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Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa

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Captulo 8Txicos Metlicos

Autores:

Bioq. Fernando Rainoldi.Docente de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP.Dra. Leda Giannuzzi.Profesora Adjunta de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP.Bioq. Cristian Oliver.Perito de la Seccin de Toxicologa del Laboratorio Qumico Pericial de la Direccin General dePolica Cinetfica de la Polica de la Provincia de Buenos Aires.Docente de la Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal de la UNLP.

Introduccin

Resulta bien conocido que los metales cumplen un doble papel en los seres vivos: sonvarios de ellos nutrientes esenciales mientras que en funcin de su dosis pueden resultarextremadamente txicos. La lista de los metales toxicolgicamente importantes se vaampliando al descubrirse nuevas funciones bioqumicas, dado que algunos de ellos sonconsiderados esenciales tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, cromo, molibdeno,manganeso, hierro, cobalto, nquel, cobre, zinc, selenio y flor. A esta lista podran incorporarseel estao y el silicio.

Si bien se suele unir en un solo grupo a los as llamados metales txicos estadistincin no hace referencia a las propiedades metlicas de hecho incluye metaloides comoel selenio y el arsnico ni a la forma de metal elemental como la especie txica, ya queusualmente las formas inicas solubles son las ms activas.

Los metales, especialmente los denominados metales pesados, constituyen una

importante fuente de riesgo para la salud y el medio ambiente tanto bajo la forma deintoxicaciones agudas o crnicas. La actividad antropognica es la principal fuente de riesgo,pues acta concentrando los metales y produciendo mltiples ocasiones de exposicin en lavida diaria a travs de los alimentos, aire, agua e incluso en nuestros hogares. En este captuloveremos los distintos metales de mayor importancia en nuestro medio y los distintos mtodosde anlisis.

8.1 ToxicocinticaA los efectos de realizar los monitoreos correspondientes y seleccionar las muestras,

resulta til realizar una sntesis de las vas de entrada, depsito y eliminacin de los metales.

8.1.1Vas de absorcinSe conocen como vas de entrada posibles a la inhalatoria, drmica, oral, mediada porprtesis metlicas y la transferencia madre-hijo por la placenta o la leche materna. De estas,especialmente en personal expuesto en industrias, la va inhalatoria se considera una de lams importantes y habituales, observndose en la mayora de las legislaciones laborales unaespecial preocupacin por la proteccin de los empleados y la medicin en el aire.

En los ambientes fabriles o talleres metalrgicos la forma de exposicin ms habitual esa travs de material particulado, vapores o gases, siendo estos ltimos generalmentecompuestos organometlicos (carbonilos de nquel, cobalto). Estas combinaciones son muchoms txicas que las formas elementales. La va drmica, ya sea para la forma elemental o enforma de polvos o gases, resulta otra ruta de exposicin importante en ambientes industriales,provocando dermatitis, alergias y distintos tipos de cncer.

La toxicidad de un metal se halla estrechamente relacionada con la va de entrada y suespecie qumica. Uno de los mejores ejemplos lo constituye el mercurio, el cual al ser ingeridoen su forma elemental resulta prcticamente atxica, mientras que una sal de mercurio soluble


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o el metil mercurio son absorbidos casi en su totalidad. El mismo metal muestra las mismasdiferencia en la va inhalatoria, donde tanto el metil mercurio como el vapor de mercurioatmico se absorben un 80 %.

8.1.2Biotransformacin

La mayora de los metales circula unidos a la fraccin proteica del plasma, mediante launin a grupos funcionales como sulfihidrilos, amino, fosfato, imidazol e hidroxilo. Ladistribucin refleja la diferente capacidad para atravesar membranas y para permanecer unidosa los diferentes componentes de los tejidos u rganos. Debido a que los organismos no puedendestruir a los metales a diferencia de lo que ocurre con las molculas orgnicas existe unalarga permanencia en el organismo. A pesar de esto se conocen mecanismos especializadosde quelacin y oxidorreduccin, que pueden modificar su excrecin y toxicidad.

8.1.3 EliminacinDebido a sus caractersticas qumicas, la va principale de eliminacin es a travs de

quelatos hidrosolubles por va renal y gastrointestinal. La va renal requiere previamente quelos metales circulen en forma soluble unidos a protenas como la albmina o las

metalotionenas, siendo estas ltimas las preferidas por su pequeo tamao (5-6 kDa), lo quepermite atravesar libremente por los glomrulos y llegar de esta forma a la orina. Si bien sonrutas de poca importancia desde el punto de vista de la detoxificacin, el sudor, el aliento y lasfaneras constituyen rutas conocidas desde hace tiempo (ej. Talio en pelo y uas).

Resulta importante hacer una breve referencia a un tema de por s de inmensacomplejidad, el de las especies qumicas. El contenido total de un elemento presente en unamuestra no es el factor principal para determinar su toxicidad sino la proporcin de las distintasespecies qumicas presentes una matriz determinada. Existen dos ejemplos clsicos queilustran este concepto: el As(III) resulta mucho ms txicos que el As(V), pues slo el arsnicotrivalente puede unirse a los tioles; el Cr (VI) resulta ms txico que el Cr(III) pues es massoluble en agua que el trivalente, una vez en el interior de la clula pasa a varios estadiosintermedios de reduccin Cr(V), Cr (IV) todos ellos capaces de unirse al ADN y provocarmutagnesis.

En lo que respecta a los metales de transicin, basta recordar la especiacin qumicadel Fe en solucin acuosa para tener una idea de las complejidades posibles. A la fecha, sibien los modelos de prediccin incorporan la especiacin dentro de sus parmetros la medicinde esta resulta an extremadamente compleja.

8.2 Tipos de muestrasA efectos de establecer una relacin dosis-respuesta es necesario conocer tanto la

concentracin del metal como el tiempo de exposicin. La definicin ms precisa de dosis es lacantidad de metal dentro de las clulas del rgano que manifiesta efectos txicos. Sin embargola cuantificacin de metales dentro de los rganos no es posible en sujetos vivos. Se pueden

hacer estimaciones indirectas a partir de modelos metablicos derivados de las autopsias.La sangre, orina y pelos son los tejidos ms accesibles para realizar las medidas. Losresultados de dichas determinaciones reflejan exposicin reciente, pasada de larga data,dependiendo del tiempo de retencin y del tejido en particular.

La muestra de sangre y orina refleja exposiciones recientes y se correlacionan muy biencon los efectos agudos. Una excepcin es el cadmio en orina: su presencia en altaconcentracin en orina implica un dao renal relacionado con la acumulacin del metal en elrin.

Las muestras pilosaspueden usarse en asociacin a variaciones en la exposicin a losmetales durante largo tiempo. Los anlisis pueden realizarse sobre distintos segmentos delcabello de modo tal que el contenido del metal del nuevo crecimiento puede compararse conexposiciones pasadas. Se debe tener la precaucin de lavar el pelo previamente al anlisis

para remover el depsito de metal por la contaminacin externa.Otro tipo importante de muestras es el agua. Las aguas de bebidas libres de materia en

suspensin pueden ser analizadas directamente, mientras que las que presentan materia


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orgnica requieren un procedimiento para solubilizar el material suspendido. Los barros,sedimentos y otros tipos de muestras slidas pueden ser analizadas despus de un tratamientoadecuado.

Tambin muchas veces se presentan muestras ambientales o alimentos en los queresulta de inters conocer el contenido de metales. Desde el punto de vista cuantitativo, lasintoxicaciones por metales ms frecuentes provienen de la ingestin de agua o alimentoscontaminados, ya sea su contenido o continente (latas con plomo).

8.3 Tratamiento de las muestrasPrevio a la cuantificacin de metales presentes en medios biolgicos, es necesario

efectuar un tratamiento de la muestra, dependiendo el mismo de varios factores:1- Material biolgico (orina, suero, sangre, vsceras)2- Metal en cuestin (volatilidad y formas no disociables del metal en el organismo)3- Procedimiento utilizado para la determinacin final (colorimtrico, absorcin atmica,activacin neutrnica).

