DIPARTIMENTO DI MEDICINA SPERIMENTALE
SEZIONE DI FISIOPATOLOGIA MEDICA ED ENDOCRINOLOGICA
DOTTORATO DI RICERCA
In
BIOTECNOLOGIE DELLA RIPRODUZIONE UMANA XXVI ciclo
“INVECCHIAMENTO OVOCITARIO UMANO: PARAMETRI STRUTTURALI ED ULTRASTRUTTURALI”
Relatore: Prof.ssa Giulietta Micara Candidato: Correlatore: Dott.ssa Claudia Boninsegna Prof.ssa Stefania Annarita Nottola
Anno Accademico 2012/2013
1
Indice 1. Introduzione .....................................................................................................................2
Ovogenesi e follicologenesi................................................................................................5 Struttura dell’ovocita maturo............................................................................................20 Valutazione morfologica dell’ovocita...............................................................................22 Invecchiamento riproduttivo.............................................................................................27 Tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA) ..................................................30
2. Scopo del lavoro .............................................................................................................33 3. Materiali e metodi ..........................................................................................................36
3.1 Stimolazione ovarica ..................................................................................................38 3.2 Pick-up ovocitario ......................................................................................................39 3.3 Recupero degli ovociti................................................................................................40 3.4 Microscopia a contrasto di fase...................................................................................40 3.5 Microscopia ottica ed elettronica ...................................................................................40
3.5.1 Processamento degli ovociti.................................................................................41 3.5.2 Analisi dei parametri morfologici ........................................................................43
4. Risultati ..........................................................................................................................47 Gruppo <35......................................................................................................................49 Gruppo <35c ....................................................................................................................50 Gruppo ≥35 ......................................................................................................................52
Gruppo ≥35c ....................................................................................................................53 4.1 Risultati dell’analisi statistica .....................................................................................55 Aggregati M-SER ............................................................................................................56 MVC................................................................................................................................57 CG ...................................................................................................................................57 Mv ...................................................................................................................................58 ZPt ...................................................................................................................................58
5. Discussione......................................................................................................................60 M-SER e MVC ................................................................................................................63 Lisosomi ..........................................................................................................................70 Granuli corticali ...............................................................................................................70 Microvilli .........................................................................................................................73 Zona pellucida..................................................................................................................74
6. Conclusioni .....................................................................................................................76 7. Bibliografia.....................................................................................................................78
2
1. Introduzione
3
Con il termine “infertilità” si definisce l’incapacità di una coppia di concepire dopo
un anno o più di rapporti sessuali regolari non protetti (Zegers-Hochschild et al.,
2009).
L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) riporta la presenza, nel mondo, di
circa 80 milioni di coppie infertili. Questo dato risulta presumibilmente sottostimato
in quanto si riferisce quasi esclusivamente ai Paesi in cui le statistiche sono
disponibili. Poiché nei Paesi industrializzati la prevalenza delle coppie infertili è
passata dal 6-7% degli anni '60 al 15-20% attuale, si può ipotizzare che i fattori
socio-ambientali siano in grado di interferire con le problematiche biologiche. A
conferma di ciò, l’analisi dei flussi migratori dimostra come le popolazioni
immigrate, da aree a sviluppo modesto a quelle più industrializzate, rapidamente
assumano un pattern riproduttivo analogo a quello del Paese ospite.
Tra le molteplici cause di ordine socio-ambientale, certamente i due principali fattori
coinvolti sono rappresentati dal ritardo nel programmare la gravidanza e
dall’inquinamento ambientale. Nel corso degli ultimi decenni si è assistito ad un
progressivo aumento dell’età della donna nel programmare la prima gravidanza (dai
24 anni degli anni ’60-’70 ai 31 della fine del XX secolo) (Ubaldi et al., 2009). Le
cause sono diverse e comprendono una serie di condizioni che portano a ritardare la
gravidanza, desiderando di raggiungerla solo nel momento in cui altre situazioni
pratiche siano interamente soddisfatte. La disponibilità dei metodi contraccettivi a
partire dagli anni sessanta, insieme al crescente benessere economico, ha fornito alle
donne l’opportunità di aumentare il loro livello di educazione e di partecipare alla
forza lavoro (te Velde and Pearson, 2002) permettendo loro di raggiungere un ruolo
sociale, con possibilità lavorative e di carriera, sovrapponibili a quelle del coniuge.
4
Inoltre è cambiato il valore in senso sociale del concetto di famiglia numerosa ed è
sempre più comune la condizione prolungata dello status di single o della coppia non
stabilizzata. Probabilmente anche i massmedia, enfatizzando il concetto di potenza
della scienza e della medicina, svolgono un importante ruolo nel trasmettere
messaggi distorti di potenzialità riproduttive al di là di qualsiasi condizione
biologica, tranquillizzando falsamente le coppie sul loro futuro riproduttivo (Ubaldi
et al., 2009; Broekmans et al., 2009).
I fattori sopra esposti hanno contribuito molto alla riduzione dei tassi di fertilità
complessivi (Total Fertility Rate, TFR), ovvero al numero medio di figli nati per
donna. In molti Paesi occidentali, soprattutto quelli del sud Europa, il numero medio
di figli stimato per famiglia è insufficiente per assicurare il ricambio della
popolazione. I TFR in Italia (1,33), Spagna (1,32) e Grecia (1,29) sono i più bassi di
tutta l’Europa (Eurostat, 2006). In termini più ampiamente demografici, le stime
OMS fanno intravedere una proiezione caratterizzata da un decremento sia dei tassi
di fertilità e natalità che di quelli di mortalità. Si stima che queste due opposte
tendenze condurranno, nel 2050, ad un tasso di crescita complessiva che sarà 1/3
rispetto a quello di un secolo prima (0,48% vs 1,78%).
La popolazione risulterà così prevalentemente costituita da persone al di sopra dei 50
anni di età (Lutz et al., 2003; Lutz, 2006; Gallo et al., 2006; Ziebe and Devroey,
2008) e tali cambiamenti demografici avranno drastiche implicazioni economiche e
sociali.
L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è
determinata dalla graduale diminuzione, che si verifica con l’età, sia nella quantità
che nella qualità dei gameti femminili, gli ovociti (te Velde and Pearson, 2002).
5
Ovogenesi e follicologenesi
L’ovogenesi è l’insieme dei processi che conducono alla formazione degli ovociti.
Essa si svolge nelle ovaie, dove le cellule germinali si associano con cellule
somatiche (cellule follicolari) a formare i follicoli ovarici (Le Moigne and Foucrier,
2004). Gli ovociti subiscono processi di sviluppo lunghi e attentamente regolati come
risultato delle interazioni paracrine e giunzionali con le circostanti cellule follicolari.
Il dialogo tra l’ovocita e le cellule follicolari permette lo scambio di molteplici
segnali regolatori che controllano il metabolismo ovocitario, il rimodellamento del
citoscheletro e la progressione del ciclo cellulare, processi chiave per la fecondazione
ed i primi stadi dell’embriogenesi (Albertini, 1992).
Le ovaie sono organi pari altamente complessi sia nella struttura che nella fisiologia.
Ciascun ovaio misura circa 3 cm di lunghezza, 1,5 cm di larghezza e 1 cm di
spessore ed è costituito da una zona periferica, il cortex, e da una zona interna, la
medulla. Nel tessuto connettivo della medulla si trovano nervi, vasi linfatici e molti
vasi sanguigni. Nel cortex sono immersi i follicoli in vari stadi di sviluppo (Monesi,
2002). Associati ai follicoli in crescita si trovano numerosi capillari (Macchiarelli et
al., 1992).
L’ovogenesi include eventi importanti tra cui la formazione e la proliferazione delle
cellule germinali, l’avvio della meiosi e l’immagazzinamento di sostanze necessarie
per la fecondazione e per le prime fasi dello sviluppo embrionale (Makabe et al.,
1991; Gosden, 1995; Motta et al., 1995).
Nell’embrione le cellule che daranno origine ai gameti femminili (cellule germinali
primordiali, Primordial Germ Cells, PGCs) sono riconoscibili, per la prima volta,
6
alla 3a settimana di sviluppo, nella parete dorsale del sacco vitellino, in prossimità
dell’allantoide in via di sviluppo (Witschi, 1984). Da questa regione, tra la 4a e la 5a
settimana le PGCs migrano, proliferando attivamente, verso le creste genitali (gli
abbozzi delle gonadi che diventeranno poi ovaie), raggiungendole tra la 5a e la 6a
settimana (Fukuda, 1976; Hoang-Ngoc Minh et al., 1993; Jansen and de Boer, 1998).
La principale caratteristica citoplasmatica delle PGCs è l’estrema scarsità degli
organelli. Sono presenti mitocondri, cisterne di reticolo endoplasmatico rugoso,
ribosomi e polisomi, un singolo complesso del Golgi, occasionali gocce lipidiche,
fasci di microfilamenti e di microtubuli ma solo il glicogeno è presente in quantità
cospicue, accumulandosi soprattutto all’inizio della migrazione (Fukuda, 1976;
Fujimoto et al., 1977; Makabe and Motta, 1989; Makabe et al., 1989; Makabe et al.,
1991; Hoang-Ngoc Minh et al., 1993). La migrazione delle PGCs avviene tramite
movimenti ameboidi grazie alla presenza di fasci di microfilamenti nei processi
citoplasmatici (Motta et al., 1995).
Nel periodo di migrazione delle PGCs ha inizio il differenziamento delle creste
genitali in ovaie. Questo sembra essere il pathway di default in quanto le creste
genitali con cariotipo XY si differenziano in testicoli sotto l’influenza del gene Y-
linked SRY. L’assenza del gene SRY nelle creste genitali XX ne determina lo
sviluppo in ovaie (Bowles and Koopmann, 2010).
Verso la 9a settimana post-fecondazione, le PGCs cominciano a differenziarsi in
ovogoni, che presentano un’alta attività mitotica caratterizzata da citochinesi
incompleta, per cui gli ovogoni derivanti dalla stessa cellula germinale primordiale
rimangono collegati da ponti citoplasmatici e si dividono in modo sincrono. Queste
cellule collegate tra loro sono dette “nidi” o “cisti” (Pepling, 2006; Motta et al.,
7
2000) e si trovano associate con le cellule follicolari in via di sviluppo nella regione
corticale dell’ovaio. Tra questi due tipi cellulari si stabiliscono giunzioni cellulari
primitive simili a desmosomi (Sathananthan et al., 2006).
Gli ovogoni presentano pochi organelli, dispersi in tutto il citoplasma. I mitocondri
risultano essere i più abbondanti; il loro numero è raddoppiato rispetto a quello delle
PGCs. Talvolta i mitocondri entrano in stretta relazione spaziale con le membrane
del reticolo endoplasmatico liscio, formando strutture che diventeranno tipiche delle
fasi finali di maturazione (Baker and Franchi, 1967; Gondos et al., 1971; Dvorak and
Tesarik, 1980; Hoang-Ngoc Minh et al., 1993). In alcuni casi i mitocondri sono
riuniti in clusters in stretta associazione con una sostanza granulare elettrondensa
contenente RNA e/o proteine. Questa sostanza, morfologicamente simile al materiale
del nucleolo, è stata definita corpo nucleolo-simile, granuli nucleolari, sostanza
intermitocondriale o, più comunemente, nuage (Kellokumpu-Lehtinen and
Soderstrom, 1978; Van Blerkom and Motta, 1979; Dvorak and Tesarik, 1980; Eddy,
1996). La presenza del nuage è stata associata alla potenzialità differenziativa
(Makabe et al., 2006a).
A partire dalla 12a settimana gli ovogoni cessano di proliferare ed entrano in meiosi,
diventando ovociti primari (ovociti I) (Gondos et al., 1986). L’ingresso in meiosi non
si realizza in modo sincrono per tutte le cellule germinali: mentre alcune hanno già
iniziato la meiosi, altre cellule continuano a moltiplicarsi per mitosi.
Il processo della meiosi consiste in due divisioni cellulari successive precedute da un
unico ciclo replicativo del DNA. Dopo la sua duplicazione, i 46 cromosomi risultano
costituiti da due cromatidi fratelli identici, tenuti insieme da una regione definita
centromero. Entrambe le divisioni meiotiche comprendono quattro stadi: profase,
8
metafase, anafase e telofase. La profase della prima divisione meiotica è
ulteriormente suddivisa in cinque sottofasi: leptotene, zigotene, pachitene, diplotene
e diacinesi. La prima divisione meiotica porta alla riduzione del numero
cromosomico da un assetto diploide ad uno aploide (divisione riduzionale), mentre la
seconda determina la separazione dei cromatidi fratelli (divisione equazionale).
Al contrario di quanto avviene nella meiosi maschile, in cui le divisioni cellulari
sono simmetriche e portano alla formazione di quattro gameti di uguali dimensioni,
nella meiosi femminile entrambe le divisioni cellulari sono caratterizzate da estrema
asimmetria, sia nelle dimensioni che nel destino delle cellule risultanti (Russel, 2004;
Li and Albertini, 2013) (Fig 1).
Le divisioni cellulari asimmetriche consentono la massima ritenzione del citoplasma
all’interno dell’ovocita: in seguito a ciascuna divisione si forma un grande ovocita ed
una cellula molto più piccola, detta corpo polare. I corpi polari, che non hanno alcun
ruolo funzionale, persistono durante le prime divisioni embrionali per poi degenerare
(Sathananthan et al., 2006; Li and Albertini, 2013).
La generazione di due cellule figlie di dimensioni differenti, a partire dalla cellula
madre, richiede un posizionamento asimmetrico del fuso meiotico, responsabile del
piano di clivaggio (Siller and Doe, 2009; Morin and Bellaiche, 2011).
Fig 1. Divisione asimmetrica dell’ovocita. Tratto da: Li and Albertini, 2013.
9
Una volta entrati in meiosi, gli ovociti I progrediscono attraverso la profase della
prima divisione meiotica, ma si arrestano allo stadio di diplotene, nel quale possono
rimanere anche 40 anni o più, fino a quando non sono stimolati a riprendere la
meiosi.
A partire dalla 16a settimana gli ovociti I perdono le loro connessioni citoplasmatiche
e ciascuno di essi viene circondato da uno strato di cellule follicolari, dando origine
al follicolo primordiale (Motta et al., 2000; Makabe et al., 2006).
Significativo parametro dell’intensità del processo di follicologenesi è la densità dei
follicoli primordiali per unità di corticale ovarica. Alla 16ª settimana di sviluppo
sono presenti circa 3000 follicoli per mm3 e, a 20 settimane, questo valore è più che
raddoppiato, raggiungendo i 7000 follicoli per mm3. Dalla 26ª settimana la densità
inizia a decrescere ed alla nascita i follicoli primordiali, per mm3 di corticale ovarica,
sono circa 1400 (Forabosco and Sforza, 2007).
Basandosi sulle dimensioni, sulla morfologia delle cellule follicolari e sulla
formazione dell’antro (una cavità ripiena di liquido), i follicoli ovarici nel corso del
loro sviluppo possono essere classificati in primordiali, primari, secondari, terziari
(antrali) e di Graaf (maturi, preovulatori) (Fig 2) (Sànchez and Smitz 2012; Li and
Albertini, 2013).
L’aumento che si osserva nelle dimensioni e nella complessità dei follicoli è dovuto
soprattutto alla moltiplicazione delle cellule follicolari e all’accumulo di liquido
all’interno dell’antro. In ogni caso, anche gli ovociti si accrescono, sebbene
relativamente di poco. Durante questa fase l’ovocita sintetizza e accumula RNA e
proteine essenziali per un’appropriata crescita e maturazione, così come per lo
10
sviluppo in un embrione evolutivo (Moore and Lintern-Moore, 1978; Eichenlaub-
Ritter and Peschke, 2002).
Nel corso della vita fertile della donna, dal raggiungimento della maturità sessuale
fino alla menopausa, solo 400-500 ovociti completeranno lo sviluppo e verranno
ovulati, mensilmente (Sathananthan et al., 2006).
Fig 2. Sviluppo follicolare. Tratto da: Li and Albertini, 2013
A partire dalla pubertà, il sistema riproduttivo femminile dipende dal ripetersi ciclico
degli eventi di reclutamento follicolare, selezione di un singolo follicolo dominante,
ovulazione (rilascio dell’ovocita maturo dall’ovaio) e formazione del corpo luteo (la
struttura residuale del follicolo dopo l’ovulazione). Se non si verifica la fecondazione e
il successivo impianto dell’embrione nell’utero, il corpo luteo regredisce e si verifica la
mestruazione, dovuta alla desquamazione dell’endometrio, la mucosa di rivestimento
dell’utero (Fauser and Van Heusden, 1997; Buffet and Bouchard, 2001). Con il
termine “ciclo mestruale” si indicano gli eventi che si compiono nell’intervallo di
tempo che intercorre tra due mestruazioni successive. L’ovulazione avviene a metà di
questo ciclo: la fase preovulatoria è detta fase follicolare e quella successiva fase
luteale. I cicli mestruali durano in media 28 giorni e si verificano ininterrottamente
11
dalla pubertà alla menopausa (Le Moigne and Foucrier, 2004). Tale meccanismo
ciclico richiede il funzionamento integrato di ipotalamo, ipofisi e ovaie. Il generatore
pulsatile dell’ormone di rilascio delle gonadotropine (Gonadotropin Releasing
Hormone, GnRH) all’interno dell’ipotalamo assicura il rilascio pulsatile, dall’ipofisi
anteriore, sia dell’ormone follicolo-stimolante (Follicle-Stimulating Hormone, FSH)
che dell’ormone luteinizzante (Luteinizing Hormone, LH) (de Koning et al., 2008).
Poco prima dell’inizio di ogni ciclo, la secrezione di gonadotropine ipofisarie
aumenta. Sotto l’influenza dell’FSH avviene il reclutamento di una coorte di piccoli
follicoli antrali FSH-sensibili (la crescita dei follicoli preantrali è indipendente
dall’FSH) (Li and Albertini, 2013; Gougeon, 1996; Fauser and Van Heusden, 1997;
Welt et al., 2001).
Mentre i follicoli crescono, sia le cellule della granulosa, sotto l’influenza dell’FSH,
che le cellule della teca interna, sotto l’influenza dell’LH, iniziano a produrre ormoni
steroidei. Le cellule della teca interna producono androgeni, che per diffusione
raggiungono le cellule della granulosa, dove vengono convertiti in estrogeni grazie
alla presenza dell’enzima aromatasi (Erickson et al., 1985, Monesi, 2002).
L’incremento graduale dei livelli di estrogeni in circolo ha diversi effetti. Gli
estrogeni esercitano un controllo a retroazione negativa sulla secrezione ipofisaria di
FSH ed LH, impedendo lo sviluppo di altri follicoli durante lo stesso ciclo. Allo
stesso tempo, gli estrogeni stimolano la produzione di altri estrogeni da parte delle
cellule della granulosa. Questa retroazione positiva permette ai follicoli di continuare
a secernere estrogeni nonostante la riduzione della stimolazione da parte dell’FSH e
dell’LH. Quando la fase follicolare si avvicina al termine, la secrezione ovarica degli
estrogeni raggiunge il picco. In questa fase del ciclo, solo un follicolo, detto follicolo
12
dominante, si sta ancora sviluppando ed inizia a secernere inibina e progesterone, in
aggiunta agli estrogeni. Gli estrogeni esercitano ora retroazione negativa. Di
conseguenza, la secrezione di LH aumenta notevolmente; questo fenomeno, detto
picco di LH, è essenziale per l’ovulazione. Anche l’FSH raggiunge un picco, ma più
basso, presumibilmente perché viene soppresso dall’inibina (Silverthorn, 2005).
