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En la actualidad, la mayor parte de la evidencia acumuladaindica que la periodontitis no es una enfermedad infecciosaconvencional, sino una enfermedad inflamatoria, desencade-nada por la respuesta inmunitaria del hospedador frente a unaconstelación de microorganismos asociados con la biopelículaperiodontal (infección polimicrobiana) (94, 122, 151). Dentrode los tejidos gingivales y periodontales se encuentran abun-dantes linfocitos en un denso infiltrado inflamatorio mono-nuclear (67, 100). Esta afluencia de células parece ser respon-sable de la regulación de la respuesta inmunitaria frente a lasbacterias relacionadas con la enfermedad periodontal (38, 64)y da lugar a la patogenia de la periodontitis, y a la resorción delhueso periodontal (9, 94, 122, 151, 152). En el tejido gingivalhumano con enfermedad periodontal, son los linfocitos B y Tlos principales productores de un factor de diferenciación delos osteoclastos, el ligando del receptor activador del factor nu-clear ÎB (RANKL), el cual induce la diferenciación y la activa-ción de osteoclastos y da lugar, como consecuencia de ello, auna resorción del hueso (67). De hecho, diversos modelos ani-males de enfermedad periodontal respaldan firmemente la aso-ciación de los linfocitos T (8, 9, 35, 47, 64, 65, 68, 124, 126, 134)y B (27, 51, 53) con la resorción del hueso periodontal. Hemosdesarrollado modelos experimentales de periodontitis, tantoen ratas como en ratones, que pueden demostrar la mediaciónde dichas células en la resorción ósea periodontal (51, 53, 65,68, 69). Un hallazgo clave de estos modelos es el aumento delos osteoclastos existentes sobre la cresta de hueso alveolar delos animales que reciben linfocitos específicos de antígeno, loscuales pueden ser suprimidos por la proteína de fusión osteo-protegerina (OPG-Fc), un inhibidor de RANKL, lo que implicaque la inducción de la resorción de hueso periodontal mediadapor linfocitos depende de RANKL (51, 68, 126). No sólo se hanhallado evidencias de resorción ósea mediada por linfocitos enla enfermedad periodontal, sino también en la artritis reuma-toide, lo que ha atraído un interés creciente para emprenderinvestigaciones con el objetivo de desarrollar abordajes tera-péuticos que interfieran con los linfocitos T y B efectores delsistema inmunitario, los cuales producen RANKL y otros fac-tores que activan e inducen la diferenciación de los osteoclas-tos (74, 123, 128). Basándonos en nuestros hallazgos y en losde otros investigadores (51, 67, 74, 118, 119, 123, 127, 150), cre-emos que es crucial desarrollar y evaluar estrategias de trata-miento de la enfermedad periodontal mediada por las célulasinmunitarias. Uno de los objetivos de dichas estrategias es in-

terferir en la producción y liberación de RANKL, o producir elbloqueo fisiológico de la interacción RANKL/RANK y su pos-terior señalización, a fin de reducir la diferenciación de osteo-clastos y la resorción ósea. Se aportará información acerca delos recientes hallazgos sobre la regulación de la osteoclastogé-nesis dependiente de RANKL como significativo factor contri-buyente en la resorción del hueso periodontal, y se analizaránabordajes inmunológicos de utilidad potencial en la mejoríade la resorción del hueso periodontal mediada por las célulasinmunitarias.

Respuesta inmunitaria del hospedadorfrente a las bacterias en la enfermedadperiodontal crónica

Primeros hallazgos de la pérdida de huesoperiodontal de origen inmunitario

Ebersole et al. (39) demostraron –mediante la determina-ción de anticuerpos séricos de tipo IgG frente a bacterias con-cretas, y/o de sus antígenos– que la respuesta inmunitaria hu-moral del hospedador frente a las bacterias se encuentraactivada en pacientes con enfermedad periodontal. Este es-tudio ya antiguo fue el primero en respaldar el hallazgo de quela respuesta inmunitaria del hospedador frente a los microor-ganismos bucales se asocia con una lesión activa en la enfer-medad periodontal en seres humanos (37, 39). Se detectó unarespuesta elevada de anticuerpos frente a los microorganis-mos en el 56 % de los sitios con bolsas periodontales activas,frente al 18 % de los sitios inactivos. La diferencia significativaen la incidencia de seropositividad frente a las bacterias entrelas bolsas periodontales activas e inactivas (p < 0,001 medianteel análisis estadístico de χ2 [39]) indicó que en las bolsas pe-riodontales activas existían bacterias asociadas a la enferme-dad, las que podían ser recuperadas de estos sitios y, además,podían desencadenar una respuesta inmunitaria de IgG.

Primeros hallazgos de la posible implicación delos linfocitos T en la pérdida de hueso periodontal

La periodontitis puede relacionarse con los linfocitos in-munitarios T y con los productos de éstos que participan en

Periodontology 2000 (Ed Esp), Vol. 20, 2008, 49-59

Interferencia en la resorción óseamediada por células inmunitariasen la enfermedad periodontalXIAOZHE HAN, TOSHIHISA KAWAI Y MARTIN A. TAUBMAN

Copyright © Blackwell Munksgaard

PERIODONTOLOGY 2000ISSN 0906-6713

Copyright © Grupo Ars XXI de Comunicación, S.L.

PERIODONTOLOGY 2000 (Ed Esp)ISSN 1695-1808

la respuesta, tal como demostraron los primeros estudios co-menzados por Yoshie et al. (150), en un modelo de enferme-dad periodontal en ratas en el cual el desarrollo de periodon-titis fue relacionado con la transferencia adoptiva de linfocitosT específicos frente a antígenos bacterianos, seguida de la in-fección con la bacteria. En los primeros estudios (116) con te-jidos de pacientes con periodontitis, se caracterizaron los in-filtrados exclusivos de linfocitos T que parecían relacionarsecon la gravedad de la enfermedad, determinada a partir de laresorción ósea (116). Además, se ha implicado a los linfocitosT en la patogenia de la enfermedad periodontal inflamatoriacrónica, y se considera que constituyen un elemento centralde control para la regulación de la progresión de la enferme-dad (122). Se ha demostrado que diferentes tipos de clones delinfocitos T frente a una serie de antígenos específicos de-sempeñan papeles destructivos (65, 148). La inmunidad me-diada por los linfocitos T colaboradores (linfocitos T CD4+) esun brazo importante de la respuesta inmunitaria adaptativafrente a la infección bacteriana. Los linfocitos T CD4+ se pue-den clasificar en distintas poblaciones, según su función y lospatrones de producción de citocinas. Entre ellas se incluyenlos linfocitos Th1, responsables de la inmunidad celular, queproducen de forma preferente interleucina 2 (IL-2), interferónγ (IFN-γ) y factor de necrosis tumoral α (TNF-α), y los linfoci-tos Th2, que ayudan en la síntesis de anticuerpos y producenIL-4, IL-5, IL-6 e IL-13. Estudios previos con muestras de te-jido gingival humano han señalado que los linfocitos T CD4+

de las lesiones periodontales producían de forma preferenteIFN-γ, junto con otras citocinas, como IL-6, IL-10 e IL-13 (100,121). No obstante, puesto que ninguno de los estudios previosha abordado esta cuestión en un solo linfocito T empleandoun método analítico in situ, sigue sin quedar totalmente claroel perfil detallado de expresión de citocinas de cada linfocitoT presente en tejidos gingivales sanos y enfermos.

