio suero de leche, con una mortalidad del
98%. En 96% de larvas muertas tuvo el medio de remoho de maíz.
Sin embargo, en el análisis estadístico arroja que no existe difrencias
significativas entre los tratamientos comparados. Para esto se realizo un análisis de
varianza y las medias de los tratamientos fueron comparadas con la prueba de Tukey
con un p<0.05.
56
VIII. DISCUSIÓN
La producción de Bti como bioinsecticida es realizado en medios derivados de
diversas fuentes de nutrientes. Prabhakaran y Balaraman (2008) utilizan materias
primas disponibles localmente, como la harina de soya, polvo de torta de cacahuete y
extracto de salvado de trigo en fermentadores de 100 L. La esporulación, toxicidad y
biomasa del cultivo se realizó satisfactoriamente en los tres medios de cultivo.
En los estudios de fermentación a nivel matraz, con una cepa de Bti con clave
BtiAC y los medios de cultivo melaza, suero de leche y remojo de maíz como medios
de cultivos económicos, determinando las concentraciones óptimas para la
producción del complejo espora/cristal, tomando como parámetros la Biomasa g/L y
UFC/mL, encontramos que en el crecimiento alcanzado con el medio melaza tuvo un
rango de 1x108 UFC/mL a 0.8x108 UFC/mL y una Biomasa de 2 a 2.24 g/L en 72 h.
Este rendimiento de biomasa es similar al de Prabakaran et al., (2008), quienes
obtuvieron 2.5 g/L pero en la producción de esporas ellos obtuvieron grandes
cantidades de 1x1011esporas/mL a nivel fermentador.
Por otro lado, de acuerdo al análisis estadístico factorial 23 que se llevo acabo
con las variables temperatura (25, 30 y 35 °C) y agitación (150, 200 y 250 rpm), las
mejores condiciones del cultivo para el crecimiento de la bacteria Bti fue de: 30 ºC y
200 rpm, el pH siempre se trató de mantener constante a pH=7, Estos resultados son
semejantes a los reportado por Prabakaran et al, (2008) con una velocidad de
agitación de 180 rpm.
En cuanto al contenido de azúcares residuales en el medio de melaza, este
aumentó conforme se fueron incrementando las concentraciones del medio. En el
medio que contenía 3 g/L, al final de las 72 h se obtuvo una concentración de
azúcares reductores totales de 0.7 g/L, en el medio 6 g/L de 2.55 g/L y en el 9 g/L. La
concentración de azúcares reductores totales fue de 5.87 g/L. La bacteria no alcanzó
a consumir en su totalidad esta fuete de carbono, esto concuerda con observaciones
de Berbert-Molina (2008) quien realizó cinéticas de crecimiento con Bacillus
thuringiensis var israelensis utilizando diferentes concentraciones de glucosa en el
57
medio S0=10 g/L y S0=152 g/L, obteniendo como resultado mejor rendimiento en el
sustrato que contenía 10 g/L.
La concentración obtenida de UFC/mL en el medio de cultivo a base de remojo
de maíz fue de 1.98 g/L a 2.33 g/L de Biomasa, con una concentración de UFC/mL
de 3x106 UFC/mL. Al respecto Yezza y colaboradores en el 2005 reportaron una
concentración de 1x108 UFC/mL y 2.5 g/L de Biomasa en fermentador con un medio
de almidón proveniente residuos de la industria.
Las concentraciones de Bti obtenida en el medio de suero de leche fueron: 2.1
g/L y 1x106UFC/L a 7x106 UFC/mL con condiciones de 30 ºC y 200 rpm, El-Bendary
et al. (2007) realizaron un trabajo en el que los resultados fueron a nivel matraz: 30
ºC y 150 rpm obteniendo de 4.3x107 UFC/mL en 72 h.
Finalmente, el mejor medio fue melaza con 6 g/L y las mejores condiciones
fueron: 30 ºC 200 rpm y pH=7, Estos valores son similares a los que reporta la
literatura para el crecimiento de Bti. Validando en esto nuestro proceso de
producción de esporas-cristal de Bti a nivel matraz (Zhuang, L., S. Zhou, et al. 2011).