Los metales pesados se encuentran frecuentemente en el material a analizar formandocomplejos con molculas orgnicas y deben ser liberados de los mismos para poder

determinarlos. Entre los mtodos ms utilizados para el tratamiento previo de las muestras,pueden mencionarse:a) Destruccin oxidativa por va hmeda de la materia orgnica (DMO) empleando cidontrico, ntrico-agua oxigenada, ntrico-sulfrico, ntrico-sulfrico-perclrico, o bienpermanganato de potasio-clorhdrico.b) Destruccin de materia orgnica por va seca.c) Formacin de quelatos y extraccin con solventes.d) Precipitacin de las protenas y determinacin de los metales en el sobrenadante.e) Tcnicas de volatilizacin (arsnico como AsH3, antimonio como SbH3 y mercurio comovapor del elemento).

A veces pueden efectuarse combinaciones entre los distintos mtodos, de manera deobtener una muestra apropiada para las posteriores determinaciones.

El mtodo de destruccin de materia orgnica (DMO) sulfo-nitro-perclrico (SNP),puede ser aplicado para la determinacin de arsnico, talio, plomo y otros metales de interstoxicolgico en medios biolgicos. Para la determinacin de mercurio se efectuar en undispositivo especial que incluye un refrigerante a reflujo con dedo fro para evitar prdidas delelemento por volatilizacin del mismo. Existen tambin otros mtodos denominados secosdado que realizan la Destruccin de Materia Orgnica (DMO) por calcinacin.

A continuacin se detalla el fundamento del mtodo de DMO por Va Hmeda Sulfo-Nitro -Perclrica

8.3.1 Destruccin de materia Orgnica (DMO) por va hmeda sulfo-nitro-perclrica

Se basa en la accin de una mezcla fuertemente oxidante sobre la muestra en cuestina fin de romper la unin entre los metales y la materia orgnica llevndolos a su mximo estadode oxidacin.

El HNO3 es un agente oxidante (punto de ebullicin: 56C).

2HNO3 H2O + NO + 3 O*__ en fro.2HNO3 H2O + 2 NO2 +1O* en caliente.

Luego O* + H (de la materia orgnica) H2O

El H2SO

4permite trabajar a mayor temperatura (270 C) siendo adems un indicador

de la destruccin de la materia orgnica: cuando cido ntrico se consume comienza a actuar elcido sulfrico que ataca la materia orgnica dando carbono de color negro. En ese momentoes necesario detener el calentamiento porque falta medio oxidante, entonces se agregar cido


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ntrico y se contina el calentamiento. (El C es reductor y podr reducir el As a AsH3perdindose por volatilizacin). Adems el H2SO4 rompe cadenas de glcidos, protenas ygrasas, dando molculas ms pequeas que sern fcilmente atacadas por el cido ntrico.

El cido sulfrico es tambin un deshidratante fuerte. Es indicador de que la materiaorgnica ha sido totalmente destruida, cuando no aparece color negro y se observan humosblancos de SO3 .

El HClO4 posee un poder oxidante muy fuerte. Explota en presencia de materiaorgnica, por eso nunca se lo usa slo sino como mezcla cido ntrico-cido perclrico.Adems de ser oxidante produce el clivaje de cadenas.

4 HClO4 2H2O + 2Cl2 + 7 O2 (4 HClO4 :14 O*)

4 HClO4 4 ClO2 + 3O2 +2H2O

4ClO2 + C (de la materia orgnica) 4 CO2 + Cl2

La principal desventaja de la mezcla SNP es que resulta peligrosa debido a que los

cidos oxidantes empleados generan vapores txicos e irritantes as como pueden producirexplosiones. Entre las ventajas se menciona la rapidez y utilidad si se manipula con cuidado,permitiendo trabajar en presencia de materia grasa en la muestra permite romper cadenascarbonadas mientras que la calcinacin por va seca no resulta suficiente.

8.3.2 Muestras biolgicasSe describe a continuacin la metodologa empleada para el caso de sangre, orina o

vsceras. Para sangre, se emplean 5 a 10 ml de sangre entera; para orina se usan 50 ml ypara vsceras se emplean 25 g vsceras desmenuzadas

ReactivosAcido ntrico (p.a.)

Acido sulfrico concentrado exento de Arsnico, Talio y Plomo.Mezcla en la proporcin 1: 2 de cido perclrico y ntricoOxalato de amonio, solucin saturada a temperatura ambiente.

EquiposBaln de Kjeldahl de 100ml.

ProcedimientoTodo el procedimiento debe realizarse bajo campana de extraccin de gases. Si se

trata de vsceras se coloca 25 g de vsceras desmenuzadas en un baln Kjeldahl de 250 ml devidrio Pyrex tratando de no tocar las paredes. Se agregan 30 ml de cido ntrico concentrado yse calienta sobre tela metlica hasta disgregar todo el material. Se contina calentandodirectamente sobre llama pequea hasta disolver el material. Se retira y se deja enfriar.

Si se trata de orina, se miden 50 ml de orina y se calienta sobre tela metlica en un

vaso de precipitados hasta reducir a un quinto del original. Se pasa el lquido remanente a unbaln Kjeldhal de 100 ml y se incorpora 10 ml de cido ntrico concentrado.De all en adelante se procede de la misma manera en ambos casos. Se agrega al

contenido del Kjeldhal 4-5 ml de cido sulfrico concentrado. Se calienta el contenido hastallegar a carbonizar la materia orgnica. En ese momento debe suspenderse el calentamientodado que se genera ambiente reductor y se perdern metales como el arsnico o el antimoniopor volatilizacin. Se deja enfriar y se agrega lentamente por el cuello del baln 4 ml de cidontrico y se vuelve a calentar. El agregado de cido ntrico se repite cuando se observeoscurecimiento del material. Se contina calentando y si se produce carbonizacin se agrega 4ml la mezcla nitrico-perclrico. Se calienta nuevamente y si se observa nuevamenteoscurecimiento se agrega 4 ml de la mezcla ntrico-perclrico.

Se contina calentando hasta la aparicin humos densos y pesados de trixido de

azufre. Llegado este punto, se retira el baln del fuego quedando un lquido incoloro o con unligero precipitado blanco o amarillento de sulfato de calcio o de hierro respectivamente.


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Dejar enfriar y luego agregar 3 a 4 ml de oxalato de amonio y se vuelve a calentar paraeliminar los restos de sustancias oxidantes hasta nuevamente humos blancos de trixido deazufre. Se deja enfriar y se agrega 1 o 2 ml de agua destilada y se calienta para desprendervapores de agua. Se repite el agregado de agua y se calienta hasta humos blancos de trixidode azufre. Se contina calentando hasta obtener un lquido residual de 2ml, se deja enfriar y setrata el lquido y el residuo slido si lo hubiera con agua destilada transvasndolo a un matrazde 25 ml. En estos 25 ml de investigar los metales como Talio, Arsnico, Plomo y otrosmetales de inters toxicolgico.

8.3.3 Muestras de aguasPara el caso de muestras de agua, antes de la recoleccin de la muestra debe tomarse

la decisin de que tipo de dato se desea obtener como ser: metales disueltos, suspendidos,totales o recuperables totales.

Los llamados metales disueltos que son aquellos constituyentes metlicos queatraviesan una membrana filtrante de 0,45 m. Los metales suspendidos que son los quequedan retenidos por la membrana de 0,45 m, los metales totales corresponden a laconcentracin determinada sobre una muestra sin filtrar seguida por una vigorosa digestin y

los metales recuperables totales corresponden a la concentracin de metales en una muestrasin filtrar seguida de un tratamiento con cido mineral diluido caliente.

Para la recoleccin de las muestras de agua el recipiente debe ser de vidrio alborosilicato, polietileno lineal, polipropileno o tefln que deben ser muy bien lavados condetergente y agua corriente, enjuagado con cido ntrico 1:1, agua corriente, cido clorhdrico1:1 y finalmente con agua destilada desionzada.

ProcedimientoPara la determinacin de metales disueltos las muestras de agua deben estar libres de

turbiedad o filtradas a travs de membrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con cidontrico diluido). La muestra debe ser filtrada en el momento de la recoleccin y luego seacidifica con 2 ml de ntrico concentrado por litro de muestra.

Para la determinacin de metales suspendidos la muestra se filtra a travs de unamembrana filtrante de 0.45 m (previamente lavada con cido ntrico diluido) y el anlisis serealiza sobre la porcin de muestra retenida en la membrana. Se transfiere la membrana a unvaso de precipitado de 250 ml y se agregan 3ml de ntrico concentrado.