Demostración de la participación de los linfocitos Ten la pérdida ósea en modelos animalesde enfermedad periodontal

Baker et al. (7) demostraron la importancia de los linfoci-tos T CD4+ en la destrucción del hueso alveolar durante la en-fermedad periodontal, empleando una batería de ratones condeficiencias genéticas provocadas y sus controles sin mani-pulación. Este modelo puso de manifiesto que la reducciónde linfocitos T CD4+, pero no de CD8+, disminuye la pérdidaósea asociada con la infección por Porphyromonas gingiva-lis. Además, los ratones con deficiencia genética para produ-cir citocinas, especialmente, IFN-γ e IL-6, mostraban una pér-dida de hueso alveolar reducida tras la infección con dichabacteria (7), lo que indica la influencia de las citocinas in-munitarias en el curso del desarrollo de la resorción del huesoperiodontal. Nuestros estudios han puesto de manifiesto quela transferencia adoptiva de linfocitos Th1 frente a antígenosespecíficos, pero no la de linfocitos Th2, realizada en ratas ex-puestas por vía oral a un antígeno de Actinobacillus acti-nomycetemcomitans (cuya denominación ha cambiado re-cientemente a Aggregatibacter actinomycetemcomitans [98])daba lugar a resorción ósea en el periodonto. Se ha sugeridoque los linfocitos Th1, a través de la activación local en la en-cía, podrían constituir una causa más significativa de infla-mación y de la resorción ósea resultante en el periodonto (65).Se ha demostrado una predominante producción de la cito-

cina de tipo Th1 IFN-γ, pero una escasa o nula producción dela de tipo Th2 IL-4, en los linfocitos T aislados de los sitiosafectados en el modelo de ratón humanizado no obeso dia-bético con inmunodeficiencia combinada grave (NOD-SCID),así como en los linfocitos T aislados de los tejidos gingivalesde pacientes con periodontitis agresiva (125). Estos estudioshan demostrado de forma clara que la destrucción de huesoalveolar en los tejidos periodontales puede estar mediada porla activación de los linfocitos T CD4+ como respuesta a la ex-posición a microorganismos y la consecuente activación deosteoclastos. Es necesario determinar aún las propiedades delos linfocitos T responsables de dicha inducción. Parece queestas células pueden dividirse en subtipos efectores de la in-munidad adaptativa, como los Th de tipo 1, 2 y 17, que posi-blemente induzcan la resorción ósea, y en subtipos supreso-res, como los TH de tipo 3, o los linfocitos T reguladores (Tr),como los Tr de tipo 1, que pueden actuar contrarrestando lainducción de la resorción ósea. De este modo, los investiga-dores aún necesitan definir el perfil de expresión de citoci-nas, así como el repertorio de receptores de linfocitos T (TCR)y de marcadores fenotípicos de cada subtipo de linfocito T enlos tejidos gingivales. De este modo, la ausencia de una tec-nología apropiada y el tamaño limitado de las muestras detejido se combinan para impedir la realización de los estu-dios más elaborados, requeridos para establecer los perfilesde linfocitos T en las lesiones con enfermedad periodontal.

Papel de los linfocitos B presentes en el tejidoperiodontal enfermo

En el denso infiltrado inflamatorio mononuclear del tejidogingival enfermo existen abundantes linfocitos de la serie B,incluidos los plasmocitos (19), lo que hace a la enfermedadperiodontal distinta de la gingivitis y de otras lesiones infla-matorias de origen infeccioso (114). Se piensa que los linfoci-tos B activados de los tejidos periodontales enfermos contri-buyen a la protección frente a la infección bacteriana mediantela producción de anticuerpos IgG (36), si bien puede haberanticuerpos autorreactivos involucrados en la patogenia de laperiodontitis (17). Sin embargo, si la IgG reactiva frente a lasbacterias y producida por los linfocitos B protege al hospeda-dor en la enfermedad periodontal, es posible preguntarse porqué una concentración elevada de IgG frente a las bacteriasno es suficiente para mejorar la enfermedad. En respuesta aello, se han aclarado otros papeles de los linfocitos B en la en-fermedad periodontal a partir del descubrimiento de que loslinfocitos B, junto con los linfocitos T, constituían la principalfuente celular de RANKL, lo que proporcionó evidencias deque los linfocitos B no sólo producen IgG reactiva frente a lasbacterias, sino que también contribuyen a los procesos pato-génicos de la destrucción del hueso periodontal (67).

RANKL: una pieza clave intermedia en laruta que conecta las células inmunitariascon la pérdida patológica de hueso

Bases biológicas de la actividad de RANKL

RANKL, ligando del RANK (receptor activador del factornuclear κB [FN-κB]), es una citocina relacionada con TNF que,según se ha descrito, participa no sólo en la osteoclastogé-

Han et al.

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nesis fisiológica, sino también en la pérdida patológica dehueso (75, 84, 132). RANKL, su receptor de la superficie celu-lar RANK y un receptor anzuelo soluble para RANKL, la oste-oprotegerina (OPG), son tres piezas clave que regulan la di-ferenciación y la función de los osteoclastos (117, 128). Hastaque se identificó a RANKL como un factor clave en la dife-renciación de los osteoclastos, se consideraba que los osteo-blastos y las células del estroma de la médula ósea eran lasúnicas células efectoras que podían inducir la diferenciaciónosteoclástica mediante el contacto célula-célula con célulasprecursoras de osteoclastos (81, 131). Si bien algunos traba-jos señalaban que las células inmunitarias, en particular loslinfocitos T, podrían estar implicados en la resorción del huesoperiodontal (12, 101), hasta el descubrimiento de RANKL nose aclaró el mecanismo molecular que subyacía a la osteo-clastogénesis mediada por células inmunitarias. Además, seesclareció por primera vez la participación de dicha osteo-clastogénesis, ante la evidencia de que RANKL no sólo se ex-presa en los osteoblastos y células del estroma de la médulaósea, sino también en linfocitos T y B (67, 73, 147).

Implicación del RANKL expresado por los linfocitosT en la resorción ósea de la artritis

La participación del RANKL expresado por los linfocitos Ten el contexto de la pérdida patológica de hueso fue demos-trada por primera vez en la artritis reumatoide. Kong et al.(74) emplearon un modelo de artritis en ratas para demostrarque los linfocitos T activados participaban, por medio de suexpresión de RANKL, en la regulación de la pérdida de huesoy en la destrucción articular. Los ratones con deficiencia ge-nética de RANKL provocada muestran osteopetrosis. Presen-tan defectos en la maduración de los linfocitos T y B, ademásde carecer de ganglios linfáticos, pero no muestran defectosen los progenitores hematopoyéticos de los osteoclastos, loque sugiere la importancia de RANKL en la regulación del de-sarrollo de las células inmunitarias y en la formación y la re-sorción del hueso (74, 75, 84). El RANKL producido por loslinfocitos T CD4+ activados también puede tener influenciaspatológicas sobre las manifestaciones destructivas del huesoen la artritis, tanto en seres humanos como en modelos ani-males (79, 149). Asimismo, los linfocitos T aislados del líquidosinovial en la artritis reumatoide expresaban RANKL y podíanmantener la diferenciación osteoclástica (58, 74). Resulta im-portante que, mientras los linfocitos Th1 producen de formaconstante mayores cantidades de RANKL que los Th2 (78), laexpresión de RANKL inducida por la señalización deTCR/CD28 fue suprimida ante la presencia de IL-4 (62), loque sugiere que RANKL puede ser expresado de forma másabundante por los linfocitos Th1 que por los Th2 (62). Ade-más, como la OPG impide la unión de RANKL a su receptorRANK expresado sobre los osteoclastos (2, 83), la diferencia-ción y la activación de los precursores osteoclásticos son re-guladas por el cociente molar RANKL:OPG en el microentornoque rodea dichas células precursoras (56). Se ha sugerido quela producción en exceso de RANKL por parte de los linfoci-tos T activados aumenta la concentración de RANKL solubleen el líquido sinovial y puede contribuir a la resorción oste-oclástica del hueso en los pacientes con artritis reumatoide(79). Estas líneas de evidencia sugieren con fuerza que elRANKL expresado por los linfocitos T participa de forma sig-

nificativa en las lesiones con pérdida patológica de hueso ha-lladas en los pacientes con artritis reumatoide.