En el bioensayo realizado con el bioformulado obtenido de cada uno de los
medios de cultivos, demostró que en los tres medios se tuvo una concentración de
1x108 UFC/mL cantidad suficiente para presentar una mortalidad del 100% de larvas,
por lo que fue posible obtener un bioinsecticida con toxicidad para Culex spp.
58
IX. CONCLUSIONES
Con los medios melaza, remojo de maíz y suero de leche fue posible sumistrar
a Bti una fuente de carbono, de subproductos de la industria agroalimentaria
regional, se puede concluir que la bacteria Bti crecio satisfactoriamente y
produjo concentraciones aceptables de espora-cristal 1x108 UFC/mL para
cumplir los estándares de un bioinsecticida.
De las tres concentraciones utilizadas en cada uno de los medio de cultivo, el
punto óptimo se encuentra entre los valores 3 g/L y 6 g/L, en el caso de
melaza, y de 5 g/L a 10 g/L en medio con suero de leche, y en el remojo de
maíz la concentración de almidón debe ser lo que proviene de la molienda y
del proceso de gelificación.
Las mejores condiciones para el crecimiento de Bti fue: medio melaza 6 g/L, a
30 ºC, 200 rpm y pH=7. En matraces agitados de 500 mL con volumen de
medio de 200 mL.
Cuando la concentración de los medios: melaza y suero de leche es alta (9 g/L
y 15 g/L) el crecimiento de la bacteria se vio afectado por el potencial hidrico.
De acuerdo al bajo costo de la materia prima, la productividad de biomasa de
Bti y el pretratamiento de los medios, el mejor medio fue la melaza a una
concentración de 6 g/L, produciendo 2 g/L de BioM en 30 h y 1x108 UFC/mL
El complejo espora/cristal obtenido de los medio de cultivo fue efectivo para el
control del mosquito Culex sp a concentración de 1x108 UFC/mL, con un
porcentaje de mortalidad de larvas de 100% en 24 h.
59
X. BIBLIOGRAFÍA
Abdelnour-Esquivel, A., Escalant, J. V., & CATIE, Turrialba. (1994). Conceptos
Básicos del Cultivo de Tejidos Vegetales. CATIE.
Agüera, M. M., Alves, S. B., Arcas, J., Benintende, G., Brehelin, M., Boemare, N., &
Henry, S. S. (1996). Microorganismos patógenos empleados en el control
microbiano de insectos plaga.
Aizawa, K. (2001) Shigetane Ishiwata: His Discovery of sotto-kin (Bacillus
thutingiensis) in 1901 and subsecuent investigations in Japan. Procceedings of
a Centenial Symposium Commemorating Ishiwata’s Discovery of Bacillus
thuringiensis. Kurume, Japan. pp. 1-14.
Amicarelli, A., di Sciascio, F., Álvarez, H., & Ortiz, O. (2006). Estimación de Biomasa
en un proceso Batch: Aplicación a la producción de-endotoxinas de Bt. In XXII
Interamerican congress of chemical engineering.
Amicarelli, A., di Siascio, F., Álvarez, H., & Ortiz, O. (2006). Modelado de la dinámica
de oxigeno disuelto en el proceso de producción de∂-endotoxinas de Bt.
Ariza, B. y González, L. (1997). Producción de Proteína Unicelular a partir de
levaduras de melaza de caña de azúcar como sustrato. Tesis de pregrado
Bacteriología. pp 22-27.
Badii, M. H., Flores, A. E., Foroughbakhch, R., Quiróz, H., & Torres, R. (1996).
Ecología de manejo integrado de plagas (mip) con observaciones sobre
control microbiano de insectos. Avances Recientes en la Biotecnología en
Bacillus Thuringiensis. Ciencia, Universitaría, (2), 21-49.
Badui D. S. (2006). Química de los alimentos. 4ta edición. Pearson Educación,
México. pp 81 – 92 y 603 – 629.
60
Baker, K. y Cook, R. (1989). The nature and practice of biological control of plan
pathogens. Minnesota, USA. The American Phytopathological Society (APPS).
Basanta, R., Delgado, M. G., Martínez, J. C., Vázquez, H. M., & Vázquez, G. B.