Cubrir el vaso con un vidrio reloj y calentar. Cuando se ha disuelto la membranaincrementar el calentamiento y evaporar a sequedad. Enfriar y agregar 3 ml de cido ntricocontinuar calentando hasta que se complete la digestin dado por un residuo de color claro.Agregar residuo seco 2 ml de cido clorhdrico (1+1) y calentar muy bien hasta disolver elmaterial. Lavar las paredes de vaso de precipitados con agua desionizada y filtrar si esnecesario para eliminar los silicatos u otros materiales insolubles que pueden obturar elatomizador. Llevar al volumen original de la muestra con agua desionizada.

La concentracin de metales totales resulta ser la suma de las concentraciones de lasfracciones disueltas y suspendidas.La determinacin de metales extrables se realiza despus del agregado de cido

mineral (2 ml/L) y del agitado vigoroso permitiendo que repose durante una noche. En muchoscasos esto representa el contenido metlico total si han sido disueltos todos los sedimentos.La muestra est lista para el anlisis cuantitativo mediante Espectroscopia de AbsorcinAtmica.

8.3.4 Destruccin de Materia Orgnica (DMO) por va secaEste tipo de destruccin de materia orgnica resulta de eleccin en el caso de muestras

de alimentos que presenten una proporcin de hidratos de carbono elevada. Esta tcnica no esadecuada en el caso de matrices que presenten elevado contenido de protenas o lpidos. Serealiza la DMO por calcinacin de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y xido demagnesio que transforma el a los metales cuantitativamente en compuestos derivados de


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magnesio. En estas condiciones los metales no son voltiles. En el item denominadodeterminacin de arsnico se describe el procedimiento y el fundamento de las reacciones.

Luego, la muestra est lista para el anlisis cuantitativo mediante Espectroscopia deAbsorcin Atmica

8.4 Determinacin de metales de inters toxicolgico por absorcinatmica

Los metales en solucin pueden ser muy bien determinados por espectroscopa deabsorcin atmica. El mtodo es simple, rpido y aplicable a un gran nmero de metales enagua de bebida, desechos domiciliarios, barros, fluidos biolgicos como las muestras desangre, orina o vsceras luego de una adecuada DMO.

Algunos metales como el antimonio, arsnico, oro, iridio, mercurio, osmio, paladio,platino, rhodio, ruthemio, selenio, plata, talio, estao y titanio requieren modificaciones en elproceso de digestin.

EquiposEspectrofotmetro de absorcin atmica: debe poseer uno o dos canales haz de luz

simple o doble monocromador a red de difraccin, detector fotomultiplicador, ranurasajustables, rango variable de 190 a 800 nm e interconeccin a un registrador.

Lmparas de ctodo hueco pueden utilizarse las del elemento simple o las multictodo.Reactivos.

Agua destilada desionizadaAcido ntrico concentrado grado espectroscpico.Acido ntrico (1:1)Acido clorhdrico (1:1)Combustible y oxidante se usa generalmente acetileno comercial y aire proveniente de uncilindro con aire comprimido.Soluciones stock standard del metal

Preparacin del estndar y la calibracin.

Se preparan a partir de metales de alta pureza, sales de calidad analtica no higroscpicasusando agua desionizada y cido ntrico. Las soluciones stock se preparan en concentraciones de1000 mg de metal por litro. Los standards de calibracin se preparan por dilucin de la solucinstock del metal en el momento del anlisis y se descartan luego del uso. Se deber preparar unblanco y como mnimo cuatro estndares de calibracin en intervalos de acuerdo al rango totalesperado. Se preparan empleando el mismo tipo y concentracin de cido usado en lapreparacin de las muestras (cido ntrico 1:1). Aspirar el blanco y las soluciones registrando laslecturas. La curva de calibracin debe cubrir un rango apropiado de concentracin que produceuna absorcin de 0 a 80 %.

Debido a que las concentraciones detectadas por este equipamiento son muy bajas(ppm o ppb), debe evitarse interferencias de todo tipo. Una de ellas puede provenir del materialde vidrio utilizado. Por ello, debe mantenerse todo el material de vidrio en cido ntrico 1:1

durante 24 hs, para luego realizar los lavados y enjuagues del material con agua bidestilada.

8.5 Mtodos de Anlisis para la determinacin de metales

8.5.1 Investigacin y determinacin de Arsnico.Generalidades de la intoxicacinEll Arsnico se halla presente en las aguas subterrneas utilizadas como agua de

consumo. Por eso se lo halla tambin en los vegetales que lo absorben en la raz o sonregados con dichas aguas. Los mariscos filtran grandes cantidades de agua y concentran elAs. El As forma parte tambin de algunos medicamentos orgnicos e inorgnicos usadosantiguamente. El arseniato de sodio se us como colorante y el arseniato de cobre en vidrio,papel y pinturas. En pirotecnia se usan compuestos de As para las llamas verdes. En algunoscasos el As se us desde el punto de vista criminal.


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La sintomatologa observada en casos de intoxicacin pude distinguirse segn seade tipo aguda o crnica.

Aguda:- Vaso dilatacin de los capilares sanguneos con alteracin de la permeabilidad de

los mismos.- Vmitos, diarrea (prdida de agua y sales), irritacin de garganta, dolores faringes.- Edemas subcutneos. Hipertensin.- Colapso, shock, coma. Muerte.

Crnica:El As se une a albmina, se absorbe fcilmente a las mucosas y se deposita en

hgado, rin, huesos, pelos y uas. Se elimina por orina y heces, pero se reabsorbe en eltabulo contorneado proximal. Por lo tanto, debido a que la absorcin es mayor que laeliminacin, se acumula. Los sntomas ms caractersticos son:

- cada del cabello.- mano en forma de garra y pie colgante- en piel:- erupciones

- * hiperqueratosis (engrosamiento de la piel de la palma de las manos y pies)* hiperpigmentacin (manchas oscuras)-degeneracin grasa del hgado que puede dar cirrosis.-temblores por alteracin del SNC con desequilibrio de Na y K-fase final: cncer de pielInvestigacin toxicolgica de arsnicoPara la determinacin de arsnico en materiales biolgicos, alimentos, etc, es

necesario destruir previamente la materia orgnica. El mtodo empleado depende delmaterial biolgico de que se trate.

Pelos y uasSe utiliza una mezcla de cidos oxigenados concentrados que deshidratan, oxidan ysaponifican la materia orgnica.

Procedimiento:En una cpsula de porcelana colocar 1 a 2 g de material. Si se trata de pelos es

conveniente humedecerlos con unas gotas de agua destilada. Agregar 1 ml de cido sulfricoconcentrado y 5 ml de cido ntrico concentrado. Si es posible dejar en contacto varias horas.

Calentar progresivamente sobre tela metlica y luego en bao de arena. Cuandoaparecen humos blancos, retirar del bao de arena y agregar 2 ml de la mezcla constituida pordos partes de cido ntrico concentrado y una parte de cido perclrico concentrado (70%).Desde este punto en adelante, cuando se produzca oscurecimiento del lquido porcarbonizacin debe suspenderse el calentamiento del mismo pues en dicho medio reductor seperder As por volatilizacin.

Calentar hasta humos blancos y repetir este tratamiento hasta que el residuo seaincoloro o blanquecino. Retirar del bao y agregar 10 ml de agua destilada. Calentarnuevamente hasta residuo siruposo. Enfriar y tomar con 10 ml de agua destilada. El materialest listo para la determinacin cualitativa y luego cuantitativa empleando Absorcin Atmica.

AlimentosNos referiremos en particular al caso de alimentos en base a hidratos de carbono. Se

realiza la DMO por calcinacin de la muestra con una mezcla de nitrato de magnesio y xido demagnesio que transforma el As cuantitativamente en piroarseniato de magnesio. En estascondiciones el As no es voltil. En este caso es adecuada una DMO por va seca porque laproporcin de hidratos de carbono es elevada, ya que con la presencia de protenas o lpidos,se dificulta la ruptura de las grandes molculas.Procedimiento:

Colocar 10 g de muestra en cpsula de porcelana y agregar 3.5 ml de solucin de

nitrato de magnesio al 20% y 0.1 g. de xido de magnesio. Mezclar bien formando una papillay calentar primero a bao mara hasta sequedad, luego en bao de arena y por ltimo entringulo de pipas hasta cenizas blancas. Enfriar y tomar el residuo con 10 ml de cido sulfricoal 10%. Filtrar si es necesario a fin de obtener una muestra de aspecto lmpido.