La diminuzione dei livelli di FSH è essenziale per la selezione, all’interno della
coorte reclutata, del follicolo dominante, che progredirà nella crescita e verrà
ovulato. Questo processo è detto concetto della soglia/finestra di FSH (van Santbrink
et al., 1995).
Dopo l’ovulazione, il corpo luteo sopravvive per circa 12 giorni e produce quantità
crescenti di progesterone, estrogeni e inibina. Con la regressione del corpo luteo, il
crollo delle concentrazioni di progesterone, estradiolo e inibina consente la risalita
dei livelli di gonadotropine e l’avvio di un nuovo ciclo mestruale (Silverthorn, 2005;
Broekmans et al., 2009).
I follicoli primordiali sono considerati follicoli “quiescienti” in quanto non mostrano
cambiamenti morfologici fino al raggiungimento della maturità sessuale (Zamboni et
al., 1972). Si tratta di strutture tondeggianti del diametro di 55-75 µm, costituiti da un
ovocita di 30-40 µm allo stadio di diplotene, circondato da un singolo strato di cellule
follicolari di forma allungata e appiattita; esternamente è presente una sottile lamina
basale che separa il follicolo dal circostante stroma ovarico (Makabe et al., 2006).
Le cellule follicolari stabiliscono, tra di loro e con l’ovocita, sia giunzioni di
adesione (zonule aderenti e piccoli desmosomi), che assicurano il mantenimento
della struttura follicolare (Motta et al., 1971, 1994; Dvorak and Tesarik, 1980;
Stankova et al., 1985; Familiari et al., 1993), sia giunzioni di comunicazione, che
13
determinano la formazione di una sorta di sincizio funzionale (Ackert et al., 2001;
Epping, 1991; Kidder and Mhawi, 2002). Queste ultime, del diametro di 1,5 nm,
permettono infatti il passaggio di nutrienti (precursori metabolici, piccole molecole,
ioni) e di segnali regolatori (ormoni, fattori di crescita, secondi messaggeri) (Makabe
et al., 2006; Sathananthan et al., 2006) attraverso le membrane plasmatiche.
In questo stadio gli ovociti presentano una forma sferica o ovoidale e sono
caratterizzati da una superficie per lo più regolare e liscia; solo in alcune regioni
dell’oolemma sono presenti corti microvilli (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and
Tesarik, 1980; Hertig and Adams, 1967).
In posizione eccentrica nell’ooplasma è presente un nucleo voluminoso, definito
vescicola germinale (VG), contenente cromatina finemente dispersa, sebbene possa
essere osservata una iniziale condensazione in fibrille (Baca and Zamboni, 1967;
Dvorak and Tesarik, 1980; Hertig and Adams, 1967; Motta et al., 1997, 2003; Pozo
et al., 1990; Sathananthan et al., 2006). All’interno del nucleo è già avvenuto, in
tardo pachitene, il crossing-over, ossia lo scambio, tra cromosomi omologhi, di
segmenti di materiale genetico localizzati nella stessa posizione lungo il cromosoma.
Questo processo di ricombinazione genetica tra il DNA nucleare di origine materna e
quello di origine paterna, che consente la trasmissione alle generazioni successive di
un patrimonio genetico riarrangiato in maniera originale, è alla base della variabilità
genetica (Russell, 2004).
Durante la progressione nella prima profase meiotica, all’interno dell’ooplasma si
sono verificate due ridistribuzioni mitocondriali. La prima consiste nel passaggio
dalla distribuzione casuale del leptotene alla distribuzione perinucleare dello
zigotene, in cui i mitocondri si trovano distribuiti in una fila singola (o talvolta
14
doppia) intorno alla membrana nucleare. La seconda si verifica in diplotene, in
seguito alla migrazione dei mitocondri verso un polo della cellula, dove essi si
ritrovano con una distribuzione a mezzaluna in prossimità del nucleo. L’associazione
dei mitocondri alla membrana nucleare è un fenomeno che si riscontra in molte
specie animali e potrebbe riflettere un’alta richiesta energetica del nucleo durante la
progressione della prima divisione meiotica fino all’arresto in diplotene (Dvorak and
Tesarik, 1980).
Oltre ai numerosi mitocondri, anche diversi altri organelli si raggruppano in
prossimità del nucleo, formando il cosiddetto “complesso paranucleare” o “corpo
vitellino di Balbiani”. Esso è costituito da cisterne e vescicole del Golgi, membrane
di reticolo endoplasmatico liscio, uno scarso reticolo endoplasmatico rugoso,
vacuoli, gocce lipidiche, lisosomi e lamelle annulate (Baca and Zamboni, 1967;
Hertig, 1968; Hertig and Adams, 1967; Dvorak and Tesarik, 1980); queste ultime,
originate dall’involucro nucleare, sono formate da pile di doppia membrana
contenenti pori (Sathananthan et al., 2000a, 2006).
A partire dalla pubertà, ogni giorno nuovi follicoli primordiali vengono reclutati in
gruppo per iniziare la follicologenesi, processo che dura circa sei mesi. Questa
dinamica emerge con chiarezza nell’organizzazione dell’ovaio, caratterizzato dalla
presenza contemporanea di follicoli in tutti gli stadi di accrescimento (Le Moigne
and Foucrier, 2004; Sànchez and Smitz, 2012).
I follicoli reclutati dal pool di follicoli quiescienti, per intraprendere la fase di
crescita follicolare, vengono detti follicoli primari. Questi follicoli mantengono le
caratteristiche morfologiche generali dei follicoli primordiali, ma, in seguito
all’aumento di dimensioni e alla proliferazione, le cellule follicolari formano un
15
epitelio ancora monostratificato ma costituito da cellule cubiche o poliedriche
(Makabe et al., 2006). La conversione del follicolo primordiale in follicolo primario
è caratterizzata da una crescita follicolare minima, se non nulla (Motta et al., 1994),
l’ovocita presente al suo interno è invece molto attivo nella sintesi proteica a partire
da trascritti nucleari e mitocondriali (Motta et al., 1994). Alcune di queste proteine
sono richieste per il differenziamento dell’ovocita stesso, altre per la formazione
delle interazioni con le circostanti cellule follicolari e altre ancora diventeranno
enzimi o saranno importanti per la formazione della zona pellucida (un involucro
glicoproteico che circonderà l’ovocita e successivamente l’embrione fino al
momento dell’impianto nell’utero), per la capacità di andare incontro a fecondazione
o per le prime fasi dello sviluppo embrionale (Picton and Gosden, 1999). Le
dimensioni dell’ovocita aumentano leggermente, raggiungendo un diametro di circa
50 µm (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and Tesarik, 1980; Motta et al., 1994,
2003; Van Blerkom and Motta, 1979).
Le cellule stromali localizzate all’esterno della lamina basale cominciano ad
aggregarsi concentricamente intorno alla essa, formando la teca follicolare (Dvorak
and Tesarik, 1980; Motta et al., 1994; Van Blerkom and Motta, 1979).
Man mano che l’ovocita cresce, i suoi organelli diventano gradualmente sempre più
dispersi nell’ooplasma. Il Golgi si frammenta e comincia ad assemblare nel cortex
glicoproteine della zona pellucida e granuli corticali, che appaiono come strutture dense
e circondate da membrana. Il numero di microvilli ovocitari aumenta progressivamente e
lo stesso avviene per le cellule follicolari (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and
Tesarik, 1980; Motta et al., 1994, 2003; Van Blerkom and Motta, 1979).
16
La comparsa di un secondo strato di cellule della granulosa caratterizza la
formazione del follicolo secondario. Nel corso dello sviluppo del follicolo
secondario, la lamina basale diventa più spessa ed esternamente ad essa la teca si
differenzia in due compartimenti: la teca interna, riccamente vascolarizzata da
capillari, e la teca esterna, costituita principalmente dai componenti tipici del tessuto
connettivo, da sporadiche cellule muscolari lisce e da vasi sanguigni di grande
calibro (Dvorak and Tesarik, 1980; Familiari et al., 1989, 1991; Macchiarelli et al.,
1992; Motta et al., 1995, 2003; Sathananthan et al., 2006).
L’ovocita aumenta ancora in dimensioni, raggiungendo il diametro di 80 µm
(Makabe et al., 2006). Polisomi e lamelle annulate sono rare (Baca and Zamboni,
1967; Dvorak and Tesarik, 1980), mentre mitocondri, Golgi, SER, lisosomi,
perossisomi e ribosomi aumentano gradualmente in quantità e si disperdono in tutto
il citoplasma (Baca and Zamboni, 1967; Dvorak and Tesarik, 1980; Familiari et al.,
1989, Makabe et al., 1991; Motta et al., 2000). In particolare, l’apparato del Golgi
aumenta di dimensioni e sviluppa numerose unità, che gradualmente si disperdono
nel cortex cellulare. Contemporaneamente si osserva un notevole aumento dei
granuli corticali, che migrano progressivamente verso la periferia andando a disporsi
al di sotto dell’oolemma, dove si associano alla rete di microfilamenti di actina del
cortex ovocitario (Baca and Zamboni, 1967; Sathananthan et al., 1985). Il nuage
gradualmente diminuisce e infine scompare (Dvorak and Tesarik, 1980; Baca and
Zamboni, 1967).
Sulla superficie dell’ovocita si sviluppano numerosi microvilli (Makabe et al., 2006).
Le cellule follicolari presentano una forma poliedrica e sono disposte in strati
concentrici intorno all’ovocita, formando la cosiddetta granulosa. Queste cellule
17
secernono un liquido chiamato “liquor folliculi primario” che si accumula in piccole
lacune intercellulari presenti nello strato della granulosa.
Intorno all’ooplasma sono presenti piccole masse irregolari di materiale flocculento
(materiale glicoproteico secreto dall’ovocita) che successivamente si fonderanno
insieme per formare, intorno all’ovocita, una zona pellucida continua (Motta and
Van Blerkom, 1979; Wassarman, 1991).
Man mano che lo sviluppo follicolare procede e le cellule della granulosa si
dividono, si verifica un aumento della vascolarizzazione della teca interna e della
permeabilità della parete endoteliale dei vasi sanguigni e linfatici tecali (Macchiarelli
et al., 1992; Macchiarelli, 2000). Anche la permeabilità della lamina aumenta,
consentendo la diffusione di una considerevole quantità di filtrato ematico e linfatico
verso la granulosa. Il liquor folliculi (ora detto “secondario”) diventa così
progressivamente più acquoso e abbondante, creando grandi lacune intercellulari,
dalla cui confluenza si forma un’unica ampia cavità o antro. In questo stadio il
follicolo è detto antrale (Dvorak and Tesarik, 1980; Familiari et al., 1989, Greenwald
and Terranova, 1988; Macchiarelli et al., 1992; Makabe et al., 1991; Motta et al.,
1994; Murakami et al., 1988; Zoller, 1991).
In seguito alla formazione del follicolo antrale sono riconoscibili due popolazioni di
cellule della granulosa: il cumulo ooforo, le cui cellule disposte internamente in
stretto contatto con l’ovocita sono dette cellule della corona radiata, e la granulosa
parietale, che riveste la cavità follicolare. Il cumulo ooforo e la granulosa parietale
sono congiunte da un sottile peduncolo formato da poche cellule della granulosa
(Familiari et al., 1989, Motta and Van Blerkom, 1975; Li et Albertini, 2013).
18
Nelle fasi finali della follicologenesi la quantità di liquido follicolare nell’antro
aumenta bruscamente in risposta all’azione dell’LH e, alla fine dell’accrescimento
follicolare, l’antro occupa pressoché tutto il volume del follicolo (Monesi, 2002; Le
Moigne and Foucrier, 2004). In questo stadio il follicolo appare come una vescicola
ripiena di un fluido trasparente e sporge visibilmente al di sotto della superficie
dell’ovaio; a questo punto si parla di follicolo preovulatorio o di Graaf (Makabe et
al., 2006).
Fino al momento dell’ovulazione, gli ovociti sono mantenuti in arresto meiotico per
mezzo di un fattore inibente, il cAMP, trasportato dalle cellule somatiche circostanti
(Schultz et al., 1983; Bornslaeger et al., 1986).
I livelli intracellulari di cAMP nell’ovocita dipendono da diversi fattori: il tasso di
sintesi e di metabolismo, in entrambi i tipi cellulari, e il trasporto, via giunzioni
comunicanti, tra le cellule del cumulo e l’ovocita. Il picco nella secrezione dell’LH
determina un forte incremento nella sintesi del cAMP nelle cellule del cumulo,
tuttavia nell’ovocita i livelli di cAMP diminuiscono, promuovendo la ripresa della
meiosi (Russell and Robker, 2007; Li et Albertini, 2013). Diversi meccanismi
potrebbero essere coinvolti nella diminuzione dei livelli di questo secondo
messaggero:
- la diminuzione, per mezzo della fosforilazione e della down-regolazione delle
proteine che le costituiscono, del numero di giunzioni comunicanti (connessine)
(Granot and Dekel, 1994; Kalma et al., 2004; Sela-Abramovich et al., 2005),
- la dissociazione fisica delle cellule del cumulo dall’ovocita come risultato
dell’espansione del complesso cumulo-ovocita (Cumulus Oocyte Complex, COC)
(Larsen et al., 1996),
19
- la retrazione attiva dei processi delle cellule del cumulo (Motta and Van Blerkom,
1975; Motta et al., 1994);
- l’aumento, negli ovociti, dell’attività della fosfodiesterasi 3A, l’enzima che
metabolizza il cAMP (Richard et al., 2001);
- l’inibizione dell’attività dell’adenilato ciclasi, con la conseguente diminuzione
della sintesi di cAMP (Kawamura et al., 2004).
Al momento della ripresa della meiosi la vescicola germinale migra verso la periferia
e al suo interno i cromosomi completano la loro condensazione, il profilo
dell’involucro nucleare diviene estremamente irregolare e, infine, il nucleolemma si
rompe (Germinal Vesicle Breakdown, GVBD), determinando il rilascio dei
cromosomi nell’ooplasma. Si verifica dunque rapidamente la prima divisione
meiotica: in metafase le coppie di cromosomi omologhi (bivalenti) si allineano lungo
il piano equatoriale del fuso e, all’anafase, i cromosomi omologhi di ciascun
bivalente si separano migrando ai poli opposti. I cromosomi omologhi di derivazione
materna e paterna si distribuiscono in modo casuale a ciascun polo, garantendo
un’ulteriore variabilità genetica. In telofase si formano nuove membrane nucleari
intorno a ognuno dei due gruppi cromosomici per formare i due nuclei figli. Con la
citocinesi si verifica l’estrusione del primo corpo polare nello spazio perivitellino,
mentre si avvia immediatamente la seconda divisione meiotica, che subisce un nuovo
arresto in metafase (metafase II) (Sathananthan et al., 1993; Russell, 2004).
L’ovocita in questo stadio è detto “maturo” o “preovulatorio” e 36 ore dopo il picco
di LH viene rilasciato dall’ovaio nel processo di ovulazione.
In risposta alla secrezione LH-dipendente di proteasi o dei loro attivatori
(collagenasi, attivatore del plasminogeno), nonché di prostaglandine, il tratto di
20
parete del follicolo (granulosa e teche) rivolto verso la superficie dell’ovaio e la
parete di questo organo, si assottigliano formando una zona traslucida denominata
stigma. Quando, in corrispondenza di questo punto, si verifica la rottura della parete
del follicolo e dell’ovaio, il complesso cumulo-oocita è espulso dall’ovaio e, grazie
all’azione delle fimbrie tubariche, viene convogliato nella tuba di Falloppio, sede
fisiologica della fecondazione. Quello che rimane del follicolo dopo l’ovulazione
costituisce il corpo luteo. Se mentre discende attraverso la tuba l’ovocita viene
fecondato e in seguito l’embrione si impianta nella cavità uterina, instaurando così la
gravidanza, il corpo luteo viene mantenuto; in caso contrario, regredisce in corpus
albicans (Monesi, 2002; Le Moigne and Foucrier, 2004).
L’ingresso dello spermatozoo fecondante innesca la ripresa della seconda divisione
meiotica, che si completa con l’estrusione del secondo corpo polare. La seconda
divisione meiotica attraversa gli stessi stadi della prima ma con alcune differenze: la
minore durata della profase e la separazione, durante l’anafase, dei due cromatidi
fratelli che compongono ciascun cromosoma (Russell, 2004).
Struttura dell’ovocita maturo
Osservato al microscopio ottico in sezione equatoriale, l’ovocita umano maturo
possiede una forma rotondeggiante e un diametro di circa 100 µm. L’ooplasma ha
una tessitura omogenea e appare provvisto di numerosi organelli uniformemente
dispersi (Motta et al., 1988).
L’ovocita è circondato da una zona pellucida continua e uniforme dello spessore di
circa 17 µm, dal quale è separato da un sottile spazio perivitellino (Motta et al., 1988).
21
In questo spazio è racchiuso il primo corpo polare, di forma rotondeggiante o ovalare
e con un diametro di 8-10 µm, visibile in sezioni particolarmente favorevoli. Nelle
medesime sezioni sono frequentemente osservabili anche i cromosomi allineati sul
fuso durante la metafase della seconda divisione meiotica.
Il primo corpo polare, che rappresenta il risultato del completamento della prima
divisione meiotica dell’ovocita, è considerato da alcuni una sorta di “ovocita in
miniatura” (Sathananthan et al., 2006). Esso infatti, come l’ovocita, al microscopio
elettronico a trasmissione presenta una superficie ricca di microvilli e un citoplasma
in cui sono visibili cromosomi, non circondati da un involucro nucleare, microtubuli
e granuli corticali (El Shafie et al., 2000). Esso può essere occasionalmente penetrato
da uno spermatozoo, rispondendo in tal caso, come l’ovocita, con l’estrusione del
contenuto dei granuli corticali (Sathananthan et al., 1993).
Ad un’analisi al microscopio elettronico a trasmissione, dell’ovocita maturo, aploide,
i 23 cromosomi, localizzati sulla piastra equatoriale del fuso meiotico, presentano
una microstruttura granulo-fibrillare fortemente elettrondensa. Il fuso meiotico,
formato da microtubuli organizzati che si estendono da un polo all’altro, è anastrale,
privo di centrioli e ha una forma a barile con poli leggermente appuntiti
(Sathananthan et al., 2003, 2006). Il fuso è orientato perpendicolarmente rispetto
all’oolemma ed è localizzato in una zona periferica dell’ooplasma, in genere
sprovvista di altri organelli, sebbene occasionalmente possano essere presenti
mitocondri e reticolo endoplasmatico liscio.