(2007). Sostenibilidad del reciclaje de residuos de la agroindustria azucarera:
una revisión sustainable recycling of waste from sugarcane agroindustry: a
review. cyta-Journal of Food, 5(4), 293-305.
Becerra J. 1992. Proyecto: Estudio de los zancudos picadores que se encuentran en
el distrito capital de Santafe de Bogotá. Secretaria de Salud, Subdirección de
Vigilancia Epidemiológica. Santafe de Bogotá. pp 34.
Bello, D. G., Carrera, B., Días, Y., 2006. Determinación de azucares reductores
totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido
3,5-dinitrosalisílico. Sobre los derivados de la caña de azúcar. pp. 45-50.
Berbert, M.M., A. Prata, A.M.R, Pessanha LG, Silveira MM (2008). Kinetics of
Bacillus thuringiensis var. israelensis growth on high glucose concentrations. J
Ind Microbiol Biotechnol 35:1397–1404.
Bravo A., Likitvivatanavong S., Gill S., and Soberón M. (2011). Bacillus thuringiensis:
A story a successful bioinsecticide. Insect Biochemistry and Molecular 41. pp.
423-431
Bravo, A., Supaporn, L., Sarjeet S., Soberón, M., (2011) Bacillus thuringiensis: A
story of a successful bioinsecticide, Insect Biochemistry and Molecular Biology,
Volume 41, Issue 7, July 2011, pp 423-43.
Brawer, H. (1987). Development and Efficiency of a New Generation of Bioreactors.
Part 1. Bioprocess Eng. 2:149-159.
Brisola, C.M., Santos L.G., Lozovei A. (2001). Ecology of phlebotomine sandflies
(Diptera, Psychodidae) in Brazilian Atlantic Forest. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical 2001; pp 34(3):255-60.
61
Castro, M. (1993). Estudio de la melaza de caña como sustrato de la fermentación
acetobutílica. Tesis Pregrado ingeniería química. Universidad Nacional de
Colombia. Facultad de Ingeniería. Bogotá, Colombia. pp 3-35.
Castro, M. (1993). Estudio de la melaza de caña como sustrato de la fermentación
acetobutilíca. Colombia. Pp 3-35.
Cepeda J. (1999). Química de suelos. México. Editorial Trillas. pp. 167
Clements A.N. 1992. The biology of mosquitoes. Development, nutrition and
reproduction, Chapman and Hall, London. pp 10-55.
Desneux, N., Wajnberg, E., Wyckhuys, K. A., Burgio, G., Arpaia, S., Narváez-
Vasquez, C. A.,. & Urbaneja, A. (2010). Biological invasion of European tomato
crops by Tuta absoluta: ecology, geographic expansion and prospects for
biological control. Journal of Pest Science. pp 197-215.
Devine, G.J., Furlong, M.J., (2007). Insecticide use: contexts and ecological
consequences. Agr. Hum. Values 24, 281306.
Doran, P.M. (1995). Bioprocess Engineering Principles. San Diego. Academic Press.
Elósegui Claro, O., & Elizondo Silva, A. I. (2010). Evaluación microbiológica in vitro
de mezclas de especies de hongos entomopatógenos ingredientes activos de
bioplaguicidas cubanos. Fitosanidad, 14(2), pp 103-109.
Emmert and Handelsman, (1999). E.A.B. Emmert and J. Handelsman, Biocontrol of
plant disease: a (Gram-) positive perspective, FEMS Microbiol.
Lett.171 (1999), pp. 1–9.
Enshasy, H.A., Mohamed, N.A., Farid M.A., A.I. (2008). El-Diwany, Improvement of
erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea in molasses based
medium through cultivation medium optimization, Bioresource.
Escobar, J. M., Pardo, E. M., Buitrago, G., & López, L. A. (2004). Análisis exploratorio
para la optimización de un medio de cultivo para la fermentación de Bacillus
62
thuringiensis Exploratory analysis for the optimization of culture media for
Bacillus thuringiensis fermentation. Revista colombiana de biotecnologia, 6(2),
pp 43-53.
Fernández, C., & Juncosa, R. (2002). Biopesticidas: la agricultura del futuro.
Phytoma, 141, 14-19.
