DIPARTIMENTO DI MEDICINA SPERIMENTALE

SEZIONE DI FISIOPATOLOGIA MEDICA ED ENDOCRINOLOGICA

DOTTORATO DI RICERCA

In

BIOTECNOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE UMANA XXVI ciclo

“INVECCHIAMENTO OVOCITARIO UMANO: PARAMETRI STRUTTURALI ED ULTRASTRUTTURALI”

Relatore: Prof.ssa Giulietta Micara Candidato: Correlatore: Dott.ssa Claudia Boninsegna Prof.ssa Stefania Annarita Nottola

Anno Accademico 2012/2013

1

Indice 1. Introduzione .....................................................................................................................2

Ovogenesi e follicologenesi................................................................................................5 Struttura dell’ovocita maturo............................................................................................20 Valutazione morfologica dell’ovocita...............................................................................22 Invecchiamento riproduttivo.............................................................................................27 Tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA) ..................................................30

2. Scopo del lavoro .............................................................................................................33 3. Materiali e metodi ..........................................................................................................36

3.1 Stimolazione ovarica ..................................................................................................38 3.2 Pick-up ovocitario ......................................................................................................39 3.3 Recupero degli ovociti................................................................................................40 3.4 Microscopia a contrasto di fase...................................................................................40 3.5 Microscopia ottica ed elettronica ...................................................................................40

3.5.1 Processamento degli ovociti.................................................................................41 3.5.2 Analisi dei parametri morfologici ........................................................................43

4. Risultati ..........................................................................................................................47 Gruppo <35......................................................................................................................49 Gruppo <35c ....................................................................................................................50 Gruppo ≥35 ......................................................................................................................52

Gruppo ≥35c ....................................................................................................................53 4.1 Risultati dell’analisi statistica .....................................................................................55 Aggregati M-SER ............................................................................................................56 MVC................................................................................................................................57 CG ...................................................................................................................................57 Mv ...................................................................................................................................58 ZPt ...................................................................................................................................58

5. Discussione......................................................................................................................60 M-SER e MVC ................................................................................................................63 Lisosomi ..........................................................................................................................70 Granuli corticali ...............................................................................................................70 Microvilli .........................................................................................................................73 Zona pellucida..................................................................................................................74

6. Conclusioni .....................................................................................................................76 7. Bibliografia.....................................................................................................................78

2

1. Introduzione

3

Con il termine “infertilità” si definisce l’incapacità di una coppia di concepire dopo

un anno o più di rapporti sessuali regolari non protetti (Zegers-Hochschild et al.,

2009).

L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) riporta la presenza, nel mondo, di

circa 80 milioni di coppie infertili. Questo dato risulta presumibilmente sottostimato

in quanto si riferisce quasi esclusivamente ai Paesi in cui le statistiche sono

disponibili. Poiché nei Paesi industrializzati la prevalenza delle coppie infertili è

passata dal 6-7% degli anni '60 al 15-20% attuale, si può ipotizzare che i fattori

socio-ambientali siano in grado di interferire con le problematiche biologiche. A

conferma di ciò, l’analisi dei flussi migratori dimostra come le popolazioni

immigrate, da aree a sviluppo modesto a quelle più industrializzate, rapidamente

assumano un pattern riproduttivo analogo a quello del Paese ospite.

Tra le molteplici cause di ordine socio-ambientale, certamente i due principali fattori

coinvolti sono rappresentati dal ritardo nel programmare la gravidanza e

dall’inquinamento ambientale. Nel corso degli ultimi decenni si è assistito ad un

progressivo aumento dell’età della donna nel programmare la prima gravidanza (dai

24 anni degli anni ’60-’70 ai 31 della fine del XX secolo) (Ubaldi et al., 2009). Le

cause sono diverse e comprendono una serie di condizioni che portano a ritardare la

gravidanza, desiderando di raggiungerla solo nel momento in cui altre situazioni

pratiche siano interamente soddisfatte. La disponibilità dei metodi contraccettivi a

partire dagli anni sessanta, insieme al crescente benessere economico, ha fornito alle

donne l’opportunità di aumentare il loro livello di educazione e di partecipare alla

forza lavoro (te Velde and Pearson, 2002) permettendo loro di raggiungere un ruolo

sociale, con possibilità lavorative e di carriera, sovrapponibili a quelle del coniuge.

4

Inoltre è cambiato il valore in senso sociale del concetto di famiglia numerosa ed è

sempre più comune la condizione prolungata dello status di single o della coppia non

stabilizzata. Probabilmente anche i massmedia, enfatizzando il concetto di potenza

della scienza e della medicina, svolgono un importante ruolo nel trasmettere

messaggi distorti di potenzialità riproduttive al di là di qualsiasi condizione

biologica, tranquillizzando falsamente le coppie sul loro futuro riproduttivo (Ubaldi

et al., 2009; Broekmans et al., 2009).

I fattori sopra esposti hanno contribuito molto alla riduzione dei tassi di fertilità

complessivi (Total Fertility Rate, TFR), ovvero al numero medio di figli nati per

donna. In molti Paesi occidentali, soprattutto quelli del sud Europa, il numero medio

di figli stimato per famiglia è insufficiente per assicurare il ricambio della

popolazione. I TFR in Italia (1,33), Spagna (1,32) e Grecia (1,29) sono i più bassi di

tutta l’Europa (Eurostat, 2006). In termini più ampiamente demografici, le stime

OMS fanno intravedere una proiezione caratterizzata da un decremento sia dei tassi

di fertilità e natalità che di quelli di mortalità. Si stima che queste due opposte

tendenze condurranno, nel 2050, ad un tasso di crescita complessiva che sarà 1/3

rispetto a quello di un secolo prima (0,48% vs 1,78%).

La popolazione risulterà così prevalentemente costituita da persone al di sopra dei 50

anni di età (Lutz et al., 2003; Lutz, 2006; Gallo et al., 2006; Ziebe and Devroey,

2008) e tali cambiamenti demografici avranno drastiche implicazioni economiche e

sociali.

L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è

determinata dalla graduale diminuzione, che si verifica con l’età, sia nella quantità

che nella qualità dei gameti femminili, gli ovociti (te Velde and Pearson, 2002).

5

Ovogenesi e follicologenesi

L’ovogenesi è l’insieme dei processi che conducono alla formazione degli ovociti.

Essa si svolge nelle ovaie, dove le cellule germinali si associano con cellule

somatiche (cellule follicolari) a formare i follicoli ovarici (Le Moigne and Foucrier,

2004). Gli ovociti subiscono processi di sviluppo lunghi e attentamente regolati come

risultato delle interazioni paracrine e giunzionali con le circostanti cellule follicolari.

Il dialogo tra l’ovocita e le cellule follicolari permette lo scambio di molteplici

segnali regolatori che controllano il metabolismo ovocitario, il rimodellamento del

citoscheletro e la progressione del ciclo cellulare, processi chiave per la fecondazione

ed i primi stadi dell’embriogenesi (Albertini, 1992).

Le ovaie sono organi pari altamente complessi sia nella struttura che nella fisiologia.

Ciascun ovaio misura circa 3 cm di lunghezza, 1,5 cm di larghezza e 1 cm di

spessore ed è costituito da una zona periferica, il cortex, e da una zona interna, la

medulla. Nel tessuto connettivo della medulla si trovano nervi, vasi linfatici e molti

vasi sanguigni. Nel cortex sono immersi i follicoli in vari stadi di sviluppo (Monesi,

2002). Associati ai follicoli in crescita si trovano numerosi capillari (Macchiarelli et

al., 1992).

L’ovogenesi include eventi importanti tra cui la formazione e la proliferazione delle

cellule germinali, l’avvio della meiosi e l’immagazzinamento di sostanze necessarie

per la fecondazione e per le prime fasi dello sviluppo embrionale (Makabe et al.,

1991; Gosden, 1995; Motta et al., 1995).

Nell’embrione le cellule che daranno origine ai gameti femminili (cellule germinali

primordiali, Primordial Germ Cells, PGCs) sono riconoscibili, per la prima volta,

6

alla 3a settimana di sviluppo, nella parete dorsale del sacco vitellino, in prossimità

dell’allantoide in via di sviluppo (Witschi, 1984). Da questa regione, tra la 4a e la 5a

settimana le PGCs migrano, proliferando attivamente, verso le creste genitali (gli

abbozzi delle gonadi che diventeranno poi ovaie), raggiungendole tra la 5a e la 6a

settimana (Fukuda, 1976; Hoang-Ngoc Minh et al., 1993; Jansen and de Boer, 1998).

La principale caratteristica citoplasmatica delle PGCs è l’estrema scarsità degli

organelli. Sono presenti mitocondri, cisterne di reticolo endoplasmatico rugoso,

ribosomi e polisomi, un singolo complesso del Golgi, occasionali gocce lipidiche,

fasci di microfilamenti e di microtubuli ma solo il glicogeno è presente in quantità

cospicue, accumulandosi soprattutto all’inizio della migrazione (Fukuda, 1976;

Fujimoto et al., 1977; Makabe and Motta, 1989; Makabe et al., 1989; Makabe et al.,

1991; Hoang-Ngoc Minh et al., 1993). La migrazione delle PGCs avviene tramite

movimenti ameboidi grazie alla presenza di fasci di microfilamenti nei processi

citoplasmatici (Motta et al., 1995).

Nel periodo di migrazione delle PGCs ha inizio il differenziamento delle creste

genitali in ovaie. Questo sembra essere il pathway di default in quanto le creste

genitali con cariotipo XY si differenziano in testicoli sotto l’influenza del gene Y-

linked SRY. L’assenza del gene SRY nelle creste genitali XX ne determina lo

sviluppo in ovaie (Bowles and Koopmann, 2010).

Verso la 9a settimana post-fecondazione, le PGCs cominciano a differenziarsi in

ovogoni, che presentano un’alta attività mitotica caratterizzata da citochinesi

incompleta, per cui gli ovogoni derivanti dalla stessa cellula germinale primordiale

rimangono collegati da ponti citoplasmatici e si dividono in modo sincrono. Queste

cellule collegate tra loro sono dette “nidi” o “cisti” (Pepling, 2006; Motta et al.,

7

2000) e si trovano associate con le cellule follicolari in via di sviluppo nella regione

corticale dell’ovaio. Tra questi due tipi cellulari si stabiliscono giunzioni cellulari

primitive simili a desmosomi (Sathananthan et al., 2006).

Gli ovogoni presentano pochi organelli, dispersi in tutto il citoplasma. I mitocondri

risultano essere i più abbondanti; il loro numero è raddoppiato rispetto a quello delle

PGCs. Talvolta i mitocondri entrano in stretta relazione spaziale con le membrane

del reticolo endoplasmatico liscio, formando strutture che diventeranno tipiche delle

fasi finali di maturazione (Baker and Franchi, 1967; Gondos et al., 1971; Dvorak and

Tesarik, 1980; Hoang-Ngoc Minh et al., 1993). In alcuni casi i mitocondri sono

riuniti in clusters in stretta associazione con una sostanza granulare elettrondensa

contenente RNA e/o proteine. Questa sostanza, morfologicamente simile al materiale

del nucleolo, è stata definita corpo nucleolo-simile, granuli nucleolari, sostanza

intermitocondriale o, più comunemente, nuage (Kellokumpu-Lehtinen and

Soderstrom, 1978; Van Blerkom and Motta, 1979; Dvorak and Tesarik, 1980; Eddy,

1996). La presenza del nuage è stata associata alla potenzialità differenziativa

(Makabe et al., 2006a).

A partire dalla 12a settimana gli ovogoni cessano di proliferare ed entrano in meiosi,

diventando ovociti primari (ovociti I) (Gondos et al., 1986). L’ingresso in meiosi non

si realizza in modo sincrono per tutte le cellule germinali: mentre alcune hanno già

iniziato la meiosi, altre cellule continuano a moltiplicarsi per mitosi.

Il processo della meiosi consiste in due divisioni cellulari successive precedute da un

unico ciclo replicativo del DNA. Dopo la sua duplicazione, i 46 cromosomi risultano

costituiti da due cromatidi fratelli identici, tenuti insieme da una regione definita

centromero. Entrambe le divisioni meiotiche comprendono quattro stadi: profase,

8

metafase, anafase e telofase. La profase della prima divisione meiotica è

ulteriormente suddivisa in cinque sottofasi: leptotene, zigotene, pachitene, diplotene

e diacinesi. La prima divisione meiotica porta alla riduzione del numero

cromosomico da un assetto diploide ad uno aploide (divisione riduzionale), mentre la

seconda determina la separazione dei cromatidi fratelli (divisione equazionale).

Al contrario di quanto avviene nella meiosi maschile, in cui le divisioni cellulari

sono simmetriche e portano alla formazione di quattro gameti di uguali dimensioni,

nella meiosi femminile entrambe le divisioni cellulari sono caratterizzate da estrema

asimmetria, sia nelle dimensioni che nel destino delle cellule risultanti (Russel, 2004;

Li and Albertini, 2013) (Fig 1).

Le divisioni cellulari asimmetriche consentono la massima ritenzione del citoplasma

all’interno dell’ovocita: in seguito a ciascuna divisione si forma un grande ovocita ed

una cellula molto più piccola, detta corpo polare. I corpi polari, che non hanno alcun

ruolo funzionale, persistono durante le prime divisioni embrionali per poi degenerare

(Sathananthan et al., 2006; Li and Albertini, 2013).

La generazione di due cellule figlie di dimensioni differenti, a partire dalla cellula

madre, richiede un posizionamento asimmetrico del fuso meiotico, responsabile del

piano di clivaggio (Siller and Doe, 2009; Morin and Bellaiche, 2011).

Fig 1. Divisione asimmetrica dell’ovocita. Tratto da: Li and Albertini, 2013.

9

Una volta entrati in meiosi, gli ovociti I progrediscono attraverso la profase della

prima divisione meiotica, ma si arrestano allo stadio di diplotene, nel quale possono

rimanere anche 40 anni o più, fino a quando non sono stimolati a riprendere la

meiosi.

A partire dalla 16a settimana gli ovociti I perdono le loro connessioni citoplasmatiche

e ciascuno di essi viene circondato da uno strato di cellule follicolari, dando origine

al follicolo primordiale (Motta et al., 2000; Makabe et al., 2006).

Significativo parametro dell’intensità del processo di follicologenesi è la densità dei

follicoli primordiali per unità di corticale ovarica. Alla 16ª settimana di sviluppo

sono presenti circa 3000 follicoli per mm3 e, a 20 settimane, questo valore è più che

raddoppiato, raggiungendo i 7000 follicoli per mm3. Dalla 26ª settimana la densità

inizia a decrescere ed alla nascita i follicoli primordiali, per mm3 di corticale ovarica,

sono circa 1400 (Forabosco and Sforza, 2007).

Basandosi sulle dimensioni, sulla morfologia delle cellule follicolari e sulla

formazione dell’antro (una cavità ripiena di liquido), i follicoli ovarici nel corso del

loro sviluppo possono essere classificati in primordiali, primari, secondari, terziari

(antrali) e di Graaf (maturi, preovulatori) (Fig 2) (Sànchez and Smitz 2012; Li and

Albertini, 2013).

L’aumento che si osserva nelle dimensioni e nella complessità dei follicoli è dovuto

soprattutto alla moltiplicazione delle cellule follicolari e all’accumulo di liquido

all’interno dell’antro. In ogni caso, anche gli ovociti si accrescono, sebbene

relativamente di poco. Durante questa fase l’ovocita sintetizza e accumula RNA e

proteine essenziali per un’appropriata crescita e maturazione, così come per lo

10

sviluppo in un embrione evolutivo (Moore and Lintern-Moore, 1978; Eichenlaub-

Ritter and Peschke, 2002).

Nel corso della vita fertile della donna, dal raggiungimento della maturità sessuale

fino alla menopausa, solo 400-500 ovociti completeranno lo sviluppo e verranno

ovulati, mensilmente (Sathananthan et al., 2006).

Fig 2. Sviluppo follicolare. Tratto da: Li and Albertini, 2013

A partire dalla pubertà, il sistema riproduttivo femminile dipende dal ripetersi ciclico

degli eventi di reclutamento follicolare, selezione di un singolo follicolo dominante,

ovulazione (rilascio dell’ovocita maturo dall’ovaio) e formazione del corpo luteo (la

struttura residuale del follicolo dopo l’ovulazione). Se non si verifica la fecondazione e

il successivo impianto dell’embrione nell’utero, il corpo luteo regredisce e si verifica la

mestruazione, dovuta alla desquamazione dell’endometrio, la mucosa di rivestimento

dell’utero (Fauser and Van Heusden, 1997; Buffet and Bouchard, 2001). Con il

termine “ciclo mestruale” si indicano gli eventi che si compiono nell’intervallo di

tempo che intercorre tra due mestruazioni successive. L’ovulazione avviene a metà di

questo ciclo: la fase preovulatoria è detta fase follicolare e quella successiva fase

luteale. I cicli mestruali durano in media 28 giorni e si verificano ininterrottamente

11

dalla pubertà alla menopausa (Le Moigne and Foucrier, 2004). Tale meccanismo

ciclico richiede il funzionamento integrato di ipotalamo, ipofisi e ovaie. Il generatore

pulsatile dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (Gonadotropin Releasing

Hormone, GnRH) all’interno dell’ipotalamo assicura il rilascio pulsatile, dall’ipofisi

anteriore, sia dell’ormone follicolo-stimolante (Follicle-Stimulating Hormone, FSH)

che dell’ormone luteinizzante (Luteinizing Hormone, LH) (de Koning et al., 2008).

Poco prima dell’inizio di ogni ciclo, la secrezione di gonadotropine ipofisarie

aumenta. Sotto l’influenza dell’FSH avviene il reclutamento di una coorte di piccoli

follicoli antrali FSH-sensibili (la crescita dei follicoli preantrali è indipendente

dall’FSH) (Li and Albertini, 2013; Gougeon, 1996; Fauser and Van Heusden, 1997;

Welt et al., 2001).

Mentre i follicoli crescono, sia le cellule della granulosa, sotto l’influenza dell’FSH,

che le cellule della teca interna, sotto l’influenza dell’LH, iniziano a produrre ormoni

steroidei. Le cellule della teca interna producono androgeni, che per diffusione

raggiungono le cellule della granulosa, dove vengono convertiti in estrogeni grazie

alla presenza dell’enzima aromatasi (Erickson et al., 1985, Monesi, 2002).

L’incremento graduale dei livelli di estrogeni in circolo ha diversi effetti. Gli

estrogeni esercitano un controllo a retroazione negativa sulla secrezione ipofisaria di

FSH ed LH, impedendo lo sviluppo di altri follicoli durante lo stesso ciclo. Allo

stesso tempo, gli estrogeni stimolano la produzione di altri estrogeni da parte delle

cellule della granulosa. Questa retroazione positiva permette ai follicoli di continuare

a secernere estrogeni nonostante la riduzione della stimolazione da parte dell’FSH e

dell’LH. Quando la fase follicolare si avvicina al termine, la secrezione ovarica degli

estrogeni raggiunge il picco. In questa fase del ciclo, solo un follicolo, detto follicolo

12

dominante, si sta ancora sviluppando ed inizia a secernere inibina e progesterone, in

aggiunta agli estrogeni. Gli estrogeni esercitano ora retroazione negativa. Di

conseguenza, la secrezione di LH aumenta notevolmente; questo fenomeno, detto

picco di LH, è essenziale per l’ovulazione. Anche l’FSH raggiunge un picco, ma più

basso, presumibilmente perché viene soppresso dall’inibina (Silverthorn, 2005).