Gli organelli più abbondanti nell’ooplasma sono i mitocondri. Essi hanno una forma
sferica o ovale, un diametro compreso tra 0,6 e 0,8 µm e una matrice densa, con
scarse creste periferiche arciformi (Motta et al., 2000). I mitocondri si ritrovano
22
tipicamente associati con le membrane del reticolo endoplasmatico liscio a formare
due tipi di strutture citoplasmatiche:
- aggregati M-REL: elementi tubulari di REL anastomizzati l’uno con l’altro e
associati strettamente a mitocondri;
- complessi MV: vescicole di REL ripiene di materiale flocculento, leggermente
elettrondenso, circondate da un anello di mitocondri (Motta et al., 1988, 1995,
2000; Sathananthan et al., 1993, 2006; Sundstrom et al., 1985; Szollosi et al.,
1986).
Al contrario degli ovociti in crescita, negli ovociti maturi il reticolo endoplasmatico
rugoso (RER) non è presente e anche i ribosomi liberi si incontrano raramente;
inoltre il Golgi è raro (pochi complessi, in genere piccoli) o assente. Questi aspetti
substrutturali riflettono la relativa inattività degli ovociti umani maturi riguardo la
sintesi e la secrezione di proteine (Motta et al., 1988; Sathananthan et al., 2006).
Al di sotto dell’oolemma, a 0,4-0,6 µm di distanza da essa, disposti in 1-3 file, è
possibile osservare la presenza di numerosi granuli corticali del diametro di 300-400
nm e contenenti una matrice omogenea estremamente elettrondensa (Sathananthan et
al., 1985, 2006; Motta et al., 1988).
Valutazione morfologica dell’ovocita
Il gamete femminile gioca un ruolo cruciale nella determinazione della competenza
embrionale e di conseguenza nel successo della riproduzione umana. Il
raggiungimento della completa e corretta maturazione che avviene in fase
preovulatoria è fondamentale per la fecondazione ed il successivo sviluppo
23
embrionale, sia in vivo che in vitro. La qualità dell’ovocita, valutabile
morfologicamente in termini di mantenimento della sua integrità morfofunzionale, è
determinata non solo dal genoma nucleare e mitocondriale, ma anche dal
microambiente fornito dall’ovaio e dal follicolo pre-ovulatorio, che influenza i
processi di trascrizione e di traduzione e, di conseguenza, la maturità citoplasmatica.
Nel corso della sua maturazione, l’ovocita umano va incontro a una complessa e
coordinata riorganizzazione del materiale genetico, dell’ooplasma e della matrice
extracellulare. Tale riorganizzazione, seguita al microscopio elettronico, appare
caratterizzata dalla neogenesi, modificazione e ridistribuzione di organelli,
membrane e trama glicoproteica della zona pellucida. Un’alterazione sia spaziale che
temporale dei processi maturativi, associata a una evidente asincronia morfologica
tra maturazione nucleare e citoplasmatica, può essere responsabile di una ridotta o
alterata performance ovocitaria (Makabe et al., 2006a).
L’applicazione dei protocolli di stimolazione ovarica, utilizzati nel corso delle
procedure di riproduzione assistita, bypassando i complicati processi di selezione che
portano alla maturazione e all’ovulazione fisiologica di un singolo ovocita,
consentono la maturazione di molti ovociti, spesso con qualità compromessa (Rienzi
et al., 2012).
La valutazione morfologica dell’ovocita nel laboratorio di procreazione
medicalmente assistita (PMA) è basata prima di tutto sull’osservazione,
all’invertoscopio a contrasto di fase, delle cellule del cumulo-corona (Veeck, 1999),
che permette di classificare gli ovociti in maturi, intermedi e immaturi, generalmente
correlati rispettivamente con gli stadi di sviluppo MII, MI e VG.
24
Gli ovociti sono classificati come “maturi” quando la corona è radiante e la massa del
cumulo appare espansa, lassa e mucificata, per l’attiva secrezione di acido ialuronico.
Questa molecola si interpone tra le cellule del cumulo disperdendole e conferendo alla
massa cumulo-corona un aspetto lanuginoso e soffice (Rienzi et al., 2012).
Un complesso cumulo-corona meno espanso denota uno stadio di maturità
intermedio e l’assenza di espansione è indice di immaturità.
Nei cicli naturali, la maturazione nucleare corre parallela all’espansione graduale
delle cellule del cumulo e della corona, ma questa sincronia può essere persa nei cicli
stimolati, probabilmente a causa di una diversa sensibilità dell’ovocita e della massa
cumulo-corona alla stimolazione. Per questo motivo la valutazione potrebbe non
rispecchiare con certezza lo stato di maturità ovocitaria (Laufer et al., 1984).
La rimozione delle cellule del cumulo-corona che precede l’inseminazione
intracitoplasmatica dell’ovocita (IntraCytoplasmic Sperm Injection, ICSI), rende
possibile una valutazione più accurata dell’ovocita, in quanto è possibile evidenziare
lo stadio di maturazione nucleare, la morfologia del citoplasma e l’aspetto della
strutture extacitoplasmatiche (Rienzi et al., 2012).
Un ovocita umano maturo ideale dovrebbe avere un citoplasma dall’aspetto
“normale”, uno spessore appropriato della zona pellucida, un singolo corpo polare e
un adeguato spazio perivitellino (Swain and Pool, 2008). La presenza del primo corpo
polare è normalmente considerata il marker di maturità nucleare dell’ovocita (Rienzi et
al., 2012), tuttavia, recenti studi di microscopia a luce polarizzata hanno mostrato che,
nonostante la presenza del corpo polare, gli ovociti possono essere ancora immaturi
(Rienzi et al., 2005). Infatti, solo quelli in cui si osserva il fuso meiotico possono
essere considerati come veri ovociti maturi allo stadio di metafase II (MII). Oltre alla
25
presenza, anche la posizione e il “ritardo” del fuso meiotico sono stati messi in
relazione con la competenza di sviluppo ovocitaria.
La maggior parte degli ovociti recuperati in seguito a stimolazione ovarica
esibiscono una o più variazioni dai criteri morfologici “ideali” descritti (De Sutter et
al., 1996; Balaban et al., 1998; Mikkelsen and Lindeberg, 2001; Balaban and Urman,
2006; Ebner et al., 2006; Rienzi et al., 2008). Questo è vero anche per gli ovociti
ottenuti da donatrici con fertilità accertata (Ten et al., 2007).
La valutazione morfologica comunque spesso fallisce nel predire la capacità di un
ovocita di fecondarsi e di procedere nello sviluppo: solo poche caratteristiche
morfologiche rilevabili negli ovociti in metafase II indicherebbero una competenza
ridotta.
Il diametro medio dell’ovocita può variare sostanzialmente, ma non sono state
osservate correlazioni con i tassi di fecondazione o con la qualità degli embrioni nel
corso delle prime divisioni mitotiche (Romao et al., 2010). La situazione è differente
con gli ovociti giganti (diametro di circa 200 µm, raddoppiato rispetto agli ovociti
normali), che riflettono anomalie genetiche, contenendo un set addizionale di
cromosomi (Balakier et al., 2002; Rosenburch et al., 2002). Questi ovociti derivano
dalla meiosi di ovociti tetraploidi, che sono generati in seguito alla divisione nucleare
non seguita da quella citoplasmatica di un ovogonio o in seguito alla fusione di due
ovogoni. Tali meccanismi spiegano la presenza di due nuclei negli ovociti in profase
I; inoltre, quando osservati al microscopio a luce polarizzata, essi mostrano la
presenza di due fusi meiotici distinti. Sebbene il recupero di ovociti giganti sia
relativamente raro in seguito a stimolazione ovarica, questi ovociti non dovrebbero
26
mai essere utilizzati per la fecondazione in vitro in quanto danno origine a triploidie
diginiche.
Per quanto riguarda la forma ovocitaria sono stati riscontrati vari tipi di anomalie
(Paz et al., 2004; Esfandiari et al., 2005), sebbene sia stato dimostrato che tali ovociti
possono essere fecondati e portare alla nascita di bambini sani.
Sono possibili anche diversi gradi di eterogeneità del citoplasma, sebbene il
significato biologico di tale variabilità non sia noto. Gravi dismorfismi della trama
del citoplasma sembrano essere in grado di compromettere il potenziale di sviluppo
ed impianto dell’embrione (Balaban and Urman, 2006), mentre un citoplasma
leggermente eterogeneo sembra rappresentare solamente una variante piuttosto che
un’anomalia con effetti sullo sviluppo (Alpha Scientists in Reproductive Medicine
and ESHRE Special Interest Group of Embryology, 2011).
Una delle più importanti e gravi anomalie citoplasmatiche ovocitarie è la presenza di
voluminosi aggregati di tubuli di reticolo endoplasmatico liscio (dischi di REL).
E’stata documentata un’associazione significativa tra la presenza di queste anomalie
negli ovociti e il verificarsi di esiti molto gravi in seguito al trasferimento degli
embrioni risultanti (Balaban and Urman, 2006).
I vacuoli, quando di piccole dimensioni, del diametro di 5-10 µm, non sembrano
avere alcuna conseguenza biologica, mentre vacuoli più grandi (>14 µm) sono stati
associati a tassi di fecondazione ridotti. Inoltre, nei casi in cui l’ovocita viene
fecondato, la persistenza di tali strutture in seguito alla singamia può interferire con i
piani di clivaggio ed essere responsabile della riduzione nel tasso di formazione di
blastocisti (Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest
Group of Embryology, 2011).
27
Secondo l’Istanbul consensus workshop on embryo assessment (Alpha Scientists in
Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embriology, 2011) le
anomalie extracitoplasmatiche (la morfologia del primo corpo polare, l’ampiezza
dello spazio perivitellino e l’aspetto della zona pellucida) sarebbero solamente
variazioni fenotipiche.
A causa della complessità dei meccanismi legati alla maturazione ovocitaria e
all’acquisizione della competenza, è improbabile che una singola caratteristica (con
l’eccezione dei dischi di REL e degli ovociti giganti) possa riflettere in modo
adeguato la qualità della cellula (Rienzi et al., 2012).
Invecchiamento riproduttivo
L’esistenza di una relazione inversa tra età e fertilità femminile è nota da tempo ed è
determinata dal graduale esaurimento della riserva di follicoli ovarici e dal
contemporaneo peggioramento della qualità ovocitaria che si verifica con l’età (te
Velde and Pearson, 2002).
Il pool di follicoli primordiali costituisce la riserva ovarica disponibile durante
l’intera vita riproduttiva della donna. Esso raggiunge un picco di 6-7 milioni alla 20°
settimana di vita fetale (Block, 1952, 1953; Baker, 1963). Nella seconda metà della
vita fetale si verifica una rapida perdita, per apoptosi, della maggior parte dei
follicoli primordiali, e alla nascita ne permangono solo 1-2 milioni (Markström et al.,
2002). Dopo la nascita, il tasso di apoptosi subisce un rallentamento così che, al
menarca, sono presenti almeno 300.000-400.000 follicoli primordiali. Nel corso
dell’età riproduttiva il declino continuerà in modo sempre più accelerato e farà
28
scendere il numero di follicoli primordiali al di sotto dei 1000 al momento della
menopausa (Richardson et al., 1987; Faddy and Gosden, 1996; Faddy, 2000). A ogni
specifica età cronologica, la quasi totalità (>99%) degli ovociti presenti nell’ovaio si
trova allo stadio di follicoli quiescenti.
Alcuni studi indicano che la fertilità della donna inizi a decrescere precocemente, in
media già a partire dai 30 anni (Schwartz and Mayaux, 1982; van Noord-Zaadstra et
al., 1991) (Fig 3).
Fig 3. Rappresentazione schematica dei quattro stadi di invecchiamento riproduttivo (riduzione della fertilità, perdita della fertilità naturale, transizione menopausale e menopausa). Tratto da: Broekmans et al., 2009.
Nelle popolazioni del 19° secolo la fertilità era limitata solo da fattori naturali, di
conseguenza l’età della donna al momento della nascita dell’ultimo figlio è
considerabile come la perdita della fertilità naturale. Essa si verifica in media all’età
di 41 anni, con un range compreso tra 23 e 51 anni (Broekmans et al., 2004 ;
O'Connor et al., 1998).
Il primo sintomo clinico del processo di invecchiamento riproduttivo è un
accorciamento della lunghezza del ciclo mestruale di 2-3 giorni (Treloar et al., 1967),
29
ma è solo quando il ciclo mestruale diventa irregolare che in genere la donna si
accorge dell’avvicinarsi della menopausa.
Si verificano con frequenza sempre maggiore cicli allungati o assenza di
mestruazioni, anche per intervalli prolungati. Questo stadio, detto transizione
menopausale (Soules et al., 2001), dura fino al momento dell’ultima mestruazione,
che segna l’ingresso nella menopausa.
La transizione menopausale deve essere distinta dalla perimenopausa, che include
anche l’anno successivo all’ultimo sanguinamento mestruale. L’inizio della fase di
transizione menopausale si verifica in media all’età di 46 anni, con un range
compreso tra 34 e 54 anni (Treloar et al., 1967; den Tonkelaar et al., 1998; Weinstein
et al., 2003; Treloar, 1981; Vollman, 1977). La menopausa si verifica in media
all’età di 51 anni, con un range di variazione compreso tra 40 e 60 anni (Broekmans
et al., 2004; Treloar, 1981; Hagstad et al., 1985 van Noord et al., 1997).
Tra i quattro eventi riproduttivi sopra esposti (Fig 3) (riduzione della fertilità, perdita
della fertilità naturale, transizione menopausale e menopausa) sembra esistere una
relazione temporale fissa (te Velde and Pearson, 2002).
Gli studi condotti in popolazioni del 19° secolo hanno dimostrato che un tasso di
nascita ridotto nei primi anni di matrimonio (tra i 20 e i 30 anni) è associato a un’età
giovane al momento della nascita dell’ultimo figlio (intorno ai 35 anni). Questo
suggerisce che la perdita prematura della fertilità sia preceduta da una fertilità ridotta
già prima dei 30 anni (Eijkemans et al., 2005).
Diversi report di fecondazione assistita hanno evidenziato che, nelle pazienti in cui si
verificano ripetute basse risposte alla stimolazione ovarica, la perdita prematura della
30
fertilità naturale è strettamente associata alla comparsa prematura della transizione
menopausale (de Boer et al., 2003; Lawson R et al., 2003; Nikolaou et al., 2002).
In aggiunta, studi di follow up condotti su donne volontarie hanno dimostrato che
diversi test per la valutazione della riserva ovarica sono predittivi di una precoce
transizione menopausale o menopausa (Sowers et al., 2008 van Rooij et al., 2004).
Inoltre, in popolazioni con assenza di limitazioni riproduttive, la distribuzione delle
curve di età al momento della nascita dell’ultimo figlio (Bouchard, 2000) e al
momento della menopausa tendono ad essere straordinariamente simili (te Velde and
Pearson, 2002; Broekmans et al., 2004). Infine, la durata del periodo di irregolarità
del ciclo che precede la menopausa appare costante e indipendente dall’età in cui la
menopausa successivamente si verifica (te Velde and Pearson, 2002; den Tonkelaar
et al., 1998).
E’ da tenere presente che valutazioni approfondite di singoli individui in diversi
momenti della vita sono difficili da condurre a causa della vasta applicazione di
metodi ormonali per il controllo delle nascite. Comunque, se venisse confermata,
l’interrelazione tra i quattro eventi riproduttivi avrebbe importanti implicazioni
sociali, in quanto consentirebbe una predizione corretta della durata della vita
riproduttiva delle singole donne.
Tecniche di procreazione medicalmente assistita (PMA)
La prima bambina concepita con l’aiuto della PMA, Louise Brown, nacque in
Inghilterra nel 1978 mediante la tecnica IVF-ET (In Vitro Fertilization - Embryo
Transfer, fecondazione in vitro con trasferimento dell’embrione nella cavità uterina)
31
(Edwards, 1980; Steptoe et al., 1980). Da allora, le acquisizioni relative alla
riproduzione umana si sono enormemente evolute, sia da un punto di vista
conoscitivo che tecnico (Edwards and Brody, 1995) e attualmente si stima che più di
8 milioni di bambini nel mondo siano stati concepiti mediante trattamenti di PMA
(de Mouzon et al., 2009).
Le tecniche di PMA disponibili possono essere classificate in tre livelli. Il primo
consiste nella deposizione del seme maschile, opportunamente trattato, direttamente
nell’utero della paziente. E’ un processo che sostituisce il rapporto sessuale e ha lo
scopo di facilitare l’incontro tra spermatozoo e ovocita. Il secondo e terzo livello
invece comprendono metodiche che si avvalgono della fecondazione extracorporea
(IVF/ICSI), con successivo trasferimento dell’embrione ottenuto nella cavità uterina,
stabilendo in questo modo il presupposto diretto per una gravidanza (Micara et al.,
2012; Ubaldi et al., 2009).
Le tecniche di PMA possono rappresentare una soluzione al problema dell’infertilità
dovuta al fattore età. Le strategie di trattamento, sostanzialmente, si basano sulla
possibilità di diminuire il tempo necessario per il concepimento. Ciò può essere
ottenuto attraverso il tentativo di modificare i meccanismi della selezione follicolare
del ciclo ovulatorio spontaneo e di “salvataggio” dall’atresia di un maggior numero
di ovociti del patrimonio follicolare residuo. Quindi, il passaggio critico, rispetto alla
prognosi riproduttiva, è l’efficienza della induzione della crescita follicolare multipla
(ICFM), sia essa associata alle tecniche di I che di II e III livello. La riduzione critica
del patrimonio follicolare, propria della fisiologia ovarica, è a sua volta responsabile
della relativa inadeguatezza della risposta ovarica alla ICFM (Ubaldi et al., 2009).
32
A causa della tendenza generale a posporre la ricerca della prima gravidanza, una
quota sempre maggiore di donne avrà difficoltà a concepire e, di conseguenza, un
numero sempre maggiore di coppie dipenderà dalle tecnologie di riproduzione
assistita (Assisted Reproduction Technology, ART) per ottenere una gravidanza.
Tuttavia la ART potrà compensare solo in parte la progressiva perdita della capacità
riproduttiva femminile (Leridon, 2004; Habbema et al., 2009), lasciando senza figli
la maggior parte delle coppie (oltre il 70%) (Ubaldi et al., 2009; Broekmans et al.,
2009).
33
2. Scopo del lavoro
34
Come illustrato precedentemente, con l’avanzare dell’età della donna la qualità degli
ovociti subisce un deterioramento (te Velde and Pearson, 2002). I sistemi di
classificazione morfologica usati nella routine di laboratorio, basati sulla microscopia
a contrasto di fase (Phase Contrast Microscopy, PCM), spesso non evidenziano
l’invecchiamento dell’ovocita in termini di qualità (Stensen et al., 2010). Infatti
ovociti apparentemente normali possono presentare una fecondabilità ridotta o
l’arresto dello sviluppo durante le prime divisioni embrionali. Il mantenimento
dell’integrità strutturale delle strutture ovocitarie, e il parallelo mantenimento delle
loro funzioni fisiologiche, è essenziale per la fecondazione e per il successivo
sviluppo embrionale. La compromissione di queste strutture, anche in assenza di
difetti rilevabili tramite PCM, può influenzare negativamente questi eventi (Nottola
et al., 2007).