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MgO + 2 Mg(NO3 )2 +As2O3 Mg3(AsO4)2 + 4 NO2

Mg3(AsO4 )2 CALOR As2O7Mg2 (piroarseniato) + MgO

As2O7Mg2 +H2SO4 AsO4H3 + MgSO4(c. arsnico)

Determinacin cualitativa.

Reacciones de identificacinSe realizan luego de la destruccin de la materia orgnica (DMO). Las mismas se

basan en las propiedades reductoras de la AsH3 o de ciertos reactivos.

Reacccin de Bougault:En un tubo de ensayo colocar un volumen de lquido a ensayar con un volumen de

reactivo (cido fosfrico) a bao mara durante 10 minutos. En presencia de compuestosarsenicales aparece un color pardo oscuro a marrn cuya intensidad vara con la

concentracin.

2 AsO3-3 + 3 H3PO2 3 H3PO4 + 2 As

0 (marrn)

La reaccin tiene una sensibilidad de 100 ppm aumentada a 10 ppm si se agrega I2.El selenito acta como interferencia pues da la misma reaccin. Se requiere ausenciaabsoluta de materia orgnica.

Reaccin de Bettendorf:En un tubo de ensayo poner un volumen de lquido ms un volumen de reactivo . Calentar aebullicin y dejar reposar. Si hay As aparece coloracin parda oscura o marrn.

AsO3-3 + 3 HCl Cl3As

2 Cl3As + 3 SnCl2 (2%) 2 As0 (marrn) + 3 SnCl4

Reaccin de Gutzeit:En un tubo de hemlisis colocar 1 ml de c. sulfrico al 25% Agregar 1 ml del lquido

problema y una granalla de Zn activado.En la parte media del tubo colocar un trozo de algodn embebido en solucin de

acetato de plomo al 1% y en la boca del tubo un papel de filtro sobre al que se coloca unapequea gota de una solucin de nitrato de plata cuya concentracin no sea menor del 50%Colocar el tubo en bao de agua fra.

En presencia de As se obtiene una coloracin amarilla caracterstica. El papel colocadoen la boca del tubo puede pasar a color negro correspondiente a Ag debido a la humedad delambiente.

AsO4-3 + Zn + 11 H+ AsH3 + Zn

+2 + 4 H2O

AsH3 + 6 NO3Ag As.Ag3.3 NO3Ag (amarillo) + 3 HNO3

As.Ag3.3 NO3Ag + 3 H2O AsO3-3 + 6 Ag0 (negro) + 3 NO3

- + 6 H+

La reaccin tiene una sensibilidad de 10 ppm.Determinacin cuantitativa de arsnico

a) Mtodo de Gutzeit:Se basa en la formacin de arsina por accin del hidrgeno naciente sobre compuestosarsenicales. La arsina reacciona con un papel embebido en Cl2Hg formando complejos


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coloreados. La longitud e intensidad de la mancha es proporcional a la concentracin de As lacual se compara con manchas estndar.

El aparato consiste en un frasco cuyo volumen vara segn la cantidad de As adeterminar (Fig. 1). Para cantidades de As entre 50 y 300 ppm se utiliza un frasco cuyovolumen de 250 ml. Para cantidades de As entre 0,1 y 20 ppm el volumen del frasco es de 60ml.

Lleva un tapn de goma con un orificio al que se ajusta un tubo de vidrio con unestrechamiento; a ste se adosa otro tubo similar pero de menor dimetro en cuya partesuperior se coloca una banda de papel embebida con una solucin de Cl2Hg y luego secado.

Reactivos.Solucin de acetato de plomo al 1%Papel embebido en solucin acuosa de cloruro de mercurio al 5%Mezcla cidaAlumbre frricoCloruro estannoso al 40% P/Ven cido clorhdrico 60% V/VGranallas de Zinc

ProcedimientoColocar en la parte inferior del tubo de desprendimiento un papel de filtro plegado yembebido en solucin de acetato de plomo seco. Por el estrechamiento de este tubo introducirlana de vidrio embebida en acetato de plomo. Finalmente, en la parte superior del tubo colocaruna tira embebida en Cl2Hg seco. El Ac2Pb retiene el SH2 (como SPb) que interfiere con elcolor.

En el frasco colocar 20 ml de mezcla cida, 2 ml de solucin de alumbre frrico, 0,5 mlde Cl2Sn. Agregar la capacidad de un crisol de 30 ml de granallas de Zn activado y llevar avolumen de 200 ml con agua destilada y colocar por ltimo una cantidad exactamente medidade solucin a ensayar.

El agregado de ClNa y H2O a la mezcla cida produce un desprendimiento regular deArsina (AsH3). El alumbre frrico compleja el Sb que pudiera estar presente. El Cl 2Sn disminuye

el sobrepotencial del Hidrgeno permitiendo la reduccin.Tapar perfectamente y colocar en bao de agua fra durante 45 minutos. Sacar labanda de papel reactivo y sumergirla en una solucin de KI al 10% que permite estabilizar elcolor. Secar entre papel de filtro y comparar con bandas standard obtenidas operando de lamisma manera. En el caso de utilizar el frasco de 60 ml, las cantidades de reactivos varan.

AsO4-3 + 4 Zn0 + H+ AsH3 (arsina) + 4 Zn

+2 + 4 H2O

2 AsH3 + 3 Cl2Hg As2Hg3 (amarillo pardo) + HCl

As2Hg3 + I-1 (I4Hg)3As3

La sensibilidad del mtodo es de 50 ppm a 300 ppm


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Fig. 1: Equipo para determinacin de arsnico por el mtodo de Gutzeit cuali y cuantitativo.

Expresin de resultados: se indicar la cantidad de As sobre la masa de muestra pesada. Lohabitual es expresar el resultado en mg/Kg de muestra.b) Mtodo de Vasac y Sedivec:

El mtodo es similar al anterior con el fundamento de reducir cuantitavamente elarsnico en la muestra con granallas de zinc y luego la arsina reacciona con una solucin dedietilditiocarbamato de plata en piridina formando un complejo color rojo que es medidoespectrofomtricamente.

Reactivos:Solucin Estndar de Arsnico: disolver 0.1734 g de arsenito de sodio en 1000 ml de aguabidestilada (solucin A). Tomar 10 ml de esta solucin (A) y llevar a 100 ml con agua

bidestilada (solucin B). Tomar 10 ml de la solucin B y llevar a 100 ml con agua bidestilada(solucin C)= 1 /ml.Se preparan Estndar de 0, 1, 2, 5 10 y 20 g de As tomando 0,1, 2,5, 10 y 20 ml de lasolucin patrn C.loduro de potasio 15%Acetato de plomo 10% P/V.Acido clorhdrico concentradoSolucin piridinica de dietilditiocarbamato de plata (DDCAg) 0.5%Granallas de zincIoduro de potasio 15% P/V.Cloruro estannoso al 40% P/Ven cido clorhdrico 60% V/V

Procedimiento:Una vez finalizada la mineralizacin se trasvasa cuantitativamente el contenido del

baln al erlenmeyer A del dispositivo de Vasac y Sedivec lavando el baln con cantidadsuficiente de agua destilada hasta un volumen de 25 ml. Paralelamente procesar un blancode reactivos sin mineralizacin previa. Agregar a continuacin en 1 ml de ioduro de potasio15% ms 10 ml de cido clorhdrico concentrado. Dejar reposar 2 minutos y agregar 0,5 mlde solucin de cloruro estanoso y dejar 15 minutos en reposo. La solucin debe permanecerincolora o ligeramente turbia. Si en la etapa final de la mineralizacin no se elimin todo eloxidante, el cloruro se convierte en Cl2 y aparece color amarillo en la solucin).