Producción de RANKL por las célulasinmunitarias en la enfermedadperiodontal

Varios estudios han demostrado que no sólo los linfocitosT, sino también los B, expresan RANKL en el tejido gingivalhumano con enfermedad periodontal (27, 67, 86). Tambiénse ha demostrado que la proporción de ácido ribonucleicomensajero (ARNm) de RANKL es mayor en las células infla-matorias de pacientes con periodontitis avanzada, en com-paración con los pacientes con una enfermedad moderada ocon los individuos sanos, lo que sugiere una posible partici-pación de RANKL en la destrucción ósea, mediada por oste-oclastos, en la periodontitis (86). Utilizando una técnica deinmunofluorescencia, Crotti et al. (29) demostraron que enlos tejidos con periodontitis se expresaban cantidades signi-ficativamente superiores de la proteína RANKL, asociada alinfocitos y macrófagos. Nuestros estudios con inmunohisto-química de fluorescencia y microscopia confocal en pacien-tes con periodontitis crónica señalaban que se expresabaabundante RANKL en linfocitos T CD3+ y también en linfoci-tos B CD20+, pero sólo en pequeña o nula cantidad en los mo-nocitos CD14+ (67, 90, 91). Existían muy pocas células que ex-presaran RANKL en el tejido gingival sano (67, 90, 91). Másdel 50 % de los linfocitos T y el 90 % de los linfocitos B ex-presaban RANKL en los tejidos gingivales enfermos, mientrasque menos del 20 % de los linfocitos B o T lo hacían en teji-dos sanos. La concentración de RANKL, pero no la de su re-ceptor anzuelo osteoprotegerina, era significativamente ma-yor en los tejidos gingivales enfermos que en los sanos. Loslinfocitos aislados de tejidos gingivales de pacientes inducíanla diferenciación de células osteoclásticas maduras de formadependiente de RANKL in vitro (67). Otros estudios tambiénhan demostrado que los linfocitos T CD4+ constituían el sub-tipo predominante de células que infiltraban el tejido gingi-val en los pacientes con periodontitis crónica, y eran las prin-cipales células responsables de las concentraciones superioresde RANKL observadas en estos pacientes (138).

Enfermedad periodontal asociadacon los linfocitos T en animales

Hemos establecido un modelo de enfermedad periodon-tal en ratas que demuestra la pérdida de hueso alveolar comoresultado de la transferencia adoptiva de clones de linfocitosTh1 (G23) específicos frente a la proteína de la membrana ex-terna (OMP) de 29 kDa de A.actinomycetemcomitans (65, 134).Para la inducción de la pérdida de hueso periodontal, se re-quirió la exposición de la encía a la OMP de 29 KDa y al LPSde esta bacteria, además de la transferencia adoptiva de losclones de células citados (65, 134), lo que indica que la pér-dida ósea se relacionaba con la activación local de los clonesde linfocitos Th1. Utilizando este método, hemos obtenidodos hallazgos. En primer lugar, la resorción ósea inducida enlos tejidos periodontales depende tanto de RANKL como dela coestimulación por parte de B7/CD28 entre las células pre-sentadoras de antígenos y los Th1, además de la unión entre

Interferencia en la resorción ósea mediada por células inmunitarias en la enfermedad periodontal

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el complejo mayor de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) y TCR, para la activación de linfocitos T específicos de an-tígeno (65, 68, 134). En segundo lugar, la expresión de RANKLpor parte de los linfocitos T depende de la señalización delcanal de potasio Kv1.3 mediada por la inducción de la oste-oclastogénesis local. Teng et al. (126), empleando un modelode ratón, también han demostrado que el RANKL producidopor los linfocitos T CD4+ activados puede desencadenar unadestrucción localizada del hueso alveolar. En su modelo, seinducía la enfermedad periodontal en el ratón mediante eltransplante de linfocitos humanos de sangre periférica aisla-dos de pacientes con periodontitis en ratones NOD-SCID(126). La exposición oral de estos ratones a A. actinomyce-temcomitans activaba los linfocitos T CD4+ humanos trans-plantados en el periodonto, y daba lugar a una destrucciónlocal del hueso alveolar de forma dependiente de RANKL (126).La reducción de los linfocitos T CD4+ derivados del donanteen los ratones NOD-SCID disminuía la resorción ósea, mien-tras que la reducción de los linfocitos T CD8+ o de los linfo-citos B del donante no parecían alterar la pérdida de huesoen los ratones (126). Los linfocitos T humanos transferidos deforma adoptiva, existentes en las lesiones del tejido gingivalen este modelo, presentaban perfiles mixtos de expresión decitocinas, tanto de tipo Th1 como de tipo Th2 (124).

Participación de los linfocitos Ben la resorción de hueso periodontalen un modelo animal

Para determinar si los linfocitos B de las lesiones perio-dontales podían participar en la resorción ósea, hemos in-vestigado recientemente cómo puede verse influida la pér-dida de hueso periodontal por la transferencia adoptiva delinfocitos B específicos de antígeno en ratas con deficienciade linfocitos T (atímicas de forma congénita) (fig. 1). Los da-tos han demostrado que los linfocitos B expresan RANKL trasla estimulación con el antígeno análogo, y que dichos linfo-citos B, preactivados por su antígeno específico, pueden en-tonces contribuir al aumento de la resorción del hueso pe-riodontal ante la ausencia de linfocitos T (51, 53). Resulta muyimportante señalar que la administración de osteoprotege-rina Fc (OPG-Fc) al modelo de transferencia de linfocitos Bsuprimió la pérdida ósea periodontal, lo que indica que la re-sorción inducida por dicha transferencia dependía de RANKL(51, 53). Otros estudios han señalado el papel de los linfoci-tos B en la osteoclastogénesis mediada por RANKL, emple-ando un sistema de cultivo in vitro de linfocitos de ratón (27).Este último estudio ha demostrado que los linfocitos B acti-vados pueden expresar varios factores osteoclastogénicos,como RANKL, TNF-α e IL-6, además de favorecer la osteo-clastogénesis y la resorción ósea in vitro.

Considerados en conjunto, estos hallazgos han demostradoclaramente que la resorción ósea periodontal se asocia conun aumento en la expresión y la actividad de RANKL expre-sado por linfocitos T y B específicos de antígeno que infiltranlas lesiones resortivas del hueso. En función de estas líneasde evidencia, hemos llegado a la conclusión de que las célu-las inmunitarias activadas que producen RANKL constituyenuno de los principales tipos celulares efectores patógenos enla pérdida de hueso, y como tales, estimulan la resorción delhueso periodontal.