Lo scopo di questo lavoro è l’osservazione approfondita, tramite microscopia ottica
(Light Microscopy, LM) ed elettronica a trasmissione (Transmission Electron
Microscopy, TEM), dei tratti morfologici che caratterizzano l’invecchiamento
ovocitario, sia nel processo fisiologico dell’invecchiamento riproduttivo (Reproductive
Aging, RA), sia nel corso dell’invecchiamento in vitro (In vitro Aging, IvA).
Attraverso la comparazione della qualità strutturale e ultrastrutturale degli ovociti si
è inoltre cercato di comprendere se i due tipi di invecchiamento possano essere
sovrapponibili. Infatti negli ultimi anni l’invecchiamento in vitro è stato assunto
come modello per lo studio dell’invecchiamento riproduttivo, ma ad oggi non
esistono studi di microscopia sistematici sull’argomento.
Lo studio è stato condotto utilizzando ovociti soprannumerari donati alla ricerca,
previa firma di un consenso informato e secondo le leggi vigenti, da pazienti che si
35
sono sottoposte a trattamenti di fecondazione assistita presso la UOC OGC03 -
Infertilità e FIVET (Prof. Cesare Aragona) del DAI (Dipartimento di Attività
Integrata) di Ginecologia e Ostetricia, Perinatologia e Puericultura (Prof. Pierluigi
Benedetti Panici) dell’Azienda Policlinico Umberto I, Università “Sapienza” di
Roma (DU -Dipartimento Universitario- di Scienze Ginecologico-ostetriche e
Scienze Urologiche, Prof. Vincenzo Gentile).
La successiva analisi di microscopia ottica ed elettronica è stata condotta presso la
UO Microscopia elettronica (Prof. Giuseppe Familiari), sezione di Anatomia Umana
(Prof. Eugenio Gaudio) del Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche,
Medico Legali e dell’Apparato Locomotore (Prof. Elio Ziparo) dell’Università
“Sapienza” di Roma. Tale analisi è stata condotta in collaborazione con la sezione di
Anatomia (Prof. Guido Macchiarelli) del Dipartimento di Scienze della Salute
dell’Università degli studi dell’Aquila.
36
3. Materiali e metodi
37
Il presente studio è stato condotto su un totale di 61 ovociti ottenuti a partire da 23
pazienti che si sono sottoposte a cicli di riproduzione assistita (IVF o ICSI) nel
periodo compreso tra ottobre 2007 e luglio 2013. Le coppie sono state selezionate in
base alla condizione di infertilità, escludendo quelle patologie in cui il
microambiente ovarico potesse essere direttamente responsabile delle alterazioni
ovocitarie, come ad esempio l’endometriosi. L’infertilità era dovuta al fattore
maschile nel 39,1% dei casi, al fattore uterino nel 21,8% e al fattore tubarico nel
rimanente 39,1%.
Il processo fisiologico di invecchiamento riproduttivo varia in modo considerevole tra
le donne, motivo per il quale non esiste una definizione universalmente accettata di
“età riproduttiva avanzata”. Tuttavia generalmente l’età di 35 anni è considerata uno
spartiacque in termini di fertilità (American Society of Reproductive Medicine, 2006).
Tenendo conto di questa considerazione, le pazienti sono state suddivise in due gruppi
(A e B): il gruppo A (8 pazienti) comprende le donne con età inferiore ai 35 anni
(range 31-34, età media 32±1,069), mentre appartengono al gruppo B (15 pazienti) le
donne con età uguale o superiore ai 35 anni (range 35-44, età media 38,06±2,84).
Gli ovociti sono stati fissati poco dopo il pick up (tempo 0) o dopo 24 ore di coltura,
per la successiva osservazione al microscopio ottico e al microscopio elettronico a
trasmissione.
Sono stati osservati 25 ovociti nel gruppo A (13 a tempo 0 e 12 a 24 h) e 36 nel
gruppo B (18 a tempo 0 e 18 a 24 h).
Tutte le pazienti incluse in questo studio presentavano un cariotipo normale, erano
negative per colture vaginali o uretrali e non avevano tumori o malattie sistemiche.
Inoltre, le pazienti erano nullipare e si erano precedentemente sottoposte a un
38
numero di cicli di PMA compreso tra 0 e 4. I valori basali in terza giornata del ciclo
non erano in nessun caso superiori a 10mIU/ml per l’ormone follicolo-stimolante
(FSH) e superiori a 40 pg/ml per l’estradiolo (E2).
3.1 Stimolazione ovarica
La prima fase della PMA è rappresentata dalla somministrazione di farmaci per
indurre una maturazione contemporanea di più follicoli, allo scopo di avere a
disposizione più ovociti.
La terapia di induzione della crescita follicolare multipla si basa sulla
desensibilizzazione dell’ipofisi e sulla successiva somministrazione delle
gonadotropine. Questo al fine di evitare ovulazioni spontanee premature, ossia la
rottura dei follicoli prima che si possa procedere al recupero mediante prelievo
ecografico (pick up) degli ovociti in essi contenuti.
La soppressione dell’attività ovarica fisiologica è consistita nella somministrazione
sottocutanea giornaliera, a partire dal 1° giorno del ciclo, di 0,1 ml di Decapeptyl
(Ipsen), un analogo dell’ormone rilasciante le gonadotropine (GnRH).
La soppressione ovarica viene valutata sia ecograficamente, sia tramite il profilo
dell’estradiolo: l’ecografia deve mostrare l’assenza di follicoli in crescita ed i valori
plasmatici dell’estradiolo devono essere inferiori ai 30 pg/ml. Una volta confermata la
soppressione, iniziata la somministrazione sottocutanea giornaliera di 150 IU di FSH
urinario (Fostimon 75 UI, Ibsa) o di FSH+LH urinari (Meropur 75 UI + 75 UI, Ferring).
A partire dal settimo giorno di terapia la crescita follicolare viene attentamente
seguita mediante monitoraggio ecografico (diametro dei follicoli) ed ormonale
39
(misurazione dei livelli plasmatici di estradiolo e di progesterone). La successiva
terapia con le gonadotropine viene modulata in base alla risposta individuale di
ciascuna paziente.
Quando lo sviluppo dei follicoli e i livelli ormonali fanno ritenere che un numero
soddisfacente di ovociti abbia raggiunto un’adeguata maturazione, viene
somministrata la gonadotropina corionica umana (human Chorionic Gonadotrophin,
hCG) per completare lo sviluppo dei follicoli e degli ovociti in essi contenuti.
Ecograficamente deve essere stata riscontrata la presenza di almeno quattro follicoli
con diametro medio >18 mm (due misure perpendicolari) e i livelli ormonali di
estradiolo devono essere compresi tra 1000 e 3000 pg/ml mentre quelli di
progesterone <1,5 ng/ml.
La maturazione finale viene indotta mediante la somministrate sottocutanea di 10.000 IU
di hCG (Gonasi HP 5000, Ibsa). Prima che avvenga l’ovulazione viene programmato il
prelievo degli ovociti (pick up), 34-36 ore dopo la somministrazione della hCG.
3.2 Pick-up ovocitario
Il prelievo degli ovociti è stato eseguito per via transvaginale sotto controllo
ecografico in anestesia locale o in lieve sedazione intravenosa.
La tecnica consiste nell’introduzione in vagina di una sonda ecografica, a cui è
collegato un supporto che consente ad un sottile ago di raggiungere, attraverso la
parete vaginale, i follicoli ovarici, che vengono aspirati singolarmente. Il contenuto di
ciascun follicolo (liquido follicolare ed ovocita) viene prelevato grazie ad un sistema di
aspirazione e raccolto mediante un tubicino all’interno di una provetta sterile.
40
3.3 Recupero degli ovociti
Il contenuto delle provette è stato esaminato in laboratorio mediante uno
stereomicroscopio (Nikon SMZ645), che consente la visualizzazione tridimensionale
del campione. In seguito alla loro identificazione, i complessi cumulo-ovocita
vengono lavati in un mezzo tamponato (Human Tubal Fluid (HTF) + HEPES, Sage,
U.S.A.) supplementato con il 10% di albumina umana (Human Serum Albumin,
HSA, Sage, U.S.A.)
3.4 Microscopia a contrasto di fase
Per cercare di visualizzare il primo corpo polare e l’aspetto del citoplasma, i
complessi cumulo-ovocita vengono strisciati su una piastra e successivamente
osservati all’invertoscopio a contrasto di fase (Nikon TE2000-U ECLIPSE), ad un
ingrandimento di 400x.
3.5 Microscopia ottica ed elettronica
L’analisi strutturale degli ovociti si effettua mediante l’osservazione al microscopio
ottico, mentre l’analisi ultrastrutturale si esegue tramite osservazione al microscopio
elettronico a trasmissione.
Questo dipende dal diverso potere di risoluzione dei due microscopi, ovvero la
distanza minima alla quale due oggetti possono essere ancora distinti come separati,
41
che è indirettamente proporzionale alla lunghezza d’onda della radiazione utilizzata.
Il microscopio ottico, che sfrutta come sorgente la luce visibile, di lunghezza d’onda
elevata, ha un limite di risoluzione di circa 0,3 µm, mentre il microscopio elettronico
a trasmissione, che utilizza come sorgente un fascio di elettroni, caratterizzati da una
lunghezza d’onda molto piccola, è dotato di un potere risolutivo molto maggiore, di
circa 2 nm.
Tra gli ovociti classificati come maturi all’invertoscopio, l’osservazione al LM e al
TEM è stata limitata alla popolazione di buona qualità, in quanto la loro analisi ha un
maggiore impatto clinico. Infatti solo gli ovociti che appaiono normali
all’invertoscopio vengono selezionati di routine per il loro utilizzo nei cicli di PMA.
In totale sono stati selezionati 61 complessi cumulo-ovocita.
3.5.1 Processamento degli ovociti
Per consentirne l’analisi strutturale ed ultrastrutturale, i campioni devono essere
sottoposti ad una serie di fasi di preparazione: fissaggio, post-fissaggio,
disidratazione, inclusione in resina, sezionamento e colorazione delle sezioni
ottenute.
Un totale di 31 complessi cumulo-ovocita (13 appartenenti al gruppo A e 18 al
gruppo B) sono stati fissati subito dopo la loro osservazione al microscopio invertito,
mentre i rimanenti 30 (12 appartenenti al gruppo A e 18 al gruppo B) sono stati
mantenuti in coltura per 24 ore (37°C, 5% CO2) in gocce di Fertilization Medium
(Quinn’s Advantage Medium, Sage U.S.A.) supplementato con albumina umana
(HSA, Sage U.S.A.) al 10%, prima di procedere con il fissaggio.
42
Il fissaggio è stato eseguito ponendo i complessi cumulo-ovocita in una soluzione 1:3
Fertilization Medium (Quinn’s Advantage Medium, Sage U.S.A.): glutaraldeide
2,5% (SIC, Roma, Italia) in PBS e mantenendoli, stoccati in eppendorf, per 2-5
giorni a 4°C.
Dopo il fissaggio i campioni sono stati lavati in PBS, post-fissati con tetrossido di
osmio (Agar Scientific, Stansted, Regno Unito) 1% in PBS per un’ora e mezza e
sciacquati nuovamente in PBS.
Gli ovociti sono stati poi inclusi in piccoli blocchi di agar all’1% delle dimensioni di
circa 5x5x1 mm e disidratati in etanolo (Carlo Erba Reagenti, Milano, Italia) in
concentrazioni crescenti (30%, 50%, 70%, 95%, 100%). I primi tre passaggi di
disidratazione sono stati effettuati per dieci minuti; i successivi due per quindici
minuti.
I campioni disidratati sono stati poi immersi per un’ora e mezza in ossido di propilene
(BDH Italia, Milano, Italia) per la sostituzione del solvente e infine incorporati in
resina, ottenuta dalla miscelazione di Epon 812 (47%), DDSA (24%), MNA (28%) e
DMP30 (1%) (Agar Scientific, Stansted, Regno Unito). L’inclusione è stata
inizialmente condotta overnight in una “prima resina”, costituita da ossido di propilene
e resina in rapporto 1:1. Il giorno successivo è stata aggiunta resina in sostituzione
dell’ossido di propilene e il campione è stato lasciato per due giorni in stufa a 50°C per
la polimerizzazione della resina. I blocchetti di resina con i campioni inclusi sono stati
poi sezionati utilizzando un ultramicrotomo Leika Ultracut.
Per consentirne l’analisi microscopica al LM e al TEM è necessario ottenere, dai
campioni, sezioni di adeguato spessore, che possano essere attraversate
rispettivamente dalla luce e dagli elettroni, emessi dalle sorgenti dei microscopi.
43
Per l’osservazione al LM sono state ottenute sezioni dello spessore di 1 µm
(semifini), utilizzando una lama di vetro mentre, per l’osservazione al TEM è stata
utilizzata una lama di diamante, che permette di ottenere sezioni molto sottili, dello
spessore di 60-80 nm (ultrasottili), in quanto i raggi elettronici sono dotati di scarso
potere di penetrazione.
Per ciascun campione sono state analizzate tre sezioni equatoriali semifini e tre
sezioni equatoriali ultrasottili. Le tre sezioni sono state effettuate a una distanza di 3-
4 µm l’una dall’altra.
Le sezioni semifini sono state recuperate con un ciglio sistemato all’apice di un
bastoncino, poste su vetrini portaoggetti e colorate con il blu di toluidina. I campioni
sono stati poi esaminati al microscopio ottico (Zeiss Axioskop) e fotografati con una
fotocamera digitale (Leica DFC230). Le immagini ottenute al massimo
ingrandimento (100x) sono state ricostruite con la tecnica del Photomerge
(Photoshop CS3).
Le sezioni ultrasottili sono state raccolte su griglie di rame 150 mesh e contrastate
con acetato di uranile saturato (SIC, Roma, Italia) seguito da citrato di piombo (SIC,
Roma, Italia). I campioni sono stati poi esaminati utilizzando due microscopi
elettronici a trasmissione operanti a 80 KV: lo Zeiss EM 10 e il Philips TEM
CM100. Le immagini sono state acquisite usando una fotocamera digitale (Gatan).
3.5.2 Analisi dei parametri morfologici
Per la valutazione della preservazione strutturale e ultrastrutturale degli ovociti
tramite LM e TEM sono stati presi in considerazione i seguenti parametri
44
morfologici di analisi qualitativa, tenendo come riferimento quelli descritti da Motta
et al. (1988) e da Khalili et al. (2012):
- caratteristiche generali dell’ovocita (forma, dimensioni, aspetto dell’ooplasma)
(Fig 1.1)
- integrità della membrana plasmatica (Fig 1.1 e 1.5)
- aspetto e spessore della zona pellucida (Fig 1.1 e 1.5, ZP)
- presenza e aspetto del fuso meiotico (Fig 1.2, mt: microtubuli del fuso; cr:
cromosomi)
- microtopografia e qualità degli organelli (Fig 1.3: mitocondri -M, aggregati di
mitocondri e tubuli di reticolo endoplasmatico liscio -REL, complessi di
mitocondri e vescicole -V- di reticolo endoplasmatico liscio)
- numero, pattern e morfologia dei microvilli (Fig 1.4, m)
- numero, pattern e densità della matrice dei granuli corticali (Fig 1.4, GC)
- spazio perivitellino (Fig 1.5, *): ampiezza, presenza di granularità, presenza e
caratteristiche del primo corpo polare (1° CP)
- presenza di vacuoli e lisosomi (Fig 1.6, Va e frecce)
45
Fig 1. Caratteristiche strutturali (1) e ultrastrutturali (2-6) dell’ovocita umano maturo. Tratto da: Nottola et al., 2012.
3.5.2.1 Analisi statistica
L’analisi statistica è stata condotta su 5 parametri morfologici: spessore della zona
pellucida (Zona Pellucida thickness, ZPt), numero di granuli corticali (Cortical
Granules, CG), numero di microvilli (Mv), densità di aggregati di mitocondri e
tubuli di REL (Mitochondria-Smooth Endoplasmic Reticulum, M-SER) e densità di
complessi mitocondri-vescicole (Mitochondria-Vesicle Complex, MVC), valutati
46
mediante l’acquisizione di microfotografie al TEM all’ingrandimento di 6300x. Le
immagini sono state ulteriormente ingrandite sullo schermo di un PC in modo da
permettere facilmente la conta delle strutture in esame, i cui valori sono stati espressi
come:
a) numero di M-SER per 10 µm2 di area citoplasmatica
b) numero di MVC per 10 µm2 di area citoplasmatica
c) numero di CG per 10 µm di superficie lineare
d) numero di Mv per 10 µm di superficie lineare
Ciascuno dei 5 parametri morfologici è stato valutato all’interno dei 4 gruppi oggetto
dello studio:
gruppo <35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età inferiore a 35 anni
gruppo <35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età inferiore a 35 anni
gruppo ≥35: ovociti MII all’aspirazione di donne con età uguale o superiore a 35 anni
gruppo ≥35c: ovociti MII coltivati per 24 h di donne con età uguale o superiore a 35 anni
Per ciascun parametro è stato calcolato il valore medio e la deviazione standard (DS).
I dati sono stati confrontati mediante un’analisi di varianza a due vie ANOVA,
ponendo come variabili indipendenti (fattori di raggruppamento) l’età e la coltura in
vitro, seguita dal test HSD (Honestly Significant Difference) di Tukey, utilizzando il
software ezANOVA. I risultati sono stati considerati significativi con valori di
p<0,05.
47
4. Risultati
48
In tutti i campioni era riconoscibile, in posizione centrale, un ovocita di forma
rotonda, con un diametro compreso tra 90 e 100 µm e un citoplasma omogeneo. La
membrana plasmatica appariva intatta e circondata da uno stretto spazio perivitellino,
più ampio nel punto in cui era presente il corpo polare, nelle sezioni effettuate su
piani appropriati. Lo spazio perivitellino era regolare e contenente talvolta materiale
granulare disperso.
La zona pellucida appariva intatta e continua e occasionalmente al suo interno erano
visibili residui di prolungamenti citoplasmatici delle cellule del cumulo (Cumulus
Cells, CCs).
In sezioni favorevoli è stato osservato sporadicamente il fuso meiotico.
Tutti i campioni mostravano un numero variabile di strati di cellule del cumulo
compreso tra quattro e sette.
Nei campioni fissati all’aspirazione era presente un cumulo espanso con grandi spazi
intercellulari. Le cellule più vicine all’ovocita avevano una forma allungata mentre le
periferiche avevano una forma cuboidale.
Tutti i campioni mantenuti in coltura per 24 h presentavano un cumulo collassato
costituito da cellule di forma sferica o cuboidale, strettamente adiacenti l’una
all’altra, senza differenze tra cellule periferiche e cellule vicine all’ovocita.
49
Gruppo <35
A basso ingrandimento negli ovociti fissati all’aspirazione di donne giovani è stato
osservato un abbondante numero di organelli, uniformemente distribuiti
nell’ooplasma. A ingrandimento maggiore, gli organelli consistevano principalmente
di mitocondri di forma sferica o ovale, con un diametro variabile tra 0,5 e 0,8 µm e
una matrice moderatamente elettrondensa. I mitocondri erano frequentemente
associati con tubuli di reticolo endoplasmatico liscio anastomizzati tra loro a formare
gli aggregati M-SER (Fig 2d). Questi aggregati erano molto numerosi (2,89±0,68 per
10 µm2) e di dimensioni variabili; solitamente gli aggregati di dimensioni maggiori si
trovavano localizzati nell’area corticale dell’ooplasma.