La diminuzione dei livelli di FSH è essenziale per la selezione, all’interno della

coorte reclutata, del follicolo dominante, che progredirà nella crescita e verrà

ovulato. Questo processo è detto concetto della soglia/finestra di FSH (van Santbrink

et al., 1995).

Dopo l’ovulazione, il corpo luteo sopravvive per circa 12 giorni e produce quantità

crescenti di progesterone, estrogeni e inibina. Con la regressione del corpo luteo, il

crollo delle concentrazioni di progesterone, estradiolo e inibina consente la risalita

dei livelli di gonadotropine e l’avvio di un nuovo ciclo mestruale (Silverthorn, 2005;

Broekmans et al., 2009).

I follicoli primordiali sono considerati follicoli “quiescienti” in quanto non mostrano

cambiamenti morfologici fino al raggiungimento della maturità sessuale (Zamboni et

al., 1972). Si tratta di strutture tondeggianti del diametro di 55-75 µm, costituiti da un

ovocita di 30-40 µm allo stadio di diplotene, circondato da un singolo strato di cellule

follicolari di forma allungata e appiattita; esternamente è presente una sottile lamina

basale che separa il follicolo dal circostante stroma ovarico (Makabe et al., 2006).

Le cellule follicolari stabiliscono, tra di loro e con l’ovocita, sia giunzioni di

adesione (zonule aderenti e piccoli desmosomi), che assicurano il mantenimento

della struttura follicolare (Motta et al., 1971, 1994; Dvorak and Tesarik, 1980;

Stankova et al., 1985; Familiari et al., 1993), sia giunzioni di comunicazione, che

13

determinano la formazione di una sorta di sincizio funzionale (Ackert et al., 2001;

Epping, 1991; Kidder and Mhawi, 2002). Queste ultime, del diametro di 1,5 nm,

permettono infatti il passaggio di nutrienti (precursori metabolici, piccole molecole,

ioni) e di segnali regolatori (ormoni, fattori di crescita, secondi messaggeri) (Makabe

et al., 2006; Sathananthan et al., 2006) attraverso le membrane plasmatiche.

In questo stadio gli ovociti presentano una forma sferica o ovoidale e sono

caratterizzati da una superficie per lo più regolare e liscia; solo in alcune regioni

dell’oolemma sono presenti corti microvilli (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and

Tesarik, 1980; Hertig and Adams, 1967).

In posizione eccentrica nell’ooplasma è presente un nucleo voluminoso, definito

vescicola germinale (VG), contenente cromatina finemente dispersa, sebbene possa

essere osservata una iniziale condensazione in fibrille (Baca and Zamboni, 1967;

Dvorak and Tesarik, 1980; Hertig and Adams, 1967; Motta et al., 1997, 2003; Pozo

et al., 1990; Sathananthan et al., 2006). All’interno del nucleo è già avvenuto, in

tardo pachitene, il crossing-over, ossia lo scambio, tra cromosomi omologhi, di

segmenti di materiale genetico localizzati nella stessa posizione lungo il cromosoma.

Questo processo di ricombinazione genetica tra il DNA nucleare di origine materna e

quello di origine paterna, che consente la trasmissione alle generazioni successive di

un patrimonio genetico riarrangiato in maniera originale, è alla base della variabilità

genetica (Russell, 2004).

Durante la progressione nella prima profase meiotica, all’interno dell’ooplasma si

sono verificate due ridistribuzioni mitocondriali. La prima consiste nel passaggio

dalla distribuzione casuale del leptotene alla distribuzione perinucleare dello

zigotene, in cui i mitocondri si trovano distribuiti in una fila singola (o talvolta

14

doppia) intorno alla membrana nucleare. La seconda si verifica in diplotene, in

seguito alla migrazione dei mitocondri verso un polo della cellula, dove essi si

ritrovano con una distribuzione a mezzaluna in prossimità del nucleo. L’associazione

dei mitocondri alla membrana nucleare è un fenomeno che si riscontra in molte

specie animali e potrebbe riflettere un’alta richiesta energetica del nucleo durante la

progressione della prima divisione meiotica fino all’arresto in diplotene (Dvorak and

Tesarik, 1980).

Oltre ai numerosi mitocondri, anche diversi altri organelli si raggruppano in

prossimità del nucleo, formando il cosiddetto “complesso paranucleare” o “corpo

vitellino di Balbiani”. Esso è costituito da cisterne e vescicole del Golgi, membrane

di reticolo endoplasmatico liscio, uno scarso reticolo endoplasmatico rugoso,

vacuoli, gocce lipidiche, lisosomi e lamelle annulate (Baca and Zamboni, 1967;

Hertig, 1968; Hertig and Adams, 1967; Dvorak and Tesarik, 1980); queste ultime,

originate dall’involucro nucleare, sono formate da pile di doppia membrana

contenenti pori (Sathananthan et al., 2000a, 2006).

A partire dalla pubertà, ogni giorno nuovi follicoli primordiali vengono reclutati in

gruppo per iniziare la follicologenesi, processo che dura circa sei mesi. Questa

dinamica emerge con chiarezza nell’organizzazione dell’ovaio, caratterizzato dalla

presenza contemporanea di follicoli in tutti gli stadi di accrescimento (Le Moigne

and Foucrier, 2004; Sànchez and Smitz, 2012).

I follicoli reclutati dal pool di follicoli quiescienti, per intraprendere la fase di

crescita follicolare, vengono detti follicoli primari. Questi follicoli mantengono le

caratteristiche morfologiche generali dei follicoli primordiali, ma, in seguito

all’aumento di dimensioni e alla proliferazione, le cellule follicolari formano un

15

epitelio ancora monostratificato ma costituito da cellule cubiche o poliedriche

(Makabe et al., 2006). La conversione del follicolo primordiale in follicolo primario

è caratterizzata da una crescita follicolare minima, se non nulla (Motta et al., 1994),

l’ovocita presente al suo interno è invece molto attivo nella sintesi proteica a partire

da trascritti nucleari e mitocondriali (Motta et al., 1994). Alcune di queste proteine

sono richieste per il differenziamento dell’ovocita stesso, altre per la formazione

delle interazioni con le circostanti cellule follicolari e altre ancora diventeranno

enzimi o saranno importanti per la formazione della zona pellucida (un involucro

glicoproteico che circonderà l’ovocita e successivamente l’embrione fino al

momento dell’impianto nell’utero), per la capacità di andare incontro a fecondazione

o per le prime fasi dello sviluppo embrionale (Picton and Gosden, 1999). Le

dimensioni dell’ovocita aumentano leggermente, raggiungendo un diametro di circa

50 µm (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and Tesarik, 1980; Motta et al., 1994,

2003; Van Blerkom and Motta, 1979).

Le cellule stromali localizzate all’esterno della lamina basale cominciano ad

aggregarsi concentricamente intorno alla essa, formando la teca follicolare (Dvorak

and Tesarik, 1980; Motta et al., 1994; Van Blerkom and Motta, 1979).

Man mano che l’ovocita cresce, i suoi organelli diventano gradualmente sempre più

dispersi nell’ooplasma. Il Golgi si frammenta e comincia ad assemblare nel cortex

glicoproteine della zona pellucida e granuli corticali, che appaiono come strutture dense

e circondate da membrana. Il numero di microvilli ovocitari aumenta progressivamente e

lo stesso avviene per le cellule follicolari (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and

Tesarik, 1980; Motta et al., 1994, 2003; Van Blerkom and Motta, 1979).

16

La comparsa di un secondo strato di cellule della granulosa caratterizza la

formazione del follicolo secondario. Nel corso dello sviluppo del follicolo

secondario, la lamina basale diventa più spessa ed esternamente ad essa la teca si

differenzia in due compartimenti: la teca interna, riccamente vascolarizzata da

capillari, e la teca esterna, costituita principalmente dai componenti tipici del tessuto

connettivo, da sporadiche cellule muscolari lisce e da vasi sanguigni di grande

calibro (Dvorak and Tesarik, 1980; Familiari et al., 1989, 1991; Macchiarelli et al.,

1992; Motta et al., 1995, 2003; Sathananthan et al., 2006).

L’ovocita aumenta ancora in dimensioni, raggiungendo il diametro di 80 µm

(Makabe et al., 2006). Polisomi e lamelle annulate sono rare (Baca and Zamboni,

1967; Dvorak and Tesarik, 1980), mentre mitocondri, Golgi, SER, lisosomi,

perossisomi e ribosomi aumentano gradualmente in quantità e si disperdono in tutto

il citoplasma (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and Tesarik, 1980; Familiari et al.,

1989, Makabe et al., 1991; Motta et al., 2000). In particolare, l’apparato del Golgi

aumenta di dimensioni e sviluppa numerose unità, che gradualmente si disperdono

nel cortex cellulare. Contemporaneamente si osserva un notevole aumento dei

granuli corticali, che migrano progressivamente verso la periferia andando a disporsi

al di sotto dell’oolemma, dove si associano alla rete di microfilamenti di actina del

cortex ovocitario (Baca and Zamboni, 1967; Sathananthan et al., 1985). Il nuage

gradualmente diminuisce e infine scompare (Dvorak and Tesarik, 1980; Baca and

Zamboni, 1967).

Sulla superficie dell’ovocita si sviluppano numerosi microvilli (Makabe et al., 2006).

Le cellule follicolari presentano una forma poliedrica e sono disposte in strati

concentrici intorno all’ovocita, formando la cosiddetta granulosa. Queste cellule

17

secernono un liquido chiamato “liquor folliculi primario” che si accumula in piccole

lacune intercellulari presenti nello strato della granulosa.

Intorno all’ooplasma sono presenti piccole masse irregolari di materiale flocculento

(materiale glicoproteico secreto dall’ovocita) che successivamente si fonderanno

insieme per formare, intorno all’ovocita, una zona pellucida continua (Motta and

Van Blerkom, 1979; Wassarman, 1991).

Man mano che lo sviluppo follicolare procede e le cellule della granulosa si

dividono, si verifica un aumento della vascolarizzazione della teca interna e della

permeabilità della parete endoteliale dei vasi sanguigni e linfatici tecali (Macchiarelli

et al., 1992; Macchiarelli, 2000). Anche la permeabilità della lamina aumenta,

consentendo la diffusione di una considerevole quantità di filtrato ematico e linfatico

verso la granulosa. Il liquor folliculi (ora detto “secondario”) diventa così

progressivamente più acquoso e abbondante, creando grandi lacune intercellulari,

dalla cui confluenza si forma un’unica ampia cavità o antro. In questo stadio il

follicolo è detto antrale (Dvorak and Tesarik, 1980; Familiari et al., 1989, Greenwald

and Terranova, 1988; Macchiarelli et al., 1992; Makabe et al., 1991; Motta et al.,

1994; Murakami et al., 1988; Zoller, 1991).

In seguito alla formazione del follicolo antrale sono riconoscibili due popolazioni di

cellule della granulosa: il cumulo ooforo, le cui cellule disposte internamente in

stretto contatto con l’ovocita sono dette cellule della corona radiata, e la granulosa

parietale, che riveste la cavità follicolare. Il cumulo ooforo e la granulosa parietale

sono congiunte da un sottile peduncolo formato da poche cellule della granulosa

(Familiari et al., 1989, Motta and Van Blerkom, 1975; Li et Albertini, 2013).

18

Nelle fasi finali della follicologenesi la quantità di liquido follicolare nell’antro

aumenta bruscamente in risposta all’azione dell’LH e, alla fine dell’accrescimento

follicolare, l’antro occupa pressoché tutto il volume del follicolo (Monesi, 2002; Le

Moigne and Foucrier, 2004). In questo stadio il follicolo appare come una vescicola

ripiena di un fluido trasparente e sporge visibilmente al di sotto della superficie

dell’ovaio; a questo punto si parla di follicolo preovulatorio o di Graaf (Makabe et

al., 2006).

Fino al momento dell’ovulazione, gli ovociti sono mantenuti in arresto meiotico per

mezzo di un fattore inibente, il cAMP, trasportato dalle cellule somatiche circostanti

(Schultz et al., 1983; Bornslaeger et al., 1986).

I livelli intracellulari di cAMP nell’ovocita dipendono da diversi fattori: il tasso di

sintesi e di metabolismo, in entrambi i tipi cellulari, e il trasporto, via giunzioni

comunicanti, tra le cellule del cumulo e l’ovocita. Il picco nella secrezione dell’LH

determina un forte incremento nella sintesi del cAMP nelle cellule del cumulo,

tuttavia nell’ovocita i livelli di cAMP diminuiscono, promuovendo la ripresa della

meiosi (Russell and Robker, 2007; Li et Albertini, 2013). Diversi meccanismi

potrebbero essere coinvolti nella diminuzione dei livelli di questo secondo

messaggero:

- la diminuzione, per mezzo della fosforilazione e della down-regolazione delle

proteine che le costituiscono, del numero di giunzioni comunicanti (connessine)

(Granot and Dekel, 1994; Kalma et al., 2004; Sela-Abramovich et al., 2005),

- la dissociazione fisica delle cellule del cumulo dall’ovocita come risultato

dell’espansione del complesso cumulo-ovocita (Cumulus Oocyte Complex, COC)

(Larsen et al., 1996),

19

- la retrazione attiva dei processi delle cellule del cumulo (Motta and Van Blerkom,

1975; Motta et al., 1994);

- l’aumento, negli ovociti, dell’attività della fosfodiesterasi 3A, l’enzima che

metabolizza il cAMP (Richard et al., 2001);

- l’inibizione dell’attività dell’adenilato ciclasi, con la conseguente diminuzione

della sintesi di cAMP (Kawamura et al., 2004).

Al momento della ripresa della meiosi la vescicola germinale migra verso la periferia

e al suo interno i cromosomi completano la loro condensazione, il profilo

dell’involucro nucleare diviene estremamente irregolare e, infine, il nucleolemma si

rompe (Germinal Vesicle Breakdown, GVBD), determinando il rilascio dei

cromosomi nell’ooplasma. Si verifica dunque rapidamente la prima divisione

meiotica: in metafase le coppie di cromosomi omologhi (bivalenti) si allineano lungo

il piano equatoriale del fuso e, all’anafase, i cromosomi omologhi di ciascun

bivalente si separano migrando ai poli opposti. I cromosomi omologhi di derivazione

materna e paterna si distribuiscono in modo casuale a ciascun polo, garantendo

un’ulteriore variabilità genetica. In telofase si formano nuove membrane nucleari

intorno a ognuno dei due gruppi cromosomici per formare i due nuclei figli. Con la

citocinesi si verifica l’estrusione del primo corpo polare nello spazio perivitellino,

mentre si avvia immediatamente la seconda divisione meiotica, che subisce un nuovo

arresto in metafase (metafase II) (Sathananthan et al., 1993; Russell, 2004).

L’ovocita in questo stadio è detto “maturo” o “preovulatorio” e 36 ore dopo il picco

di LH viene rilasciato dall’ovaio nel processo di ovulazione.

In risposta alla secrezione LH-dipendente di proteasi o dei loro attivatori

(collagenasi, attivatore del plasminogeno), nonché di prostaglandine, il tratto di

20

parete del follicolo (granulosa e teche) rivolto verso la superficie dell’ovaio e la

parete di questo organo, si assottigliano formando una zona traslucida denominata

stigma. Quando, in corrispondenza di questo punto, si verifica la rottura della parete

del follicolo e dell’ovaio, il complesso cumulo-oocita è espulso dall’ovaio e, grazie

all’azione delle fimbrie tubariche, viene convogliato nella tuba di Falloppio, sede

fisiologica della fecondazione. Quello che rimane del follicolo dopo l’ovulazione

costituisce il corpo luteo. Se mentre discende attraverso la tuba l’ovocita viene

fecondato e in seguito l’embrione si impianta nella cavità uterina, instaurando così la

gravidanza, il corpo luteo viene mantenuto; in caso contrario, regredisce in corpus

albicans (Monesi, 2002; Le Moigne and Foucrier, 2004).

L’ingresso dello spermatozoo fecondante innesca la ripresa della seconda divisione

meiotica, che si completa con l’estrusione del secondo corpo polare. La seconda

divisione meiotica attraversa gli stessi stadi della prima ma con alcune differenze: la

minore durata della profase e la separazione, durante l’anafase, dei due cromatidi

fratelli che compongono ciascun cromosoma (Russell, 2004).

Struttura dell’ovocita maturo

Osservato al microscopio ottico in sezione equatoriale, l’ovocita umano maturo

possiede una forma rotondeggiante e un diametro di circa 100 µm. L’ooplasma ha

una tessitura omogenea e appare provvisto di numerosi organelli uniformemente

dispersi (Motta et al., 1988).

L’ovocita è circondato da una zona pellucida continua e uniforme dello spessore di

circa 17 µm, dal quale è separato da un sottile spazio perivitellino (Motta et al., 1988).

21

In questo spazio è racchiuso il primo corpo polare, di forma rotondeggiante o ovalare

e con un diametro di 8-10 µm, visibile in sezioni particolarmente favorevoli. Nelle

medesime sezioni sono frequentemente osservabili anche i cromosomi allineati sul

fuso durante la metafase della seconda divisione meiotica.

Il primo corpo polare, che rappresenta il risultato del completamento della prima

divisione meiotica dell’ovocita, è considerato da alcuni una sorta di “ovocita in

miniatura” (Sathananthan et al., 2006). Esso infatti, come l’ovocita, al microscopio

elettronico a trasmissione presenta una superficie ricca di microvilli e un citoplasma

in cui sono visibili cromosomi, non circondati da un involucro nucleare, microtubuli

e granuli corticali (El Shafie et al., 2000). Esso può essere occasionalmente penetrato

da uno spermatozoo, rispondendo in tal caso, come l’ovocita, con l’estrusione del

contenuto dei granuli corticali (Sathananthan et al., 1993).

Ad un’analisi al microscopio elettronico a trasmissione, dell’ovocita maturo, aploide,

i 23 cromosomi, localizzati sulla piastra equatoriale del fuso meiotico, presentano

una microstruttura granulo-fibrillare fortemente elettrondensa. Il fuso meiotico,

formato da microtubuli organizzati che si estendono da un polo all’altro, è anastrale,

privo di centrioli e ha una forma a barile con poli leggermente appuntiti

(Sathananthan et al., 2003, 2006). Il fuso è orientato perpendicolarmente rispetto

all’oolemma ed è localizzato in una zona periferica dell’ooplasma, in genere

sprovvista di altri organelli, sebbene occasionalmente possano essere presenti

mitocondri e reticolo endoplasmatico liscio.