Adaptar inmediatamente el tubo B que contiene algodn impregnado en acetato deplomo y el tubo acodado C que contiene la solucin piridinica de dietilditiocarbamato de

plata (DDCAg).Finalmente se agregan tres granallas de zinc y rpidamente se cierra el equipoasegurando que no existan prdidas en las juntas. Trabajar en campana de extraccin degases. Se deja burbujear (desprender hidrgeno) durante 30 a 45 minutos.


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En presencia de arsenamina el reactivo argntico adquiere color rojo. Se realiza unacurva de calibracin con 5 patrones. Realizar la curva de calibracin representandoAbsorbancia vs. g de As.

Leer la absorbancia del complejo formado a 540 nm y se calcula la concentracin deAs en la muestra interpolando el valor de la absorbancia obtenida en una curva decalibracin.Interpretacin qumica de la reaccin:

En el mineralizado el As se encuentra como AsO4H2. El agregado de ioduro depotasio tiene por objeto transformar el AsO4H2

- en AsO3H2- de acuerdo a la siguiente

reaccin:

AsO4H2- + 2 H+ + 3I- AsO3H2

- + H20 + I3-

EI C12Sn adems de actuar como despolarizante reduce el I3- formado:

I3- + 6Cl- + Sn2+ 3I- + (Cl6Sn)

2-

El Zn libera H naciente el cual reduce el AsO4H2- a arsenamina (AsH3)

La AsH3, al incidir sobre la solucin piridnica de dietilditiocarbamato de plata que es decolor amarillo, forma con ste un complejo de color rojo. La reaccin qumica es la siguiente:

C

N(Et)2

S +AH3

SAg

C S

N(Et)2

SH+ C S

S

N(Et)2

As/3 +H2O

+ Ag

color rojo

El acetato de plomo se utiliza para eliminar la interferencia del SH2 que en este casoestara presente por las condiciones reductoras de estos ensayos lo que favorecera latransformacin del SO4

2- en SH2 .

Lmite de cuantificacin:En las condiciones de trabajo precedentes el lmite de cuantificacin es de 0,5 g%.

Esta tcnica permite determinar As total y es til para la investigacin en intoxicaciones agudasy crnicas, pero no sirve para el seguimiento biolgico de trabajadores expuestos al Asinorgnico.

8.5.2 Intoxicacin por PlomoGeneralidades de la intoxicacin

El origen de la intoxicacin con Plomo puede ser:Profesional: En la industria se usan compuestos organometlicos de Plomo como

antidetonantes. Revestimiento de cables, anticorrosivos, en pinturas y esmaltes (xidos dePlomo), imprentas de tipografa. En fundiciones e industrias de recuperacin del metal.

Ambiental: El agua potable puede contaminarse a partir del polvo atmosfrico. Lastuberas de Plomo vuelcan el metal soluble al agua en condiciones cidas.

En una intoxicacin con Plomo, generalmente crnica, se vern afectadasfundamentalmente dos enzimas de la va de sntesis del Hem:

(a) Delta-ALA dehidratasa, que cataliza la conversin de cido delta-aminolevulnico (delta-ALA) a porfobilingeno en el inicio de la va


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(b) ferroquelatasa que cataliza la introduccin del Fe+3 en el anillo de laprotoporfirina IX para dar lugar a la formacin del Hemo.

Esto va a derivar en una porfiria secundaria o adquirida, que, en forma crnica, semanifiesta en el conjunto de sntomas caractersticos que constituyen el saturnismo.

En laboratorio se determina el Perfil Plmbico, que consiste en la cuantificacin dedelta-ALA (aumentada) y coproporfirinas (aumentadas) en orina y delta-ALA dehidratasa(disminuda) y Plomo en sangre (aumentado).

Por otro lado se buscar tambin el punteado basfilo caracterstico.

Investigacin de intoxicacin plmbicaDeterminacin de Plomo en sangre (Plumbemia)El mtodo clsico para la determinacin de Plomo en sangre es el mtodo de Jacobs

modificado, que se basa en la formacin del ditizonato de Plomo, una vez eliminados porcomplejacin y extraccin los metales interferentes, y su lectura espectrofotomtrica a 510 nm.

Las tcnicas de absorcin atmica son ms rpidas y precisas. Tienen adems muy altaespecificidad de manera que las interferencias son pocas. Por esto los pretratamientos utilizadosen las tcnicas colorimtricas se simplifican enormemente. Raramente se usan para el anlisis

cualitativo.Los lmites de deteccin para las tcnicas de atomizacin en llama se encuentran en elorden de los g/ml y los volmenes de muestra requeridos son de alrededor de 2 ml. Loscoeficientes de variacin son de 2 a 0,1%.

En tcnicas en donde se realiza una atomizacin en horno de grafito se requierenvolmenes de muestra de alrededor de 50 L, con lmites de deteccin 10 a 100 vecesmenores que en la atomizacin en llama. Los coeficientes de variacin son de 10 a 1%.

Se describe a continuacin la determinacin de plomo mediante espectrofotometra deabsorcin atmica en sangre por dos mtodos:

1. Mtodo del sobreagregado2. Curva de calibracin

En el mtodo del sobreagregado, cantidades conocidas del analito es sobreagregado a

la muestra de sangre realizndose luego la hemlisis de la muestra. Se forma luego uncomplejo metlico para realizar entonces una extraccin en fase orgnica del mismo y laposterior medida mediante atomizacin en llama.

La muestra de sangre se toma por puncin venosa una vez desinfectada la zona conalcohol, mediante jeringa descartable de plstico, previamente heparinizada. Se necesita delpaciente un ayuno de por lo menos 10 horas.

Todo el material a usar debe ser tratado previamente con cido ntrico 1:1 durante 24horas. Se enjuaga luego tres veces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tresveces con agua bidestilada.

Reactivos:Pirrolidn ditio carbamato de amonio (APDC) 4%: Se pesan 4 gr de APDC y se llevan a 100 mlcon agua bidestilada caliente. Luego se filtra en papel Whatman No4.Tritn X-100 10%: Tomar 10 ml de Tritn X-100 y llevar a 100 ml con agua bidestilada tibia.APDC 2%-Tritn 5%: Se mezclan volmenes iguales de las soluciones anteriores que debenser preparadas en el momento de usar.Metil isobutil cetona (MIBK): Por lo menos 24 horas antes, saturar en agua destilada MIBK,dejando en contacto permanente ambos lquidos.Solucin madre de Plomo: Se pesan 1.5985 gr de (NO3 )2Plomo p.a. llevando a un litro concido ntrico 1/1000. Se tendr una solucin de 1 mg/ml.Solucin testigo: 12,5 ml de la solucin madre se llevan a 100 ml con cido ntrico 1/1000. Setendr una solucin de 125 g/ml.(125 ppm).

Equipos.Espectrofotometro de absorcin Atmica.

Procedimiento:1. Colocar 2,5 ml de sangre entera de la misma muestra en cada uno de dos tubos,provistos de tapa y cierre esmerilado.


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2. A uno de los tubos agregar una cantidad conocida, por ejemplo 0,1 ml, de la solucintestigo de Plomo.

3. Paralelamente se preparan un blanco con 2,5 ml de agua bidestilada y un tubo testigocon 2,5 ml de agua bidestilada y 0,1 ml de la solucin testigo.

4. A cada uno de los tubos que contienen sangre se les adicionan 1 ml de la solucinAPDC-Tritn. Se agitan los tubos en Vrtex, hasta hemlisis completa, duranteaproximadamente 15 segundos.

5. A los tubos blanco y testigo se les agregar 1 ml de la solucin APDC 4%, pues lasolucin APDC-Tritn con el agua forma emulsiones muy difciles de separar.

6. Se agrega luego a cada uno de los tubos 2,5 ml de MIBK, agitando en Vrtex duranteaproximadamente 30 segundos. Se debe verificar que la mezcla sea adecuada. Secentrifugarn luego durante 10 minutos a 3000 rpm.

7. Finalmente se separarn las fases superiores de MIBK. La fase orgnica debe tomar unleve color amarillo y de no ser as se debe sospechar una agitacin insuficiente y serecomienda repetir la operacin.

8. Los extractos de MIBK se nebulizan en el atomizador de llama y se leen contra MIBK,controlando el cero del aparato despus de cada medida.