Meno frequentemente i mitocondri sono stati trovati in associazione con piccole
vescicole sferiche, del diametro di 0,2-0,3 µm, contenenti un materiale leggermente
elettrondenso, a formare i complessi mitocondri-vescicole. Queste strutture, in cui i
mitocondri circondano le vescicole, erano presenti con una densità complessiva di
0,35±0,26 per 10 µm2.
Appena sotto la membrana plasmatica era presente un pattern continuo di granuli corticali
(Fig 2b,c) (11±1,41 per 10 µm), di diametro variabile compreso tra 300 e 400 nm.
Lo spazio perivitellino era stretto e più ampio in corrispondenza del primo corpo
polare (nelle sezioni che giacevano su piani appropriati).
I microvilli (Fig 2c), sporgenti nello spazio perivitellino, erano normali per quantità
(11,18±1,54 per 10 µm), distribuzione e forma. Esternamente era presente una zona
pellucida di struttura normale (Fig 2 a,b,c), dello spessore medio di 18,32±1,93 µm.
50
Il cumulo si presentava espanso (Fig 2a) e le cellule mostravano un nucleo ovale con
uno o più nucleoli. Dispersi nel citoplasma sono stati riscontrati numerosi
mitocondri, gocce lipidiche elettrondense e cisterne appartenenti al complesso di
Golgi.
Fig 2. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo <35
Gruppo <35c
Rispetto al gruppo precedente, il citoplasma degli ovociti delle donne appartenenti
alla stessa classe di età, ma sottoposti a invecchiamento in vitro, mostrava una
riduzione dei complessi M-SER (Fig 3 b,c) (1,80±0,35 per 10 µm2) e un incremento
nella quantità di MVC (Fig 3d) (1,31±0,36 per 10 µm2). Le vescicole erano dotate di
una membrana intatta e di un contenuto elettrondenso. Il loro diametro medio era
inferiore a 1 µm.
51
Complessivamente si osservava una riduzione del numero di granuli corticali
(8,73±0,79 per 10 µm2) e la loro assenza in alcuni distretti suboolemmali.
Occasionalmente è stata osservata una loro parziale internalizzazione.
Sulla superficie della membrana plasmatica regioni con un pattern tipico di
microvilli si alternavano ad aree totalmente prive di queste strutture, di conseguenza
il numero totale di microvilli appariva significativamente ridotto (9,45 ±1,13 per 10
µm).
La ZP (Fig 3b) presentava una tessitura regolare e uno spessore sostanzialmente
invariato rispetto al gruppo precedente (18,27±1,74 µm).
Il cumulo era collassato (Fig 3a) ma a livello ultrastrutturale le CCs erano
sovrapponibili a quelle osservate negli ovociti fissati all’aspirazione di donne
giovani.
Fig 3. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo <35c
52
Gruppo ≥35
Negli ovociti fissati all’aspirazione delle pazienti in età riproduttiva avanzata si
osservavano quantità ridotte di M-SER (Fig 4c) (8,73±0,79 per 10 µm2), che
presentava anche una riduzione delle dimensioni, e un aumento di MVC, sia nel
numero (2,05±0,48 per 10 µm2) che nelle dimensioni. A maggiore ingrandimento le
vescicole di questi complessi apparivano di forma rotonda o allungata e molto
grandi, raggiungendo il diametro di 2-3 µm, ma comunque sostanzialmente intatte
(Fig 4c,d).
Il numero dei CG (7,45±1,37 per 10 µm) era ridotto in maniera molto significativa
rispetto a quello osservato nei due gruppi di ovociti di donne giovani.
Occasionalmente sono stati rilevati dei lisosomi.
Sulla superficie dell’oolemma i microvilli (Fig 4b) erano presenti in scarso numero
(6,00±1,00 per 10 µm): zone con pochi microvilli e dalla struttura atipica, più corta e
sottile del normale, si alternavano ad aree dall’aspetto liscio.
La trama della ZP (Fig 4b) era normale, contrariamente al suo spessore (21,73±1,79
µm), significativamente aumentato rispetto a quello osservato negli ovociti di
entrambi i gruppi di donne giovani.
Il cumulo si presentava espanso (Fig 4a), ma anche in questo caso le CCs non
mostravano caratteristiche ultrastrutturali particolari.
53
Fig 4. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo ≥35
Gruppo ≥35c
Negli citoplasma degli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata e sottoposti a
coltura per 24 h si osservava un ulteriore decremento della quantità di M-SER
(0,57±0,31 per 10 µm2) nonché delle sue dimensioni, mentre i complessi MV (Fig
5c) aumentavano significativamente in numero (3,19±0,40 per 10 µm2) e in
dimensioni, diventando la struttura più rilevante dell’ooplasma. A maggiore
ingrandimento diverse vescicole mostravano una forma irregolare (Fig 5d, freccia),
raggiungendo anche la lunghezza di 4 µm, la rottura delle membrane delimitanti e un
contenuto elettron-trasparente. I CG erano ridotti drasticamente in numero
(2,55±1,37 per 10 µm) e grandi aree al di sotto dell’oolemma ne erano
completamente prive. Occasionalmente sono stati rilevati dei lisosomi.
54
La quantità di microvilli era minima (4,73±1,13 per 10 µm), inoltre, quando presenti,
mostravano uno sviluppo fortemente ridotto. Di conseguenza la superficie
dell’oolemma risultava quasi liscia.
Lo spessore della ZP (21,55±1,57 µm) non differiva significativamente da quello
degli ovociti di donne della stessa classe di età e non sottoposti a invecchiamento in
vitro, ma nella sua parte interna era osservabile un certo aumento dell’elettrondensità
(Fig 5b, *).
Il cumulo si presentava collassato, con CCs dall’aspetto complessivamente
comparabile a quello degli altri campioni (Fig 5a).
Fig 5. Caratteristiche strutturali e ultrastrutturali degli ovociti del gruppo ≥35c
55
4.1 Risultati dell’analisi statistica
<35 <35c ≥35 ≥35c P P Parametri esaminati Media (DS) Età Coltura M-SER 2,89 (0,68) 1,80 (0,35) 0,97 (0,28) 0,57 (0,31) <0,000001 <0,000001 MVC 0,35 (0,26) 1,31 (0,36) 2,05 (0,48) 3,19 (0,40) <0,000001 <0,000001 CG 11,00 (1,41) 8,73 (0,79) 7,45 (1,37) 2,55 (1,37) <0,000001 <0,000001 Mv 11,18 (1,54) 9,45 (1,13) 6,00 (1,00) 4,73 (1,13) <0,000001 <0,000233 ZPt 18,32 (1,93) 18,27 (1,74) 21,73 (1,79) 21,55 (1,57) <0,000001 <0,831740
Tabella 1. Analisi di varianza a due vie ANOVA
L’analisi di varianza a due vie ANOVA ha mostrato i seguenti risultati:
- Effetto dell’età
Gli effetti dell’età erano statisticamente significativi per tutti i parametri valutati.
- Effetto della coltura
Gli effetti della coltura erano statisticamente significativi per tutti i parametri
valutati, eccetto per ZPt.
56
Grafico 1. Test HSD (Honestly Significant Difference) di Tukey
Aggregati M-SER
Gli ovociti delle pazienti appartenenti al gruppo <35 presentavano numerosi
(2,89±0,68 per 10 µm2) aggregati M-SER, di dimensioni variabili. I mitocondri erano
sferici o ovali, con un diametro variabile tra 0,5 e 0,8 µm e una matrice
moderatamente elettrondensa.
Il confronto tra i gruppi mostrava un andamento decrescente nella quantità dell’M-
SER (0,97±0,28 per 10 µm2 nel gruppo <35c; 1,80±0,35 per 10 µm2 nel gruppo ≥35 e
0,57±0,31 per 10 µm2 nel gruppo ≥35c) con differenze statisticamente molto
significative (p<0,01) tra tutti i gruppi nelle comparazioni a coppie (Grafico 1).
57
MVC
Gli ovociti fissati all’aspirazione delle pazienti giovani esibivano pochi complessi
MV (0,35±0,26 per 10 µm2) di piccole dimensioni, confermando quanto riportato in
letteratura (Sundstrom et al., 1985; Szollosi et al., 1986; Motta et al., 1988; El Shafie
et al., 2000).
L’aumento crescente rilevato nella quantità degli MVC (1,31±0,36 per 10 µm2;
2,05±0,48 per 10 µm2 e 3,19±0,40 per 10 µm2 rispettivamente nei gruppi <35c, ≥35 e
≥35c) mostrava differenze statisticamente molto significative (p<0,01) in tutte le
comparazioni a coppie (Grafico 1).
CG
Gli ovociti del gruppo <35 mostravano un pattern continuo di granuli corticali
elettrondensi (11±1,41 per 10 µm), di diametro variabile tra 300 e 400 nm, localizzati
appena al di sotto della membrana plasmatica. Si osservava un trend decrescente nel
numero dei CG (8,73±0,79 per 10 µm in <35c; 7,45±1,37 per 10 µm in ≥35 e
2,55±1,37 per 10 µm in ≥35c) con differenze statisticamente molto significative
(p<0,01) in quasi tutte le comparazioni a coppie. Solo la differenza tra i gruppi <35c
e ≥35 era meno evidente, ma comunque statisticamente significativa (p<0,0146)
(Grafico 1).
58
Mv
Negli ovociti del gruppo <35 i microvilli apparivano normali per morfologia e
numero (11,18±1,54 per 10 µm). Negli ovociti delle pazienti giovani sottoposti a
invecchiamento in vitro (<35c) i microvilli mantenevano la loro morfologia, ma il
loro numero era significativamente ridotto (9,45±1,13 per 10 µm).
Nel gruppo ≥35, la superficie dell’oolemma degli ovociti presentava microvilli rari e
atipici (6,00±1,00 per 10 µm).
Nel gruppo ≥35c sono stati osservati ovociti con un numero molto scarso di
microvilli dallo sviluppo fortemente ridotto (4,73±1,13 per 10 µm) e la superficie
dell’oolemma risultava quasi liscia. La comparazione a coppie mostrava una
differenza altamente significativa tra tutti i gruppi (p<0,01), con l’eccezione della
differenza tra i gruppi ≥35 e ≥35c, minore ma comunque statisticamente significativa
(p<0,05) (Grafico 1).
ZPt
Contrariamente agli altri parametri analizzati, lo spessore medio della zona pellucida
è influenzato solamente dall’età (p<0,000001). La coltura (p<0,831740) non sembra
avere effetto su questo parametro (Tab 1).
Lo spessore medio della zona pellucida era comparabile tra i gruppi di ovociti di
donne giovani, essendo di 18,32±1,93 µm nel gruppo <35 e di 18,27±1,74 µm nel
gruppo <35c. Allo stesso modo non si riscontravano differenze significative tra i
valori osservati nei gruppi di ovociti di donne in età riproduttiva avanzata
59
(rispettivamente 21,73±1,79 µm in ≥35 e 21,55±1,57 µm in ≥35c) sebbene la ZP in
quest’ultimo gruppo presentasse un certo aumento dell’elettrondensità nella parte
interna.
60
5. Discussione
61
L’esito della PMA è strettamente dipendente dalle caratteristiche morfo-funzionali
dell’ovocita (Nottola et al., 2007). Infatti, nel periodo preovulatorio, il gamete
femminile va incontro ad una serie di cambiamenti maturativi che, in assenza di
alterazioni degenerative o dismorfismi, lo rendono competente per la fecondazione e
capace di generare un embrione vitale (Familiari et al., 2006).
La valutazione della morfologia degli ovociti al PCM è un indicatore importante e
insostituibile della qualità ovocitaria, ancora in uso per valutare il successo di un dato
protocollo di PMA. Comunque essa consente solamente un’analisi morfologica
semplice, non adeguata per determinare il potenziale di fecondazione e la
competenza di sviluppo ovocitaria (Khalili et al., 2005).
L’analisi al microscopio elettronico a trasmissione, grazie al suo elevato potere di
risoluzione, consente un esame molto più dettagliato e di conseguenza una migliore
comprensione delle caratteristiche subcellulari dell’ovocita. Evidenziando anche
minime alterazioni substrutturali, non diagnosticabili mediante gli approcci
morfologici utilizzati di routine nei centri di PMA, la microscopia elettronica può
essere in grado di chiarire le cause responsabili di fallimenti altrimenti inspiegabili
nell’ambito delle procedure di fecondazione assistita (Motta et al., 1988;
Sathananthan et al., 1993; El Shafie et al., 2000).
Tuttavia, sebbene consentano di esaminare accuratamente l’ultrastruttura cellulare, le
tecniche di microscopia elettronica presentano importanti limitazioni, principalmente
l’alto costo e la necessità di personale altamente addestrato. Inoltre la preparazione
dei campioni e la loro osservazione sono processi lunghi e quasi completamente
manuali, il che rende difficoltosa l’analisi di un numero ampio di campioni (Khalili
et al., 2012).
62
Negli ultimi anni le tecnologie di riproduzione assistita hanno subito un significativo
miglioramento ma l’invecchiamento ovocitario rimane uno dei principali fattori
limitanti per il successo della PMA. In questa tesi è stata valutata l’ultrastruttura di
ovociti invecchiati con lo scopo di stabilire la presenza, l’entità e il significato dei
cambiamenti subcellulari che possono verificarsi durante il processo
dell’invecchiamento.
Come già esposto nella sezione “materiali e metodi” si è deciso di limitare l’analisi
ultrastrutturale ai soli ovociti che presentavano una buona qualità al microscopio a
contrasto di fase, in quanto questi sono gli ovociti che vengono utilizzati nella
routine clinica.
Gli ovociti fissati all’aspirazione di donne giovani (età inferiori a 35 anni),
mostravano le caratteristiche ultrastrutturali tipiche degli ovociti MII ideali: MVC
piccoli e scarsamente rappresentati (0,35±0,26 per 10 µm2) ed aggregati M-SER ben
rappresentati (2,89±0,68 per 10 µm2), una quantità adeguata di CG e di Mv
(rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10 µm). Lo spessore medio della ZP era
18,32±1,93 µm.
Negli ovociti di donne giovani ma soggetti a invecchiamento in vitro si osservava un
aumento della densità di MVC (1,31±0,36 per 10 µm2) ed una contemporanea
riduzione dei complessi M-SER (1,80±0,35 per 10 µm2) e, in misura più lieve, dei
CG e degli Mv (rispettivamente 11±1,41 e 11,18±1,54 per 10 µm). Lo spessore
medio della ZP era 18,27±1,74 µm.
Negli ovociti fissati all’aspirazione di donne in età riproduttiva avanzata (≥ 35 anni)
gli MCV sono presenti in numero maggiore (2,05±0,48 per 10 µm2), i complessi M-
SER erano scarsi (0,97±0,28 per 10 µm2) e si osservava una ulteriore riduzione dei
63
CG e degli Mv (rispettivamente 7,45±1,37 e 6±1 per 10 µm). Lo spessore medio
della ZP era 21,73±1,79 µm.
Negli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata ma soggetti a invecchiamento in
vitro si osservava un aumento notevole della densità degli MVC (3,19±0,40 per 10
µm2) e una marcata diminuzione dei complessi M-SER (0,57±0,31 per 10 µm2). Si
notava anche una riduzione della quantità di CG e di Mv (rispettivamente 2,55±1,37 e
4,73±1,13 per 10 µm). Lo spessore medio della ZP era 21,55±1,57 µm.
Le variazioni numeriche, tutte statisticamente significative, mostrano un andamento
graduale, essendo minime nel gruppo <35c, più evidenti nel gruppo ≥35 e molto
accentuate nel gruppo ≥35c.
Nel caso dello spessore della ZP non si osserva un andamento graduale ma
differenze dovute solamente all’età.
Per valutare meglio le cause e le conseguenze dei cambiamenti osservati negli
organelli in esame è necessario esaminare ciascun elemento individualmente.
M-SER e MVC
A partire dalla loro scoperta nel diciannovesimo secolo, i mitocondri sono stati
considerati dei “parassiti” cellulari, originati dall’incorporazione, in cellule primitive,
di batteri aventi un proprio metabolismo ossidativo (Jansen and de Boer, 1998).
Questa teoria ha ricevuto supporto da studi biochimici e di microscopia elettronica,
che hanno rivelato che i mitocondri contengono propri DNA (mtDNA), ribosomi e
RNA (Smith and Alcivar, 1993). Il genoma mitocondriale non segue le leggi
64
dell’eredità mendeliana, ma viene trasmesso da una generazione alla successiva con
il citoplasma ovocitario, una modalità conosciuta come “eredità citoplasmatica”
(Jansen and de Boer, 1998). L’eredità citoplasmatica, in contrasto con l’eredità
nucleare, avviene quasi esclusivamente per via materna, sebbene sia stato accertato
un ruolo per il centriolo prossimale dello spermatozoo fecondante
nell’organizzazione del fuso mitotico delle prime divisioni embrionali (Sathananthan
et al., 1996; Palermo et al., 1997).
Nelle prime fasi di sviluppo embrionale non vengono prodotti nuovi mitocondri, di
conseguenza l’embrione è totalmente dipendente dai mitocondri ereditati dalla madre
(Sathananthan et al., 2006).
I mitocondri rappresentano gli organelli più abbondanti riscontrati nell’ooplasma degli
ovociti fissati all’aspirazione di pazienti giovani, in cui si trovano generalmente
organizzati con elementi tubulari di reticolo endoplasmatico liscio a formare aggregati
M-SER di varie dimensioni; meno frequentemente i mitocondri si ritrovano associati
con vescicole di reticolo endoplasmatico liscio a formare piccoli complessi MV
(Sundstrom et al., 1985; Szollosi et al., 1986; Motta et al., 1988; El Shafie et al., 2000).
Durante la maturazione dell’ovocita, l’aggregazione dei tubuli di SER sembra essere
il primo dei fenomeni a comparire; successivamente tali tubuli vengono circondati
dai mitocondri, costituendo gli aggregati M-SER; questi ultimi, a loro volta,
rappresentano probabilmente i precursori dei complessi MV che compaiono più
tardi, solo durante la fase finale di maturazione citoplasmatica dell’ovocita
(Sundstrom et al., 1985; Motta et al., 1988, 2003).
65
A sostegno dell’ipotesi della generazione dei complessi MV a partire dagli aggregati M-
SER vi sono le osservazioni al TEM, in cui sono state riscontrate figure di transizione
con caratteristiche intermedie tra tubuli e vescicole (Motta et al., 1988).
La presenza di complessi MV grandi e numerosi è una caratteristica non comune degli
ovociti umani maturi ed è considerata un processo degenerativo (El Shafie et al., 2000).