Gli organelli più abbondanti nell’ooplasma sono i mitocondri. Essi hanno una forma

sferica o ovale, un diametro compreso tra 0,6 e 0,8 µm e una matrice densa, con

scarse creste periferiche arciformi (Motta et al., 2000). I mitocondri si ritrovano

22

tipicamente associati con le membrane del reticolo endoplasmatico liscio a formare

due tipi di strutture citoplasmatiche:

- aggregati M-REL: elementi tubulari di REL anastomizzati l’uno con l’altro e

associati strettamente a mitocondri;

- complessi MV: vescicole di REL ripiene di materiale flocculento, leggermente

elettrondenso, circondate da un anello di mitocondri (Motta et al., 1988, 1995,

2000; Sathananthan et al., 1993, 2006; Sundstrom et al., 1985; Szollosi et al.,

1986).

Al contrario degli ovociti in crescita, negli ovociti maturi il reticolo endoplasmatico

rugoso (RER) non è presente e anche i ribosomi liberi si incontrano raramente;

inoltre il Golgi è raro (pochi complessi, in genere piccoli) o assente. Questi aspetti

substrutturali riflettono la relativa inattività degli ovociti umani maturi riguardo la

sintesi e la secrezione di proteine (Motta et al., 1988; Sathananthan et al., 2006).

Al di sotto dell’oolemma, a 0,4-0,6 µm di distanza da essa, disposti in 1-3 file, è

possibile osservare la presenza di numerosi granuli corticali del diametro di 300-400

nm e contenenti una matrice omogenea estremamente elettrondensa (Sathananthan et

al., 1985, 2006; Motta et al., 1988).

Valutazione morfologica dell’ovocita

Il gamete femminile gioca un ruolo cruciale nella determinazione della competenza

embrionale e di conseguenza nel successo della riproduzione umana. Il

raggiungimento della completa e corretta maturazione che avviene in fase

preovulatoria è fondamentale per la fecondazione ed il successivo sviluppo

23

embrionale, sia in vivo che in vitro. La qualità dell’ovocita, valutabile

morfologicamente in termini di mantenimento della sua integrità morfofunzionale, è

determinata non solo dal genoma nucleare e mitocondriale, ma anche dal

microambiente fornito dall’ovaio e dal follicolo pre-ovulatorio, che influenza i

processi di trascrizione e di traduzione e, di conseguenza, la maturità citoplasmatica.

Nel corso della sua maturazione, l’ovocita umano va incontro a una complessa e

coordinata riorganizzazione del materiale genetico, dell’ooplasma e della matrice

extracellulare. Tale riorganizzazione, seguita al microscopio elettronico, appare

caratterizzata dalla neogenesi, modificazione e ridistribuzione di organelli,

membrane e trama glicoproteica della zona pellucida. Un’alterazione sia spaziale che

temporale dei processi maturativi, associata a una evidente asincronia morfologica

tra maturazione nucleare e citoplasmatica, può essere responsabile di una ridotta o

alterata performance ovocitaria (Makabe et al., 2006a).

L’applicazione dei protocolli di stimolazione ovarica, utilizzati nel corso delle

procedure di riproduzione assistita, bypassando i complicati processi di selezione che

portano alla maturazione e all’ovulazione fisiologica di un singolo ovocita,

consentono la maturazione di molti ovociti, spesso con qualità compromessa (Rienzi

et al., 2012).

La valutazione morfologica dell’ovocita nel laboratorio di procreazione

medicalmente assistita (PMA) è basata prima di tutto sull’osservazione,

all’invertoscopio a contrasto di fase, delle cellule del cumulo-corona (Veeck, 1999),

che permette di classificare gli ovociti in maturi, intermedi e immaturi, generalmente

correlati rispettivamente con gli stadi di sviluppo MII, MI e VG.

24

Gli ovociti sono classificati come “maturi” quando la corona è radiante e la massa del

cumulo appare espansa, lassa e mucificata, per l’attiva secrezione di acido ialuronico.

Questa molecola si interpone tra le cellule del cumulo disperdendole e conferendo alla

massa cumulo-corona un aspetto lanuginoso e soffice (Rienzi et al., 2012).

Un complesso cumulo-corona meno espanso denota uno stadio di maturità

intermedio e l’assenza di espansione è indice di immaturità.

Nei cicli naturali, la maturazione nucleare corre parallela all’espansione graduale

delle cellule del cumulo e della corona, ma questa sincronia può essere persa nei cicli

stimolati, probabilmente a causa di una diversa sensibilità dell’ovocita e della massa

cumulo-corona alla stimolazione. Per questo motivo la valutazione potrebbe non

rispecchiare con certezza lo stato di maturità ovocitaria (Laufer et al., 1984).

La rimozione delle cellule del cumulo-corona che precede l’inseminazione

intracitoplasmatica dell’ovocita (IntraCytoplasmic Sperm Injection, ICSI), rende

possibile una valutazione più accurata dell’ovocita, in quanto è possibile evidenziare

lo stadio di maturazione nucleare, la morfologia del citoplasma e l’aspetto della

strutture extacitoplasmatiche (Rienzi et al., 2012).

Un ovocita umano maturo ideale dovrebbe avere un citoplasma dall’aspetto

“normale”, uno spessore appropriato della zona pellucida, un singolo corpo polare e

un adeguato spazio perivitellino (Swain and Pool, 2008). La presenza del primo corpo

polare è normalmente considerata il marker di maturità nucleare dell’ovocita (Rienzi et

al., 2012), tuttavia, recenti studi di microscopia a luce polarizzata hanno mostrato che,

nonostante la presenza del corpo polare, gli ovociti possono essere ancora immaturi

(Rienzi et al., 2005). Infatti, solo quelli in cui si osserva il fuso meiotico possono

essere considerati come veri ovociti maturi allo stadio di metafase II (MII). Oltre alla

25

presenza, anche la posizione e il “ritardo” del fuso meiotico sono stati messi in

relazione con la competenza di sviluppo ovocitaria.

La maggior parte degli ovociti recuperati in seguito a stimolazione ovarica

esibiscono una o più variazioni dai criteri morfologici “ideali” descritti (De Sutter et

al., 1996; Balaban et al., 1998; Mikkelsen and Lindeberg, 2001; Balaban and Urman,

2006; Ebner et al., 2006; Rienzi et al., 2008). Questo è vero anche per gli ovociti

ottenuti da donatrici con fertilità accertata (Ten et al., 2007).

La valutazione morfologica comunque spesso fallisce nel predire la capacità di un

ovocita di fecondarsi e di procedere nello sviluppo: solo poche caratteristiche

morfologiche rilevabili negli ovociti in metafase II indicherebbero una competenza

ridotta.

Il diametro medio dell’ovocita può variare sostanzialmente, ma non sono state

osservate correlazioni con i tassi di fecondazione o con la qualità degli embrioni nel

corso delle prime divisioni mitotiche (Romao et al., 2010). La situazione è differente

con gli ovociti giganti (diametro di circa 200 µm, raddoppiato rispetto agli ovociti

normali), che riflettono anomalie genetiche, contenendo un set addizionale di

cromosomi (Balakier et al., 2002; Rosenburch et al., 2002). Questi ovociti derivano

dalla meiosi di ovociti tetraploidi, che sono generati in seguito alla divisione nucleare

non seguita da quella citoplasmatica di un ovogonio o in seguito alla fusione di due

ovogoni. Tali meccanismi spiegano la presenza di due nuclei negli ovociti in profase

I; inoltre, quando osservati al microscopio a luce polarizzata, essi mostrano la

presenza di due fusi meiotici distinti. Sebbene il recupero di ovociti giganti sia

relativamente raro in seguito a stimolazione ovarica, questi ovociti non dovrebbero

26

mai essere utilizzati per la fecondazione in vitro in quanto danno origine a triploidie

diginiche.

Per quanto riguarda la forma ovocitaria sono stati riscontrati vari tipi di anomalie

(Paz et al., 2004; Esfandiari et al., 2005), sebbene sia stato dimostrato che tali ovociti

possono essere fecondati e portare alla nascita di bambini sani.

Sono possibili anche diversi gradi di eterogeneità del citoplasma, sebbene il

significato biologico di tale variabilità non sia noto. Gravi dismorfismi della trama

del citoplasma sembrano essere in grado di compromettere il potenziale di sviluppo

ed impianto dell’embrione (Balaban and Urman, 2006), mentre un citoplasma

leggermente eterogeneo sembra rappresentare solamente una variante piuttosto che

un’anomalia con effetti sullo sviluppo (Alpha Scientists in Reproductive Medicine

and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011).

Una delle più importanti e gravi anomalie citoplasmatiche ovocitarie è la presenza di

voluminosi aggregati di tubuli di reticolo endoplasmatico liscio (dischi di REL).

E’stata documentata un’associazione significativa tra la presenza di queste anomalie

negli ovociti e il verificarsi di esiti molto gravi in seguito al trasferimento degli

embrioni risultanti (Balaban and Urman, 2006).

I vacuoli, quando di piccole dimensioni, del diametro di 5-10 µm, non sembrano

avere alcuna conseguenza biologica, mentre vacuoli più grandi (>14 µm) sono stati

associati a tassi di fecondazione ridotti. Inoltre, nei casi in cui l’ovocita viene

fecondato, la persistenza di tali strutture in seguito alla singamia può interferire con i

piani di clivaggio ed essere responsabile della riduzione nel tasso di formazione di

blastocisti (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest

Group of Embryology, 2011).

27

Secondo l’Istanbul consensus workshop on embryo assessment (Alpha Scientists in

Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embriology, 2011) le

anomalie extracitoplasmatiche (la morfologia del primo corpo polare, l’ampiezza

dello spazio perivitellino e l’aspetto della zona pellucida) sarebbero solamente

variazioni fenotipiche.

A causa della complessità dei meccanismi legati alla maturazione ovocitaria e

all’acquisizione della competenza, è improbabile che una singola caratteristica (con

l’eccezione dei dischi di REL e degli ovociti giganti) possa riflettere in modo

adeguato la qualità della cellula (Rienzi et al., 2012).

Invecchiamento riproduttivo

L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è

determinata dal graduale esaurimento della riserva di follicoli ovarici e dal

contemporaneo peggioramento della qualità ovocitaria che si verifica con l’età (te

Velde and Pearson, 2002).

Il pool di follicoli primordiali costituisce la riserva ovarica disponibile durante

l’intera vita riproduttiva della donna. Esso raggiunge un picco di 6-7 milioni alla 20°

settimana di vita fetale (Block, 1952, 1953; Baker, 1963). Nella seconda metà della

vita fetale si verifica una rapida perdita, per apoptosi, della maggior parte dei

follicoli primordiali, e alla nascita ne permangono solo 1-2 milioni (Markström et al.,

2002). Dopo la nascita, il tasso di apoptosi subisce un rallentamento così che, al

menarca, sono presenti almeno 300.000-400.000 follicoli primordiali. Nel corso

dell’età riproduttiva il declino continuerà in modo sempre più accelerato e farà

28

scendere il numero di follicoli primordiali al di sotto dei 1000 al momento della

menopausa (Richardson et al., 1987; Faddy and Gosden, 1996; Faddy, 2000). A ogni

specifica età cronologica, la quasi totalità (>99%) degli ovociti presenti nell’ovaio si

trova allo stadio di follicoli quiescenti.

Alcuni studi indicano che la fertilità della donna inizi a decrescere precocemente, in

media già a partire dai 30 anni (Schwartz and Mayaux, 1982; van Noord-Zaadstra et

al., 1991) (Fig 3).

Fig 3. Rappresentazione schematica dei quattro stadi di invecchiamento riproduttivo (riduzione della fertilità, perdita della fertilità naturale, transizione menopausale e menopausa). Tratto da: Broekmans et al., 2009.

Nelle popolazioni del 19° secolo la fertilità era limitata solo da fattori naturali, di

conseguenza l’età della donna al momento della nascita dell’ultimo figlio è

considerabile come la perdita della fertilità naturale. Essa si verifica in media all’età

di 41 anni, con un range compreso tra 23 e 51 anni (Broekmans et al., 2004 ;

O'Connor et al., 1998).

Il primo sintomo clinico del processo di invecchiamento riproduttivo è un

accorciamento della lunghezza del ciclo mestruale di 2-3 giorni (Treloar et al., 1967),

29

ma è solo quando il ciclo mestruale diventa irregolare che in genere la donna si

accorge dell’avvicinarsi della menopausa.

Si verificano con frequenza sempre maggiore cicli allungati o assenza di

mestruazioni, anche per intervalli prolungati. Questo stadio, detto transizione

menopausale (Soules et al., 2001), dura fino al momento dell’ultima mestruazione,

che segna l’ingresso nella menopausa.

La transizione menopausale deve essere distinta dalla perimenopausa, che include

anche l’anno successivo all’ultimo sanguinamento mestruale. L’inizio della fase di

transizione menopausale si verifica in media all’età di 46 anni, con un range

compreso tra 34 e 54 anni (Treloar et al., 1967; den Tonkelaar et al., 1998; Weinstein

et al., 2003; Treloar, 1981; Vollman, 1977). La menopausa si verifica in media

all’età di 51 anni, con un range di variazione compreso tra 40 e 60 anni (Broekmans

et al., 2004; Treloar, 1981; Hagstad et al., 1985 van Noord et al., 1997).

Tra i quattro eventi riproduttivi sopra esposti (Fig 3) (riduzione della fertilità, perdita

della fertilità naturale, transizione menopausale e menopausa) sembra esistere una

relazione temporale fissa (te Velde and Pearson, 2002).

Gli studi condotti in popolazioni del 19° secolo hanno dimostrato che un tasso di

nascita ridotto nei primi anni di matrimonio (tra i 20 e i 30 anni) è associato a un’età

giovane al momento della nascita dell’ultimo figlio (intorno ai 35 anni). Questo

suggerisce che la perdita prematura della fertilità sia preceduta da una fertilità ridotta

già prima dei 30 anni (Eijkemans et al., 2005).

Diversi report di fecondazione assistita hanno evidenziato che, nelle pazienti in cui si

verificano ripetute basse risposte alla stimolazione ovarica, la perdita prematura della

30

fertilità naturale è strettamente associata alla comparsa prematura della transizione

menopausale (de Boer et al., 2003; Lawson R et al., 2003; Nikolaou et al., 2002).

In aggiunta, studi di follow up condotti su donne volontarie hanno dimostrato che

diversi test per la valutazione della riserva ovarica sono predittivi di una precoce

transizione menopausale o menopausa (Sowers et al., 2008 van Rooij et al., 2004).

Inoltre, in popolazioni con assenza di limitazioni riproduttive, la distribuzione delle

curve di età al momento della nascita dell’ultimo figlio (Bouchard, 2000) e al

momento della menopausa tendono ad essere straordinariamente simili (te Velde and

Pearson, 2002; Broekmans et al., 2004). Infine, la durata del periodo di irregolarità

del ciclo che precede la menopausa appare costante e indipendente dall’età in cui la

menopausa successivamente si verifica (te Velde and Pearson, 2002; den Tonkelaar

et al., 1998).

E’ da tenere presente che valutazioni approfondite di singoli individui in diversi

momenti della vita sono difficili da condurre a causa della vasta applicazione di

metodi ormonali per il controllo delle nascite. Comunque, se venisse confermata,

l’interrelazione tra i quattro eventi riproduttivi avrebbe importanti implicazioni

sociali, in quanto consentirebbe una predizione corretta della durata della vita

riproduttiva delle singole donne.

Tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA)

La prima bambina concepita con l’aiuto della PMA, Louise Brown, nacque in

Inghilterra nel 1978 mediante la tecnica IVF-ET (In Vitro Fertilization - Embryo

Transfer, fecondazione in vitro con trasferimento dell’embrione nella cavità uterina)

31

(Edwards, 1980; Steptoe et al., 1980). Da allora, le acquisizioni relative alla

riproduzione umana si sono enormemente evolute, sia da un punto di vista

conoscitivo che tecnico (Edwards and Brody, 1995) e attualmente si stima che più di

8 milioni di bambini nel mondo siano stati concepiti mediante trattamenti di PMA

(de Mouzon et al., 2009).

Le tecniche di PMA disponibili possono essere classificate in tre livelli. Il primo

consiste nella deposizione del seme maschile, opportunamente trattato, direttamente

nell’utero della paziente. E’ un processo che sostituisce il rapporto sessuale e ha lo

scopo di facilitare l’incontro tra spermatozoo e ovocita. Il secondo e terzo livello

invece comprendono metodiche che si avvalgono della fecondazione extracorporea

(IVF/ICSI), con successivo trasferimento dell’embrione ottenuto nella cavità uterina,

stabilendo in questo modo il presupposto diretto per una gravidanza (Micara et al.,

2012; Ubaldi et al., 2009).

Le tecniche di PMA possono rappresentare una soluzione al problema dell’infertilità

dovuta al fattore età. Le strategie di trattamento, sostanzialmente, si basano sulla

possibilità di diminuire il tempo necessario per il concepimento. Ciò può essere

ottenuto attraverso il tentativo di modificare i meccanismi della selezione follicolare

del ciclo ovulatorio spontaneo e di “salvataggio” dall’atresia di un maggior numero

di ovociti del patrimonio follicolare residuo. Quindi, il passaggio critico, rispetto alla

prognosi riproduttiva, è l’efficienza della induzione della crescita follicolare multipla

(ICFM), sia essa associata alle tecniche di I che di II e III livello. La riduzione critica

del patrimonio follicolare, propria della fisiologia ovarica, è a sua volta responsabile

della relativa inadeguatezza della risposta ovarica alla ICFM (Ubaldi et al., 2009).

32

A causa della tendenza generale a posporre la ricerca della prima gravidanza, una

quota sempre maggiore di donne avrà difficoltà a concepire e, di conseguenza, un

numero sempre maggiore di coppie dipenderà dalle tecnologie di riproduzione

assistita (Assisted Reproduction Technology, ART) per ottenere una gravidanza.

Tuttavia la ART potrà compensare solo in parte la progressiva perdita della capacità

riproduttiva femminile (Leridon, 2004; Habbema et al., 2009), lasciando senza figli

la maggior parte delle coppie (oltre il 70%) (Ubaldi et al., 2009; Broekmans et al.,

2009).

33

2. Scopo del lavoro

34

Come illustrato precedentemente, con l’avanzare dell’età della donna la qualità degli

ovociti subisce un deterioramento (te Velde and Pearson, 2002). I sistemi di

classificazione morfologica usati nella routine di laboratorio, basati sulla microscopia

a contrasto di fase (Phase Contrast Microscopy, PCM), spesso non evidenziano

l’invecchiamento dell’ovocita in termini di qualità (Stensen et al., 2010). Infatti

ovociti apparentemente normali possono presentare una fecondabilità ridotta o

l’arresto dello sviluppo durante le prime divisioni embrionali. Il mantenimento

dell’integrità strutturale delle strutture ovocitarie, e il parallelo mantenimento delle

loro funzioni fisiologiche, è essenziale per la fecondazione e per il successivo

sviluppo embrionale. La compromissione di queste strutture, anche in assenza di

difetti rilevabili tramite PCM, può influenzare negativamente questi eventi (Nottola

et al., 2007).