Expresin de los resultados, para los siguientes valores:Abs muestra = MAbs muestra ms testigo = M TCantidad de Plomo en muestra = PCantidad de Plomo sobreagregada = PaAbsortividad = aLongitud de la ranura del quemador = bVolumen de la muestra = VmVolumen agregado de la solucin testigo = VtConcentracin del testigo en g / ml = Ct

Se tienen las relaciones M = a . b . Pa

Vm

M T = a . b . (Pa P)Vm Vt

Despejando el valor de se llega a una relacin, independiente de los valores de a y b, delsiguiente tipo

M PaP = M T .

Vm Vt - M____Vm M T

Multiplicando este valor por el factor Ct xVt/Vm se obtendr la concentracin de Plomo eng / ml.

b) Mtodo empleando curva de calibracin:Este mtodo es similar al anterior con las siguientes modificaciones: se construye una

curva de calibracin con sobreagregado de plomo concentracin conocida a 5 tubos demuestra entera de sangre. La curva se construye de la siguiente manera:

De la solucin madre de Plomo (1000ppm), tomar 12.5 ml y llevar a 100 ml con cidontrico 1/1000.De esta manera se obtiene una solucin de Plomo de 125ppm.Realizar una curva de calibracin con sangre de la siguiente maneraEn 5 tubos se colocan 2.5ml de sangre en cada uno y agregar 0, 5, 10, 15, 20 microlitros de la

solucin de Plomo de 125 ppm.

Tubo Microlitros de plomo de Concentracin de plomo


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solucin 125 ppm1 0 X2 5 X+25 g/ 100 ml Plomo3 10 X+50 g/ 100 ml Plomo4 15 X+75 g/ 100 ml Plomo

5 20 X+100 g/ 100 ml Plomo

1. Agregar 2 ml de APDC y tritn y luego agitar en vrtex durante 60 segundos. Luegoagregar 2 ml de MIBK durante 30 segundos.

2. Todos los dems pasos se conservan tal cual, incluido el tratamiento de la muestraproblema (cantidades, concentraciones, etc.)

3. La sangre empleada para realizar la curva debe ser de banco asegurando que nocontiene plomo mas all de los valores normales. Es conveniente siempre contar con unvial con sangre y cantidad conocida de plomo sobreagregada (standard interno) a modode verificar los resultados obtenidos.

4. Debe recordarse que el material de vidrio debe estar escrupulosamente mantenindoloen cido ntrico 1:1 durante 24 hs para luego lavarlo con agua bidestilada.

Valores de referencia para la poblacin de Capital Federal y alrededores

Nios no expuestos: 17 8 g %Adultos no expuestos: 19 7 g %Adultos expuestos: 57 21 g %

Valor lmite para el sujeto expuesto: 70 g % (segn Working Conference, Amsterdam1968).

Determinacin de Porfobirinogeno (PBG) orina. Ensayo rpido

1. Se utiliza como muestra la orina recolectada en las condiciones correspondientes a ladeterminacin de coproporfirinas totales (pH = 7.8) ver item 5.3.2.4. ya que el plomo sepolimeriza en medio cido dando uroporfirina.

2. En un tubo pequeo a 2 ml del reactivo de Erlich (2 g de p-dimetil aminobenzaldehdoen 50 ml de HCl y 50 ml de agua destilada) se agregan 1 - 2 gotas de orina. Al cabo de2 segundos un desarrollo de color rosado a rojo al tope de la solucin indica un testpositivo para PBG.

3. El color amarillo que se observa a veces, se debe a compuestos tales como urea yurobilingeno que no desarrollan color en esas condiciones hasta una concentracin de200 mg/g.

4. En una intoxicacin con Plomo se encontrarn valores de PBG en orina normales odisminuidos. Si se hallaran valores aumentados, sera indicio que la porfiria manifestada

es de otra naturaleza, por ejemplo de tipo congnito.

Determinacin de Acido Delta Aminolevulnico (delta ALA) en orina. Mtodo de Berk-Durk modificado, Clinical Chem. Lab., 1973.

La reaccin se fundamenta en la reaccin del delta ALA con acetilacetona dando uncompuesto pirrolico (2 metil, 3 acetil 4 (3 propion) pirrol) que condensa luego con el reactivode Erhlich originado un compuesto rojo que se determina por espectrofotometra a 553 nm.

Muestra:

Orina correspondiente a 24 horas recolectada en frasco oscuro conteniendo solucinsaturada de cido tartrico aprox. 1 ml/ 100 ml de orina.

Reactivos.1. Reactivo de Erlich modificado = 1 gr de p-dimetilaminobenzaldehdo se disuelve en 35

ml de cido actico glacial, se agregan 8 ml de cido perclrico 70% y se lleva a 50 mlcon cido actico glacial.


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2. Solucin acetato de sodio 0.5 M: 41 gr de AcNa se disuelven en 1 litro de aguadestilada.

3. Solucin AcH 0.5 M: 28.7 ml AcH glacial se llevan a 1000 ml con agua destilada.4. Buffer acetato: 93.2 ml AcH 0.5 M ms 6.8 ml AcNa 0.5 M (pH=3.5).5. Solucin diluyente: 0.25 gr de carbn medicinal se agregan a 100 ml de solucin buffer

acetato 0.5 M.6. Estndar de delta-ALA 400 g/ml: se disolvern 4 mg de delta-ALA p.a. en buffer

acetato, llevando a 10 ml totales.Equipos.

Espectrofotmetro UV-visibleBao termostticoCentrfuga hasta 500 rpm

Procedimiento:1. Transferir 1 ml de orina (pH 6 6.5) a un tubo de centrfuga y agregar 9 ml de

solucin diluyente. Mezclar durante unos minutos y centrifugar.2. Filtrar por papel de filtro y transferir 2 alcuotas de 2 ml c/u del filtrado a sendos

tubos de ensayo B y D (Blanco y Desconocido, respectivamente). Al tubo D se

le agrega 0.1 ml de acetilacetona y ambos tubos se llevan a bao Mara (BM)hirviente durante 20 minutos.3. Se enfran entonces los tubos en bao de agua y se le agrega 2 ml de Reactivo

de Erlich a cada una. Luego de 15 minutos se lee la absorbancia del tubo D a553 nm contra el tubo blanco.

4. La cantidad de delta ALA se obtiene a partir de una curva de calibracinexpresada en g/ml. Se tomarn soluciones de 50, 30, 10, 5 y 1 g/ml, diluyendola solucin standard original de 400 g/ml. sobre ellas se realiza la reaccin deErlich en forma anloga a la realizada sobre las muestras.

Observacin: La reaccin del delta ALA con el reactivo de Erlich es muy sensible aunque noespecfica pues tambin la dan las aminocetonas y las glucosaminas. Desde el punto de vista dela determinacin del perfil plmbico, estas interferencias no tienen relevancia en los rangos de

concentracin de -ALA halladas en el saturnismo.

Valores normales 0.1 a 0.5 mg% para menores de 15 aos0.1 a 0.6 mg% para adultosexcrecin urinaria 1.3 a 7 mg/24 hs.

Ensayo para porfirinas en orinaSe trata de un test rpido cuyo resultado es positivo desde valores de concentracin de 70

g% (1 mol/L).Reactivos

Acido actico

Alcohol amlicoEter etlicoProcedimiento

En un tubo de ensayo se colocan 2 ml de una mezcla de igual volumen (1:1:1) de cidoactico, alcohol amlico y ter dejando caer sobre ella 15 ml de orina. Luego de 2 minutos elreactivo habr extrado la mayor parte de las porfirinas presentes por lo que se separara unacapa superior en el tubo. Si esta capa superior muestra fluorescencia roja, el test es positivo.

El ensayo se puede hacer ms sensible transfiriendo la fase orgnica superior con unapipeta Pasteur a otro tubo conteniendo 1 - 2 gotas de HCl. Se agita fuertemente (10 - 20 seg)y se observa la capa clorhdrica inferior a la luz UV.

Tambin puede hacerse una prueba mediante 10 ml de orina, 0.5 ml de AcH glacial y talco,agitando vigorosamente, para observar la fluorescencia en el tubo.

Determinacin de coproporfirinas totales en orina. A.A.Fernndez; R.J. Henry,H.Goldenberg Clin. Chem. 12, 463 - 474, (1966).