A questo proposito, gli MVC non devono essere confusi con i vacuoli, caratterizzati
da una membrana delimitante interrotta e da un contenuto traslucente, scarsamente
elettrondenso rispetto al citoplasma circostante e pressoché identico a quello presente
nello spazio perivitellino. I vacuoli, normalmente assenti nell’ovocita umano maturo,
si formano in risposta a un danno cellulare, come per esempio nel corso di procedure
di criopreservazione ovocitaria (Nottola et al., 2007, 2008; Coticchio et al., 2010;
Khalili et al., 2012).
Le osservazioni originali effettuate nel presente studio rivelano che durante
l’invecchiamento degli ovociti maturi, sia fisiologico che dovuto alla coltura in vitro,
l’equilibrio reciproco di M-SER/MVC è compromesso, si osserva infatti un generale
decremento nella densità degli aggregati M-SER e un proporzionale incremento degli
MVC. Questo suggerisce che in entrambi i tipi di invecchiamento si verifichi un
progressivo rigonfiamento e vescicolazione dei tubuli SER, sebbene sia necessario
chiarire le differenze osservate tra i diversi gruppi.
Negli ovociti di donne giovani coltivati in vitro, si è osservato un aumento dei
complessi MV, che rimpiazzavano gli aggregati M-SER. Tuttavia le vescicole erano
di piccole dimensioni (inferiori a 1 µm), moderatamente elettrondense e
sostanzialmente intatte. Anche nell’invecchiamento riproduttivo i complessi MV
rappresentavano una percentuale cospicua degli organelli citoplasmatici a spese
66
dell’M-SER, ma si osservava un considerevole rigonfiamento delle vescicole (circa
2-3 µm). L’interazione tra invecchiamento riproduttivo e invecchiamento in vitro
causa uno sconvolgimento drammatico del bilancio M-SER/MVC e gli MVC
diventano gli organelli più rappresentati nell’ooplasma. Inoltre numerose vescicole
mostravano la rottura delle membrane e il rilascio del loro contenuto, diventando
elettrontrasparenti e dando inizio ad una vacuolizzazione citoplasmatica.
Il rigonfiamento e la vescicolazione del reticolo endoplasmatico liscio è stato messo
in relazione con lo stress ossidativo (de Bruin et al., 2004), ma potrebbe anche
essere dovuto all’ingresso di acqua in seguito a condizioni colturali non ottimali
(Ghadially, 1982).
I risultati del presente studio suggeriscono che gli ovociti più giovani reagiscano
meglio all’invecchiamento in vitro, mantenendo l’integrità delle vescicole, mentre gli
ovociti di donne in età avanzata sembrano essere più sensibili, probabilmente in
quanto sono già stati danneggiati all’interno dell’ambiente ovarico. Condizioni di
coltura subottimali quindi, agendo su un SER già compromesso, provocherebbero
una dilatazione ulteriore e la rottura delle vescicole, con trasformazione in veri
vacuoli. Questo è in linea con quanto osservato da de Bruin et al. (2004) per il pool
di follicoli quiescienti di donne in età avanzata. Precedentemente alcuni autori
avevano suggerito che la transizione M-SER/MCV fosse accelerata e incrementata
dalla permanenza in coltura dell’ovocita: infatti generalmente negli ovociti maturi i
complessi MV sono piccoli e scarsamente rappresentati, mentre sono grandi e
numerosi negli ovociti che sono stati maturati in vitro o che sono stati tenuti in
coltura per lungo tempo (Sathananthan et al., 1993, 2006; El Shafie et al., 2000). Le
nostre valutazioni morfometriche e quantitative confermano questa ipotesi ed
67
aggiungono una nuova informazione: un simile fenomeno ultrastrutturale si verifica
nell’invecchiamento riproduttivo.
Sebbene gli elementi del REL associati ai mitocondri siano presenti in diverse forme
(tubuli e vescicole: M-SER e MVC), essi appartengono allo stesso apparato
funzionale.
Questi particolari sistemi di membrane associate ai mitocondri sembrano possedere
diversi ruoli nell’ovocita:
- ricco pool di energia di riserva, necessaria per la fecondazione e per le prime fasi
di sviluppo embrionale
- produzione/secrezione di sostanze (nutrienti, fattori di crescita) utili per la
fecondazione e/o per le prime fasi di sviluppo embrionale
- neogenesi di membrane necessarie per la fecondazione e per le prime divisioni
cellulari (Motta et al., 1988, 2000, 2003)
- regolazione della concentrazione intracellulare di ioni calcio (Sousa et al., 1997;
Makabe et al., 2006a).
I segnali del calcio sono coinvolti nel controllo di molti eventi che si verificano
durante la fecondazione e le prime fasi di sviluppo embrionale: l’avvio
dell’attivazione ovocitaria (Swann and Ozil, 1994), lo sviluppo dei pronuclei e la
singamia (Poenie et al., 1985; Gillot and Whitaker, 1994) e il ciclo cellulare nel
corso dello sviluppo embrionale precoce (Poenie et al., 1985; Whitaker and Patel,
1990; Hepler, 1992). Quindi, la disorganizzazione morfologica delle strutture di
deposito del calcio (REL), con possibile alterazione del loro contenuto, può
rappresentare l’evidenza ultrastrutturale di pathways di calcio compromessi, e di
conseguenza di una ridotta fecondabilità e competenza di sviluppo.
68
Gli eventi di attivazione ovocitaria includono l’esocitosi dei granuli corticali (con il
conseguente blocco della polispermia), la ripresa del ciclo cellulare e il reclutamento
degli mRNA materni (Schultz and Kopf, 1995).
Negli ovociti di mammifero l’ingresso dello spermatozoo fecondante induce drastici
cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio, consistenti in un singolo
aumento di lunga durata seguito da aumenti brevi e ripetitivi che durano per diverse
ore. Questi cambiamenti temporali nella concentrazione intracellulare di calcio sono
detti “oscillazioni di calcio” (Miyazaki, 2006).
Recentemente la presenza di aggregati di tubuli di REL particolarmente voluminosi
(dischi di REL), rilevabile anche tramite microscopia a contrasto di fase, è stata
messa in relazione con diversi esiti negativi nel corso delle procedure di PMA. Nel
limitato numero di studi presenti in letteratura dedicati esclusivamente a questo
dismorfismo strutturale è stato osservato un ridotto tasso di fecondazione e di
divisione embrionale (Sa et al., 2011), un ridotto tasso di formazione di blastocisti
(Ebner et al., 2008; Sa et al., 2011), di impianto e di gravidanza clinica (Otsuki et al.,
2004; Sa et al., 2011). La presenza di questi aggregati sembra inoltre essere associata
ad aborto precoce (Ebner et al., 2008), ad alcuni difetti di imprinting nei nati (es.
sindrome di Beckwith-Wiedemann) (Otsuki et al., 2004) e a diversi tipi di
malformazioni quali l’ernia del diaframma (Ebner et al., 2008) e lievi difetti cardiaci
(Sa et al., 2011). La “connessione molecolare” tra questo dismorfismo strutturale del
REL e gli esiti negativi sembra essere il livello di calcio intracellulare raggiunto in
seguito all’ingresso dello spermatozoo: rispetto agli ovociti normali, negli ovociti
che presentano questo fenotipo dismorfico il primo picco nella concentrazione di
69
calcio è significativamente superiore e di maggiore durata (Alpha Scientists in
Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embriology, 2011).
Alterazioni nelle oscillazioni di calcio sono state descritte da vari autori anche
nell’invecchiamento in vivo e in vitro. Negli ovociti invecchiati è stata osservata una
frequenza maggiore delle oscillazioni, mentre l’ampiezza dei singoli picchi era
ridotta in modo significativo (Igarashi et al., 1997; Takahashi et al., 2000, 2003,
2009). Questi dati si riferiscono purtroppo al topo, che viene usato come organismo
modello in quanto l’attuazione di ampi studi sugli ovociti umani è complicata da
problemi etici e dalla difficoltà nell’ottenere un numero sufficiente di ovociti per la
ricerca.
Per quanto riguarda i mitocondri associati alle membrane di reticolo endoplasmatico
liscio, le analisi al TEM del presente studio non rivelano nessuna variazione
ultrastrutturale degna di nota, così come è stato descritto anche da de Bruin et al.
(2004) per il pool di follicoli quiescienti di donne in età avanzata e da Sathananthan
(1997, 2013) e Van Blerkom (2011) per gli ovociti MII sottoposti a coltura in vitro.
In questi ultimi infatti i mitocondri cominciano a presentare alterazioni strutturali
dopo due o più giorni di coltura: tendono a raggrupparsi insieme, diventano più
elettrondensi, mostrano una matrice con granuli densi (Sathananthan, 1997, 2013) e
dopo 3 o 4 giorni presentano la comparsa di spazi traslucenti all’interno della matrice
(Van Blerkom, 2011).
E’ possibile che i tempi brevi di coltura utilizzati in questo studio (24h) non
permettano il verificarsi di alterazioni ultrastrutturali e probabilmente riproducono
meglio la situazione clinica reale. La frazione totale di mitocondri non è stata
quantificata perché il metodo appropriato di quantificazione è ancora dibattuto e le
70
immagini al TEM non sembrano essere adatte (Van Blerkom, 2011). Inoltre i livelli
di ATP in ovociti di donne di età superiore a 40 anni sembrano essere simili a quelli
presenti negli ovociti in donne giovani (Van Blerkom, 2011).
Così, sebbene il deficit bioenergetico sia uno dei più affascinanti fattori candidati per
il fallimento riproduttivo legato all’età, le considerazioni sopra riportate e i risultati
del presente studio suggeriscono che la causa non sia attribuibile ai mitocondri. Un
ruolo cruciale sembra invece che lo giochino i dismorfismi del REL, che possono
essere predittivi di alterazioni nel metabolismo del calcio. I dati del presente studio,
che hanno documentato un’importante transizione degli aggregati M-SER in
complessi MV negli ovociti invecchiati, sembrerebbero favorire questa ipotesi.
Lisosomi
I lisosomi sono organelli coinvolti nei fenomeni di autolisi/autodigestione del materiale
ovocitario e quindi sono correlabili alla degenerazione dell’ovocita stesso (Sathananthan
et al., 2006). Essi sono numerosi negli ovociti immaturi (Motta et al., 2003) e aumentano
in seguito ad invecchiamento in vitro prolungato (Sathananthan et al., 2006).
Nel presente studio sono stati riscontrati nelle pazienti in età riproduttiva avanzata.
Granuli corticali
I granuli corticali sono gli organelli più rappresentati nella zona corticale
dell’ooplasma degli ovociti umani maturi. Hanno origine dall’apparato di Golgi
71
quando l’ovocita è ancora immaturo e il loro numero aumenta progressivamente nel
corso della maturazione ovocitaria, con la migrazione verso l’oolemma
(Sathananthan et al., 1985, 2006; Familiari et al., 2006). Una volta terminata la
funzione di sintesi dei CG, l’apparato di Golgi si osserva solo occasionalmente,
venendo gradualmente rimpiazzato nell’ooplasma dal REL.
Nell’ovocita maturo i CG si trovano disposti linearmente in 1-3 file al di sotto della
membrana plasmatica, da cui sono separati da una rete di microfilamenti actinici
(Sathananthan, 1997; Sathananthan et al., 2006), che controlla il loro ancoraggio e
rilascio (Sun and Schatten, 2006).
I CG contengono glicosamminoglicani, proteasi, fosfatasi acida e perossidasi
(Strömsted and Byskov, 1999).
Sebbene questi granuli possano occasionalmente liberare il loro contenuto nello
spazio perivitellino indipendentemente dalla fecondazione (Lopata et al., 1980;
Szollosi et al., 1986), il rilascio fisiologico, immediato e massiccio del loro contenuto
(reazione corticale), avviene solo al momento dell’ingresso dello spermatozoo
fecondante. In seguito all’esocitosi del contenuto dei CG, nella porzione interna della
ZP si formano grandi aree in cui i filamenti che la costituiscono si compattano
strettamente insieme (reazione zonale). Questa modificazione della struttura della ZP
impedisce la penetrazione di altri spermatozoi (blocco della polispermia) (Familiari
et al., 1992, 2006).
Le osservazioni sul destino dei CG nel corso dell’invecchiamento umano sono scarse
e limitate all’invecchiamento in vitro, mentre gli studi condotti su animali modello
sono numerosi.
72
Nel topo sono state descritte numerose alterazioni morfologiche dei CG negli ovociti
recuperati da femmine in età riproduttiva avanzata (Peluso et al., 1980; Tarin et al.,
2001; Diaz and Esponda, 2004), durante l’invecchiamento post-ovulatorio in vivo
(Szollosi, 1971; Ducibella et al., 1990; Xu et al., 1997; Diaz and Esponda, 2004) e
durante l’invecchiamento in vitro (Dodson et al., 1989; Abbott et al., 1998).
Gli studi condotti sugli ovociti umani MII invecchiati in vitro mostrano risultati
contraddittori: Ducibella et al. (1995) riscontrarono il verificarsi dell’esocitosi dei
CG e il conseguente indurimento della zona pellucida, mentre Talevi et al. (1997)
osservarono una distribuzione normale dei CG, ma alterazioni intrinseche della ZP
(penetrazione all’interno della ZP di residui glucidici della matrice extracellulare
presente all’interfaccia tra ZP e corona radiata).
I risultati di questo studio evidenziano una riduzione nella quantità dei CG
subolemmali nei tre gruppi di ovociti invecchiati (<35c, ≥35 e ≥35c), rispetto agli
ovociti del gruppo “di controllo” <35. Questo fenomeno può avere una triplice
interpretazione: potrebbe riflettere un problema nella sintesi, una distribuzione
alterata o un’esocitosi prematura dei CG.
Negli ovociti invecchiati in vitro di donne giovani (gruppo <35c) è stato osservato un
certo grado di internalizzazione dei CG, ma l’elettrondensità della loro matrice
interna appare preservata, in linea con quanto osservato precedentemente da
Sathananthan (1997). Questo porterebbe ad escludere un difetto nella produzione, per
cui il fenomeno potrebbe essere attribuito ad una distribuzione difettiva
accompagnata da un lieve grado di esocitosi (in quanto la ZP non sembra presentare
alterazioni).
73
Tutti gli ovociti di donne in età avanzata (gruppi ≥35 e ≥35c), oltre alla significativa
riduzione della quantità, mostrano anche una riduzione della densità della matrice dei
CG. Questo suggerisce un deficit nella sintesi dei CG, ipotesi supportata dalla
presenza di un Golgi dilatato negli ovociti immaturi invecchiati (de Bruin et al.,
2004). Inoltre negli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata coltivati in vitro
(gruppo ≥35c) si verifica un’evidente compattamento della parte interna della ZP,
suggerendo il verificarsi di un maggior grado di esocitosi.
Microvilli
I microvilli sono estroflessioni digitiformi della membrana plasmatica contenenti uno
scheletro di filamenti di actina (Sathananthan, 1997). Essi esercitano un ruolo
fondamentale nella fecondazione, mediando il contatto e la fusione con lo
spermatozoo fecondante (Sathananthan et al., 1993).
I risultati di questo studio mostrano che gli ovociti di donne giovani fissati
all’aspirazione sono dotati di numerosi microvilli di aspetto normale, come descritto
precedentemente da diversi autori (Motta et al., 1988; Sathananthan et al., 1993,
2006; El Shafie et al., 2000; Familiari et al., 2006).
In tutti gli ovociti invecchiati, invece, sono stati osservati anomalie morfologiche e/o
e diversi gradi di riduzione della loro quantità, in linea con quanto osservato
precedentemente in altri studi (Pickering et al., 1988; Sathananthan, 1994). Dato il
ruolo fondamentale dei microvilli nella fecondazione, queste anomalie potrebbero
essere responsabili della ridotta fecondabilità osservata negli ovociti invecchiati.
74
Zona pellucida
Gli ovociti di mammifero sono circondati da una matrice extracellulare glicoproteica
detta zona pellucida (ZP), che nella specie umana è costituita da quattro
glicoproteine designate come ZP1-4 (Gupta et al., 2012). Osservata al TEM la ZP ha
un aspetto granulo-fibrillare e presenta un margine esterno irregolare e ruvido
(Familiari et al., 1992).
La zona pellucida si forma durante lo sviluppo preantrale del follicolo all’interfaccia
tra ovocita e cellule follicolari e, una volta completata la sua sintesi, permane attorno
all’ovocita durante le successive fasi della follicologenesi, al momento
dell’ovulazione e della fecondazione; successivamente, continua a circondare
l’embrione fino al momento dell’impianto in utero fungendo da barriera protettiva,
da filtro selettivo e mediando gli scambi tra l’ovocita/embrione e il microambiente
circostante (Motta et al., 2003).
Circondando l’embrione fino allo stadio di blastocisti, la zona pellucida previene
l’instaurarsi di gravidanze ectopiche, dovute ad un impianto embrionale prematuro
(Familiari et al., 2006).
La ZP inoltre gioca un ruolo cruciale durante la fecondazione, mediando il legame
specie-specifico con gli spermatozoi, l’induzione della reazione acrosomiale e la
prevenzione della polispermia (Gupta et al., 2012).
Inizialmente gli spermatozoi capacitati con l’acrosoma intatto si legano alle
glicoproteine ZP1, ZP3 e ZP4. Questo legame induce la reazione acrosomiale che
consiste nella fusione della membrana acrosomiale esterna con la membrana
plasmatica e nel conseguente rilascio del contenuto dell’acrosoma. Dopo aver
75
completato la reazione acrosomiale, che determina l’esposizione della membrana
acrosomiale interna, gli spermatozoi si legano a ZP2, penetrano attraverso la ZP
raggiungendo lo spazio perivitellino e si fondono con la membrana plasmatica
dell’ovocita. La fusione delle membrane dei gameti innesca la reazione corticale, in
conseguenza della quale viene impedito l’ingresso di altri spermatozoi (Wassarman,
1999).
I nostri dati mostrano che gli ovociti di donne in età riproduttiva avanzata presentano
una ZP sostanzialmente più spessa rispetto a quella degli ovociti di donne giovani,
indipendentemente dall’invecchiamento in vitro, suggerendo l’esistenza di una
correlazione diretta con l’età della donna. In letteratura questo aspetto è controverso:
alcuni studi suggeriscono un significativo incremento dello spessore della ZP con
l’età (Nawroth et al., 2001; Kiliani et al., 2006), mentre altri sostengono il contrario
(Garside et al., 1999; Valeri et al., 2011). Tuttavia questi dati sono stati ottenuti
tramite valutazioni al microscopio ottico, che potrebbe non essere adatto nel rilevare
piccole variazioni nello spessore della zona pellucida.
Una zona ispessita è stata messa in relazione con un ridotto tasso di fecondazione
nelle procedure IVF (Bertrand et al., 1995; Nawroth et al., 2001).
Inoltre nel presente studio negli ovociti di donne in età avanzata e sottoposti a coltura
è stato osservato un compattamento della parte interna della ZP.
76
6. Conclusioni
77
Gli ovociti invecchiati in vitro e quelli invecchiati in vivo condividono molte
caratteristiche ultrastrutturali tipiche che possono essere considerate markers
morfologici di invecchiamento. Inoltre, i dati presentati in questo lavoro rivelano che
gli ovociti di donne giovani sembrano meno sensibili all’invecchiamento in vitro
rispetto a quelli di donne in età avanzata, già soggetti a invecchiamento riproduttivo.