Fernández, M. D. C. (2007). Aspectos bioecológicos de importancia para el control
de Aedes aegypti y otros culícidos en el ecosistema urbano. Instituto de
Medicina Tropical “Pedro Kourí”.
Financiera Rural, (2011). Monografía de la caña de azúcar, Dirección General
Adjunta de Planeación Estratégica y Análisis Sectorial Dirección Ejecutiva de
Análisis Sectorial.
Forattini O, Kakitani I, La corte dos santos R, Kobayashi K, ueno H, Fernandez
Forattini O.P., (1965). Entomología médica. Editora da Universidade de Sao Paulo,
Sao Paulo.
French, E. R., & Hebert, T. T. (1982). Métodos de investigación fitopatológica (Vol.
43). Lica.
Galindo, E., Peña, C., & Serrano-Carreón, L. (2007). Domesticar microorganismos en
un biorreactor: los retos del bioingeniero. Una ventana al quehacer científico
(Instituto de Biotecnología de la UNAM).
Ghribi D, Zouari N, Hassen T, and Jaoua S. (2007). Improvement of Bacillus
thuringiensis delta-endotoxin through adequate control of aeration. Enzyme
and Microbial Technology 40. pp 614-622.
Godoy, R., & Universidad Nacional de Colombia Departamento de Ingeniería
Química. (2002). Método DNS para la determinación de azúcares reductores
totales en melaza, sustrato de fermentación y vinos. Manual de métodos
analíticos.
63
Guigon, B., Thonnelier B., Duzan, B., Felix, F. (1989). Pour valoriser les analyses de
sol. pp 134:3-88.
Hernández, B.C. (2003). “Crecimiento y formación de productos en cultivos aeróbicos
y anaeróbicos de Bacillus subtilis con glucosa, xilosa y celobiosa” “tesis de
licenciatura”, Instituto Tecnologico de Zacatepec.
Hoyos, R. C., López, T. T., Villarreal, F. C., Lucatero, A. P., González, M. A., &
Coutiño, B. L. (2006). Concepciones culturales sobre el dengue en contextos
urbanos de México. Rev Saude Publica, 40(1), pp 126-33.
Ibarra, J. E. (2005). Las bacterias y su uso en el control biológico: XVI Concurso
nacional de control biológico. Sociedad de Mexicana de control Biológico. Edit.
Ibarra Rendón y Del Rincón Castro. Guanajuato México. pp. 15.
Iriarte, J. and Caballero, P. (2001). Biologia y ecología de Bacillus thuringiensis
bioinsecticidas; fundamentos y aplicaciones de Bacillus thuringiensis en el
control integrado de plagas.
Jackson, M L. (1970). Análisis químico de suelos. Barcelona, España. Omega. pp
662.
James, Y. (1985). Fluid Mixing Technology. Ed. Mc Graw Hill. New York.
Khachatourians, G G. (1986). Production and use of Biological Pest Control Agents.
Trends Biotechnol. 4(5): 120-124.
Khanh Dang Vu, R.D. Tyagi, R.Y. Surampalli, J.R. Valéro, Mathematical relationships
between spore concentrations, delta-endotoxin levels, and entomotoxicity of
Bacillus thuringiensis preparations produced in different fermentation media,
Bioresource Technology, Volume 123, November 2012, Pages 303-311, ISSN
0960-8524, 10.1016/j.biortech.2012.07.110.
Kunstler., (1952). Te Genus Giardia. (Mastigophora: Octomitidae). I. Sinoptyc list of
known and four new species. 27(4). pp 421-79.
64
Magda, A. El-Bendary, Maysa, E. Moharam, M.S. Foda, (2008) Efficient
mosquitocidal toxin production by Bacillus sphaericus using cheese whey
permeate under both submerged and solid state fermentations, Journal of
Invertebrate Pathology, Volume 98, Issue 1, May 2008, Pages 46-53, ISSN
0022-2011, 10.1016/j.jip.2007.12.004.
Marina F.S. Cartaxo, Constância F.J. Ayres, David Weetman, (2011). Loss of genetic
diversity in Culex quinquefasciatus targeted by a lymphatic filariasis vector
control program in Recife, Brazil, Transactions of the Royal Society of Tropical
Medicine and Hygiene, Volume 105, Issue 9, September 2011, Pages 491-
499, ISSN 0035-9203.