Posibles estrategias de intervenciónpara la resorción ósea periodontalmediada por linfocitos

Los nuevos tratamientos para la enfermedad periodontaldeben tener en cuenta la contribución fundamental de las cé-lulas inmunitarias en la resorción ósea. La mayor parte de lostratamientos actuales se basan en procedimientos mecánicos,como el raspado y alisado radicular y la cirugía, y no consi-deran las células inmunitarias. Sin embargo, en función de lacomprensión actual de las respuestas inmunitarias, es esen-cial revaluar las modalidades terapéuticas disponibles para de-sarrollar nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a la des-trucción del hueso periodontal mediada por las célulasinmunitarias. De este modo, nuestra propuesta es que la in-hibición de la producción de RANKL por células inmunitariasactivadas ofrecerá una serie de potentes abordajes terapéuti-cos para la pérdida ósea periodontal. Específicamente, los prin-cipales abordajes dirigidos hacia la producción de RANKL porparte de las células inmunitarias activadas son los siguientes:

1. Interferencia con las moléculas coestimuladoras necesa-rias para la producción de RANKL por parte de células in-munitarias activadas.

2. Control de las rutas de señalización que regulan la expre-sión de RANKL en las células inmunitarias.

3. Inhibición de la expresión de RANKL en linfocitos mediantemanipulación del equilibrio de citocinas.

Puesto que estos métodos se dirigen a los procesos bioló-gicos que se producen durante la transcripción y la traduc-ción del ARNm y la proteína de RANKL en las células inmu-nitarias activadas, directamente suprimirían su expresión en

Han et al.

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Fig. 1. La resorción del hueso alveolar inducida por linfocitos B es-pecíficos de antígeno puede ser inhibida por la osteoprotegerina Fc(OPG-Fc). Se administró en las papilas gingivales de ratas desnudasuna microinyección de Actinobacillua actinomycetemcomitans des-truido con formol durante los días 0, 2 y 4. En el día 0, también seadministró a cada grupo de ratas (n = 6 por grupo) una inyecciónen la vena de la cola de solución salina amortiguada con fosfato(PBS), o linfocitos B de donante (1 × 106 en 500 µl de PBS por ani-mal). Para algunos experimentos, se inyectó OPG-Fc humana, o unaproteína de fusión irrelevante, L6-Fc (L6), en las papilas gingivales(1 µg por sitio) durante los días 1, 3 y 5, tras la transferencia adop-tiva. Tras 10 días de dicha transferencia, se procesaron las cabezasde las ratas para medir la resorción del hueso periodontal. Media ±EE, *p < 0,05, prueba de la t de Student, en comparación con los lin-focitos B específicos de antígeno; LB: linfocitos B.

PBS LB noinmu-

nitarios

LB noespecíficos

deantígeno

LBespecíficos

deantígeno

LBespecíficos

deantígeno/

OPG

LBespecíficos

deantígeno/

L6

35

30

25

20

15

10

5

0

% r

eso

rció

n ó

sea

Tratamiento

dichas células. Sin embargo, otros abordajes terapéuticos in-directos podrían dar lugar a la remisión de la actividad deRANKL en aquellas células inmunitarias ya producidas, asícomo la supresión del posterior proceso de diferenciaciónmediada por RANKL en los precursores osteoclásticos. Entreestos otros abordajes, se incluyen:

4. Bloqueo fisiológico de la interacción RANKL-RANK.5. Desactivación de la enzima conversora de TNF-α que li-

bera RANKL soluble a partir del RANKL unido a la mem-brana que se expresa en los linfocitos activados.

6. Administración local de compuestos farmacéuticos, comolos bisfosfonatos, diseñados para interferir con la osteo-clastogénesis derivada de los linfocitos y mediada porRANKL.

Analizaremos a continuación el potencial de estos nuevosabordajes, haciendo referencia a ejemplos experimentales queseñalan la potencia y la utilidad de cada uno de ellos para in-terferir en la resorción ósea periodontal mediada por célulasinmunitarias y dependiente de RANKL.

1. Interferencia con moléculas coestimuladorasnecesarias para la producción de RANKL por partede células inmunitarias activadas

Interferencia con la resorción de hueso periodontalmediada por linfocitos T mediante el bloqueo de lainteracción B7/CD28 con la coestimulación inhibitoriamediante CTLA4-Ig (inmunoglobulina fusionadaal antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico)

La activación completa de los linfocitos T requiere dos se-ñales, una procedente del TCR y la otra de las moléculas coes-timuladoras (61). B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) pertenecen a lasuperfamilia de la inmunoglobulinas (44, 45). La expresión deB7-1 se encuentra en los linfocitos B y T activados, así comoen los macrófagos (45). B7-2 se expresa de forma constitutivaen las células dendríticas y en linfocitos B de memoria (44).Tanto B7-1 como B7-2 se pueden unir a los receptores, CD28y CTLA4 (antígeno 4 asociado al linfocito T citotóxico) (4, 115),los cuales son también miembros de la superfamilia de inmu-noglubulinas. CD28 se expresa en casi todos los linfocitos TCD4+ y en alrededor de la mitad de los linfocitos T CD8+ (115).Tras la unión de TCR a la molécula de MHC presentadora deantígeno, la conexión física entre B7 y CD28 proporciona unaseñal coestimuladora a los linfocitos T (4, 115), que regula laproliferación de linfocitos T y la producción de IL-2 (54).

En contraste con los efectos estimuladores de CD28, CTLA4actúa como un receptor coestimulador inhibidor que suprimela respuesta de los linfocitos T (4,115). En relación con la su-presión de estas células mediada por CTLA4, este antígenono se expresa de forma constitutiva en la superficie celular,sino que su expresión en superficie es activada rápidamentetras la unión a CD28 y la activación del linfocito T (5). Portanto, CTLA4 participa en el mecanismo contrarregulador paramodular a la baja un exceso de respuesta inmunitaria de loslinfocitos T. Se ha demostrado que CTLA4-Ig, una proteína defusión formada por CTLA4 humano y el fragmento Fc de laIgG humana, se comporta como un fuerte inhibidor de la res-puesta de linfocitos T específica de antígeno (85).

La expresión de RANKL puede activarse en los linfocitos Tpor medio de la estimulación de TCR y CD28 (147). Para acla-