L’invecchiamento subito in vitro in questi ultimi ovociti potrebbe spiegare la loro
ridotta finestra di fecondazione e la minore competenza di sviluppo.
Alla luce di quanto esposto si evidenzia l’importanza che riveste la figura
dell’embriologo, laddove un ritardo nell’esecuzione dell’inseminazione potrebbe
compromettere l’esito della PMA: al fine di evitare ulteriori danni ultrastrutturali, gli
ovociti di donne in età avanzata andrebbero inseminati il prima possibile dopo la loro
aspirazione.
Probabilmente l’invecchiamento in vitro dipende dalle condizioni di coltura, non
efficienti. Si rendono dunque necessari ulteriori studi per chiarire il ruolo della
composizione dei terreni di coltura nel processo di invecchiamento e delle condizioni
del microambiente nella quale avviene la coltura stessa.
78
7. Bibliografia
79
Abbott AL, Xu Z, Kopf GS, Ducibella T and Schultz RM (1998) In vitro culture retards spontaneous activation of cell cycle progression and cortical granule exocytosis that normally occur in in vivo unfertilized mouse eggs. Biol Reprod 59: 1515-1521. Ackert CL, Gittens JE, O’Brien MJ, Eppig JJ and Kidder GM (2001) Intercellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse. Dev Biol 233: 258-270. Albertini DF (1992) Regulation of meiotic maturation in the mammalian oocyte: inteplay between exogenous cues and the microtubule cytoskeleton. BioEssays 14: 97-103. Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology (2011) The Istanbul consensus workshop on embryo assessment: proceedings of an expert meeting. Hum Reprod 26: 1270-1283. Baca M and Zamboni L (1967) The fine structure of human follicular oocytes. J Ultrastruct Res 19: 354-381. Baker TG (1963) A quantitative and cytological study of germ cells in human ovaries. Proc R Soc Lond B Biol Sci 158: 417-433. Baker TG and Franchi LL (1967) The fine structure of oogonia and oocytes in human ovaries. J Cell Sci 2: 213-224. Balaban B and Urman B (2006) Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reprod Biomed Online 12: 608-615. Balaban B, Urman B, Sertac A, Alatas C, Aksoy S and Mercan R (1998) Oocyte morphology does not affect fertilization rate, embryo quality and implantation rate after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 13: 3431-3433. Balakier H, Bouman D, Sojecki A, Librach C and Squire JA (2002) Morphological and cytogenetic analysis of human giant oocytes and giant embryos. Hum Reprod 17: 2394-2401. Bertrand E, Van den Bergh M and Englert Y (1995) Does zona pellucida thickness influence the fertilization rate? Hum Reprod 10: 1189-1193. Block E (1952) Quantitative morphological investigations of the follicular system in women; variations at different ages. Acta Anat (Basel) 14: 108-123. Block E (1953) A quantitative morphological investigation of the follicular system in newborn female infants. Acta Anat (Basel) 17: 201-206. Bornslaeger EA, Mattei P and Schultz RM (1986) Involvement of cAMP-dependent protein kinase and protein phosphorylation in regulation of mouse oocyte maturation. Dev Biol 114: 453-462. Bouchard G (2000) Through the meshes of patriarchy: the male/female relationship in the Saguenay peasant society (1860-1930), IV edn., Elsevier Science Inc., New York, pp 397-425.
80
Bowles J and Koopman P (2010) Sex determination in mammalian germ cells: extrinsic versus intrinsic factors. Reproduction 139: 943-958. Broekmans FJ, Faddy MJ, Scheffer G and te Velde ER (2004) Antral follicle counts are related to age at natural fertility loss and age at menopause. Menopause 11: 607-614. Broekmans FJ, Soules MR and Fauser BC (2009) Ovarian aging: mechanisms and clinical consequences. Endocr Rev 30: 465-493. Buffet NC and Bouchard P (2001) The neuroendocrine regulation of the human ovarian cycle. Chronobiol Int 18: 893-919. Coticchio G, Borini A, Distratis V, Maione M, Scaravelli G, Bianchi V, Macchiarelli G and Nottola SA (2010) Qualitative and morphometric analysis of the ultrastructure of human oocytes cryopreserved by two alternative slow cooling protocols. J Assist Reprod Genet 27: 131-140. De Boer EJ, den Tonkelaar I, te Velde ER, Burger CW and van Leeuwen FE (2003) Increased risk of early menopausal transition and natural menopause after poor response at first IVF treatment. Hum Reprod 18: 1544-1552. De Bruin JP, Dorland M, Spek ER, Posthuma G, van Haaften M, Looman CW and te Velde ER (2004) Age-related changes in the ultrastructure of the resting follicle pool in human ovaries. Biol Reprod 70: 419-424. De Koning CH, McDonnell J, Themmen AP, de Jong FH, Homburg R and Lambalk CB (2008) The endocrine and follicular growth dynamics throughout the menstrual cycle in women with consistently or variably elevated early follicular phase FSH compared with controls. Hum Reprod 23: 1416-1423. De Mouzon J, Lancaster P, Nygren KG, Sullivan E, Zegers-Hochschild F, Mansour R, Ishihara O and Adamson D (2009) World collaborative report on assisted reproductive technology. Hum Reprod 24: 2310-2320. De Sutter P, Dozortsev D, Qian C and Dhont M (1996) Oocyte morphology does not correlate with fertilization rate and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 11: 595-597. den Tonkelaar I, te Velde ER and Looman CW (1998) Menstrual cycle length preceding menopause in relation to age at menopause. Maturitas 29: 115-123. Diaz H and Esponda P (2004) Ageing-induced changes in the cortical granules of mouse eggs. Zygote 12: 95-103. Dodson MG, Minhas BS, Curtis SK, Palmer TV and Robertson JL (1989) Spontaneous zona reaction in the mouse as a limiting factor for the time in which an oocyte may be fertilized. J In Vitro Fert Embryo Transf 6: 101-106. Ducibella T, Duffy P, Reindollar R and Su B (1990) Changes in the distribution of mouse oocyte cortical granules and ability to undergo the cortical reaction during gonadotropin-stimulated meiotic maturation and aging in vivo. Biol Reprod 43: 870-876.
81
Ducibella T, Dubey A, Gross V, Emmi A, Penzias AS, Layman L and Reindollar R (1995) A zona biochemical change and spontaneous cortical granule loss in eggs that fail to fertilize in vitro fertilization. Fertil Steril 64: 1154-61. Dvorak M and Tesarik J (1980) Ultrastructure of human ovarian follicles. In: Biology of the ovary, Developments in Obstetrics and Gynecology (Motta PM and Hafez ESE), Martinus Nijhoff Publishers, The Hague, pp 121-137. Ebner T, Moser M and Tews G (2006) Is oocyte morphology prognostic of embryo developmental potential after ICSI? Reprod Biomed Online 12: 507-512. Ebner T, Shebl O, Moser M, Sommergruber M and Tews G (2008) Developmental fate of ovoid oocytes. Hum Reprod 23: 62-66. Eddy EM (1996) The germ line and development. Dev Gen 19: 287-289. Edwards RG (1980) Conception in the Human Female. Academic Press, London; New York. Edwards RG and Brody SA (1995) Principles and Practice of Assisted Human Reproduction. Saunders Company, Philadelphia. Eichenlaub-Ritter and Peschke M (2002) Expression in in-vivo and in-vitro growing and maturing oocytes: focus on regulation of expression at the translational level Hum Reprod Update 8: 21-41. Eijkemans MJ, Habbema JDF and te Velde ER (2005) Age at last childbirth and fertility at young age. In: Fertility in populations and in patients (Eijkemans M.J.), Academic thesis, Erasmus Medical Center, Rotterdam, pp 23-34. El Shafie M, Sousa M, Windt M-L and Kruger TF (2000) An atlas of the ultrastructure of human oocytes. Parthenon Publishing, New York. Eppig JJ (1991) Intercommunication between mammalian oocytes and companion somatic cells. Bioessays 13: 569-574. Erickson GF, Magoffin DA, Dyer CA and Hofeditz C (1985) The ovarian androgen producing cells: a review of structure/function relationships. Endocr Rev 6: 371-399. Esfandiari N, Ryan EAJ, Gotlieb L and Casper RF (2005) Successful pregnancy following transfer of embryos from oocytes with abnormal zona pellucida and cytoplasm morphology. Reprod Biomed Online 11: 620-623. Eurostat (2006) Population and social conditions database. http://epp.eurEN.PDF Faddy MJ (2000) Follicle dynamics during ovarian ageing. Mol Cell Endocrinol 163: 43-48. Faddy MJ and Gosden RG (1996) A model conforming the decline in follicle numbers to the age of menopause in women. Hum Reprod 11: 1484-1486.
82
Familiari G, Makabe S and Motta PM (1989) The ovary and the ovulation: a three-dimensional ultrastructural study. In: Ultrastructure of human gametogenesis and early embryogenesis (Van Blerkom J and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 85-124. Familiari G, Vizza E, Miani A and Motta PM (1991) Ultrastructural and functional development of the theca interna. In: Ultrastructure of the ovary (Familiari G, Makabe S and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 113-128. Familiari G, Nottola SA, Macchiarelli G, Micara G, Aragona C and Motta PM (1992) Human zona pellucida during in vitro fertilization: An ultrastructural study using saponin, ruthenium red, and osmium-thiocarbohydrazide. Mol Reprod Dev 32: 51-61. Familiari G, Caggiati A, Nottola SA, Ermini M, Di Benedetto MR and Motta PM (1993) Ultrastructure of human ovarian primordial follicles after combination chemotherapy for Hodgkin’s disease. Hum Reprod 8: 2080 -2087. Familiari G, Heyn R, Relucenti M, Nottola SA and Sathananthan AH (2006) Ultrastructural dynamics of human reproduction, from ovulation to fertilization and early embryo development. Int Rev Cytol 249: 53-141. Fauser BC and Van Heusden AM (1997) Manipulation of human ovarian function: physiological concepts and clinical consequences. Endocr Rev 18: 71-106 Forabosco A and Sforza C (2007) Establishment of ovarian reserve: a quantitative morphometric study of the developing human ovary. Fertil Steril 88: 675-83. Fujimoto T, Miyayama T and Fujita M (1977) The origin, migration and fine morphology of human primordial germ cells. Anat Rec 188: 315-330. Fukuda T (1976) Ultrastructure of primordial germ cells in human embryo. Virchows Arch B Cell Pathol 20: 85-89. Gallo F, Hoorens S, Grant J and Cave J (2006) Should ART be part of a population policy mix? A preliminary assessment of the demographic and economic impact of assisted reproductive technologies. www.policyarchive.org Garside WT, Loret de Mola JR, Bucci JA, Tureck RW and Heyner S (1997) Sequential analysis of zona thickness during in vitro culture of human zygotes: correlation with embryo quality, age, and implantation. Mol Reprod Dev 47: 99-104. Ghadially FN (1982) Ultrastructural Pathology of the Cell and Matrix, II edn., Butterworths, London. Gillot I and Whitaker M (1994) Calcium signals in and around the nucleus in sea urchin eggs. Cell Calcium 16: 269-278. Gondos B, Bhiraleus P and Hobel CJ (1971) Ultrastructural observations on germ cells in human fetal ovaries. Am J Obstet Gynecol 110: 644-652.
83
Gondos B, Westergaard L and Byskov AG (1986) Initiation of oogenesis in human fetal ovary: ultrastructural and squash preparation study. Am J Obstet Gynecol 155: 189-195. Gosden RG (1995) Ovulation 1: Oocyte development throughout life. In: Gametes - The Oocyte, Series: Cambridge Reviews in Human Reproduction (Grudzinskas JG and Yovich JL), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 119-149. Gougeon A (1996) Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses. Endocr Rev 17: 121-155. Granot I and Dekel N (1994) Phosphorylation and expression of connexin-43 ovarian gap junction protein are regulated by luteinizing hormone. J Biol Chem 269: 30502-30509. Greenwald GS and Terranova PF (1988) Follicular selection and its control. In: The physiology of reproduction (Knobil E and Neill G), Raven Press Ltd, New York, pp. 387-445. Gupta SK, Bhandari B, Shrestha A, Biswal BK, Palaniappan C, Malhotra SS and Gupta N (2012) Mammalian zona pellucida glycoproteins: structure and function during fertilization. Cell Tissue Res 349: 665-678. Habbema JD, Eijkemans MJ, Nargund G, Beets G, Leridon H and Te Velde ER (2009) The effect of in vitro fertilization on birth rates in western countries. Hum Reprod 24: 1414-1419. Hagstad A, Johansson S, Wilhelmsson C and Janson PO (1985) Gynaecology of middle-aged women-menstrual and reproductive histories. Maturitas 7: 99 -113. Hertig AT (1968) The primary human oocyte: some observations on the fine structure of Balbiani's vitelline body and the origin of the annulate lamellae. Wiley Online Library 122: 107-137. Hertig AT and Adams EC (1967) Studies on the human oocyte and its follicle. I. Ultrastructural and histochemical observations on the primordial follicle stage. J Cell Biol 34: 647-675. Hepler PK (1992) Calcium and mitosis. Int Rev Cytol 138: 239-268. Hoang-Ngoc, Minh, Makabe S, Nottola SA, Smadja A and Motta PM (1993) La folliculogenese au cours de 1’organogenese ovarienne humaine. Gynecologic 44: 67-80. Igarashi H, Takahashi E, Hiroi M and Doi K (1997) Aging-related changes in calcium oscillations in fertilized mouse oocytes. Mol Reprod Dev 48: 383 -390 Jansen, RPS and De Boer K (1998) The bottleneck: mitochondrial imperatives in oogenesis and ovarian follicular fate. Mol Cell Endocrinol 145: 81-88. Kalma Y, Granot I, Galiani D, Barash A and Dekel N (2004) Luteinizing hormone-induced connexin 43 down-regulation: inhibition of translation. Endocrinology 145: 1617-1624.
84
Kawamura K, Kumagai J, Sudo S, Chun SY, Pisarska M, Morita H, Toppari J, Fu P, Wade JD, Bathgate RAD and Hsueh AJV (2004) Paracrine regulation of mammalian oocyte maturation and male germ cell survival. Proc Natl Acad Sci USA 101: 7323-7328. Kellokumpu-Lehtinen PL and Soderstrom KO (1978) Occurrence of nuage in fetal germ cells. Cell Tissue Res 194: 171-177. Khalili MA, Sultan AM and Mojibian M (2005) Role of oocyte morphology on fertilization and embryo formation in assisted reproductive techniques. Middle East Fertil Soc 10: 72-77. Khalili MA, Maione M, Palmerini MG, Bianchi S, Macchiarelli G and Nottola SA (2012) Ultrastructure of human mature oocytes after vitrification. Eur J Histochem 56: 236-242. Kidder GM and Mhawi AA (2002) Gap junctions and ovarian folliculogenesis. Reproduction 123: 613-620. Kilani SS, Cooke S, Kan AK and Chapman MG (2006) Do age and extended culture affect the architecture of the zona pellucida of human oocytes and embryos? Zygote 14: 39-44. Larsen WJ, Chen L, Powers R, Zhang H, Russell PT, Chambers C, Hess K and Flick R (1996) Cumulus expansion initiates physical and developmental autonomy of the oocyte. Zygote 4: 335-341. Laufer N, Tarlatzis BC, De Cherney AH, Masters JT, Haseltine FP, MacLusky N and Naftolin F (1984) Asynchrony between human cumulus-corona cell complex and oocyte maturation after human menopausal gonadotropin treatment for in vitro fertilization. Fertil Steril 42: 366-372. Lawson R, El-Toukhy T, Kassab A, Taylor A, Braude P, Parsons J and Seed P (2003) Poor response to ovulation induction is a stronger predictor of early menopause than elevated basal FSH: a life table analysis. Hum Reprod 18: 527-533. Le Moigne A and Foucrier (2004) Ovogenesi. In: Biologia dello sviluppo (Andreuccetti P, Campanella C and Putti R), Edises, Napoli. Leridon H (2004) Can assisted reproduction technology compensate for the natural decline in fertility with age? A model assessment. Hum Reprod 19: 1548-1553. Li R and Albertini DF (2013) The road to maturation: somatic cell interaction and self-organization of the mammalian oocyte. Molecular Cell Biology 14: 141-152. Longo FJ (1981) Changes in the zones pellucidae and plasmalemma of aging mouse eggs. Biol Reprod 25: 399-411. Lopata A, Sathananthan AH, McBain JC, Johnston WI and Speirs AL (1980) The ultrastructure of the preovulatory human egg fertilized in vitro. Fertil Steril 33: 12-20. Lutz W, O'Neill BC and Scherbov S (2003) Demographics. Europe’s population at a turning point. Science 299: 1991-1992.
85
Lutz W (2006) Fertility rates and future population trends: will Europe’s birth rate recover or continue to decline? Int J Androl 29: 25-33. Macchiarelli G, Vizza E, Nottola SA, Familiari G and Motta PM (1992) Cellular and microvascular changes of the ovarian follicle during folliculogenesis: A scanning electon microscopic study. Arch Histol Cytol 55: 191-204. Macchiarelli G (2000) The microvasculature of the ovary. A review by SEM of vascular corrosion casts. J Reprod Dev 46: 207 -225. Makabe S, Nottola SA. and Motta PM (1989) Life history of the human female germ cell: ultrastructural aspects. In: Ultrastructure of human gametogenesis and early embryogenesis (Van Blerkom J and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 33-60. Makabe S and Motta PM (1989) Migration of human germ cells and their relationship with the developing ovary: ultrastructural aspects. Prog Clin Biol Res 296: 41-54. Makabe S, Naguro T, Nottola SA, Pereda J and Motta PM (1991) Migration of germ cells, developing of the ovary, and folliculogenesis. In: Ultrastructure of the Ovary (Familiari G, Makabe S and Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 1-27. Makabe S, Naguro T and Stallone T (2006) Oocyte-Follicle Cell Interactions During Ovarian Follicle Development, as Seen by High Resolution Scanning and Transmission Electron Microscopy in Humans. Microscopy Research and Technique 69: 436-449. Makabe S, Van Blerkom J, Nottola SA and Naguro T (2006a) Atlas of human female reproductive function: ovarian development to early embryogenesis after in-vitro fertilization, Taylor and Francis, London. Markström E, Svensson EC, Shao R, Svanberg B and Billig H (2002) Survival factors regulating ovarian apoptosis-dependence on follicle differentiation. Reproduction 123: 23-30. Micara G, Linari A and Aragona C (2012) Tecniche di II livello: FIVET e ICSI. In: Biotecnologie della riproduzione umana (Gandini L and Lenzi A), Carocci, Roma, pp. 379-392. Mikkelsen AL and Lindenberg S (2001) Morphology of in-vitro matured oocytes: impact on fertility potential and embryo quality. Hum Reprod 16: 1714-1718. Miyazaki S (2006) Thirty years of calcium signals at fertilization. Semin Cell Dev Biol 17: 233-243. Monesi V (2002) Meiosi, gametogenesi, fecondazione. In: Istologia, V edn., Piccin, Milano, pp. 758-838. Moore GP and Lintern-Moore S (1978) Transcription of the mouse oocyte genome. Biol Reprod 18: 865-870. Morin X and Bellaiche Y (2011) Mitotic spindle orientation in asymmetric and symmetric cell divisions during animal development. Dev Cell 21: 102-119.