Mark M. Stevens, Peter A. Hughes, Jianhua Mo, (2013) Evaluation of a commercial
Bacillus thuringiensis var. israelensis formulation for the control of chironomid
midge larvae (Diptera: Chironomidae) in establishing rice crops in south-
eastern Australia, Journal of Invertebrate Pathology, Volume 112, Issue 1, pp
9-15.
Martínez, K.T., (2007) Optimizacion de la etapa de hidrolisis ácida en el proceso de
fosfatacion de almidon por extrusión para el encapsulado de aceite esencial de
naranja. Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo.
McGAVIN G., (2002). Essential Entomology. An order-by-order. Oxford University
Press. pp 697
Miller, G. (1989). Use of Dinitrosalisyc Acid Reagent for determination of reducing
sugar. Analytical Chemistry. 31:426-428.
Mohammedi, S. Bala Subramanian, S. Yan, R.D. Tyagi, J.R. Valéro, (2006) Molecular
screening of Bacillus thuringiensis strains from wastewater sludge for
biopesticide production, Process Biochemistry, Volume 41, Issue 4, April 2006,
pp 829-835.
Monod, J. (1949). The Growth of Bacterial Cultures. Annual Review of Microbiology,
v. 3, pp 371.
65
Pirt. S. J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwel l Scientific
Publications.
Prabakaran G. and Balaraman K. (2006) Development of a cost-effective medium for
the large scale production of Bacillus thuringiensis var israelensis. Biological
control, 36. pp 288-292.
Prabakaran, G., Hoti, A.M., Manonmani., Balaraman. (2008) Coconut water as a
cheap source for the production of endotoxin of Bacillus thuringiensis var.
israelensis, a mosquito control agent. Biological Control, 105. pp 35-38.
Quintero, R. (1981). Ingeniería Bioquímica. Edit. Alhambra Mexicana. México.
Ramos, F., Carmona A., Beres, M. y Méndez N. (2004). Evaluación de aislamiento de
Bacillus thuringiensis tóxicos a diarrea saccharalis. Bioagro. 16:3:333-310.
Raymond, B., Johnston, P.R., Nielsen-LeRoux, C., Lereclus, D., Crickmore, N.,
(2010). Bacillus thuringiensis: an impotent pathogen? Trends Microbiol. 18,
189194.
Rosas-García, N. M. (2008). Avances en el desarrollo de formulaciones insecticidas a
base de Bacillus thuringiensis. Revista Colombiana de Biotecnología, 10(1), pp
49-63.
Routh, J. Eyman, D. Burton, D. (1990). Compendio Esencial de Química General,
Orgánica y Bioquímica, tomos I y II. Segunda Edición. Editorial Reverté.
Bogotá, Colombia. 78-81p.
Saña J, J More, A Cohi. (1996). La gestión de la fertilidad de los suelos. Ministerio de
Agricultura, Pesca y Alimentación. Madrid, España. pp 277.
Sauka, D. H. y Benintende, G. H. (2008) Bacillus thuringiensis: generalidades. Un
acercamiento a su empleo en el biocontrol de insectos lepidópteros que son
plagas agrícolas. Instituto nacional de tecnología agropecuaria. Revista
Argentina de Microbiologia 40:124-140.
66
Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, et al. (1998). Bacillus
thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev 62: 775–
806.
Sébastien Boyer, Margot Paris, Sylvaine Jego, Guy Lempérière, Patrick Ravanel,
(2012) Influence of insecticide Bacillus thuringiensis subsp. israelensis
treatments on resistance and enzyme activities in Aedes rusticus larvae
(Diptera: Culicidae), Biological Control, Volume 62, Issue 2, August 2012, pp
75-81, ISSN 1049-9644.
Segundo Seminario de Ciencias Básicas Biomédicas. (2011). Actual Biol, 34(96),
133-176.
Shahbazi, A., Mims, M., Li, Y., Ibrahim, S.A., Vest, S., Morris, A., (2005).
Performance of immobilized bifido bacteria in converting lactose to lactic acid.
Appl. Biochem. Biotechnol. pp 529–540.
Siso, M.I.G., (1996). The biotechnological utilization of cheese whey: a review.