rar el papel de la coestimulación mediante B7/CD28 en la re-gulación de la respuesta de linfocitos T en la enfermedad pe-riodontal, hemos desarrollado un sistema de transferencia ce-lular en ratas con clones de linfocitos Th1 o Th2 dependientesde la señalización de TCR/CD28 (65). La inyección gingival deun antígeno frente al linfocito T, la OMP de 29 KDa de A. acti-nomycetemcomitans, y el LPS indujo la resorción ósea local tras10 días de la transferencia de clones de linfocitos Th1 especí-ficos frente a la OMP de 29 KDa, pero no tras trasferir clonesde linfocitos Th2 (65). Resulta interesante señalar que se re-quirió la presencia de LPS no sólo para la inducción de la re-sorción ósea, sino también para la producción de IgG2a espe-cífica del antígeno, un indicador de una respuesta inmunitariacon predominio de Th1 en los roedores. La inyección de LPSdesencadenó la inducción de la expresión de B7-1 y B7-2 enlos macrófagos gingivales que, en cambio, sólo expresaban mo-léculas de MHC-II al inyectar únicamente el antígeno (65). Seobservó la expresión de moléculas B7 en el tejido gingival hastalos 3 días, lo que se corresponde con el período de retenciónde los linfocitos T específicos de antígeno en los tejidos gingi-vales. La administración local o sistémica de CTLA4-Ig pudobloquear la resorción ósea inducida por los clones de linfoci-tos Th1 (fig. 2). Recientemente, un estudio clínico en fase II deartritis reumatoide ha demostrado que el bloqueo de la inte-racción B7/CD28 con CTLA4-Ig era eficaz para paliar esta en-fermedad autoinmunitaria con un perfil de seguridad acepta-ble (40). Del mismo modo, CTLA4-Ig puede impedir el comienzode la encefalitis autoinmunitaria experimental en modelos deratas mediante la inhibición de la activación de los linfocitosde tipo Th1 específicos frente a la glucoproteína de la mielinade los oligodendrocitos (28, 104). Estos resultados sugieren quela inhibición de la ruta CD28/CTLA4/B7 puede suprimir la ac-tivación patológica de los linfocitos T. De este modo, la admi-nistración local de CTLA4-Ig puede ser eficaz para interferir enla resorción ósea inflamatoria mediada por las células inmu-nitarias en la enfermedad periodontal, en situaciones en lasque el RANKL expresado por los linfocitos T activados sea lacausa principal de la pérdida ósea periodontal.

Interferencia con la resorción del hueso periodontalmediada por linfocitos B mediante el bloqueo con elanticuerpo anti-CD40L de la interacción CD40/CD40L

CD40 es un miembro de la familia del receptor de TNF, y seexpresa en linfocitos B, macrófagos, células dendríticas, célu-las endoteliales y fibroblastos (137). Su ligando, CD40L, tam-bién denominado CD154, se expresa de forma casi exclusivaen linfocitos T activados, pero no en los vírgenes ni en ningúnotro tipo celular. La unión entre CD40 y CD40L desencadenaseñales bidireccionales tanto en las células presentadoras deantígeno como en los linfocitos T (105). Aún más crucial queesto es que la unión de CD40 con CD40L inicia la respuesta in-munitaria tanto humoral como celular, incluyendo la expre-sión de numerosas citocinas y quimiocinas, y el cambio de clasede inmunoglobulina desde IgM a IgG (50). CD40L se encuen-tra de forma casi exclusiva en los linfocitos T CD4+ activados,y su opuesto, CD40, se expresa de forma constitutiva en los lin-focitos B, células endoteliales, monocitos/macrófagos y otrascélulas (3, 11, 57). CD40 es miembro de la superfamilia del re-ceptor de TNF a la que también pertenece RANKL (3).

El interrogante que surge es si la coestimulación mediadapor CD40/CD40L puede inducir la expresión de RANKL por

Interferencia en la resorción ósea mediada por células inmunitarias en la enfermedad periodontal

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parte de los linfocitos B que expresan CD40. Para abordar estacuestión, hemos utilizado un modelo de enfermedad perio-dontal en ratas. La transferencia adoptiva del clon de célulasde tipo Th1 (G23) específico frente a la OMP de 29 KDa de A.actinomycetemcomitans que se realizó en ratas sometidas auna exposición gingival a la OMP de 29 KDa y al LPS indujouna resorción del hueso periodontal junto con el aumento enla producción de RANKL soluble y citocinas inflamatorias enlos tejidos gingivales. Resulta muy importante señalar que laadministración sistémica de un anticuerpo monoclonal anti-CD40L redujo la resorción ósea periodontal en las ratas so-metidas a la transferencia del clon celular Th1 y a las inyec-ciones de antígenos en encía (fig. 2). Además, la estimulaciónin vitro de linfocitos B de rata con CD40L activó de forma sig-nificativa la expresión de las formas soluble y unida a la mem-brana de RANKL (observaciones sin publicar). Estos datos su-gieren que los linfocitos B activados, a través de la interacciónCD40/CD40L, pueden participar en el aumento de la expre-sión de RANKL en la resorción ósea periodontal desencade-nada por células de tipo Th1. Un ejemplo que respalda estasuposición se encuentra en los modelos animales de artritisreumatoide (34), en los que el tratamiento con anticuerposanti-CD40L y monoclonales puede suprimir el desarrollo delesiones osteolíticas en las articulaciones con artritis.

Si bien estos modelos animales han puesto de manifiestoresultados prometedores, un abordaje terapéutico dirigido ha-cia el proceso coestimulador de CD40/CD40L en el curso dela activación linfocitaria plantea algunos problemas de efec-tos secundarios. El bloqueo de la molécula coestimuladorasCD40 o de su ligando CD40L (que se expresan en casi todoslos linfocitos T o B, respectivamente) puede interrumpir la res-puesta inmunitaria general frente a organismos patógenos exó-genos. Al respecto, dos estudios clínicos bien diseñados han

descrito la administración de un anticuerpo monoclonal frentea CD40L en pacientes con lupus eritematoso sistémico. La-mentablemente, uno de ellos se detuvo debido a complica-ciones vasculares inesperadas (21), y el segundo no pudo de-mostrar ningún beneficio clínico (63). Sin embargo, estosensayos clínicos se basaban en la administración sistémica delanticuerpo monoclonal anti-CD40L, pero no en su aplicaciónlocal. Por ello, aún queda por determinarse si las inyeccioneslocales en la encía de dicho anticuerpo podrían constituir unabordaje posible para intervenir en la resorción ósea perio-dontal. Nuestros estudios han señalado que la inyección localde CTLA-Ig era tan eficaz como la inyección sistémica (fig. 2).

2. Control de las rutas de señalización que regulanla expresión de RANKL en las células inmunitarias

En contraste con las rutas de transducción de señales biendefinidas en los precursores osteoclásticos durante la osteo-clastogénesis mediada por RANKL, se dispone de escasa in-formación para vislumbrar los procesos de transducción deseñales que regulan la expresión de RANKL en los osteoblas-tos o en las células del estroma de la médula ósea, en con-traposición su expresión en los linfocitos T y B. La regulaciónde la transcripción de RANKL en los linfocitos T activados pa-rece ser distinta a la de otras moléculas de la superfamilia delTNF. La expresión de RANKL por linfocitos T CD3 activadosfue estimulada por dexametasona, mientras que la expresiónde otras moléculas de la familia de TNF fue inhibida por esteglucocorticoide (143), lo que indica que una ruta exclusiva detransducción de señales regula la expresión de RANKL en loslinfocitos T. De este modo, el descubrimiento de las rutas deseñalización intracelular específicas de la expresión de RANKL

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Fig. 2. Efecto de CTLA4-Ig (inmunoglobulina fusionada al antígeno4 asociado al linfocito T citotóxico), del anticuerpo antiligando deCD40 (anti-CD40L) o de la osteoprotegerina Fc (OPG-Fc) sobre laresorción ósea periodontal asociada con la transferencia adoptivade clones de linfocitos T específicos de antígeno. Los animales a losque se administró un clon de linfocitos Th1 (G23) (107/animal, n =6 a n = 9) y se los sometió a una exposición gingival a la proteínade la membrana externa (OMP) de 29 KDa y al lipopolisacárido(LPS) (0,5 µg de cada uno/sitio) de Actinobacillus actinomycetem-comitans fueron sacrificados 10 días después de la transferencia de

los linfocitos Th1. Dichos animales fueron tratados con los si-guientes reactivos en la papila gingival derecha/izquierda medianteinyección local (1µg/sitio): CTLA4-Ig/L6, anticuerpo anti-CD40L/anticuerpo monoclonal de control, u OPG-Fc/L6-Fc. La adminis-tración sistémica de CTLA4-Ig o L6 (100 µg/rata) también se llevóa cabo por separado. Se llevaron a cabo los tratamientos un díaantes y un día después de la transferencia de los linfocitos Th1.Media ± DE, *p < 0,05; **p < 0,01; en comparación con los contro-les respectivos siguiendo la prueba de la t de Student. Ac: anti-cuerpo.