86
Motta PM, Takeva Z and Nesci E (1971) Etude ultrastructurale et histochimique des rapports entre les cellules folliculaires et l’ovocyte pendant le développement du follicle ovarien chez les mammifères. Acta Anat 80: 537 -562. Motta PM and Van Blerkom J (1975) A scanning electron microscopic study of the luteo-follicular complex. II. Events leading to ovulation. Am J Anat 143: 241-264. Motta PM and Van Blerkom J (1979) Structure and ultrastructure of ovarian follicles. In: Human ovulation (Hafez ESE), Elsevier/North Holland Biomedical Press, Amsterdam, pp. 17-38. Motta PM, Nottola SA, Micara G and Familiari G (1988) Ultrastructure of human unfertilized oocytes and polyspermic embryos in an in vitro fertilization program. Ann NY Acad Sci 541: 367-383. Motta PM, Makabe S, Naguro T and Correr S (1994) Oocyte follicle cells association during development of human ovarian follicle. A study by high resolution scanning and transmission electron microscopy. Arch Histol Cytol 57: 369 -394. Motta PM, Nottola SA, Familiari G, Macchiarelli G, Vizza E and Correr S (1995) Ultrastructure of human reproduction from folliculogenesis to early embryo development. A review. Ital J Anat Embryol 100: 9-72. Motta PM, Makabe S and Nottola SA (1997) The ultrastructure of human reproduction. I. The natural history of the female germ cell: origin, migration and differentiation inside the developing ovary. Hum Reprod Update 3: 281-295. Motta PM, Nottola SA, Makabe S and Heyn R (2000) Mitochondrial morphology in human fetal and adult female germ cells. Hum Reprod 15: 129-47. Motta PM, Nottola SA, Familiari G, Makabe S, Stallone T and Macchiarelli G (2003) Morphodynamics of the follicular-luteal complex during early ovarian development and reproductive life. Int Rev Cytol 223: 177-288. Murakami T, Ikebuchi Y, Ohtsuka A, Kikuta A, Taguchi T and Ohtani O (1988) The blood vascular wreath of the rat ovarian follicle, with special reference to its changes in ovulation and luteinization: a scanning electron microscopic study of corrosion casts. Arch Histol Cytol 51: 299-313. Nawroth F, Muller P, Wolf C and Sudik R (2001) Is the zona pellucida thickness of metaphase-II oocytes in an IVF/ICSI program influenced by the patient’s age? Gynecol Obstet Invest 52: 55-58. Nikolaou D, Lavery S, Turner C, Margara R and Trew G (2002) Is there a link between an extremely poor response to ovarian hyperstimulation and early ovarian failure? Hum Reprod 17: 1106-1111. Nogués C, Ponsà M, Vidal F, Boada M and Egozcue J (1988) Effects of aging on the zona pellucida surface of mouse oocytes. J In Vitro Fert Embryo Transf 5: 225-229.
87
Nottola SA, Macchiarelli G, Coticchio G, Bianchi S, Cecconi S, De Santis L, Scaravelli G, Flamigni C and Borini A (2007) Ultrastructure of human mature oocytes after slow cooling cryopreservation using different sucrose concentrations. Hum Reprod 22: 1123-1133. Nottola SA, Coticchio G, De Santis L, Macchiarelli G, Maione M, Bianchi S, Iaccarino M, Flamigni C and Borini A (2008) Ultrastructure of human mature oocytes after slow cooling cryopreservation with ethylene glycol. Reprod Biomed Online 17: 368-377. Nottola SA (2012) Assetto morfologico strutturale e substrutturale dell’ovocita umano. In: Biotecnologie della riproduzione umana (Gandini L and Lenzi A), Carocci, Roma, pp. 7-14. O'Connor KA, Holman DJ and Wood JW (1998) Declining fecundity and ovarian ageing in natural fertility populations. Maturitas 30: 127-136. Otsuki J, Okada A, Morimoto K, Nagai Y and Kubo H (2004) The relationship between pregnancy outcome and smooth endoplasmic reticulum clusters in MII oocytes. Hum Reprod 19: 1591-1597. Palermo GD, Colombero LT and Rosenwaks Z (1997) The human sperm centrosome is responsible for normal syngamy and early embryonic development. Rev Reprod 2: 19-27. Paz G, Amit A and Yavetz H (2004) Case report: pregnancy outcome following ICSI of oocytes with abnormal cytoplasm and zona pellucida. Hum Reprod 19: 586-589. Peluso JJ, England-Charlesworth C and Hutz R (1980) Effect of age and of follicular aging on the preovulatory oocyte. Biol Reprod 22: 999-1005. Pepling ME (2006) From primordial germ cell to primordial follicle: mammalian female germ cell development. Genesis 44: 622-632. Pickering SJ, Johnson MH, Braude PR and Houliston E (1988) Cytoskeletal organization in fresh, aged and spontaneously activated human oocytes. Hum Reprod 3: 978-989. Picton HM and Gosden RG (1999) Oogenesis in mammals. In: Encyclopedia of Reproduction, Vol. 3 (Knobil E and Neill JD), Academic Press, London, pp. 488-497. Poenie M, Alderton J, Tsien RY and Steinhardt RA (1985) Changes of free calcium levels with stages of the cell division cycle. Nature 315: 147-149. Pozo J, Corral E and Pereda J (1990) Subcellular structure of prenatal human ovary: mitochondrial distribution during meiotic prophase. J Submicrosc Cytol Pathol 22: 601-607. Richard FJ, Tsafriri A and Conti M (2001) Role of phosphodiesterase type 3A in rat oocyte maturation. Biol Reprod 65: 1444-1451. Richardson SJ, Senikas V and Nelson JF (1987) Follicular depletion during the menopausal transition: evidence for accelerated loss and ultimate exhaustion. J Clin Endocrinol Metab 65: 1231-1237.
88
Rienzi L, Ubaldi FM, Iacobelli M, Minasi MG, Romano S and Greco E (2005) Meiotic spindle visualization in living human oocytes. Reprod Biomed Online 10: 192-198. Rienzi L, Ubaldi FM, Iacobelli M, Minasi MG, Romano S, Ferrero S, Sapienza F, Baroni E, Litwicka K and Greco E (2008) Significance of metaphase II human oocyte morphology on ICSI outcome. Fertil Steril 90: 1692-1700. Rienzi L, Balaban B, Ebner T and Mandelbaum J (2012) The oocyte. Human Reproduction 27: 2-21. Romao GS, Arau´ jo MC, de Melo AS, de Albuquerque Salles Navarro PA, Ferriani RA and Dos Reis RM (2010) Oocyte diameter as a predictor of fertilization and embryo quality in assisted reproduction cycles. Fertil Steril 93: 621-625. Rosenbusch B, Schneider M, Glaser B and Brucker C (2002) Cytogenetic analysis of giant oocytes and zygotes to assess their relevance for the development of digynic triploidy. Hum Reprod 17: 2388-2393. Russell DL and Robker RL (2007) Molecular mechanisms of ovulation: co-ordination through the cumulus complex. Human Reproduction Update 13: 289-312. Russell PJ (2004) Introduzione alla genetica, In: i-Genetica, V edn., EdiSES, Napoli, pp 1-29. Sá R, Cunha M, Silva J, Luís A, Oliveira C, Teixeira da Silva J, Barros A and Sousa M (2011) Ultrastructure of tubular smooth endoplasmic reticulum aggregates in human metaphase II oocytes and clinical implications. Fertil Steril 96: 143-149. Sánchez F and Smitz J (2012) Molecular control of oogenesis. Biochimica et Biophysica Acta 1822: 1896-1912. Sathananthan AH, Ng SC, Chia CM, Law HY, Edirisinghe WR and Ratnam SS (1985). The origin and distribution of cortical granules in human oocytes with reference to Golgi, nucleolar, and microfilament activity. Ann N Y Acad Sci 442: 251-264. Sathananthan AH, Ng SC, Bongso A, Trounson A and Ratnams SS (1993) Visual Atlas of Early Human Development for Assisted Reproductive Technology, National University of Singapore, Singapore. Sathananthan AH (1994) Ultrastructural changes during meiotic maturation in mammalian oocytes: unique aspects of the human oocyte. Microsc Res Tech 27:145-164. Sathananthan AH, Ratnam SS, Ng SC, Tarin JJ, Gianaroli L and Trounson A (1996) The sperm centriole: its inheritance, replication and perpetuation in early human embryos. Hum Reprod 11: 345-356. Sathananthan AH (1997) Ultrastructure of the human egg. Hum Cell 10: 21-38. Sathananthan AH, Selvaraj K and Trounson AO (2000) Fine structure of human oogonia in the foetal ovary. Mol Cell Endocrinol 161: 3-8.
89
Sathananthan AH (2000a) Ultrastructure of human gametes, fertilization and embryo development. In: Handbook of In Vitro Fertilization, II edn. (Trounson AO and Gardner DK), CRC Press, Florida, pp. 431-465. Sathananthan AH (2003) Morphology and pathology of the human oocyte. In: Biology and pathology of the oocyte (Trounson AO and Gosden RG), Cambridge University Press, Cambridge, pp 185-208. Sathananthan AH, Selvaraj K, Girijashankar ML, Ganesh V, Selvaraj P and Trounson AO (2006) From oogonia to mature oocytes: inactivation of the maternal centrosome in humans. Microsc Res Tech 69: 396-407. Sathananthan AH (2013) Ultrastructure of human gametes, fertilization and embryos in assisted reproduction: A personal survey. Micron 44: 1-20. Schultz RM and Kopf G (1995) Molecular basis of mammalian egg activation. Curr Top Dev Biol 30: 21-62. Schultz RM, Montgomery RR and Belanoff JR (1983) Regulation of mouse oocyte meiotic maturation: Implication of a decrease in oocyte cAMP and protein dephosphorylation in commitment to resume meiosis. Dev Biol 97: 264-273. Schwartz D and Mayaux MJ (1982) Female fecundity as a function of age: results of artificial insemination in 2193 nulliparous women with azoospermic husbands. Federation CECOS. N Engl J Med 306: 404-406. Sela-Abramovich S, Chorev E, Galiani D and Dekel N (2005) Mitogen-activated protein kinase mediates luteinizing hormone-induced breakdown of communication and oocyte maturation in rat ovarian follicles. Endocrinology 146: 1236-1244. Silverthorn DU (2005) Riproduzione e sviluppo, pp 823-862. In: Fisiologia - Un approccio integrato, seconda edizione (Agnati L, Bigiani A, Franzini C and Lui F), Casa Editrice Ambrosiana, Milano. Siller KH, Doe CQ (2009). Spindle orientation during asymmetric cell division. Nature Cell Biol 11: 365-374. Smith LC and Alcivar AA (1993) Cytoplasmic inheritance and its effects on development and performance. J Reprod Fertil 48: 31-43. Soules MR, Sherman S, Parrott E, Rebar R, Santoro N, Utian W and Woods N (2001) Executive summary: Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW). Fertil Steril 76: 874 -878. Sousa M, Barros A, Silva J and Tesarik J (1997) Developmental changes in calcium content of ultrastructurally distinct subcellular compartments of preimplantation human embryos. Mol Hum Reprod 2: 83-90. Sowers MR, Eyvazzadeh AD, McConnell D, Yosef M, Jannausch ML, Zhang D, Harlow S and Randolph JF (2008) Anti-mullerian hormone and inhibin B in the definition of ovarian aging and the menopause transition. J Clin Endocrinol Metab 93: 3478 -3483.
90
Stankova J, Cech S, Sedlackova M and Kristek F (1985) A morphometric comparative study of healthy and atretic human primordial and primary follicles. Z Mikrosk Anat Forsch 99: 510-518. Stensen MH, Tanbo T, Storeng R, Byholm T and Fèdorcsak P (2010) Routine morphological scoring systems in assisted reproduction treatment fail to reflect age-related impairment of oocyte and embryo quality. Reprod Biomed Online 21: 118-125. Steptoe PC, Edwards RG and Purdy JM (1980) Clinical aspects of pregnancies established with embryos grown in vitro. Brit J Obtset Gynaecol 87: 757-768. Strömstedt M and Byskov AG (1999) Oocyte, mammalian. In: Encyclopedia of Reproduction, III edn. (Knobil E, Neill JD), Academic Press, London, pp. 468-480. Sun QY and Schatten H (2006) Regulation of dynamic events by microfilaments during oocyte maturation and fertilization. Reproduction 131: 193-205. Sundstrom P, Nilsson BO, Liedholm P and Larsson E (1985a) Ultrastructural characteristics of human oocytes fixed at follicular puncture or after culture. J In Vitro Fertil Embryo Transfer 2: 195-206. Szollosi D (1971) Morphological changes in mouse eggs due to aging in the fallopian tube. Am J Anat 130: 209-25. Szollosi D, Mandelbaum J, Plachot M, Salat-Baroux J and Cohen J (1986) Ultrastructure of the human preovulatory oocyte. J In Vitro Fertil Embryo Transf 3: 232-242. Swain JE and Pool TB (2008) ART failure: oocyte contributions to unsuccessful fertilization. Hum Reprod Update 14: 431-446. Swann K and Ozil JP (1994) The dynamics of the calcium signal that triggers mammalian egg activation. Int Rev Cytol 152: 182-222. Talevi R, Gualtieri R, Tartaglione G and Fortunato A (1997) Heterogeneity of the zona pellucida carbohydrate distribution in human oocytes failing to fertilize in vitro. Hum Reprod 12: 2773-2780. Takahashi T, Saito H, Hiroi M, Doi K and Takahashi E (2000) Effects of aging on inositol 1,4,5-triphosphate-induced Ca2+ release in unfertilized mouse oocytes. Mol Reprod Dev 55: 299-306. Takahashi T, Takahashi E, Igarashi H, Tezuka N and Kurachi H (2003) Impact of oxidative stress in aged mouse oocytes on calcium oscillations at fertilization. Mol Reprod Dev 66: 143-152. Takahashi T, Igarashi H, Kawagoe J, Amita M, Hara S and Kurachi H (2009) Poor embryo development in mouse oocytes aged in vitro is associated with impaired calcium homeostasis. Biol Reprod 80: 493-502.
91
Tarín JJ, Pérez-Albalá S and Cano A (2001) Cellular and morphological traits of oocytes retrieved from aging mice after exogenous ovarian stimulation. Biol Reprod 65: 141-150. Ten J, Mendiola J, Vioque J, de Juan J and Bernabeu R (2007) Donor oocyte dysmorphisms and their influence on fertilization and embryo quality. Reprod Biomed Online 14: 40-48. te Velde ER and Pearson PL (2002) The variability of female reproductive ageing. Hum Reprod Update 8: 141-154. Treloar AE (1981) Menstrual cyclicity and the pre-menopause. Maturitas 3: 249-264. Treloar AE, Boynton RE, Behn BG and Brown BW (1967) Variation of the human menstrual cycle through reproductive life. Int J Fertil 12: 77-126. Ubaldi FM and Lanzone A (2009) Età della donna ed infertilità In: Topics Infertilità (Borini A, Bulletta C, Costa M, Ragni G and Ubaldi FM), Edi-Meetin, Ferrara. Valeri C, Pappalardo S, De Felici M and Manna C (2011) Correlation of oocyte morphometry parameters with woman's age. J Assist Reprod Genet 6: 545-552. Van Blerkom J (2011) Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their role in developmental competence. Mitochondrion 11: 797-813. Van Blerkom J and Motta PM (1979) Fertilization and preimplantation embryogenesis. In: The Cellular Basis of Mammalian Reproduction, Urban and Schwarzenberg, Munich, pp. 165-189. Van Noord PA, Dubas JS, Dorland M, Boersma H and te Velde E (1997) Age at natural menopause in a population-based screening cohort: the role of menarche, fecundity, and lifestyle factors. Fertil Steril 68: 95-102. Van Noord-Zaadstra BM, Looman CW, Alsbach H, Habbema JD, te Velde ER and Karbaat J (1991) Delaying childbearing: effect of age on fecundity and outcome of pregnancy. Br Med J 302: 1361-1365. Van Rooij IA, Tonkelaar I, Broekmans FJ, Looman CW, Scheffer GJ, de Jong FH, Themmen AP and te Velde ER (2004) Anti-mullerian hormone is a promising predictor for the occurrence of the menopausal transition. Menopause 11: 601-606. Van Santbrink EJ, Hop WC, Van Dessel TJ, De Jong FH and Fauser BC (1995) Decremental follicle-stimulating hormone and dominant follicle development during the normal menstrual cycle. Fertil Steril 64: 37-43. Veeck LL (1999) An Atlas of Human Gametes and Conceptuses: An Illustrated Reference for Assisted Reproductive Technology, Taylor and Francis, London. Vollman RF (1977) The menstrual cycle. Major Probl Obstet Gynecol 7: 1-193. Wassarman PM (1991) Construction of the zona pellucida during production of fertilizable mouse eggs. Bull Assoc Anat (Nancy) 75: 115-117.
92
Wassarman PM (1999) Mammalian fertilization: molecular aspects of gamete adhesion, exocytosis, and fusion. Cell 96: 175-183 Weinstein M, Gorrindo T, Riley A, Mormino J, Niedfeldt J, Singer B, Rodríguez G, Simon J and Pincus S (2003) Timing of menopause and patterns of menstrual bleeding. Am J Epidemiol 158: 782-791. Welt CK, Smith ZA, Pauler DK and Hall JE (2001) Differential regulation of inhibin A and inhibin B by luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, and stage of follicle development. J Clin Endocrinol Metab 86: 2531-2537. Whitaker M and Patel R (1990) Calcium and cell cycle control. Development 108: 525-542. Witschi E (1948) Migration of the germ cells of human embryos from the yolk sac to the primitive gonadal folds. Contrib Embryol Carnegie Inst 32: 67-80. Xu Z, Abbott A, Kopf GS, Schultz RM and Ducibella T (1997) Spontaneous activation of ovulated mouse eggs: time-dependent effects on M-phase exit, cortical granule exocytosis, maternal messenger ribonucleic acid recruitment, and inositol 1,4,5-trisphosphate sensitivity. Biol Reprod 57: 743-750. Zamboni L, Thompson RS and Smith DM (1972) Fine morphology of human oocyte maturation in vitro. Biol Reprod 7: 425-457. Zegers-Hochschild F, Adamson GD, De Mouzon J, Ishihara O, Mansour R, Nygren K, Sullivan E and Vanderpoel S (2009) International Committee for Monitoring Assisted Reproductive Technology (ICMART) and the World Health Organization (WHO) revised glossary of ART terminology, 2009. Fertil Steril 92: 1520-1524. Ziebe S and Devroey P (2008) Assisted reproductive technologies are an integrated part of national strategies addressing demographic and reproductive challenges. Hum Reprod Update 14: 583-592. Zoller LC (1991) Quantitative analysis of the membrana granulosa in developing and ovulatory follicles. In: Ultrastructure of the ovary (Familiari G, Makabe S, Motta PM), Kluwer Academic Publishers, Boston, pp. 73-89.