Lo scopo di questo lavoro è l’osservazione approfondita, tramite microscopia ottica

(Light Microscopy, LM) ed elettronica a trasmissione (Transmission Electron

Microscopy, TEM), dei tratti morfologici che caratterizzano l’invecchiamento

ovocitario, sia nel processo fisiologico dell’invecchiamento riproduttivo (Reproductive

Aging, RA), sia nel corso dell’invecchiamento in vitro (In vitro Aging, IvA).

Attraverso la comparazione della qualità strutturale e ultrastrutturale degli ovociti si

è inoltre cercato di comprendere se i due tipi di invecchiamento possano essere

sovrapponibili. Infatti negli ultimi anni l’invecchiamento in vitro è stato assunto

come modello per lo studio dell’invecchiamento riproduttivo, ma ad oggi non

esistono studi di microscopia sistematici sull’argomento.

Lo studio è stato condotto utilizzando ovociti soprannumerari donati alla ricerca,

previa firma di un consenso informato e secondo le leggi vigenti, da pazienti che si

35

sono sottoposte a trattamenti di fecondazione assistita presso la UOC OGC03 -

Infertilità e FIVET (Prof. Cesare Aragona) del DAI (Dipartimento di Attività

Integrata) di Ginecologia e Ostetricia, Perinatologia e Puericultura (Prof. Pierluigi

Benedetti Panici) dell’Azienda Policlinico Umberto I, Università “Sapienza” di

Roma (DU -Dipartimento Universitario- di Scienze Ginecologico-ostetriche e

Scienze Urologiche, Prof. Vincenzo Gentile).

La successiva analisi di microscopia ottica ed elettronica è stata condotta presso la

UO Microscopia elettronica (Prof. Giuseppe Familiari), sezione di Anatomia Umana

(Prof. Eugenio Gaudio) del Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche,

Medico Legali e dell’Apparato Locomotore (Prof. Elio Ziparo) dell’Università

“Sapienza” di Roma. Tale analisi è stata condotta in collaborazione con la sezione di

Anatomia (Prof. Guido Macchiarelli) del Dipartimento di Scienze della Salute

dell’Università degli studi dell’Aquila.

36

3. Materiali e metodi

37

Il presente studio è stato condotto su un totale di 61 ovociti ottenuti a partire da 23

pazienti che si sono sottoposte a cicli di riproduzione assistita (IVF o ICSI) nel

periodo compreso tra ottobre 2007 e luglio 2013. Le coppie sono state selezionate in

base alla condizione di infertilità, escludendo quelle patologie in cui il

microambiente ovarico potesse essere direttamente responsabile delle alterazioni

ovocitarie, come ad esempio l’endometriosi. L’infertilità era dovuta al fattore

maschile nel 39,1% dei casi, al fattore uterino nel 21,8% e al fattore tubarico nel

rimanente 39,1%.

Il processo fisiologico di invecchiamento riproduttivo varia in modo considerevole tra

le donne, motivo per il quale non esiste una definizione universalmente accettata di

“età riproduttiva avanzata”. Tuttavia generalmente l’età di 35 anni è considerata uno

spartiacque in termini di fertilità (American Society of Reproductive Medicine, 2006).

Tenendo conto di questa considerazione, le pazienti sono state suddivise in due gruppi

(A e B): il gruppo A (8 pazienti) comprende le donne con età inferiore ai 35 anni

(range 31-34, età media 32±1,069), mentre appartengono al gruppo B (15 pazienti) le

donne con età uguale o superiore ai 35 anni (range 35-44, età media 38,06±2,84).

Gli ovociti sono stati fissati poco dopo il pick up (tempo 0) o dopo 24 ore di coltura,

per la successiva osservazione al microscopio ottico e al microscopio elettronico a

trasmissione.

Sono stati osservati 25 ovociti nel gruppo A (13 a tempo 0 e 12 a 24 h) e 36 nel

gruppo B (18 a tempo 0 e 18 a 24 h).

Tutte le pazienti incluse in questo studio presentavano un cariotipo normale, erano

negative per colture vaginali o uretrali e non avevano tumori o malattie sistemiche.

Inoltre, le pazienti erano nullipare e si erano precedentemente sottoposte a un

38

numero di cicli di PMA compreso tra 0 e 4. I valori basali in terza giornata del ciclo

non erano in nessun caso superiori a 10mIU/ml per l’ormone follicolo-stimolante

(FSH) e superiori a 40 pg/ml per l’estradiolo (E2).

3.1 Stimolazione ovarica

La prima fase della PMA è rappresentata dalla somministrazione di farmaci per

indurre una maturazione contemporanea di più follicoli, allo scopo di avere a

disposizione più ovociti.

La terapia di induzione della crescita follicolare multipla si basa sulla

desensibilizzazione dell’ipofisi e sulla successiva somministrazione delle

gonadotropine. Questo al fine di evitare ovulazioni spontanee premature, ossia la

rottura dei follicoli prima che si possa procedere al recupero mediante prelievo

ecografico (pick up) degli ovociti in essi contenuti.

La soppressione dell’attività ovarica fisiologica è consistita nella somministrazione

sottocutanea giornaliera, a partire dal 1° giorno del ciclo, di 0,1 ml di Decapeptyl

(Ipsen), un analogo dell’ormone rilasciante le gonadotropine (GnRH).

La soppressione ovarica viene valutata sia ecograficamente, sia tramite il profilo

dell’estradiolo: l’ecografia deve mostrare l’assenza di follicoli in crescita ed i valori

plasmatici dell’estradiolo devono essere inferiori ai 30 pg/ml. Una volta confermata la

soppressione, iniziata la somministrazione sottocutanea giornaliera di 150 IU di FSH

urinario (Fostimon 75 UI, Ibsa) o di FSH+LH urinari (Meropur 75 UI + 75 UI, Ferring).

A partire dal settimo giorno di terapia la crescita follicolare viene attentamente

seguita mediante monitoraggio ecografico (diametro dei follicoli) ed ormonale

39

(misurazione dei livelli plasmatici di estradiolo e di progesterone). La successiva

terapia con le gonadotropine viene modulata in base alla risposta individuale di

ciascuna paziente.

Quando lo sviluppo dei follicoli e i livelli ormonali fanno ritenere che un numero

soddisfacente di ovociti abbia raggiunto un’adeguata maturazione, viene

somministrata la gonadotropina corionica umana (human Chorionic Gonadotrophin,

hCG) per completare lo sviluppo dei follicoli e degli ovociti in essi contenuti.

Ecograficamente deve essere stata riscontrata la presenza di almeno quattro follicoli

con diametro medio >18 mm (due misure perpendicolari) e i livelli ormonali di

estradiolo devono essere compresi tra 1000 e 3000 pg/ml mentre quelli di

progesterone <1,5 ng/ml.

La maturazione finale viene indotta mediante la somministrate sottocutanea di 10.000 IU

di hCG (Gonasi HP 5000, Ibsa). Prima che avvenga l’ovulazione viene programmato il

prelievo degli ovociti (pick up), 34-36 ore dopo la somministrazione della hCG.

3.2 Pick-up ovocitario

Il prelievo degli ovociti è stato eseguito per via transvaginale sotto controllo

ecografico in anestesia locale o in lieve sedazione intravenosa.

La tecnica consiste nell’introduzione in vagina di una sonda ecografica, a cui è

collegato un supporto che consente ad un sottile ago di raggiungere, attraverso la

parete vaginale, i follicoli ovarici, che vengono aspirati singolarmente. Il contenuto di

ciascun follicolo (liquido follicolare ed ovocita) viene prelevato grazie ad un sistema di

aspirazione e raccolto mediante un tubicino all’interno di una provetta sterile.

40

3.3 Recupero degli ovociti

Il contenuto delle provette è stato esaminato in laboratorio mediante uno

stereomicroscopio (Nikon SMZ645), che consente la visualizzazione tridimensionale

del campione. In seguito alla loro identificazione, i complessi cumulo-ovocita

vengono lavati in un mezzo tamponato (Human Tubal Fluid (HTF) + HEPES, Sage,

U.S.A.) supplementato con il 10% di albumina umana (Human Serum Albumin,

HSA, Sage, U.S.A.)

3.4 Microscopia a contrasto di fase

Per cercare di visualizzare il primo corpo polare e l’aspetto del citoplasma, i

complessi cumulo-ovocita vengono strisciati su una piastra e successivamente

osservati all’invertoscopio a contrasto di fase (Nikon TE2000-U ECLIPSE), ad un

ingrandimento di 400x.

3.5 Microscopia ottica ed elettronica

L’analisi strutturale degli ovociti si effettua mediante l’osservazione al microscopio

ottico, mentre l’analisi ultrastrutturale si esegue tramite osservazione al microscopio

elettronico a trasmissione.

Questo dipende dal diverso potere di risoluzione dei due microscopi, ovvero la

distanza minima alla quale due oggetti possono essere ancora distinti come separati,

41

che è indirettamente proporzionale alla lunghezza d’onda della radiazione utilizzata.

Il microscopio ottico, che sfrutta come sorgente la luce visibile, di lunghezza d’onda

elevata, ha un limite di risoluzione di circa 0,3 µm, mentre il microscopio elettronico

a trasmissione, che utilizza come sorgente un fascio di elettroni, caratterizzati da una

lunghezza d’onda molto piccola, è dotato di un potere risolutivo molto maggiore, di

circa 2 nm.

Tra gli ovociti classificati come maturi all’invertoscopio, l’osservazione al LM e al

TEM è stata limitata alla popolazione di buona qualità, in quanto la loro analisi ha un

maggiore impatto clinico. Infatti solo gli ovociti che appaiono normali

all’invertoscopio vengono selezionati di routine per il loro utilizzo nei cicli di PMA.

In totale sono stati selezionati 61 complessi cumulo-ovocita.

3.5.1 Processamento degli ovociti

Per consentirne l’analisi strutturale ed ultrastrutturale, i campioni devono essere

sottoposti ad una serie di fasi di preparazione: fissaggio, post-fissaggio,

disidratazione, inclusione in resina, sezionamento e colorazione delle sezioni

ottenute.

Un totale di 31 complessi cumulo-ovocita (13 appartenenti al gruppo A e 18 al

gruppo B) sono stati fissati subito dopo la loro osservazione al microscopio invertito,

mentre i rimanenti 30 (12 appartenenti al gruppo A e 18 al gruppo B) sono stati

mantenuti in coltura per 24 ore (37°C, 5% CO2) in gocce di Fertilization Medium

(Quinn’s Advantage Medium, Sage U.S.A.) supplementato con albumina umana

(HSA, Sage U.S.A.) al 10%, prima di procedere con il fissaggio.

42

Il fissaggio è stato eseguito ponendo i complessi cumulo-ovocita in una soluzione 1:3

Fertilization Medium (Quinn’s Advantage Medium, Sage U.S.A.): glutaraldeide

2,5% (SIC, Roma, Italia) in PBS e mantenendoli, stoccati in eppendorf, per 2-5

giorni a 4°C.

Dopo il fissaggio i campioni sono stati lavati in PBS, post-fissati con tetrossido di

osmio (Agar Scientific, Stansted, Regno Unito) 1% in PBS per un’ora e mezza e

sciacquati nuovamente in PBS.

Gli ovociti sono stati poi inclusi in piccoli blocchi di agar all’1% delle dimensioni di

circa 5x5x1 mm e disidratati in etanolo (Carlo Erba Reagenti, Milano, Italia) in

concentrazioni crescenti (30%, 50%, 70%, 95%, 100%). I primi tre passaggi di

disidratazione sono stati effettuati per dieci minuti; i successivi due per quindici

minuti.

I campioni disidratati sono stati poi immersi per un’ora e mezza in ossido di propilene

(BDH Italia, Milano, Italia) per la sostituzione del solvente e infine incorporati in

resina, ottenuta dalla miscelazione di Epon 812 (47%), DDSA (24%), MNA (28%) e

DMP30 (1%) (Agar Scientific, Stansted, Regno Unito). L’inclusione è stata

inizialmente condotta overnight in una “prima resina”, costituita da ossido di propilene

e resina in rapporto 1:1. Il giorno successivo è stata aggiunta resina in sostituzione

dell’ossido di propilene e il campione è stato lasciato per due giorni in stufa a 50°C per

la polimerizzazione della resina. I blocchetti di resina con i campioni inclusi sono stati

poi sezionati utilizzando un ultramicrotomo Leika Ultracut.

Per consentirne l’analisi microscopica al LM e al TEM è necessario ottenere, dai

campioni, sezioni di adeguato spessore, che possano essere attraversate

rispettivamente dalla luce e dagli elettroni, emessi dalle sorgenti dei microscopi.

43

Per l’osservazione al LM sono state ottenute sezioni dello spessore di 1 µm

(semifini), utilizzando una lama di vetro mentre, per l’osservazione al TEM è stata

utilizzata una lama di diamante, che permette di ottenere sezioni molto sottili, dello

spessore di 60-80 nm (ultrasottili), in quanto i raggi elettronici sono dotati di scarso

potere di penetrazione.

Per ciascun campione sono state analizzate tre sezioni equatoriali semifini e tre

sezioni equatoriali ultrasottili. Le tre sezioni sono state effettuate a una distanza di 3-

4 µm l’una dall’altra.

Le sezioni semifini sono state recuperate con un ciglio sistemato all’apice di un

bastoncino, poste su vetrini portaoggetti e colorate con il blu di toluidina. I campioni

sono stati poi esaminati al microscopio ottico (Zeiss Axioskop) e fotografati con una

fotocamera digitale (Leica DFC230). Le immagini ottenute al massimo

ingrandimento (100x) sono state ricostruite con la tecnica del Photomerge

(Photoshop CS3).

Le sezioni ultrasottili sono state raccolte su griglie di rame 150 mesh e contrastate

con acetato di uranile saturato (SIC, Roma, Italia) seguito da citrato di piombo (SIC,

Roma, Italia). I campioni sono stati poi esaminati utilizzando due microscopi

elettronici a trasmissione operanti a 80 KV: lo Zeiss EM 10 e il Philips TEM

CM100. Le immagini sono state acquisite usando una fotocamera digitale (Gatan).

3.5.2 Analisi dei parametri morfologici

Per la valutazione della preservazione strutturale e ultrastrutturale degli ovociti

tramite LM e TEM sono stati presi in considerazione i seguenti parametri

44

morfologici di analisi qualitativa, tenendo come riferimento quelli descritti da Motta

et al. (1988) e da Khalili et al. (2012):

- caratteristiche generali dell’ovocita (forma, dimensioni, aspetto dell’ooplasma)

(Fig 1.1)

- integrità della membrana plasmatica (Fig 1.1 e 1.5)

- aspetto e spessore della zona pellucida (Fig 1.1 e 1.5, ZP)

- presenza e aspetto del fuso meiotico (Fig 1.2, mt: microtubuli del fuso; cr:

cromosomi)

- microtopografia e qualità degli organelli (Fig 1.3: mitocondri -M, aggregati di

mitocondri e tubuli di reticolo endoplasmatico liscio -REL, complessi di

mitocondri e vescicole -V- di reticolo endoplasmatico liscio)

- numero, pattern e morfologia dei microvilli (Fig 1.4, m)

- numero, pattern e densità della matrice dei granuli corticali (Fig 1.4, GC)

- spazio perivitellino (Fig 1.5, *): ampiezza, presenza di granularità, presenza e

caratteristiche del primo corpo polare (1° CP)

- presenza di vacuoli e lisosomi (Fig 1.6, Va e frecce)

45

Fig 1. Caratteristiche strutturali (1) e ultrastrutturali (2-6) dell’ovocita umano maturo. Tratto da: Nottola et al., 2012.

3.5.2.1 Analisi statistica

L’analisi statistica è stata condotta su 5 parametri morfologici: spessore della zona

pellucida (Zona Pellucida thickness, ZPt), numero di granuli corticali (Cortical

Granules, CG), numero di microvilli (Mv), densità di aggregati di mitocondri e

tubuli di REL (Mitochondria-Smooth Endoplasmic Reticulum, M-SER) e densità di

complessi mitocondri-vescicole (Mitochondria-Vesicle Complex, MVC), valutati

46

mediante l’acquisizione di microfotografie al TEM all’ingrandimento di 6300x. Le

immagini sono state ulteriormente ingrandite sullo schermo di un PC in modo da

permettere facilmente la conta delle strutture in esame, i cui valori sono stati espressi

come:

a) numero di M-SER per 10 µm2 di area citoplasmatica

b) numero di MVC per 10 µm2 di area citoplasmatica

c) numero di CG per 10 µm di superficie lineare

d) numero di Mv per 10 µm di superficie lineare

Ciascuno dei 5 parametri morfologici è stato valutato all’interno dei 4 gruppi oggetto

dello studio:

gruppo <35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età inferiore a 35 anni

gruppo <35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età inferiore a 35 anni

gruppo ≥35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età uguale o superiore a 35 anni

gruppo ≥35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età uguale o superiore a 35 anni

Per ciascun parametro è stato calcolato il valore medio e la deviazione standard (DS).

I dati sono stati confrontati mediante un’analisi di varianza a due vie ANOVA,

ponendo come variabili indipendenti (fattori di raggruppamento) l’età e la coltura in

vitro, seguita dal test HSD (Honestly Significant Difference) di Tukey, utilizzando il

software ezANOVA. I risultati sono stati considerati significativi con valori di

p<0,05.

47

4. Risultati

48

In tutti i campioni era riconoscibile, in posizione centrale, un ovocita di forma

rotonda, con un diametro compreso tra 90 e 100 µm e un citoplasma omogeneo. La

membrana plasmatica appariva intatta e circondata da uno stretto spazio perivitellino,

più ampio nel punto in cui era presente il corpo polare, nelle sezioni effettuate su

piani appropriati. Lo spazio perivitellino era regolare e contenente talvolta materiale

granulare disperso.

La zona pellucida appariva intatta e continua e occasionalmente al suo interno erano

visibili residui di prolungamenti citoplasmatici delle cellule del cumulo (Cumulus

Cells, CCs).

In sezioni favorevoli è stato osservato sporadicamente il fuso meiotico.

Tutti i campioni mostravano un numero variabile di strati di cellule del cumulo

compreso tra quattro e sette.

Nei campioni fissati all’aspirazione era presente un cumulo espanso con grandi spazi

intercellulari. Le cellule più vicine all’ovocita avevano una forma allungata mentre le

periferiche avevano una forma cuboidale.

Tutti i campioni mantenuti in coltura per 24 h presentavano un cumulo collassato

costituito da cellule di forma sferica o cuboidale, strettamente adiacenti l’una

all’altra, senza differenze tra cellule periferiche e cellule vicine all’ovocita.