40

35

30

25

20

15

10

5

0

–5Inyección

Transferencia del clonde linfocitos T (G23)

–

–

L6 (local)

+

L6(sistémica)

+

CTLA4-Ig(local)

+

CTLA4-Ig(sistémica)

+

Ac mono-clonal

de control+

Ac anti-CD40L

+

L6 Fc

+

OPG Fc

+

en los linfocitos T inmunitarios puede conducir, posiblemente,a la identificación de nuevos puntos de intervención para eltratamiento de la periodontitis. La siguiente enumeraciónaporta ejemplos de unos pocos estudios que han descrito losprocesos de transducción de señales subyacentes a la expre-sión de RANKL en los linfocitos.

Ruta de Ca2+/calcineurina

Se sabe que los inmunosupresores ciclosporina A y FK506inhiben la ruta de Ca2+/calcineurina (107) y suprimen la ex-presión de RANKL por parte de los linfocitos T activados (143).Puesto que RANKL se expresa en los linfocitos T tras la esti-mulación de TCR (74, 128), y debido a que la activación de sutranscripción depende parcialmente de Ca2+ (74, 142), se es-pera que la inhibición de la señalización de Ca2+ en los linfo-citos T activados reduzca la expresión de RANKL y, como con-secuencia de ello, disminuya la resorción ósea inducida porlinfocitos T activados/de memoria. Acorde con esta idea, seha descrito que el inmunosupresor ciclosporina A (74, 142) re-duce la expresión de RANKL por los linfocitos T in vitro. Lasnuevas evidencias sugieren que la susceptibilidad de los lin-focitos T a la ciclosporina aumenta al bloquear las rutas de se-ñalización de la proteincinasa activada por mitógenos (MAPK)p38 y la cinasa N-terminal de c-Jun (JNK) en los linfocitos Tactivados (89). La ciclosporina A parece inhibir la pérdida dehueso periodontal en un modelo de periodontitis inducida porligadura en ratas, mientras que la ciclosporina A, por sí sola,origina sólo una ligera pérdida de hueso alveolar en las ratasde control (97). A pesar de la capacidad de la ciclosporina Ade reducir la resorción ósea mediada por RANKL que es de-sencadenada por los linfocitos T activados in vitro (74, 134,142), la administración sistémica in vivo conlleva serios efec-tos secundarios no deseados, como disfunción renal (140) ehipertensión (155), que claramente limitan el uso terapéuticode la ciclosporina A en la reducción de la resorción ósea. Sinembargo, la administración de ciclosporina A junto con el fac-tor de crecimiento transformante β (TGF-β) (49) o citrato (130)bloqueó los efectos perjudiciales del fármaco y aumentó elporcentaje de superficie en proceso de mineralización y la tasade formación de hueso. De este modo, la ciclosporina A, juntocon TGF-β o citrato, y en especial mediante administración lo-cal, aún puede ser prometedora para la reducción o la supre-sión de la resorción del hueso periodontal.

Ruta del canal de potasio (K+)

Dos canales de K+ participan en multitud de funciones encélulas existentes de forma común en lesiones inflamatorias.Varios trabajos han demostrado que los canales Kv1.3 e IKCa1desempeñan un papel crucial en la activación de los linfoci-tos T, así como en la inflamación y la progresión de las en-fermedades autoinmunitarias y otros trastornos inmunitarios(24, 139). En los pacientes con periodontitis crónica exami-nados parece estar activada la expresión de Kv1.3, mientrasque la expresión de IKCa1 no varía de forma significativa conrespecto a la verificada en los tejidos gingivales sanos (135).Hemos descrito que el receptor canal de potasio Kv1.3 de-sempeña un papel importante en la expresión de RANKL porlos linfocitos T (133, 134). El bloqueo de Kv1.3 con su inhibi-dor, kaliotoxina (veneno del escorpión), suprimía la expresiónde RANKL en linfocitos T activados (134). Resulta importante

señalar que la administración sistémica de kaliotoxina (blo-queante de Kv1.3) ha mostrado resultados prometedores enla reducción de la resorción experimental de hueso alveolar(cerca del 84 %) inducida por la transferencia adoptiva de cé-lulas específicas de antígeno realizada en ratas expuestas a lainyección gingival del antígeno específico (OMP de 29 KDa)y LPS (134). El bloqueo de la resorción ósea también se aso-ció con una disminución en el cociente de expresión de RANKLfrente a osteoprotegerina por parte de los linfocitos T de me-moria específicos de antígeno que infiltraban los tejidos gin-givales (134). Por el contrario, el clotrimazol (bloqueante deIKCa1) no influía en dicho cociente RANKL:OPG (P. Valverde,observaciones sin publicar), lo que indica que Kv1.3 desem-peña un papel más importante que IKCa1 en la regulación dela osteoclastogénesis dependiente de RANKL y en los proce-sos de resorción ósea resultantes.

Sin embargo, es importante tener en cuenta que es esen-cial evaluar los efectos secundarios de los bloqueantes deKv1.3 antes de su aplicación en inmunoterapia. Para ilustraresto, en un modelo de hipersensibilidad retardada con mini-cerdos, si bien la margatoxina (un bloqueante de Kv1.3) inhi-bió la inducción de dicho tipo de hipersensibilidad, los ani-males tratados con la margatoxina mostraron hipersalivacióno pérdida de apetito (77). En un estudio distinto empleandoel mismo modelo de minicerdos, el correolide (otro bloque-ante de Kv1.3) y sus derivados originaban una alteración in-testinal reversible y un pequeño grado de atrofia tímica al ad-ministrar dosis elevadas (76). De este modo, los bloqueantesde Kv1.3 e IKCa1 deberían ser evaluados con precaución, enmodelos animales apropiados, en cuanto a su perfil farma-cocinético, dosificación, toxicidad y selectividad.

Junto a los linfocitos T, también se ha descrito que Kv1.3 eIKCa1 desempeñan un papel en la activación de linfocitos B(22). Los linfocitos B de memoria tardía con cambio de clase(CD27+IgD–), que son una fuente importante de autoanti-cuerpos IgG patológicos en varias enfermedades autoinmu-nitarias (33, 99), expresan concentraciones muy elevadas deKv1.3 tanto en su estado quiescente como en su estado acti-vado (146). Puesto que tanto los linfocitos B como los linfo-citos T parecen ser las fuentes celulares de RANKL en laslesiones de periodontitis (67), aquellas estrategias bien dise-ñadas que manipulen Kv1.3 e IKCa1 aún constituyen abor-dajes terapéuticos prometedores para interferir en la pérdidade hueso periodontal mediada por células inmunitarias.