Biores. Technol. 57, 1–11.
Soulsby, E.J.L. (1987). Parasitología y enfermedades parasitarias en los animales
domésticos. 7ma ed., pp 308-311. Ed. Interamericana. México.
Stanbury, P. F.; Whitakeer, A. y Hall, S. J. (1995). Principles of Fermentation
Technology. 2d ed. New York: Elsevier Science Ltd.
Travi B, Montoya J. (1994) Manual de entomología médica para investigadores de
América Latina. Cali, Colombia: Cideim; pp 90-142.
Viedma M., Baragaño J. Notario A., (1985). Introducción a la entomología. Ed.
Alambra. pp 61-74.
Wang Daniel, I. C., Cooney Charles, L., Demain Arnord, L. (1979). Fermentation and
enzyme technology. Wiley – Interscience publication John Wiley & Sons, New
York. 57, pp 178 - 374.
67
Wirth, MC, A. Delécluse , y WE. Walton. (2001). Cyt1Ab1 y Cyt2Ba1 de Bacillus
thuringiensis subsp. israelensis y subsp.medellin sinergizar Bacillus sphaericus
contra el Aedes aegypti y resistente Culex quinquefasciatus (Diptera:
Culicidae). Appl. Environ. Microbiol . 67. pp 3280 a 3284.
Z., (2000). Potencial sinantropito de mosquitos Kertesia e Culex (Díptera
Culicidae) o Sudeste do Brasil. Rev Saúde Pública, 34 565-9
Zhuang, L., S. Zhou, et al. (2011). Mosquito biolarvicide production by sequential
fermentation with dual strains of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis and
Bacillus sphaericus using sewage sludge. Bioresource Technology 102(2):
1574-1580.
68
XI. ANEXO I
Análisis estadístico sistema SAS
DATA objetivo 1; INPUT temp agitac biomasa inter; CARDS;
1 1 1.789 1 1 1 1.783 1 1 2 2.104 2 1 2 2.095 2 1 3 1.801 3 1 3 1.807 3 2 1 1.894 4 2 1 1.901 4 2 2 2.31 5 2 2 2.261 5 2 3 1.934 6 2 3 1.915 6 3 1 1.9012 7 3 1 1.87 7 3 2 1.979 8 3 2 1.972 8 3 3 1.713 9 3 3 1.72 9
; PROC GLM; CLASS tem agitacion INTER; MODEL biomasa=tem agitación inter; MEANS tem agitacion INTER/TUKEY; RUN;
69
Sistema SAS
Procedimiento GLM
Información del nivel de clase
Clase Niveles Valores
temp 3 1 2 3
Agitación 3 1 2 3
inter 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Número de observaciones 18
Variable dependiente: Biomasa
Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F
Modelo 8 0.48486102 0.06060763 270.34 <.0001
Error 9 0.00201772 0.00022419
Total correcto 17 0.48687874
R-cuadrado Coef Var Raiz MSE biomasa Media
0.995856 0.775598 0.014973 1.930511
Cuadrado
Fuente DF Tipo I SS de la media F-Valor Pr > F
temp 2 0.10400880 0.05200440 231.96 <.0001
Agitación 2 0.32885667 0.16442834 733.43 <.0001
inter 4 0.05199554 0.01299889 57.98 <.0001
70
Prueba del rango estudentizado de Tukey (HSD) para biomasa
Alfa 0.05
Error de grados de libertad 9
Error de cuadrado medio 0.000224
Valor crítico del rango estudentizado 3.94850
Diferencia significativa mínima 0.0241
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tukey Agrupamiento Media N temp
A 2.035833 6 2
B 1.896500 6 1
C 1.859200 6 3
Prueba del rango estudentizado de Tukey (HSD) para biomasa
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tukey Agrupamiento Media N Agitación
A 2.120167 6 2
B 1.856367 6 1
C 1.815000 6 3
71
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Tukey Agrupamiento Media N inter
A 2.28550 2 5
B 2.09950 2 2
C 1.97550 2 8
D C 1.92450 2 6
D 1.89750 2 4
D 1.88560 2 7
E 1.80400 2 3
E 1.78600 2 1
F 1.71650 2 9