49

Gruppo <35

A basso ingrandimento negli ovociti fissati all’aspirazione di donne giovani è stato

osservato un abbondante numero di organelli, uniformemente distribuiti

nell’ooplasma. A ingrandimento maggiore, gli organelli consistevano principalmente

di mitocondri di forma sferica o ovale, con un diametro variabile tra 0,5 e 0,8 µm e

una matrice moderatamente elettrondensa. I mitocondri erano frequentemente

associati con tubuli di reticolo endoplasmatico liscio anastomizzati tra loro a formare

gli aggregati M-SER (Fig 2d). Questi aggregati erano molto numerosi (2,89±0,68 per

10 µm2) e di dimensioni variabili; solitamente gli aggregati di dimensioni maggiori si

trovavano localizzati nell’area corticale dell’ooplasma.

Meno frequentemente i mitocondri sono stati trovati in associazione con piccole

vescicole sferiche, del diametro di 0,2-0,3 µm, contenenti un materiale leggermente

elettrondenso, a formare i complessi mitocondri-vescicole. Queste strutture, in cui i

mitocondri circondano le vescicole, erano presenti con una densità complessiva di

0,35±0,26 per 10 µm2.

Appena sotto la membrana plasmatica era presente un pattern continuo di granuli corticali

(Fig 2b,c) (11±1,41 per 10 µm), di diametro variabile compreso tra 300 e 400 nm.

Lo spazio perivitellino era stretto e più ampio in corrispondenza del primo corpo

polare (nelle sezioni che giacevano su piani appropriati).

I microvilli (Fig 2c), sporgenti nello spazio perivitellino, erano normali per quantità

(11,18±1,54 per 10 µm), distribuzione e forma. Esternamente era presente una zona

pellucida di struttura normale (Fig 2 a,b,c), dello spessore medio di 18,32±1,93 µm.

50

Il cumulo si presentava espanso (Fig 2a) e le cellule mostravano un nucleo ovale con

uno o più nucleoli. Dispersi nel citoplasma sono stati riscontrati numerosi

mitocondri, gocce lipidiche elettrondense e cisterne appartenenti al complesso di

Golgi.

Fig 2. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo <35

Gruppo <35c

Rispetto al gruppo precedente, il citoplasma degli ovociti delle donne appartenenti

alla stessa classe di età, ma sottoposti a invecchiamento in vitro, mostrava una

riduzione dei complessi M-SER (Fig 3 b,c) (1,80±0,35 per 10 µm2) e un incremento

nella quantità di MVC (Fig 3d) (1,31±0,36 per 10 µm2). Le vescicole erano dotate di

una membrana intatta e di un contenuto elettrondenso. Il loro diametro medio era

inferiore a 1 µm.

51

Complessivamente si osservava una riduzione del numero di granuli corticali

(8,73±0,79 per 10 µm2) e la loro assenza in alcuni distretti suboolemmali.

Occasionalmente è stata osservata una loro parziale internalizzazione.

Sulla superficie della membrana plasmatica regioni con un pattern tipico di

microvilli si alternavano ad aree totalmente prive di queste strutture, di conseguenza

il numero totale di microvilli appariva significativamente ridotto (9,45 ±1,13 per 10

µm).

La ZP (Fig 3b) presentava una tessitura regolare e uno spessore sostanzialmente

invariato rispetto al gruppo precedente (18,27±1,74 µm).

Il cumulo era collassato (Fig 3a) ma a livello ultrastrutturale le CCs erano

sovrapponibili a quelle osservate negli ovociti fissati all’aspirazione di donne

giovani.

Fig 3. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo <35c

52

Gruppo ≥35

Negli ovociti fissati all’aspirazione delle pazienti in età riproduttiva avanzata si

osservavano quantità ridotte di M-SER (Fig 4c) (8,73±0,79 per 10 µm2), che

presentava anche una riduzione delle dimensioni, e un aumento di MVC, sia nel

numero (2,05±0,48 per 10 µm2) che nelle dimensioni. A maggiore ingrandimento le

vescicole di questi complessi apparivano di forma rotonda o allungata e molto

grandi, raggiungendo il diametro di 2-3 µm, ma comunque sostanzialmente intatte

(Fig 4c,d).

Il numero dei CG (7,45±1,37 per 10 µm) era ridotto in maniera molto significativa

rispetto a quello osservato nei due gruppi di ovociti di donne giovani.

Occasionalmente sono stati rilevati dei lisosomi.

Sulla superficie dell’oolemma i microvilli (Fig 4b) erano presenti in scarso numero

(6,00±1,00 per 10 µm): zone con pochi microvilli e dalla struttura atipica, più corta e

sottile del normale, si alternavano ad aree dall’aspetto liscio.

La trama della ZP (Fig 4b) era normale, contrariamente al suo spessore (21,73±1,79

µm), significativamente aumentato rispetto a quello osservato negli ovociti di

entrambi i gruppi di donne giovani.

Il cumulo si presentava espanso (Fig 4a), ma anche in questo caso le CCs non

mostravano caratteristiche ultrastrutturali particolari.

53

Fig 4. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo ≥35

Gruppo ≥35c

Negli citoplasma degli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata e sottoposti a

coltura per 24 h si osservava un ulteriore decremento della quantità di M-SER

(0,57±0,31 per 10 µm2) nonché delle sue dimensioni, mentre i complessi MV (Fig

5c) aumentavano significativamente in numero (3,19±0,40 per 10 µm2) e in

dimensioni, diventando la struttura più rilevante dell’ooplasma. A maggiore

ingrandimento diverse vescicole mostravano una forma irregolare (Fig 5d, freccia),

raggiungendo anche la lunghezza di 4 µm, la rottura delle membrane delimitanti e un

contenuto elettron-trasparente. I CG erano ridotti drasticamente in numero

(2,55±1,37 per 10 µm) e grandi aree al di sotto dell’oolemma ne erano

completamente prive. Occasionalmente sono stati rilevati dei lisosomi.

54

La quantità di microvilli era minima (4,73±1,13 per 10 µm), inoltre, quando presenti,

mostravano uno sviluppo fortemente ridotto. Di conseguenza la superficie

dell’oolemma risultava quasi liscia.

Lo spessore della ZP (21,55±1,57 µm) non differiva significativamente da quello

degli ovociti di donne della stessa classe di età e non sottoposti a invecchiamento in

vitro, ma nella sua parte interna era osservabile un certo aumento dell’elettrondensità

(Fig 5b, *).

Il cumulo si presentava collassato, con CCs dall’aspetto complessivamente

comparabile a quello degli altri campioni (Fig 5a).

Fig 5. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo ≥35c

55

4.1 Risultati dell’analisi statistica

<35 <35c ≥35 ≥35c P P Parametri esaminati Media (DS) Età Coltura M-SER 2,89 (0,68) 1,80 (0,35) 0,97 (0,28) 0,57 (0,31) <0,000001 <0,000001 MVC 0,35 (0,26) 1,31 (0,36) 2,05 (0,48) 3,19 (0,40) <0,000001 <0,000001 CG 11,00 (1,41) 8,73 (0,79) 7,45 (1,37) 2,55 (1,37) <0,000001 <0,000001 Mv 11,18 (1,54) 9,45 (1,13) 6,00 (1,00) 4,73 (1,13) <0,000001 <0,000233 ZPt 18,32 (1,93) 18,27 (1,74) 21,73 (1,79) 21,55 (1,57) <0,000001 <0,831740

Tabella 1. Analisi di varianza a due vie ANOVA

L’analisi di varianza a due vie ANOVA ha mostrato i seguenti risultati:

- Effetto dell’età

Gli effetti dell’età erano statisticamente significativi per tutti i parametri valutati.

- Effetto della coltura

Gli effetti della coltura erano statisticamente significativi per tutti i parametri

valutati, eccetto per ZPt.

56

Grafico 1. Test HSD (Honestly Significant Difference) di Tukey

Aggregati M-SER

Gli ovociti delle pazienti appartenenti al gruppo <35 presentavano numerosi

(2,89±0,68 per 10 µm2) aggregati M-SER, di dimensioni variabili. I mitocondri erano

sferici o ovali, con un diametro variabile tra 0,5 e 0,8 µm e una matrice

moderatamente elettrondensa.

Il confronto tra i gruppi mostrava un andamento decrescente nella quantità dell’M-

SER (0,97±0,28 per 10 µm2 nel gruppo <35c; 1,80±0,35 per 10 µm2 nel gruppo ≥35 e

0,57±0,31 per 10 µm2 nel gruppo ≥35c) con differenze statisticamente molto

significative (p<0,01) tra tutti i gruppi nelle comparazioni a coppie (Grafico 1).

57

MVC

Gli ovociti fissati all’aspirazione delle pazienti giovani esibivano pochi complessi

MV (0,35±0,26 per 10 µm2) di piccole dimensioni, confermando quanto riportato in

letteratura (Sundstrom et al., 1985; Szollosi et al., 1986; Motta et al., 1988; El Shafie

et al., 2000).

L’aumento crescente rilevato nella quantità degli MVC (1,31±0,36 per 10 µm2;

2,05±0,48 per 10 µm2 e 3,19±0,40 per 10 µm2 rispettivamente nei gruppi <35c, ≥35 e

≥35c) mostrava differenze statisticamente molto significative (p<0,01) in tutte le

comparazioni a coppie (Grafico 1).

CG

Gli ovociti del gruppo <35 mostravano un pattern continuo di granuli corticali

elettrondensi (11±1,41 per 10 µm), di diametro variabile tra 300 e 400 nm, localizzati

appena al di sotto della membrana plasmatica. Si osservava un trend decrescente nel

numero dei CG (8,73±0,79 per 10 µm in <35c; 7,45±1,37 per 10 µm in ≥35 e

2,55±1,37 per 10 µm in ≥35c) con differenze statisticamente molto significative

(p<0,01) in quasi tutte le comparazioni a coppie. Solo la differenza tra i gruppi <35c

e ≥35 era meno evidente, ma comunque statisticamente significativa (p<0,0146)

(Grafico 1).

58

Mv

Negli ovociti del gruppo <35 i microvilli apparivano normali per morfologia e

numero (11,18±1,54 per 10 µm). Negli ovociti delle pazienti giovani sottoposti a

invecchiamento in vitro (<35c) i microvilli mantenevano la loro morfologia, ma il

loro numero era significativamente ridotto (9,45±1,13 per 10 µm).

Nel gruppo ≥35, la superficie dell’oolemma degli ovociti presentava microvilli rari e

atipici (6,00±1,00 per 10 µm).

Nel gruppo ≥35c sono stati osservati ovociti con un numero molto scarso di

microvilli dallo sviluppo fortemente ridotto (4,73±1,13 per 10 µm) e la superficie

dell’oolemma risultava quasi liscia. La comparazione a coppie mostrava una

differenza altamente significativa tra tutti i gruppi (p<0,01), con l’eccezione della

differenza tra i gruppi ≥35 e ≥35c, minore ma comunque statisticamente significativa

(p<0,05) (Grafico 1).

ZPt

Contrariamente agli altri parametri analizzati, lo spessore medio della zona pellucida

è influenzato solamente dall’età (p<0,000001). La coltura (p<0,831740) non sembra

avere effetto su questo parametro (Tab 1).

Lo spessore medio della zona pellucida era comparabile tra i gruppi di ovociti di

donne giovani, essendo di 18,32±1,93 µm nel gruppo <35 e di 18,27±1,74 µm nel

gruppo <35c. Allo stesso modo non si riscontravano differenze significative tra i

valori osservati nei gruppi di ovociti di donne in età riproduttiva avanzata

59

(rispettivamente 21,73±1,79 µm in ≥35 e 21,55±1,57 µm in ≥35c) sebbene la ZP in

quest’ultimo gruppo presentasse un certo aumento dell’elettrondensità nella parte

interna.

60

5. Discussione

61

L’esito della PMA è strettamente dipendente dalle caratteristiche morfo-funzionali

dell’ovocita (Nottola et al., 2007). Infatti, nel periodo preovulatorio, il gamete

femminile va incontro ad una serie di cambiamenti maturativi che, in assenza di

alterazioni degenerative o dismorfismi, lo rendono competente per la fecondazione e

capace di generare un embrione vitale (Familiari et al., 2006).

La valutazione della morfologia degli ovociti al PCM è un indicatore importante e

insostituibile della qualità ovocitaria, ancora in uso per valutare il successo di un dato

protocollo di PMA. Comunque essa consente solamente un’analisi morfologica

semplice, non adeguata per determinare il potenziale di fecondazione e la

competenza di sviluppo ovocitaria (Khalili et al., 2005).

L’analisi al microscopio elettronico a trasmissione, grazie al suo elevato potere di

risoluzione, consente un esame molto più dettagliato e di conseguenza una migliore

comprensione delle caratteristiche subcellulari dell’ovocita. Evidenziando anche

minime alterazioni substrutturali, non diagnosticabili mediante gli approcci

morfologici utilizzati di routine nei centri di PMA, la microscopia elettronica può

essere in grado di chiarire le cause responsabili di fallimenti altrimenti inspiegabili

nell’ambito delle procedure di fecondazione assistita (Motta et al., 1988;

Sathananthan et al., 1993; El Shafie et al., 2000).

Tuttavia, sebbene consentano di esaminare accuratamente l’ultrastruttura cellulare, le

tecniche di microscopia elettronica presentano importanti limitazioni, principalmente

l’alto costo e la necessità di personale altamente addestrato. Inoltre la preparazione

dei campioni e la loro osservazione sono processi lunghi e quasi completamente

manuali, il che rende difficoltosa l’analisi di un numero ampio di campioni (Khalili

et al., 2012).

62

Negli ultimi anni le tecnologie di riproduzione assistita hanno subito un significativo

miglioramento ma l’invecchiamento ovocitario rimane uno dei principali fattori

limitanti per il successo della PMA. In questa tesi è stata valutata l’ultrastruttura di

ovociti invecchiati con lo scopo di stabilire la presenza, l’entità e il significato dei

cambiamenti subcellulari che possono verificarsi durante il processo

dell’invecchiamento.

Come già esposto nella sezione “materiali e metodi” si è deciso di limitare l’analisi

ultrastrutturale ai soli ovociti che presentavano una buona qualità al microscopio a

contrasto di fase, in quanto questi sono gli ovociti che vengono utilizzati nella

routine clinica.

Gli ovociti fissati all’aspirazione di donne giovani (età inferiori a 35 anni),

mostravano le caratteristiche ultrastrutturali tipiche degli ovociti MII ideali: MVC

piccoli e scarsamente rappresentati (0,35±0,26 per 10 µm2) ed aggregati M-SER ben

rappresentati (2,89±0,68 per 10 µm2), una quantità adeguata di CG e di Mv

(rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10 µm). Lo spessore medio della ZP era

18,32±1,93 µm.

Negli ovociti di donne giovani ma soggetti a invecchiamento in vitro si osservava un

aumento della densità di MVC (1,31±0,36 per 10 µm2) ed una contemporanea

riduzione dei complessi M-SER (1,80±0,35 per 10 µm2) e, in misura più lieve, dei

CG e degli Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10 µm). Lo spessore

medio della ZP era 18,27±1,74 µm.

Negli ovociti fissati all’aspirazione di donne in età riproduttiva avanzata (≥ 35 anni)

gli MCV sono presenti in numero maggiore (2,05±0,48 per 10 µm2), i complessi M-

SER erano scarsi (0,97±0,28 per 10 µm2) e si osservava una ulteriore riduzione dei

63

CG e degli Mv (rispettivamente 7,45±1,37 e 6±1 per 10 µm). Lo spessore medio

della ZP era 21,73±1,79 µm.

Negli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata ma soggetti a invecchiamento in

vitro si osservava un aumento notevole della densità degli MVC (3,19±0,40 per 10

µm2) e una marcata diminuzione dei complessi M-SER (0,57±0,31 per 10 µm2). Si

notava anche una riduzione della quantità di CG e di Mv (rispettivamente 2,55±1,37 e

4,73±1,13 per 10 µm). Lo spessore medio della ZP era 21,55±1,57 µm.

Le variazioni numeriche, tutte statisticamente significative, mostrano un andamento

graduale, essendo minime nel gruppo <35c, più evidenti nel gruppo ≥35 e molto

accentuate nel gruppo ≥35c.

Nel caso dello spessore della ZP non si osserva un andamento graduale ma

differenze dovute solamente all’età.

Per valutare meglio le cause e le conseguenze dei cambiamenti osservati negli

organelli in esame è necessario esaminare ciascun elemento individualmente.

M-SER e MVC

A partire dalla loro scoperta nel diciannovesimo secolo, i mitocondri sono stati

considerati dei “parassiti” cellulari, originati dall’incorporazione, in cellule primitive,

di batteri aventi un proprio metabolismo ossidativo (Jansen and de Boer, 1998).

Questa teoria ha ricevuto supporto da studi biochimici e di microscopia elettronica,

che hanno rivelato che i mitocondri contengono propri DNA (mtDNA), ribosomi e

RNA (Smith and Alcivar, 1993). Il genoma mitocondriale non segue le leggi

64

dell’eredità mendeliana, ma viene trasmesso da una generazione alla successiva con

il citoplasma ovocitario, una modalità conosciuta come “eredità citoplasmatica”

(Jansen and de Boer, 1998). L’eredità citoplasmatica, in contrasto con l’eredità

nucleare, avviene quasi esclusivamente per via materna, sebbene sia stato accertato

un ruolo per il centriolo prossimale dello spermatozoo fecondante

nell’organizzazione del fuso mitotico delle prime divisioni embrionali (Sathananthan

et al., 1996; Palermo et al., 1997).

Nelle prime fasi di sviluppo embrionale non vengono prodotti nuovi mitocondri, di

conseguenza l’embrione è totalmente dipendente dai mitocondri ereditati dalla madre

(Sathananthan et al., 2006).

I mitocondri rappresentano gli organelli più abbondanti riscontrati nell’ooplasma degli

ovociti fissati all’aspirazione di pazienti giovani, in cui si trovano generalmente

organizzati con elementi tubulari di reticolo endoplasmatico liscio a formare aggregati

M-SER di varie dimensioni; meno frequentemente i mitocondri si ritrovano associati

con vescicole di reticolo endoplasmatico liscio a formare piccoli complessi MV

(Sundstrom et al., 1985; Szollosi et al., 1986; Motta et al., 1988; El Shafie et al., 2000).

Durante la maturazione dell’ovocita, l’aggregazione dei tubuli di SER sembra essere

il primo dei fenomeni a comparire; successivamente tali tubuli vengono circondati

dai mitocondri, costituendo gli aggregati M-SER; questi ultimi, a loro volta,

rappresentano probabilmente i precursori dei complessi MV che compaiono più

tardi, solo durante la fase finale di maturazione citoplasmatica dell’ovocita

(Sundstrom et al., 1985; Motta et al., 1988, 2003).

65

A sostegno dell’ipotesi della generazione dei complessi MV a partire dagli aggregati M-

SER vi sono le osservazioni al TEM, in cui sono state riscontrate figure di transizione

con caratteristiche intermedie tra tubuli e vescicole (Motta et al., 1988).