Ruta de TRAF6 (factor 6 asociado al receptor de TNF)

La transducción de señales a través del factor 6 asociadoal receptor de TNF (TRAF6) desempeña un papel central enla osteoclastogénesis mediada por RANKL (26, 145). Hemosexaminado la inhibición de la ruta de TRAF6 sobre la osteo-clastogénesis mediada por RANKL en células de ratónRAW264.7 similares a macrófagos. La reducción en el ARNmdel receptor de TNF y la expresión de la proteína se lograronmediante la utilización del ARN de interferencia, que es unmecanismo molecular recién descubierto que puede se puededirigir para silenciar genes concretos en tejidos de mamífe-ros (153). Las células multinucleares positivas para la prote-ína asociada con el receptor de TNF inducida por RANKL so-luble recombinante de ratón fueron inhibidas de formasignificativa por la adición de un pequeño ARN de interfe-rencia frente al receptor de TNF (alrededor de un 81 % de re-

Interferencia en la resorción ósea mediada por células inmunitarias en la enfermedad periodontal

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ducción) (66). Estudios posteriores han señalado que la esti-mulación con RANKL aumentaba la expresión de genes aso-ciados con la maduración de osteoclastos, como la metalo-proteinasa 9 de la matriz (MMP-9), la anhidrasa carbónica II,NFATc-1 y c-Myc, de forma dependiente del receptor de TNF,y que el tratamiento mediante ARN de interferencia frente adicho receptor inhibía la expresión de estos genes (datos nomostrados). De este modo, se sugiere que el receptor de TNFtambién participa en el mecanismo de señalización para lainducción de RANKL por las células inmunitarias. El ARN deinterferencia está actualmente en evaluación como posibleestrategia terapéutica frente a infecciones víricas, enferme-dades neurodegenerativas, enfermedades metabólicas y cán-ceres, aunque la administración in vivo de pequeños ARN deinterferencia en células u órganos diana sigue siendo un obs-táculo significativo (1, 30, 106). Tendrán que superarse los po-sibles inconvenientes técnicos antes de que la técnica puedaconsiderarse una terapia clínica prometedora para el trata-miento de estas enfermedades, incluida la periodontitis.

Ruta de receptores tipo Toll (TLR)

Los productos bacterianos (como el LPS y el ADN bacte-riano) liberados en el medio tisular periodontal pueden indu-cir una respuesta inmunitaria innata a través de la activaciónde receptores TLR específicos, los receptores de reconoci-miento de patrones que identifican componentes microbia-nos conservados para dar lugar a una respuesta inmunitariaprotectora (120). El LPS interacciona con TLR-4 y activa la rutade señalización dependiente de TLR-4 (18). Las secuencias deoligonucleótidos de citosina-guanosina (C-G) son motivos in-munoestimuladores presentes en el ADN bacteriano, que in-teractúan con TLR-9 para activar la ruta de señalización de-pendiente de TLR-9 (14). Se ha confirmado que LPS y el ADNbacteriano con C-G activan a los linfocitos B maduros a tra-vés de TLR-4 y TLR-9, lo que induce en consecuencia su pro-liferación y la secreción de inmunoglobulinas, respectivamente(55, 59). También se ha encontrado la expresión de TLR-4 yTLR-9 en subpoblaciones de linfocitos T reguladores que res-ponden directamente ante LPS y C-G, respectivamente, aun-que dichos hallazgos siguen siendo controvertidos (48, 72). He-mos explorado recientemente el efecto de la señalización deTLR-4 y TLR-9 sobre la producción de RANKL en una pobla-ción de esplenocitos, que contiene tanto linfocitos T como lin-focitos B. Los resultados han puesto de manifiesto que la pro-ducción de RANKL aumentaba tras el tratamiento aislado conC-G o LPS. Sin embargo, dicho aumento se reducía de formasignificativa después de que las células fueran tratadas de formasimultánea con C-G y LPS (52). Estos estudios sugieren que lacoactivación de las rutas de señalización de TLR-4 y TLR-9puede regular la producción de RANKL por las células inmu-nitarias, y puede ofrecer dianas moleculares valiosas para fi-nes terapéuticos. Se requieren más investigaciones para de-terminar los posibles efectos terapéuticos de dichacoactivación de las rutas de señalización de TLR-4 y TLR-9 so-bre la resorción del hueso periodontal.

3. Inhibición de la expresión de RANKL en linfocitosmediante manipulación del equilibrio de citocinas

IL-10 es una citocina inmunosupresora producida por di-versos tipos celulares, como macrófagos, monocitos, linfoci-

tos T y linfocitos B. Hemos descubierto que una población delinfocitos T recientemente identificada, los linfocitos T regu-ladores, parece suprimir la expresión de RANKL por parte delinfocitos T activados (41). Debido a su expresión diferenciadadel factor de transcripción FOXP3 (caja con cabeza bifurcadaP3) y CD25, así como por la secreción de citocinas inmuno-supresoras, como IL-10 y TGF-β, los linfocitos T reguladoreshan sido identificados como una nueva población de linfoci-tos T diferentes de los de tipo Th1 y Th2 (108). Resulta másimportante señalar que dichas células sólo actúan en la inhi-bición de las respuestas inmunitarias adaptativas de tipo Th1y Th2 (108). Hemos encontrado que el número de células re-guladoras con doble positividad para FOXP3 y CD25 se en-cuentra reducido en los tejidos periodontales enfermos, encomparación con los tejidos gingivales sanos (41). Se ha de-mostrado que la citocina asociada con el linfocito T regula-dor, IL-10, suprime la expresión de RANKL por parte de lin-focitos T humanos de sangre periférica activados in vitro. Elestudio también puso de manifiesto una correlación negativaentre IL-10 y la concentración de RANKL soluble en los ho-mogeneizados de tejido gingival (41). Estos resultados sugie-ren que IL-10 desempeña un papel en la función contrarre-guladora con respecto a la expresión excesiva de RANKL porparte de linfocitos T activados de la respuesta adaptativa. Estaidea fue respaldada por nuestra demostración previa de quela infección por P. gingivalis indujo una pérdida significativade hueso periodontal en ratones doblemente negativos paraIL-10, mientras que no se produjo pérdida ósea en los ani-males sin manipulación genética infectados de forma com-parable con la misma bacteria, o en ratones doblemente ne-gativos para IL-10 pero no infectados (110, 111), De este modo,la manipulación de IL-10 puede conducir al desarrollo de unabordaje terapéutico viable de la resorción ósea periodontalproducida por células inmunitarias y mediada por RANKL.

La citocina proinflamatoria IL-1α es clave en la resorción óseainducida por una infección (141). Los hallazgos previos hanpuesto de manifiesto que las concentraciones de IL-1α en el te-jido periapical aumentaban hasta ocho veces ante una infec-ción en ratones manipulados genéticamente IL-10–/– (110). Aúnno se ha aclarado si en la resorción ósea periapical mediada porIL-1α participa RANKL. Sin embargo, estos resultados sugierenque IL-10 es un supresor endógeno importante de la resorciónósea estimulada por la infección in vivo, con mucha probabili-dad a través de la inhibición de la expresión de IL-1α.