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El mtodo se fundamenta en la extraccin de coproporfirinas a pH adecuado con acetato deetilo para la posterior oxidacin del coproporfiringeno remanente a coproporfinas que luego seextraen con cido clorhdrico y posterior lectura en espectrofotmetro a tres longitudes de ondaa efectos de corregir las interferencias

Muestra:Orina correspondiente a 24 horas recolectada en un frasco oscuro conteniendo CO3Na2

como conservador en cantidad suficiente para una concentracin final de 0.1 - 0.5%. El CO3Na2tiene como finalidad de evitar las prdidas de coproporfirinas fundamentalmente, conservandoa pH 5 - 9.5. En estas condiciones, la mayor parte de los coproporfiringenos pasarn acoproporfirinas.

Reactivos1. Acetato de sodio 1%: 10 g de sal anhidra o 16,6 g de acetato de sodio trihidratado sedisuelven en agua y se llevan a 1000 ml. La solucin es estable varias semanas a temperaturaambiente.2. Buffer acetato de sodio (pH = 4,8): se mezclan 1 vol. de actico glacial con 4 vol. desolucin saturada de acetato de sodio y 3 vol. de agua.3. Solucin saturada de acetato de sodio: la saturacin se facilita mucho disolviendo el

acetato de sodio a 70 - 80o

C. Si el acetato de sodio no cristaliza al enfriarse el agua, secalienta de nuevo la solucin y se aade ms sal. Se puede usar sal anhidra o trihidratada.4. Solucin alcohlica de iodo al 1% (de reserva): Se disuelve 1 g de iodo en alcohol y sediluye hasta 100 ml. Conservar en heladera en frasco oscuro con tapn de vidrio.5. Solucin de iodo al 0,005%: se diluyen 0,1 ml de la solucin de reserva en aguadestilada hasta 20 ml. Se debe preparar en el momento de usar.6. Acido clorhdrico 1,5N se aaden 12,5 ml de HCl a 50 ml de agua destiladaaproximadamente y se diluye hasta 100 ml.

Equipos:Espectrofotmetro UV visible.

Procedimiento:1. Se debe controlar el pH de la orina con papel indicador de manera que se

encuentre en el rango de 5 a 9.5; no se debe trabajar con muestras cuyo pH seainferior a 5.

2. Posteriormente, se debe examinar la muestra de orina a la luz UV y si tuvierafluorescencia roja se debe diluir la misma con agua en una relacin 1:10.

3. A 20 ml de orina se le agregan 10 ml de buffer acetato (pH = 4.8) y se transfierea una ampolla de decantacin. Se le agregan 30 ml de acetato de etilo y se agitasuavemente durante 3 a 5 minutos. Se deja reposar y se descarta la faseacuosa.

4. La fase orgnica se lava 3 veces con 5 ml de acetato de sodio 1% cada vez. Secolectan los extractos orgnicos, descartndose la fase acuosa y se agregan 2ml de solucin de iodo al 0.005% preparada en el momento, no dejando ms de5 minutos en contacto ya que el tiempo es crtico. Se desecha la solucin deiodo y finalmente se efectan tres extracciones o hasta que la capa orgnica nopresente fluorescencia, con 2.5 ml de HCl 1.5 N cada vez. Se recoge el extractoclorhdrico en un tubo graduado midiendo este volumen.

5. En forma alternativa puede realizarse una separacin mediante el sembrado de1 ml de orina en una columna de intercambio aninico Dowex 1X8, dejando eluircon 3 ml de agua destilada. Se eluyen luego las porfirinas con HCl 3 N hastafluorescencia negativa.

6. A continuacin, se lee la absorbancia del extracto clorhdrico a tres diferentes:380, mximo entre 400 y 410 (generalmente 402) y 430 nm.

Expresin de resultados:

A corregida = 2 A max - (A 380 + A 430 )1.835


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Coproporfirinas ( g/24 hs) = A corregida . V c .V t . D. V alcuota orina

donde:

A 380 y A 430 : indican absorbancia a 380 y 420 nm, respectivamenteA max : indica la absorbancia mxima en el rango 400 - 410 nmVc : volumen total de los extractos clorhdricosVt : volumen total de orina recolectada en 24 hs.D: factor de dilucin, si se diluy la orina: coeficiente de extincin (ml/ g) de coproporfirinas en HCl 1.5 N = 0.673

Valores normales = 0 - 160 g / 24 hs.Determinacin de la actividad de la enzima Delta- aminolevulinico dehidratasa. Berlin, A;Schaller, H.M.. Klim. Chim. Klim. Biochem., 12, 389-390 (1974).

Muestra:

Se utiliza sangre entera que debe ser recogida con jeringa descartable de plsticousando heparina como anticoagulante, en un volumen mnimo de 1 ml. No deben emplearseNaF ni EDTA debido a que inhiben la actividad enzimtica. La misma muestra puede usarsepara la determinacin del hematocrito y Plomo.

La muestra se mantendr en heladera a 4oC hasta su procesamiento. Se recomiendaefectuar la determinacin en el da de recoleccin, pues la actividad enzimtica desciende enun 12% a 15% luego de 24 horas.

El material de vidrio deber ser preferentemente de borosilicato. Para ser utilizado esnecesario tratarlo previamente con HNO3 1:1 durante 24 horas. Posteriormente enjuagarlo tresveces con agua corriente, tres veces con agua destilada y tres veces con agua bidestilada,para evitar cualquier contaminacin. El material de plstico ser preferentemente depolipropileno.

Reactivos:1. Buffer fosfato: 29 ml de fosfato disdico 0.1 M con 71 ml de fosfato monosdico 0.1 M.

Ajustar el pH a 6.4 con la solucin correspondiente. Mantener en heladera a 4oC.2. Buffer sustrato: disolver 0.01676 gr de -ALA p.a. en 5 ml de fosfato monosdico 0.1 M,

llevar a pH 6.4 con fosfato disdico 0.1 M. Completar a 10 ml con buffer fosfato de pH6.4. Se conservar en freezer a -18oC.

3. Reactivo de Erlich: Disolver 0.24 gr de p-DMAB en 7.2 ml de cido actico glacial,posteriormente agregar 1.92 ml de cido perclrico, completando a un volumen de 12ml con cido actico glacial. Se prepara en el momento de usar o se mantiene enheladera a 4oC.

4. cido tricloro actico (TCA) 10%: Pesar 10 gr de TCA y disolver en 100 ml de agua

destilada.Equipos.Espectrofotmetro UV-visibleBao termostatitoCentrfuga

Procedimiento:1. A un volumen de 0,2 ml de sangre agregar 1,3 ml de agua bidestilada y 1,0 ml

de buffer sustrato. Se produce la hemlisis total de la muestra de sangre.2. Paralelamente se procesa un blanco con 0.2 ml de sangre a la que se le agrega

1,3 ml de agua bidestilada, 1 ml de TCA 10% y 1 ml de buffer sustrato. Incubarlos tubos de blanco y muestra durante 60 minutos a 38oC; el tiempo deincubacin se empieza a contar desde el agregado de buffer sustrato a las

muestras.3. Cumplido el tiempo de incubacin, se le agrega al tubo de muestra 1 ml TCA10%. Se centrifugan luego todos los tubos durante 10 minutos a 2000 RPM.


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4. Reaccin de color: A un volumen de 1.5 ml del centrifugado agregar 1.5 ml dereactivo de Erhlich. Mezclar en Vrtex y leer luego de 10 minutos lasabsorbancias respectivas contra reactivo de Erhlich a 555 nm.

Expresin de resultados:

Actdelta ALA DEHIDRATASA = Abs x 100 x f x DHto x t x m

donde:Abs. Es la absorbancia de la muestra menos la Absorbancia del blanco

m: coeficiente de extincin molar en l / mol. cm = 0.062Act ALA DEHIDRATASA: en U/ L de hematesf: factor de conversin de deltaALA a Plomo = 2D: factor de dilucin = 35t: tiempo de incubacin.

Valor de referencia para la actividad enzimtica en sujetos sanos no expuestos al plomo:mayor a 20 U / L hemates

Determinacin de Plomo en una muestra de alimentos de origen vegetal por elmtodo de absorcin atmica

La determinacin de la concentracin de Plomo se puede realizar sobre cualquier tipode una muestra de alimentos, en este caso se presenta el protocolo ya puesto a punto para elcaso de muestras de producto vegetales y en particular tomate enlatado.