La presenza di complessi MV grandi e numerosi è una caratteristica non comune degli

ovociti umani maturi ed è considerata un processo degenerativo (El Shafie et al., 2000).

A questo proposito, gli MVC non devono essere confusi con i vacuoli, caratterizzati

da una membrana delimitante interrotta e da un contenuto traslucente, scarsamente

elettrondenso rispetto al citoplasma circostante e pressoché identico a quello presente

nello spazio perivitellino. I vacuoli, normalmente assenti nell’ovocita umano maturo,

si formano in risposta a un danno cellulare, come per esempio nel corso di procedure

di criopreservazione ovocitaria (Nottola et al., 2007, 2008; Coticchio et al., 2010;

Khalili et al., 2012).

Le osservazioni originali effettuate nel presente studio rivelano che durante

l’invecchiamento degli ovociti maturi, sia fisiologico che dovuto alla coltura in vitro,

l’equilibrio reciproco di M-SER/MVC è compromesso, si osserva infatti un generale

decremento nella densità degli aggregati M-SER e un proporzionale incremento degli

MVC. Questo suggerisce che in entrambi i tipi di invecchiamento si verifichi un

progressivo rigonfiamento e vescicolazione dei tubuli SER, sebbene sia necessario

chiarire le differenze osservate tra i diversi gruppi.

Negli ovociti di donne giovani coltivati in vitro, si è osservato un aumento dei

complessi MV, che rimpiazzavano gli aggregati M-SER. Tuttavia le vescicole erano

di piccole dimensioni (inferiori a 1 µm), moderatamente elettrondense e

sostanzialmente intatte. Anche nell’invecchiamento riproduttivo i complessi MV

rappresentavano una percentuale cospicua degli organelli citoplasmatici a spese

66

dell’M-SER, ma si osservava un considerevole rigonfiamento delle vescicole (circa

2-3 µm). L’interazione tra invecchiamento riproduttivo e invecchiamento in vitro

causa uno sconvolgimento drammatico del bilancio M-SER/MVC e gli MVC

diventano gli organelli più rappresentati nell’ooplasma. Inoltre numerose vescicole

mostravano la rottura delle membrane e il rilascio del loro contenuto, diventando

elettrontrasparenti e dando inizio ad una vacuolizzazione citoplasmatica.

Il rigonfiamento e la vescicolazione del reticolo endoplasmatico liscio è stato messo

in relazione con lo stress ossidativo (de Bruin et al., 2004), ma potrebbe anche

essere dovuto all’ingresso di acqua in seguito a condizioni colturali non ottimali

(Ghadially, 1982).

I risultati del presente studio suggeriscono che gli ovociti più giovani reagiscano

meglio all’invecchiamento in vitro, mantenendo l’integrità delle vescicole, mentre gli

ovociti di donne in età avanzata sembrano essere più sensibili, probabilmente in

quanto sono già stati danneggiati all’interno dell’ambiente ovarico. Condizioni di

coltura subottimali quindi, agendo su un SER già compromesso, provocherebbero

una dilatazione ulteriore e la rottura delle vescicole, con trasformazione in veri

vacuoli. Questo è in linea con quanto osservato da de Bruin et al. (2004) per il pool

di follicoli quiescienti di donne in età avanzata. Precedentemente alcuni autori

avevano suggerito che la transizione M-SER/MCV fosse accelerata e incrementata

dalla permanenza in coltura dell’ovocita: infatti generalmente negli ovociti maturi i

complessi MV sono piccoli e scarsamente rappresentati, mentre sono grandi e

numerosi negli ovociti che sono stati maturati in vitro o che sono stati tenuti in

coltura per lungo tempo (Sathananthan et al., 1993, 2006; El Shafie et al., 2000). Le

nostre valutazioni morfometriche e quantitative confermano questa ipotesi ed

67

aggiungono una nuova informazione: un simile fenomeno ultrastrutturale si verifica

nell’invecchiamento riproduttivo.

Sebbene gli elementi del REL associati ai mitocondri siano presenti in diverse forme

(tubuli e vescicole: M-SER e MVC), essi appartengono allo stesso apparato

funzionale.

Questi particolari sistemi di membrane associate ai mitocondri sembrano possedere

diversi ruoli nell’ovocita:

- ricco pool di energia di riserva, necessaria per la fecondazione e per le prime fasi

di sviluppo embrionale

- produzione/secrezione di sostanze (nutrienti, fattori di crescita) utili per la

fecondazione e/o per le prime fasi di sviluppo embrionale

- neogenesi di membrane necessarie per la fecondazione e per le prime divisioni

cellulari (Motta et al., 1988, 2000, 2003)

- regolazione della concentrazione intracellulare di ioni calcio (Sousa et al., 1997;

Makabe et al., 2006a).

I segnali del calcio sono coinvolti nel controllo di molti eventi che si verificano

durante la fecondazione e le prime fasi di sviluppo embrionale: l’avvio

dell’attivazione ovocitaria (Swann and Ozil, 1994), lo sviluppo dei pronuclei e la

singamia (Poenie et al., 1985; Gillot and Whitaker, 1994) e il ciclo cellulare nel

corso dello sviluppo embrionale precoce (Poenie et al., 1985; Whitaker and Patel,

1990; Hepler, 1992). Quindi, la disorganizzazione morfologica delle strutture di

deposito del calcio (REL), con possibile alterazione del loro contenuto, può

rappresentare l’evidenza ultrastrutturale di pathways di calcio compromessi, e di

conseguenza di una ridotta fecondabilità e competenza di sviluppo.

68

Gli eventi di attivazione ovocitaria includono l’esocitosi dei granuli corticali (con il

conseguente blocco della polispermia), la ripresa del ciclo cellulare e il reclutamento

degli mRNA materni (Schultz and Kopf, 1995).

Negli ovociti di mammifero l’ingresso dello spermatozoo fecondante induce drastici

cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio, consistenti in un singolo

aumento di lunga durata seguito da aumenti brevi e ripetitivi che durano per diverse

ore. Questi cambiamenti temporali nella concentrazione intracellulare di calcio sono

detti “oscillazioni di calcio” (Miyazaki, 2006).

Recentemente la presenza di aggregati di tubuli di REL particolarmente voluminosi

(dischi di REL), rilevabile anche tramite microscopia a contrasto di fase, è stata

messa in relazione con diversi esiti negativi nel corso delle procedure di PMA. Nel

limitato numero di studi presenti in letteratura dedicati esclusivamente a questo

dismorfismo strutturale è stato osservato un ridotto tasso di fecondazione e di

divisione embrionale (Sa et al., 2011), un ridotto tasso di formazione di blastocisti

(Ebner et al., 2008; Sa et al., 2011), di impianto e di gravidanza clinica (Otsuki et al.,

2004; Sa et al., 2011). La presenza di questi aggregati sembra inoltre essere associata

ad aborto precoce (Ebner et al., 2008), ad alcuni difetti di imprinting nei nati (es.

sindrome di Beckwith-Wiedemann) (Otsuki et al., 2004) e a diversi tipi di

malformazioni quali l’ernia del diaframma (Ebner et al., 2008) e lievi difetti cardiaci

(Sa et al., 2011). La “connessione molecolare” tra questo dismorfismo strutturale del

REL e gli esiti negativi sembra essere il livello di calcio intracellulare raggiunto in

seguito all’ingresso dello spermatozoo: rispetto agli ovociti normali, negli ovociti

che presentano questo fenotipo dismorfico il primo picco nella concentrazione di

69

calcio è significativamente superiore e di maggiore durata (Alpha Scientists in

Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embriology, 2011).

Alterazioni nelle oscillazioni di calcio sono state descritte da vari autori anche

nell’invecchiamento in vivo e in vitro. Negli ovociti invecchiati è stata osservata una

frequenza maggiore delle oscillazioni, mentre l’ampiezza dei singoli picchi era

ridotta in modo significativo (Igarashi et al., 1997; Takahashi et al., 2000, 2003,

2009). Questi dati si riferiscono purtroppo al topo, che viene usato come organismo

modello in quanto l’attuazione di ampi studi sugli ovociti umani è complicata da

problemi etici e dalla difficoltà nell’ottenere un numero sufficiente di ovociti per la

ricerca.

Per quanto riguarda i mitocondri associati alle membrane di reticolo endoplasmatico

liscio, le analisi al TEM del presente studio non rivelano nessuna variazione

ultrastrutturale degna di nota, così come è stato descritto anche da de Bruin et al.

(2004) per il pool di follicoli quiescienti di donne in età avanzata e da Sathananthan

(1997, 2013) e Van Blerkom (2011) per gli ovociti MII sottoposti a coltura in vitro.

In questi ultimi infatti i mitocondri cominciano a presentare alterazioni strutturali

dopo due o più giorni di coltura: tendono a raggrupparsi insieme, diventano più

elettrondensi, mostrano una matrice con granuli densi (Sathananthan, 1997, 2013) e

dopo 3 o 4 giorni presentano la comparsa di spazi traslucenti all’interno della matrice

(Van Blerkom, 2011).

E’ possibile che i tempi brevi di coltura utilizzati in questo studio (24h) non

permettano il verificarsi di alterazioni ultrastrutturali e probabilmente riproducono

meglio la situazione clinica reale. La frazione totale di mitocondri non è stata

quantificata perché il metodo appropriato di quantificazione è ancora dibattuto e le

70

immagini al TEM non sembrano essere adatte (Van Blerkom, 2011). Inoltre i livelli

di ATP in ovociti di donne di età superiore a 40 anni sembrano essere simili a quelli

presenti negli ovociti in donne giovani (Van Blerkom, 2011).

Così, sebbene il deficit bioenergetico sia uno dei più affascinanti fattori candidati per

il fallimento riproduttivo legato all’età, le considerazioni sopra riportate e i risultati

del presente studio suggeriscono che la causa non sia attribuibile ai mitocondri. Un

ruolo cruciale sembra invece che lo giochino i dismorfismi del REL, che possono

essere predittivi di alterazioni nel metabolismo del calcio. I dati del presente studio,

che hanno documentato un’importante transizione degli aggregati M-SER in

complessi MV negli ovociti invecchiati, sembrerebbero favorire questa ipotesi.

Lisosomi

I lisosomi sono organelli coinvolti nei fenomeni di autolisi/autodigestione del materiale

ovocitario e quindi sono correlabili alla degenerazione dell’ovocita stesso (Sathananthan

et al., 2006). Essi sono numerosi negli ovociti immaturi (Motta et al., 2003) e aumentano

in seguito ad invecchiamento in vitro prolungato (Sathananthan et al., 2006).

Nel presente studio sono stati riscontrati nelle pazienti in età riproduttiva avanzata.

Granuli corticali

I granuli corticali sono gli organelli più rappresentati nella zona corticale

dell’ooplasma degli ovociti umani maturi. Hanno origine dall’apparato di Golgi

71

quando l’ovocita è ancora immaturo e il loro numero aumenta progressivamente nel

corso della maturazione ovocitaria, con la migrazione verso l’oolemma

(Sathananthan et al., 1985, 2006; Familiari et al., 2006). Una volta terminata la

funzione di sintesi dei CG, l’apparato di Golgi si osserva solo occasionalmente,

venendo gradualmente rimpiazzato nell’ooplasma dal REL.

Nell’ovocita maturo i CG si trovano disposti linearmente in 1-3 file al di sotto della

membrana plasmatica, da cui sono separati da una rete di microfilamenti actinici

(Sathananthan, 1997; Sathananthan et al., 2006), che controlla il loro ancoraggio e

rilascio (Sun and Schatten, 2006).

I CG contengono glicosamminoglicani, proteasi, fosfatasi acida e perossidasi

(Strömsted and Byskov, 1999).

Sebbene questi granuli possano occasionalmente liberare il loro contenuto nello

spazio perivitellino indipendentemente dalla fecondazione (Lopata et al., 1980;

Szollosi et al., 1986), il rilascio fisiologico, immediato e massiccio del loro contenuto

(reazione corticale), avviene solo al momento dell’ingresso dello spermatozoo

fecondante. In seguito all’esocitosi del contenuto dei CG, nella porzione interna della

ZP si formano grandi aree in cui i filamenti che la costituiscono si compattano

strettamente insieme (reazione zonale). Questa modificazione della struttura della ZP

impedisce la penetrazione di altri spermatozoi (blocco della polispermia) (Familiari

et al., 1992, 2006).

Le osservazioni sul destino dei CG nel corso dell’invecchiamento umano sono scarse

e limitate all’invecchiamento in vitro, mentre gli studi condotti su animali modello

sono numerosi.

72

Nel topo sono state descritte numerose alterazioni morfologiche dei CG negli ovociti

recuperati da femmine in età riproduttiva avanzata (Peluso et al., 1980; Tarin et al.,

2001; Diaz and Esponda, 2004), durante l’invecchiamento post-ovulatorio in vivo

(Szollosi, 1971; Ducibella et al., 1990; Xu et al., 1997; Diaz and Esponda, 2004) e

durante l’invecchiamento in vitro (Dodson et al., 1989; Abbott et al., 1998).

Gli studi condotti sugli ovociti umani MII invecchiati in vitro mostrano risultati

contraddittori: Ducibella et al. (1995) riscontrarono il verificarsi dell’esocitosi dei

CG e il conseguente indurimento della zona pellucida, mentre Talevi et al. (1997)

osservarono una distribuzione normale dei CG, ma alterazioni intrinseche della ZP

(penetrazione all’interno della ZP di residui glucidici della matrice extracellulare

presente all’interfaccia tra ZP e corona radiata).

I risultati di questo studio evidenziano una riduzione nella quantità dei CG

subolemmali nei tre gruppi di ovociti invecchiati (<35c, ≥35 e ≥35c), rispetto agli

ovociti del gruppo “di controllo” <35. Questo fenomeno può avere una triplice

interpretazione: potrebbe riflettere un problema nella sintesi, una distribuzione

alterata o un’esocitosi prematura dei CG.

Negli ovociti invecchiati in vitro di donne giovani (gruppo <35c) è stato osservato un

certo grado di internalizzazione dei CG, ma l’elettrondensità della loro matrice

interna appare preservata, in linea con quanto osservato precedentemente da

Sathananthan (1997). Questo porterebbe ad escludere un difetto nella produzione, per

cui il fenomeno potrebbe essere attribuito ad una distribuzione difettiva

accompagnata da un lieve grado di esocitosi (in quanto la ZP non sembra presentare

alterazioni).

73

Tutti gli ovociti di donne in età avanzata (gruppi ≥35 e ≥35c), oltre alla significativa

riduzione della quantità, mostrano anche una riduzione della densità della matrice dei

CG. Questo suggerisce un deficit nella sintesi dei CG, ipotesi supportata dalla

presenza di un Golgi dilatato negli ovociti immaturi invecchiati (de Bruin et al.,

2004). Inoltre negli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata coltivati in vitro

(gruppo ≥35c) si verifica un’evidente compattamento della parte interna della ZP,

suggerendo il verificarsi di un maggior grado di esocitosi.

Microvilli

I microvilli sono estroflessioni digitiformi della membrana plasmatica contenenti uno

scheletro di filamenti di actina (Sathananthan, 1997). Essi esercitano un ruolo

fondamentale nella fecondazione, mediando il contatto e la fusione con lo

spermatozoo fecondante (Sathananthan et al., 1993).

I risultati di questo studio mostrano che gli ovociti di donne giovani fissati

all’aspirazione sono dotati di numerosi microvilli di aspetto normale, come descritto

precedentemente da diversi autori (Motta et al., 1988; Sathananthan et al., 1993,

2006; El Shafie et al., 2000; Familiari et al., 2006).

In tutti gli ovociti invecchiati, invece, sono stati osservati anomalie morfologiche e/o

e diversi gradi di riduzione della loro quantità, in linea con quanto osservato

precedentemente in altri studi (Pickering et al., 1988; Sathananthan, 1994). Dato il

ruolo fondamentale dei microvilli nella fecondazione, queste anomalie potrebbero

essere responsabili della ridotta fecondabilità osservata negli ovociti invecchiati.

74

Zona pellucida

Gli ovociti di mammifero sono circondati da una matrice extracellulare glicoproteica

detta zona pellucida (ZP), che nella specie umana è costituita da quattro

glicoproteine designate come ZP1-4 (Gupta et al., 2012). Osservata al TEM la ZP ha

un aspetto granulo-fibrillare e presenta un margine esterno irregolare e ruvido

(Familiari et al., 1992).

La zona pellucida si forma durante lo sviluppo preantrale del follicolo all’interfaccia

tra ovocita e cellule follicolari e, una volta completata la sua sintesi, permane attorno

all’ovocita durante le successive fasi della follicologenesi, al momento

dell’ovulazione e della fecondazione; successivamente, continua a circondare

l’embrione fino al momento dell’impianto in utero fungendo da barriera protettiva,

da filtro selettivo e mediando gli scambi tra l’ovocita/embrione e il microambiente

circostante (Motta et al., 2003).

Circondando l’embrione fino allo stadio di blastocisti, la zona pellucida previene

l’instaurarsi di gravidanze ectopiche, dovute ad un impianto embrionale prematuro

(Familiari et al., 2006).

La ZP inoltre gioca un ruolo cruciale durante la fecondazione, mediando il legame

specie-specifico con gli spermatozoi, l’induzione della reazione acrosomiale e la

prevenzione della polispermia (Gupta et al., 2012).

Inizialmente gli spermatozoi capacitati con l’acrosoma intatto si legano alle

glicoproteine ZP1, ZP3 e ZP4. Questo legame induce la reazione acrosomiale che

consiste nella fusione della membrana acrosomiale esterna con la membrana

plasmatica e nel conseguente rilascio del contenuto dell’acrosoma. Dopo aver

75

completato la reazione acrosomiale, che determina l’esposizione della membrana

acrosomiale interna, gli spermatozoi si legano a ZP2, penetrano attraverso la ZP

raggiungendo lo spazio perivitellino e si fondono con la membrana plasmatica

dell’ovocita. La fusione delle membrane dei gameti innesca la reazione corticale, in

conseguenza della quale viene impedito l’ingresso di altri spermatozoi (Wassarman,

1999).

I nostri dati mostrano che gli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata presentano

una ZP sostanzialmente più spessa rispetto a quella degli ovociti di donne giovani,

indipendentemente dall’invecchiamento in vitro, suggerendo l’esistenza di una

correlazione diretta con l’età della donna. In letteratura questo aspetto è controverso:

alcuni studi suggeriscono un significativo incremento dello spessore della ZP con

l’età (Nawroth et al., 2001; Kiliani et al., 2006), mentre altri sostengono il contrario

(Garside et al., 1999; Valeri et al., 2011). Tuttavia questi dati sono stati ottenuti

tramite valutazioni al microscopio ottico, che potrebbe non essere adatto nel rilevare

piccole variazioni nello spessore della zona pellucida.

Una zona ispessita è stata messa in relazione con un ridotto tasso di fecondazione

nelle procedure IVF (Bertrand et al., 1995; Nawroth et al., 2001).

Inoltre nel presente studio negli ovociti di donne in età avanzata e sottoposti a coltura

è stato osservato un compattamento della parte interna della ZP.

76

6. Conclusioni

77

Gli ovociti invecchiati in vitro e quelli invecchiati in vivo condividono molte

caratteristiche ultrastrutturali tipiche che possono essere considerate markers

morfologici di invecchiamento. Inoltre, i dati presentati in questo lavoro rivelano che

gli ovociti di donne giovani sembrano meno sensibili all’invecchiamento in vitro

rispetto a quelli di donne in età avanzata, già soggetti a invecchiamento riproduttivo.

L’invecchiamento subito in vitro in questi ultimi ovociti potrebbe spiegare la loro

ridotta finestra di fecondazione e la minore competenza di sviluppo.

Alla luce di quanto esposto si evidenzia l’importanza che riveste la figura

dell’embriologo, laddove un ritardo nell’esecuzione dell’inseminazione potrebbe

compromettere l’esito della PMA: al fine di evitare ulteriori danni ultrastrutturali, gli

ovociti di donne in età avanzata andrebbero inseminati il prima possibile dopo la loro

aspirazione.

Probabilmente l’invecchiamento in vitro dipende dalle condizioni di coltura, non

efficienti. Si rendono dunque necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo della

composizione dei terreni di coltura nel processo di invecchiamento e delle condizioni

del microambiente nella quale avviene la coltura stessa.

78

7. Bibliografia

79

Abbott AL, Xu Z, Kopf GS, Ducibella T and Schultz RM (1998) In vitro culture retards spontaneous activation of cell cycle progression and cortical granule exocytosis that normally occur in in vivo unfertilized mouse eggs. Biol Reprod 59: 1515-1521. Ackert CL, Gittens JE, O’Brien MJ, Eppig JJ and Kidder GM (2001) Intercellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse. Dev Biol 233: 258-270. Albertini DF (1992) Regulation of meiotic maturation in the mammalian oocyte: inteplay between exogenous cues and the microtubule cytoskeleton. BioEssays 14: 97-103. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology (2011) The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod 26: 1270-1283. Baca M and Zamboni L (1967) The fine structure of human follicular oocytes. J Ultrastruct Res 19: 354-381. Baker TG (1963) A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proc R Soc Lond B Biol Sci 158: 417-433. Baker TG and Franchi LL (1967) The fine structure of oogonia and oocytes in human ovaries. J Cell Sci 2: 213-224. Balaban B and Urman B (2006) Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reprod Biomed Online 12: 608-615. Balaban B, Urman B, Sertac A, Alatas C, Aksoy S and Mercan R (1998) Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo quality and implantation rate after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 13: 3431-3433. Balakier H, Bouman D, Sojecki A, Librach C and Squire JA (2002) Morphological and cytogenetic analysis of human giant oocytes and giant embryos. Hum Reprod 17: 2394-2401. Bertrand E, Van den Bergh M and Englert Y (1995) Does zona pellucida thickness influence the fertilization rate? Hum Reprod 10: 1189-1193. Block E (1952) Quantitative morphological investigations of the follicular system in women; variations at different ages. Acta Anat (Basel) 14: 108-123. Block E (1953) A quantitative morphological investigation of the follicular system in newborn female infants. Acta Anat (Basel) 17: 201-206. Bornslaeger EA, Mattei P and Schultz RM (1986) Involvement of cAMP-dependent protein kinase and protein phosphorylation in regulation of mouse oocyte maturation. Dev Biol 114: 453-462. Bouchard G (2000) Through the meshes of patriarchy: the male/female relationship in the Saguenay peasant society (1860-1930), IV edn., Elsevier Science Inc., New York, pp 397-425.

80

Bowles J and Koopman P (2010) Sex determination in mammalian germ cells: extrinsic versus intrinsic factors. Reproduction 139: 943-958. Broekmans FJ, Faddy MJ, Scheffer G and te Velde ER (2004) Antral follicle counts are related to age at natural fertility loss and age at menopause. Menopause 11: 607-614. Broekmans FJ, Soules MR and Fauser BC (2009) Ovarian aging: mechanisms and clinical consequences. Endocr Rev 30: 465-493. Buffet NC and Bouchard P (2001) The neuroendocrine regulation of the human ovarian cycle. Chronobiol Int 18: 893-919. Coticchio G, Borini A, Distratis V, Maione M, Scaravelli G, Bianchi V, Macchiarelli G and Nottola SA (2010) Qualitative and morphometric analysis of the ultrastructure of human oocytes cryopreserved by two alternative slow cooling protocols. J Assist Reprod Genet 27: 131-140. De Boer EJ, den Tonkelaar I, te Velde ER, Burger CW and van Leeuwen FE (2003) Increased risk of early menopausal transition and natural menopause after poor response at first IVF treatment. Hum Reprod 18: 1544-1552. De Bruin JP, Dorland M, Spek ER, Posthuma G, van Haaften M, Looman CW and te Velde ER (2004) Age-related changes in the ultrastructure of the resting follicle pool in human ovaries. Biol Reprod 70: 419-424. De Koning CH, McDonnell J, Themmen AP, de Jong FH, Homburg R and Lambalk CB (2008) The endocrine and follicular growth dynamics throughout the menstrual cycle in women with consistently or variably elevated early follicular phase FSH compared with controls. Hum Reprod 23: 1416-1423. De Mouzon J, Lancaster P, Nygren KG, Sullivan E, Zegers-Hochschild F, Mansour R, Ishihara O and Adamson D (2009) World collaborative report on assisted reproductive technology. Hum Reprod 24: 2310-2320. De Sutter P, Dozortsev D, Qian C and Dhont M (1996) Oocyte morphology does not correlate with fertilization rate and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 11: 595-597. den Tonkelaar I, te Velde ER and Looman CW (1998) Menstrual cycle length preceding menopause in relation to age at menopause. Maturitas 29: 115-123. Diaz H and Esponda P (2004) Ageing-induced changes in the cortical granules of mouse eggs. Zygote 12: 95-103. Dodson MG, Minhas BS, Curtis SK, Palmer TV and Robertson JL (1989) Spontaneous zona reaction in the mouse as a limiting factor for the time in which an oocyte may be fertilized. J In Vitro Fert Embryo Transf 6: 101-106. Ducibella T, Duffy P, Reindollar R and Su B (1990) Changes in the distribution of mouse oocyte cortical granules and ability to undergo the cortical reaction during gonadotropin-stimulated meiotic maturation and aging in vivo. Biol Reprod 43: 870-876.

81

Ducibella T, Dubey A, Gross V, Emmi A, Penzias AS, Layman L and Reindollar R (1995) A zona biochemical change and spontaneous cortical granule loss in eggs that fail to fertilize in vitro fertilization. Fertil Steril 64: 1154-61. Dvorak M and Tesarik J (1980) Ultrastructure of human ovarian follicles. In: Biology of the ovary, Developments in Obstetrics and Gynecology (Motta PM and Hafez ESE), Martinus Nijhoff Publishers, The Hague, pp 121-137. Ebner T, Moser M and Tews G (2006) Is oocyte morphology prognostic of embryo developmental potential after ICSI? Reprod Biomed Online 12: 507-512. Ebner T, Shebl O, Moser M, Sommergruber M and Tews G (2008) Developmental fate of ovoid oocytes. Hum Reprod 23: 62-66. Eddy EM (1996) The germ line and development. Dev Gen 19: 287-289. Edwards RG (1980) Conception in the Human Female. Academic Press, London; New York. Edwards RG and Brody SA (1995) Principles and Practice of Assisted Human Reproduction. Saunders Company, Philadelphia. Eichenlaub-Ritter and Peschke M (2002) Expression in in-vivo and in-vitro growing and maturing oocytes: focus on regulation of expression at the translational level Hum Reprod Update 8: 21-41. Eijkemans MJ, Habbema JDF and te Velde ER (2005) Age at last childbirth and fertility at young age. In: Fertility in populations and in patients (Eijkemans M.J.), Academic thesis, Erasmus Medical Center, Rotterdam, pp 23-34. El Shafie M, Sousa M, Windt M-L and Kruger TF (2000) An atlas of the ultrastructure of human oocytes. Parthenon Publishing, New York. Eppig JJ (1991) Intercommunication between mammalian oocytes and companion somatic cells. Bioessays 13: 569-574. Erickson GF, Magoffin DA, Dyer CA and Hofeditz C (1985) The ovarian androgen producing cells: a review of structure/function relationships. Endocr Rev 6: 371-399. Esfandiari N, Ryan EAJ, Gotlieb L and Casper RF (2005) Successful pregnancy following transfer of embryos from oocytes with abnormal zona pellucida and cytoplasm morphology. Reprod Biomed Online 11: 620-623. Eurostat (2006) Population and social conditions database. http://epp.eurEN.PDF Faddy MJ (2000) Follicle dynamics during ovarian ageing. Mol Cell Endocrinol 163: 43-48. Faddy MJ and Gosden RG (1996) A model conforming the decline in follicle numbers to the age of menopause in women. Hum Reprod 11: 1484-1486.

82

Familiari G, Makabe S and Motta PM (1989) The ovary and the ovulation: a three-dimensional ultrastructural study. In: Ultrastructure of human gametogenesis and early embryogenesis (Van Blerkom J and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 85-124. Familiari G, Vizza E, Miani A and Motta PM (1991) Ultrastructural and functional development of the theca interna. In: Ultrastructure of the ovary (Familiari G, Makabe S and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 113-128. Familiari G, Nottola SA, Macchiarelli G, Micara G, Aragona C and Motta PM (1992) Human zona pellucida during in vitro fertilization: An ultrastructural study using saponin, ruthenium red, and osmium-thiocarbohydrazide. Mol Reprod Dev 32: 51-61. Familiari G, Caggiati A, Nottola SA, Ermini M, Di Benedetto MR and Motta PM (1993) Ultrastructure of human ovarian primordial follicles after combination chemotherapy for Hodgkin’s disease. Hum Reprod 8: 2080 -2087. Familiari G, Heyn R, Relucenti M, Nottola SA and Sathananthan AH (2006) Ultrastructural dynamics of human reproduction, from ovulation to fertilization and early embryo development. Int Rev Cytol 249: 53-141. Fauser BC and Van Heusden AM (1997) Manipulation of human ovarian function: physiological concepts and clinical consequences. Endocr Rev 18: 71-106 Forabosco A and Sforza C (2007) Establishment of ovarian reserve: a quantitative morphometric study of the developing human ovary. Fertil Steril 88: 675-83. Fujimoto T, Miyayama T and Fujita M (1977) The origin, migration and fine morphology of human primordial germ cells. Anat Rec 188: 315-330. Fukuda T (1976) Ultrastructure of primordial germ cells in human embryo. Virchows Arch B Cell Pathol 20: 85-89. Gallo F, Hoorens S, Grant J and Cave J (2006) Should ART be part of a population policy mix? A preliminary assessment of the demographic and economic impact of assisted reproductive technologies. www.policyarchive.org Garside WT, Loret de Mola JR, Bucci JA, Tureck RW and Heyner S (1997) Sequential analysis of zona thickness during in vitro culture of human zygotes: correlation with embryo quality, age, and implantation. Mol Reprod Dev 47: 99-104. Ghadially FN (1982) Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix, II edn., Butterworths, London. Gillot I and Whitaker M (1994) Calcium signals in and around the nucleus in sea urchin eggs. Cell Calcium 16: 269-278. Gondos B, Bhiraleus P and Hobel CJ (1971) Ultrastructural observations on germ cells in human fetal ovaries. Am J Obstet Gynecol 110: 644-652.

83

Gondos B, Westergaard L and Byskov AG (1986) Initiation of oogenesis in human fetal ovary: ultrastructural and squash preparation study. Am J Obstet Gynecol 155: 189-195. Gosden RG (1995) Ovulation 1: Oocyte development throughout life. In: Gametes - The Oocyte, Series: Cambridge Reviews in Human Reproduction (Grudzinskas JG and Yovich JL), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 119-149. Gougeon A (1996) Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses. Endocr Rev 17: 121-155. Granot I and Dekel N (1994) Phosphorylation and expression of connexin-43 ovarian gap junction protein are regulated by luteinizing hormone. J Biol Chem 269: 30502-30509. Greenwald GS and Terranova PF (1988) Follicular selection and its control. In: The physiology of reproduction (Knobil E and Neill G), Raven Press Ltd, New York, pp. 387-445. Gupta SK, Bhandari B, Shrestha A, Biswal BK, Palaniappan C, Malhotra SS and Gupta N (2012) Mammalian zona pellucida glycoproteins: structure and function during fertilization. Cell Tissue Res 349: 665-678. Habbema JD, Eijkemans MJ, Nargund G, Beets G, Leridon H and Te Velde ER (2009) The effect of in vitro fertilization on birth rates in western countries. Hum Reprod 24: 1414-1419. Hagstad A, Johansson S, Wilhelmsson C and Janson PO (1985) Gynaecology of middle-aged women-menstrual and reproductive histories. Maturitas 7: 99 -113. Hertig AT (1968) The primary human oocyte: some observations on the fine structure of Balbiani's vitelline body and the origin of the annulate lamellae. Wiley Online Library 122: 107-137. Hertig AT and Adams EC (1967) Studies on the human oocyte and its follicle. I. Ultrastructural and histochemical observations on the primordial follicle stage. J Cell Biol 34: 647-675. Hepler PK (1992) Calcium and mitosis. Int Rev Cytol 138: 239-268. Hoang-Ngoc, Minh, Makabe S, Nottola SA, Smadja A and Motta PM (1993) La folliculogenese au cours de 1’organogenese ovarienne humaine. Gynecologic 44: 67-80. Igarashi H, Takahashi E, Hiroi M and Doi K (1997) Aging-related changes in calcium oscillations in fertilized mouse oocytes. Mol Reprod Dev 48: 383 -390 Jansen, RPS and De Boer K (1998) The bottleneck: mitochondrial imperatives in oogenesis and ovarian follicular fate. Mol Cell Endocrinol 145: 81-88. Kalma Y, Granot I, Galiani D, Barash A and Dekel N (2004) Luteinizing hormone-induced connexin 43 down-regulation: inhibition of translation. Endocrinology 145: 1617-1624.

84

Kawamura K, Kumagai J, Sudo S, Chun SY, Pisarska M, Morita H, Toppari J, Fu P, Wade JD, Bathgate RAD and Hsueh AJV (2004) Paracrine regulation of mammalian oocyte maturation and male germ cell survival. Proc Natl Acad Sci USA 101: 7323-7328. Kellokumpu-Lehtinen PL and Soderstrom KO (1978) Occurrence of nuage in fetal germ cells. Cell Tissue Res 194: 171-177. Khalili MA, Sultan AM and Mojibian M (2005) Role of oocyte morphology on fertilization and embryo formation in assisted reproductive techniques. Middle East Fertil Soc 10: 72-77. Khalili MA, Maione M, Palmerini MG, Bianchi S, Macchiarelli G and Nottola SA (2012) Ultrastructure of human mature oocytes after vitrification. Eur J Histochem 56: 236-242. Kidder GM and Mhawi AA (2002) Gap junctions and ovarian folliculogenesis. Reproduction 123: 613-620. Kilani SS, Cooke S, Kan AK and Chapman MG (2006) Do age and extended culture affect the architecture of the zona pellucida of human oocytes and embryos? Zygote 14: 39-44. Larsen WJ, Chen L, Powers R, Zhang H, Russell PT, Chambers C, Hess K and Flick R (1996) Cumulus expansion initiates physical and developmental autonomy of the oocyte. Zygote 4: 335-341. Laufer N, Tarlatzis BC, De Cherney AH, Masters JT, Haseltine FP, MacLusky N and Naftolin F (1984) Asynchrony between human cumulus-corona cell complex and oocyte maturation after human menopausal gonadotropin treatment for in vitro fertilization. Fertil Steril 42: 366-372. Lawson R, El-Toukhy T, Kassab A, Taylor A, Braude P, Parsons J and Seed P (2003) Poor response to ovulation induction is a stronger predictor of early menopause than elevated basal FSH: a life table analysis. Hum Reprod 18: 527-533. Le Moigne A and Foucrier (2004) Ovogenesi. In: Biologia dello sviluppo (Andreuccetti P, Campanella C and Putti R), Edises, Napoli. Leridon H (2004) Can assisted reproduction technology compensate for the natural decline in fertility with age? A model assessment. Hum Reprod 19: 1548-1553. Li R and Albertini DF (2013) The road to maturation: somatic cell interaction and self-organization of the mammalian oocyte. Molecular Cell Biology 14: 141-152. Longo FJ (1981) Changes in the zones pellucidae and plasmalemma of aging mouse eggs. Biol Reprod 25: 399-411. Lopata A, Sathananthan AH, McBain JC, Johnston WI and Speirs AL (1980) The ultrastructure of the preovulatory human egg fertilized in vitro. Fertil Steril 33: 12-20. Lutz W, O'Neill BC and Scherbov S (2003) Demographics. Europe’s population at a turning point. Science 299: 1991-1992.

85

Lutz W (2006) Fertility rates and future population trends: will Europe’s birth rate recover or continue to decline? Int J Androl 29: 25-33. Macchiarelli G, Vizza E, Nottola SA, Familiari G and Motta PM (1992) Cellular and microvascular changes of the ovarian follicle during folliculogenesis: A scanning electon microscopic study. Arch Histol Cytol 55: 191-204. Macchiarelli G (2000) The microvasculature of the ovary. A review by SEM of vascular corrosion casts. J Reprod Dev 46: 207 -225. Makabe S, Nottola SA. and Motta PM (1989) Life history of the human female germ cell: ultrastructural aspects. In: Ultrastructure of human gametogenesis and early embryogenesis (Van Blerkom J and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 33-60. Makabe S and Motta PM (1989) Migration of human germ cells and their relationship with the developing ovary: ultrastructural aspects. Prog Clin Biol Res 296: 41-54. Makabe S, Naguro T, Nottola SA, Pereda J and Motta PM (1991) Migration of germ cells, developing of the ovary, and folliculogenesis. In: Ultrastructure of the Ovary (Familiari G, Makabe S and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 1-27. Makabe S, Naguro T and Stallone T (2006) Oocyte-Follicle Cell Interactions During Ovarian Follicle Development, as Seen by High Resolution Scanning and Transmission Electron Microscopy in Humans. Microscopy Research and Technique 69: 436-449. Makabe S, Van Blerkom J, Nottola SA and Naguro T (2006a) Atlas of human female reproductive function: ovarian development to early embryogenesis after in-vitro fertilization, Taylor and Francis, London. Markström E, Svensson EC, Shao R, Svanberg B and Billig H (2002) Survival factors regulating ovarian apoptosis-dependence on follicle differentiation. Reproduction 123: 23-30. Micara G, Linari A and Aragona C (2012) Tecniche di II livello: FIVET e ICSI. In: Biotecnologie della riproduzione umana (Gandini L and Lenzi A), Carocci, Roma, pp. 379-392. Mikkelsen AL and Lindenberg S (2001) Morphology of in-vitro matured oocytes: impact on fertility potential and embryo quality. Hum Reprod 16: 1714-1718. Miyazaki S (2006) Thirty years of calcium signals at fertilization. Semin Cell Dev Biol 17: 233-243. Monesi V (2002) Meiosi, gametogenesi, fecondazione. In: Istologia, V edn., Piccin, Milano, pp. 758-838. Moore GP and Lintern-Moore S (1978) Transcription of the mouse oocyte genome. Biol Reprod 18: 865-870. Morin X and Bellaiche Y (2011) Mitotic spindle orientation in asymmetric and symmetric cell divisions during animal development. Dev Cell 21: 102-119.