El primer paso del anlisis, consiste en una digestin de la materia orgnica (DMO) paravolver ms sencilla la matriz que contiene el analito, as como obtener una solucin lmpida yms fluida que la muestra original, hecho que facilita el proceso de inyeccin de la muestra.

Reactivos.cido ntrico concentrado libre de plomo.

Equipos.En este caso se describe el procedimiento para un equipo Shimadzu AA-6701F provisto

de un quemador con cmara de premezclado y horno de grafito.Digestor de microondas CEM modelo MDS 2100.

Procedimiento.La DMO se realiza en un digestor de microondas especialmente diseado. Se pesan 0,5

gr. de la muestra a digerir, y se colocan dentro de un vaso especial, junto con 5 ml de cidontrico concentrado de calidad pro-anlisis, mas 1 ml de agua desionizada.

Los tubos de digestin y la tapa de ellos son de tefln. En la tapa se distingue unavlvula de seguridad, a la cual debe acoplarse un tubo que conecta el vaso con un recipientesituado en el centro del aparato, este recipiente sirve como trampa para los vapores nitrososque salen del vaso, y/o para recibir cualquier sustancia que salga del vaso. La vlvula deseguridad debe revisarse en cada utilizacin del aparato, esta consiste en una membrana,

semipermeable, que permite la salida del vapor contenido en el vaso si la presin desarrolladadentro de este resulta excesiva. La tapa se ajusta al vaso, por medio de un cierre a roscahecho de keblar. Una vez cerrado el vaso, se encamisa con un tuvo hecho del mismo materialque el cierre.

Luego de armar los vasos con las muestras a digerir, se disponen en un carruselsituado dentro del horno, y se conecta el tubo de seguridad que corresponde a cada uno. Unode los vasos que se utiliza tiene una tapa diferente a las otras. Esta estar provista de tressalidas, una se usa para introducir una fibra ptica que hace las veces de sensor detemperatura, a otra de las salidas se conecta el sensor de presin, y la ltima se utiliza paraacoplar el tubo de seguridad.

Una vez que se introdujeron todos los vasos a utilizar, se procede a la programacin delesquema de calentamiento. Se elige es la presin y temperatura usada durante ese proceso.

Antes de comenzar la digestin, limpiar escrupulosamente los vasos, las tapas, los cierres, ylas camisas de los vasos, con un pao limpio y seco.


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Al terminar el proceso, se debe esperar a que se enfren los vasos para que disminuyala presin en ellos, luego, se retiran los vasos, se trasvasa su contenido a un matraz de 10 ml yse lleva a volumen con cido ntrico 15%.

La digestin debe ser evaluada por el operador, considerndose terminado el proceso,cuando el producto sea una solucin lmpida, sin residuos slidos. Si esto no sucede, se debesometer la muestra a un nuevo ciclo de digestin.

Curva de calibracin:La determinacin de la cantidad de Plomo en la muestra se realizara en base a una

curva de calibracin que se confecciona con una serie de soluciones estndar. Estassoluciones son preparadas a su vez, a partir de una solucin madre comercial pro-analisis cuyaconcentracin es 1000 mg/L, o 1000 ppm. El metal se encuentra por lo general en forma denitratos o sulfatos solubles, esta solucin esta casi libre de la presencia de otros metales. Lassoluciones que se recomiendan en general son: 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm, 30 ppm, 50 ppm.

Estas soluciones se prepara tomando 50 ml de la solucin madre, que se llevan a 500ml con agua destilada desionizada. Con eso se tiene una solucin de concentracin igual a100 ppm de plomo. De esta se preparan las soluciones estndar, tomando 0.5 ml, 1 ml, 1.5 ml,3 ml, 5 ml, para luego llevar a un volumen final de 100ml con cido ntrico 15%. Adems se

usara una sexta solucin patrn para definir el 0 de concentracin, este no es mas que unasolucin de cido ntrico 15%.Clculos:

La concentracin en la muestra se determina mediante la siguiente expresin:

02.0*.leidappbppm

BibliografaSALTZMAN, B. E. 1952. Microdetermination of chrornium with diphenylearbazide bypermanganate oxidation. Anal. Chem. 24:1016.URONU, P. F. 1955. Stability of` colorimetric reagent for chromium, 5-diphenylcarbazide, invarious solvents. Anal. Chem. 27:1354.ALLEN, T. L. 1958. Microdetermination of chromium with 1,5-dipheny1carbohydrazide. Anal.Chem. 30:447.SANDFLL, E. B. 1959. Colorimetric determination of traces of metals, P ed. IntersciencePublishers, Nueva York.Chomium. Scientific Reviews of Soviet Literature on Toxicity and Hazards of Chemicals 68,Centre of International Projects, GKNT, Moscow, USSR, 1984.ALCEDO, J. A.; WETTERHAHN, K. E. Chromium toxicity and carcinogeness. Int. Rev. Exp.Pathol. 31: 85-108 (1990).JONES, R. E. Hexavalent chrome: threshold concept for carcinogenicity. Biomed. Environ. Sci. 3:20-34 (1990).WOOD, R.; MILLS, P. B.; KNOBEL, G. J.; HURLOW, W. E.; STOKOL, J. M. Acute dichromatepoisoning after use of traditional purgatives. A report of 7 cases. S. Afr. Med. J. 77: 640-642(1990).

LANGARD, S.; NORSETH, T. Chromium. En: Friberg, L.; Nordb-rg, G. F.; Vouk, V. (eds.).Handbook on the Toxicology of Metals. Elsevier, Arnsterdam, 1990, pgs. 185-210.WEDEEN, R. P.; QIAN, L. F. Chromium-induced kidney disease. Environ. Health Perspect. 92:7174(1991).

STOKINGER, H. E.; Vanadium. En: Clayton, G. D.; Clayton, F. E. (eds.). Pattys IndustrialHygiene and Toxicology. Wiley Interscience. New York, pgs.1589-1605.MASSON, S. Affections imputables aux derives mineraux du chrome. Universit de Paris VII,Facult de Mdecine Xavier-Bichat, Paris, France, 1982.


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SHEEHAN, P. J.; MEYER, D. M.; SAUER, M. M.; PAUSTENBACH, D. J. Assessment of thehuman health risks posed by exposure to chromium-contaminated soils. J. Toxicol. Environ.Health 32: 161201(1991).Captulo 5, Preparation of samples for metals analysis, de Sample Preparation Techniques inAnalytical Chemistry, edited by Somenatah Mitra, Wiley Interscience, 2003.Toxicological Profile for Arsenic, US Department of Health and Human Services, Public Health

Service, Agency for Toxic Substances and Disease Registry, September 2000.Informe sobre el Arsnico en Argentina (mtodos de tratamiento),www.ingenieroambiental.com.ar, 1999.The Enigma of Arsenic Carcinogenesis: Role of Metabolism, Toxicological Sciences, 49 5- 14,1999.WEN-YI CHEN et al, Analytical SciencesThe Japan Society for Analytical Chemistry..Determination of Total Mercury and Methylmercury in Human Hair by Graphite-Furnace AtomicAbsorption Spectrophotometry Using 2,3-Dimercaptopropane-1-sulfonate as a ComplexingAgent. , March 2002, VOL. 18 255, 2002MICHAEL KRACHLER et al, Fresenius J.Anal.Chem, editado por Springer-Verlag. Microwavedigestion methods for the determination trace elements in brain and liver samples by inductivelycoupled plasma mass spectrometry, 355:120128, 1996.Principles of Toxicology: Environmental and Industrial Applications 2nd Ed., a Wiley-IntersciencePublication Wiley & Sons, Inc., New York, 2000.Research Plan for Arsenic in Drinking Water, EPA, Review Draft, December 1996.Method for Identifying Arsenic Species in Urine for Use in Exposure and Epidemiology Studies,National Exposure Research Laboratory September 2000.Preconcentration of Arsenic Species of Environmental Waters by Solid Phase Extraction usingMetal-loaded chelating resins, Minoru Tanaka et al, Analytical Sciences 2001, Volume 17,Supplement, The Japan Society of Analytical Sciences.

intoxicacionpormetalesynometales-110418164629-phpapp01 (1)

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