86

Motta PM, Takeva Z and Nesci E (1971) Etude ultrastructurale et histochimique des rapports entre les cellules folliculaires et l’ovocyte pendant le développement du follicle ovarien chez les mammifères. Acta Anat 80: 537 -562. Motta PM and Van Blerkom J (1975) A scanning electron microscopic study of the luteo-follicular complex. II. Events leading to ovulation. Am J Anat 143: 241-264. Motta PM and Van Blerkom J (1979) Structure and ultrastructure of ovarian follicles. In: Human ovulation (Hafez ESE), Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam, pp. 17-38. Motta PM, Nottola SA, Micara G and Familiari G (1988) Ultrastructure of human unfertilized oocytes and polyspermic embryos in an in vitro fertilization program. Ann NY Acad Sci 541: 367-383. Motta PM, Makabe S, Naguro T and Correr S (1994) Oocyte follicle cells association during development of human ovarian follicle. A study by high resolution scanning and transmission electron microscopy. Arch Histol Cytol 57: 369 -394. Motta PM, Nottola SA, Familiari G, Macchiarelli G, Vizza E and Correr S (1995) Ultrastructure of human reproduction from folliculogenesis to early embryo development. A review. Ital J Anat Embryol 100: 9-72. Motta PM, Makabe S and Nottola SA (1997) The ultrastructure of human reproduction. I. The natural history of the female germ cell: origin, migration and differentiation inside the developing ovary. Hum Reprod Update 3: 281-295. Motta PM, Nottola SA, Makabe S and Heyn R (2000) Mitochondrial morphology in human fetal and adult female germ cells. Hum Reprod 15: 129-47. Motta PM, Nottola SA, Familiari G, Makabe S, Stallone T and Macchiarelli G (2003) Morphodynamics of the follicular-luteal complex during early ovarian development and reproductive life. Int Rev Cytol 223: 177-288. Murakami T, Ikebuchi Y, Ohtsuka A, Kikuta A, Taguchi T and Ohtani O (1988) The blood vascular wreath of the rat ovarian follicle, with special reference to its changes in ovulation and luteinization: a scanning electron microscopic study of corrosion casts. Arch Histol Cytol 51: 299-313. Nawroth F, Muller P, Wolf C and Sudik R (2001) Is the zona pellucida thickness of metaphase-II oocytes in an IVF/ICSI program influenced by the patient’s age? Gynecol Obstet Invest 52: 55-58. Nikolaou D, Lavery S, Turner C, Margara R and Trew G (2002) Is there a link between an extremely poor response to ovarian hyperstimulation and early ovarian failure? Hum Reprod 17: 1106-1111. Nogués C, Ponsà M, Vidal F, Boada M and Egozcue J (1988) Effects of aging on the zona pellucida surface of mouse oocytes. J In Vitro Fert Embryo Transf 5: 225-229.

87

Nottola SA, Macchiarelli G, Coticchio G, Bianchi S, Cecconi S, De Santis L, Scaravelli G, Flamigni C and Borini A (2007) Ultrastructure of human mature oocytes after slow cooling cryopreservation using different sucrose concentrations. Hum Reprod 22: 1123-1133. Nottola SA, Coticchio G, De Santis L, Macchiarelli G, Maione M, Bianchi S, Iaccarino M, Flamigni C and Borini A (2008) Ultrastructure of human mature oocytes after slow cooling cryopreservation with ethylene glycol. Reprod Biomed Online 17: 368-377. Nottola SA (2012) Assetto morfologico strutturale e substrutturale dell’ovocita umano. In: Biotecnologie della riproduzione umana (Gandini L and Lenzi A), Carocci, Roma, pp. 7-14. O'Connor KA, Holman DJ and Wood JW (1998) Declining fecundity and ovarian ageing in natural fertility populations. Maturitas 30: 127-136. Otsuki J, Okada A, Morimoto K, Nagai Y and Kubo H (2004) The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII oocytes. Hum Reprod 19: 1591-1597. Palermo GD, Colombero LT and Rosenwaks Z (1997) The human sperm centrosome is responsible for normal syngamy and early embryonic development. Rev Reprod 2: 19-27. Paz G, Amit A and Yavetz H (2004) Case report: pregnancy outcome following ICSI of oocytes with abnormal cytoplasm and zona pellucida. Hum Reprod 19: 586-589. Peluso JJ, England-Charlesworth C and Hutz R (1980) Effect of age and of follicular aging on the preovulatory oocyte. Biol Reprod 22: 999-1005. Pepling ME (2006) From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis 44: 622-632. Pickering SJ, Johnson MH, Braude PR and Houliston E (1988) Cytoskeletal organization in fresh, aged and spontaneously activated human oocytes. Hum Reprod 3: 978-989. Picton HM and Gosden RG (1999) Oogenesis in mammals. In: Encyclopedia of Reproduction, Vol. 3 (Knobil E and Neill JD), Academic Press, London, pp. 488-497. Poenie M, Alderton J, Tsien RY and Steinhardt RA (1985) Changes of free calcium levels with stages of the cell division cycle. Nature 315: 147-149. Pozo J, Corral E and Pereda J (1990) Subcellular structure of prenatal human ovary: mitochondrial distribution during meiotic prophase. J Submicrosc Cytol Pathol 22: 601-607. Richard FJ, Tsafriri A and Conti M (2001) Role of phosphodiesterase type 3A in rat oocyte maturation. Biol Reprod 65: 1444-1451. Richardson SJ, Senikas V and Nelson JF (1987) Follicular depletion during the menopausal transition: evidence for accelerated loss and ultimate exhaustion. J Clin Endocrinol Metab 65: 1231-1237.

88

Rienzi L, Ubaldi FM, Iacobelli M, Minasi MG, Romano S and Greco E (2005) Meiotic spindle visualization in living human oocytes. Reprod Biomed Online 10: 192-198. Rienzi L, Ubaldi FM, Iacobelli M, Minasi MG, Romano S, Ferrero S, Sapienza F, Baroni E, Litwicka K and Greco E (2008) Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertil Steril 90: 1692-1700. Rienzi L, Balaban B, Ebner T and Mandelbaum J (2012) The oocyte. Human Reproduction 27: 2-21. Romao GS, Arau´ jo MC, de Melo AS, de Albuquerque Salles Navarro PA, Ferriani RA and Dos Reis RM (2010) Oocyte diameter as a predictor of fertilization and embryo quality in assisted reproduction cycles. Fertil Steril 93: 621-625. Rosenbusch B, Schneider M, Glaser B and Brucker C (2002) Cytogenetic analysis of giant oocytes and zygotes to assess their relevance for the development of digynic triploidy. Hum Reprod 17: 2388-2393. Russell DL and Robker RL (2007) Molecular mechanisms of ovulation: co-ordination through the cumulus complex. Human Reproduction Update 13: 289-312. Russell PJ (2004) Introduzione alla genetica, In: i-Genetica, V edn., EdiSES, Napoli, pp 1-29. Sá R, Cunha M, Silva J, Luís A, Oliveira C, Teixeira da Silva J, Barros A and Sousa M (2011) Ultrastructure of tubular smooth endoplasmic reticulum aggregates in human metaphase II oocytes and clinical implications. Fertil Steril 96: 143-149. Sánchez F and Smitz J (2012) Molecular control of oogenesis. Biochimica et Biophysica Acta 1822: 1896-1912. Sathananthan AH, Ng SC, Chia CM, Law HY, Edirisinghe WR and Ratnam SS (1985). The origin and distribution of cortical granules in human oocytes with reference to Golgi, nucleolar, and microfilament activity. Ann N Y Acad Sci 442: 251-264. Sathananthan AH, Ng SC, Bongso A, Trounson A and Ratnams SS (1993) Visual Atlas of Early Human Development for Assisted Reproductive Technology, National University of Singapore, Singapore. Sathananthan AH (1994) Ultrastructural changes during meiotic maturation in mammalian oocytes: unique aspects of the human oocyte. Microsc Res Tech 27:145-164. Sathananthan AH, Ratnam SS, Ng SC, Tarin JJ, Gianaroli L and Trounson A (1996) The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos. Hum Reprod 11: 345-356. Sathananthan AH (1997) Ultrastructure of the human egg. Hum Cell 10: 21-38. Sathananthan AH, Selvaraj K and Trounson AO (2000) Fine structure of human oogonia in the foetal ovary. Mol Cell Endocrinol 161: 3-8.

89

Sathananthan AH (2000a) Ultrastructure of human gametes, fertilization and embryo development. In: Handbook of In Vitro Fertilization, II edn. (Trounson AO and Gardner DK), CRC Press, Florida, pp. 431-465. Sathananthan AH (2003) Morphology and pathology of the human oocyte. In: Biology and pathology of the oocyte (Trounson AO and Gosden RG), Cambridge University Press, Cambridge, pp 185-208. Sathananthan AH, Selvaraj K, Girijashankar ML, Ganesh V, Selvaraj P and Trounson AO (2006) From oogonia to mature oocytes: inactivation of the maternal centrosome in humans. Microsc Res Tech 69: 396-407. Sathananthan AH (2013) Ultrastructure of human gametes, fertilization and embryos in assisted reproduction: A personal survey. Micron 44: 1-20. Schultz RM and Kopf G (1995) Molecular basis of mammalian egg activation. Curr Top Dev Biol 30: 21-62. Schultz RM, Montgomery RR and Belanoff JR (1983) Regulation of mouse oocyte meiotic maturation: Implication of a decrease in oocyte cAMP and protein dephosphorylation in commitment to resume meiosis. Dev Biol 97: 264-273. Schwartz D and Mayaux MJ (1982) Female fecundity as a function of age: results of artificial insemination in 2193 nulliparous women with azoospermic husbands. Federation CECOS. N Engl J Med 306: 404-406. Sela-Abramovich S, Chorev E, Galiani D and Dekel N (2005) Mitogen-activated protein kinase mediates luteinizing hormone-induced breakdown of communication and oocyte maturation in rat ovarian follicles. Endocrinology 146: 1236-1244. Silverthorn DU (2005) Riproduzione e sviluppo, pp 823-862. In: Fisiologia - Un approccio integrato, seconda edizione (Agnati L, Bigiani A, Franzini C and Lui F), Casa Editrice Ambrosiana, Milano. Siller KH, Doe CQ (2009). Spindle orientation during asymmetric cell division. Nature Cell Biol 11: 365-374. Smith LC and Alcivar AA (1993) Cytoplasmic inheritance and its effects on development and performance. J Reprod Fertil 48: 31-43. Soules MR, Sherman S, Parrott E, Rebar R, Santoro N, Utian W and Woods N (2001) Executive summary: Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW). Fertil Steril 76: 874 -878. Sousa M, Barros A, Silva J and Tesarik J (1997) Developmental changes in calcium content of ultrastructurally distinct subcellular compartments of preimplantation human embryos. Mol Hum Reprod 2: 83-90. Sowers MR, Eyvazzadeh AD, McConnell D, Yosef M, Jannausch ML, Zhang D, Harlow S and Randolph JF (2008) Anti-mullerian hormone and inhibin B in the definition of ovarian aging and the menopause transition. J Clin Endocrinol Metab 93: 3478 -3483.

90

Stankova J, Cech S, Sedlackova M and Kristek F (1985) A morphometric comparative study of healthy and atretic human primordial and primary follicles. Z Mikrosk Anat Forsch 99: 510-518. Stensen MH, Tanbo T, Storeng R, Byholm T and Fèdorcsak P (2010) Routine morphological scoring systems in assisted reproduction treatment fail to reflect age-related impairment of oocyte and embryo quality. Reprod Biomed Online 21: 118-125. Steptoe PC, Edwards RG and Purdy JM (1980) Clinical aspects of pregnancies established with embryos grown in vitro. Brit J Obtset Gynaecol 87: 757-768. Strömstedt M and Byskov AG (1999) Oocyte, mammalian. In: Encyclopedia of Reproduction, III edn. (Knobil E, Neill JD), Academic Press, London, pp. 468-480. Sun QY and Schatten H (2006) Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction 131: 193-205. Sundstrom P, Nilsson BO, Liedholm P and Larsson E (1985a) Ultrastructural characteristics of human oocytes fixed at follicular puncture or after culture. J In Vitro Fertil Embryo Transfer 2: 195-206. Szollosi D (1971) Morphological changes in mouse eggs due to aging in the fallopian tube. Am J Anat 130: 209-25. Szollosi D, Mandelbaum J, Plachot M, Salat-Baroux J and Cohen J (1986) Ultrastructure of the human preovulatory oocyte. J In Vitro Fertil Embryo Transf 3: 232-242. Swain JE and Pool TB (2008) ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update 14: 431-446. Swann K and Ozil JP (1994) The dynamics of the calcium signal that triggers mammalian egg activation. Int Rev Cytol 152: 182-222. Talevi R, Gualtieri R, Tartaglione G and Fortunato A (1997) Heterogeneity of the zona pellucida carbohydrate distribution in human oocytes failing to fertilize in vitro. Hum Reprod 12: 2773-2780. Takahashi T, Saito H, Hiroi M, Doi K and Takahashi E (2000) Effects of aging on inositol 1,4,5-triphosphate-induced Ca2+ release in unfertilized mouse oocytes. Mol Reprod Dev 55: 299-306. Takahashi T, Takahashi E, Igarashi H, Tezuka N and Kurachi H (2003) Impact of oxidative stress in aged mouse oocytes on calcium oscillations at fertilization. Mol Reprod Dev 66: 143-152. Takahashi T, Igarashi H, Kawagoe J, Amita M, Hara S and Kurachi H (2009) Poor embryo development in mouse oocytes aged in vitro is associated with impaired calcium homeostasis. Biol Reprod 80: 493-502.

91

Tarín JJ, Pérez-Albalá S and Cano A (2001) Cellular and morphological traits of oocytes retrieved from aging mice after exogenous ovarian stimulation. Biol Reprod 65: 141-150. Ten J, Mendiola J, Vioque J, de Juan J and Bernabeu R (2007) Donor oocyte dysmorphisms and their influence on fertilization and embryo quality. Reprod Biomed Online 14: 40-48. te Velde ER and Pearson PL (2002) The variability of female reproductive ageing. Hum Reprod Update 8: 141-154. Treloar AE (1981) Menstrual cyclicity and the pre-menopause. Maturitas 3: 249-264. Treloar AE, Boynton RE, Behn BG and Brown BW (1967) Variation of the human menstrual cycle through reproductive life. Int J Fertil 12: 77-126. Ubaldi FM and Lanzone A (2009) Età della donna ed infertilità In: Topics Infertilità (Borini A, Bulletta C, Costa M, Ragni G and Ubaldi FM), Edi-Meetin, Ferrara. Valeri C, Pappalardo S, De Felici M and Manna C (2011) Correlation of oocyte morphometry parameters with woman's age. J Assist Reprod Genet 6: 545-552. Van Blerkom J (2011) Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their role in developmental competence. Mitochondrion 11: 797-813. Van Blerkom J and Motta PM (1979) Fertilization and preimplantation embryogenesis. In: The Cellular Basis of Mammalian Reproduction, Urban and Schwarzenberg, Munich, pp. 165-189. Van Noord PA, Dubas JS, Dorland M, Boersma H and te Velde E (1997) Age at natural menopause in a population-based screening cohort: the role of menarche, fecundity, and lifestyle factors. Fertil Steril 68: 95-102. Van Noord-Zaadstra BM, Looman CW, Alsbach H, Habbema JD, te Velde ER and Karbaat J (1991) Delaying childbearing: effect of age on fecundity and outcome of pregnancy. Br Med J 302: 1361-1365. Van Rooij IA, Tonkelaar I, Broekmans FJ, Looman CW, Scheffer GJ, de Jong FH, Themmen AP and te Velde ER (2004) Anti-mullerian hormone is a promising predictor for the occurrence of the menopausal transition. Menopause 11: 601-606. Van Santbrink EJ, Hop WC, Van Dessel TJ, De Jong FH and Fauser BC (1995) Decremental follicle-stimulating hormone and dominant follicle development during the normal menstrual cycle. Fertil Steril 64: 37-43. Veeck LL (1999) An Atlas of Human Gametes and Conceptuses: An Illustrated Reference for Assisted Reproductive Technology, Taylor and Francis, London. Vollman RF (1977) The menstrual cycle. Major Probl Obstet Gynecol 7: 1-193. Wassarman PM (1991) Construction of the zona pellucida during production of fertilizable mouse eggs. Bull Assoc Anat (Nancy) 75: 115-117.

92

Wassarman PM (1999) Mammalian fertilization: molecular aspects of gamete adhesion, exocytosis, and fusion. Cell 96: 175-183 Weinstein M, Gorrindo T, Riley A, Mormino J, Niedfeldt J, Singer B, Rodríguez G, Simon J and Pincus S (2003) Timing of menopause and patterns of menstrual bleeding. Am J Epidemiol 158: 782-791. Welt CK, Smith ZA, Pauler DK and Hall JE (2001) Differential regulation of inhibin A and inhibin B by luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, and stage of follicle development. J Clin Endocrinol Metab 86: 2531-2537. Whitaker M and Patel R (1990) Calcium and cell cycle control. Development 108: 525-542. Witschi E (1948) Migration of the germ cells of human embryos from the yolk sac to the primitive gonadal folds. Contrib Embryol Carnegie Inst 32: 67-80. Xu Z, Abbott A, Kopf GS, Schultz RM and Ducibella T (1997) Spontaneous activation of ovulated mouse eggs: time-dependent effects on M-phase exit, cortical granule exocytosis, maternal messenger ribonucleic acid recruitment, and inositol 1,4,5-trisphosphate sensitivity. Biol Reprod 57: 743-750. Zamboni L, Thompson RS and Smith DM (1972) Fine morphology of human oocyte maturation in vitro. Biol Reprod 7: 425-457. Zegers-Hochschild F, Adamson GD, De Mouzon J, Ishihara O, Mansour R, Nygren K, Sullivan E and Vanderpoel S (2009) International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) revised glossary of ART terminology, 2009. Fertil Steril 92: 1520-1524. Ziebe S and Devroey P (2008) Assisted reproductive technologies are an integrated part of national strategies addressing demographic and reproductive challenges. Hum Reprod Update 14: 583-592. Zoller LC (1991) Quantitative analysis of the membrana granulosa in developing and ovulatory follicles. In: Ultrastructure of the ovary (Familiari G, Makabe S, Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 73-89.