También se ha sugerido que la resorción ósea inducida porcitocinas proinflamatorias, incluidas TNF-α, IL-1α o IL-6, quese asocia con un aumento de osteoprotegerina y una reduc-ción de RANKL y RANK en una ruta dependiente del trans-ductor de señales y activador de la transcripción 6 (STAT-6)(102) puede ser inhibida por IL-4 e IL-13. El aumento en laexpresión local de IL-4 (144) en ratas y de IL-13 en seres hu-manos (96) por medio de terapia génica ha puesto de mani-fiesto una reducción en las concentraciones de citocinas proin-flamatorias y de la destrucción ósea en la artritis porinmunocomplejos. Si bien se ha demostrado que la resorciónósea inducida por IL-1α o IL-6 depende de RANKL, TNF-αparece inducir la diferenciación de osteoclastos de forma tantodependiente como independiente de RANKL (82). Se ha vin-culado la IL-6 secretada por linfocitos T CD4+ con el aumentoen la resorción ósea periodontal in vivo (7), aunque su acciónes predominantemente antiinflamatoria en un modelo de pér-dida ósea periapical (10). De este modo, la alteración en la

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síntesis, la secreción o la actividad de las citocinas proinfla-matorias parece modular la resorción ósea por mecanismosdependientes e independientes de RANKL, si bien sigue sinaclararse la participación de esta molécula derivada de los lin-focitos en dichos mecanismos.

Existen algunas evidencias de que IFN-γ producido por loslinfocitos T CD4+ contribuye a la destrucción ósea estimuladapor una infección, tanto en un modelo de enfermedad perio-dontal en ratón como en pacientes humanos (7, 46). Algunosestudios también han demostrado que IL-7 activa la expresiónde RANKL por los linfocitos T, lo que permite suponer que és-tos son mediadores esenciales de la pérdida ósea inducida porIL-7 in vivo (129). Además, los linfocitos T pueden regular deforma indirecta la osteoclastogénesis por medio de la IL-17.Como explicación de ello, IL-17 actúa en primer lugar sobrelas células osteoblásticas, estimula la síntesis de prostaglan-dina E2 (PGE2) dependiente de la ciclooxigenasa 2 (COX-2),luego induce la expresión del gen RANKL que, a su vez, inducela diferenciación de progenitores osteoclásticos hacia osteo-clastos maduros (80). Existen estudios que demuestran queIL-17 es producida en las lesiones periodontales de forma ex-clusiva por linfocitos T activados y que esta citocina puede in-ducir respuestas inflamatorias y estimular la resorción osteo-clástica del hueso en combinación con RANK y RANKL (118).

En resumen, estas líneas de evidencia sugieren que la mo-dulación local del perfil de citocinas proporciona una oportu-nidad para inhibir la pérdida ósea y, de este modo, puede serbeneficiosa para reducir la resorción del hueso periodontal.Esto puede lograrse por medio de la expresión local de citoci-nas inmunosupresoras, como IL-10, IL-4 o IL-13, o por inyec-ción local de inhibidores que reduzcan la secreción de citoci-nas resortivas del hueso, como TNF-α, IL-1α, IL-6 o IL-17.

4. Bloqueo de la actividad de RANKL en laosteoclastogénesis: osteoprotegerina Fc yanticuerpo anti-RANKL

Osteoprotegerina Fc

En un modelo de enfermedad periodontal en ratas basadoen la transferencia adoptiva y exposición a antígeno, hemosdemostrado que la resorción ósea se relaciona con los osteo-clastos y depende de RANKL (65). Un hallazgo fundamentalen nuestro modelo en rata ha sido el descubrimiento de quedicha resorción podía ser bloqueada por una proteína de fu-sión con osteoprotegerina (OPG-Fc) (122). OPG-Fc es una pro-teína quimérica constituida por OPG y la porción Fc de la IgGhumana. Si bien retiene la actividad neutralizante de la OPG,la porción Fc fusionada a la proteína aporta ventajas adicio-nales que facilitan la purificación de la proteína en el procesode fabricación y aumentan la estabilidad de la proteína invivo. El equilibrio entre OPG y RANKL es un determinanteclave en el metabolismo óseo. En estudios recientes, la in-yección diaria de OPG en ratones normales aumentaba deforma significativa la densidad mineral del hueso y el volu-men óseo (13). En un modelo de enfermedad periodontal enratas empleando la transferencia adoptiva de linfocitos T, laadministración sistémica de OPG-Fc reducía de forma signi-ficativa la pérdida de hueso alveolar en alrededor del 90 % (p< 0,05), en comparación con el grupo de control al que se in-yectaba la proteína de control L6-Fc (una proteína de fusióndel péptido irrelevante L6 y el fragmento Fc humano) (122).

También hemos demostrado que OPG-Fc era un potenteinhibidor de la resorción de hueso periodontal mediada porlinfocitos B. Las ratas receptoras de linfocitos B específicos deantígeno mostraron un aumento en la formación de osteo-clastos sobre la superficie del hueso alveolar, lo que puso demanifiesto una resorción significativa del hueso periodontalque fue antagonizada por la inyección local de OPG-Fc en lostejidos gingivales (fig. 2) (51). Otros modelos de enfermedadperiodontal en roedores también han demostrado que la re-sorción ósea puede inhibirse con la administración de OPG-Fc (126, 128). Estos resultados derivados de experimentos enanimales señalan el potencial terapéutico de OPG-Fc en la in-terferencia de la resorción del hueso periodontal derivada delos linfocitos T y B, y mediada por RANKL.

Sin embargo, pueden formarse auténticos anticuerpos anti-OPG por la administración de OPG-Fc, lo que da lugar a unposible riesgo no deseado para los pacientes. Es decir, el an-ticuerpo anti-OPG puede reaccionar de forma cruzada con laOPG endógena y, como consecuencia de ello, puede neutra-lizar su actividad. Ensayos clínicos recientes con esta pro-teína de fusión OPG-Fc para el tratamiento del mieloma múl-tiple han sido interrumpidos debido al desarrollo de anti-cuerpos frente a la OPG endógena de los pacientes (70). Ade-más, los análisis multifactoriales han demostrado que la OPGmantenía una fuerte asociación con índices elevados de cal-cificación de las arterias coronarias tras realizar el ajuste poredad, sexo, y otros factores de riesgo (p < 0,01) (6).

Anticuerpo anti-RANKL

Estudios más recientes han ampliado esta estrategia gene-ral de bloqueo inmunológico de la interacción RANKL-RANKempleando un anticuerpo monoclonal en investigación (de-nosumab), que inhibe el ligando de NF-κB y, de este modo,neutraliza a RANKL. Los datos señalan que, en comparacióncon OPG-Fc, dicho anticuerpo presenta mejores propiedades:es más potente, en dosis menores muestra un menor descensoen los marcadores de recambio óseo, y en dosis equivalentesla duración de la respuesta antiresortiva es significativamentemás prolongada (16). Se ha demostrado que denosumab au-menta de forma eficaz la densidad mineral del hueso en mu-jeres posmenopáusicas y reduce la resorción ósea (92, 93). Nose han observado evidencias de anticuerpos anti-anti-RANKLen estos estudios. Puesto que el anticuerpo no se parece es-tructuralmente a la OPG, la OPG endógena seguiría intacta,incluso aunque se formaran anti-anticuerpos derivados de larespuesta inmunitaria del paciente. Es factible que, si se ad-ministra de forma juiciosa por vía local, dicho anticuerpo sealo suficientemente eficaz para manejar la resorción ósea alve-olar en la periodontitis, sin mostrar efectos secundarios.

5. Desactivación de la enzima conversorade TNF-αα (TACE) que libera RANKL soluble

El desprendimiento de dominios externos es un procesobiológico importante en la regulación de la función de las mo-léculas superficiales unidas a la membrana (31). Ciertas pro-teínas de membrana pueden ser escindidas en su dominioexterno y liberarse de la superficie celular. Posteriormente, laproteína soluble se difunde y activa el receptor diana expre-sado en otras células existentes a distancia. Por el contrario,

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las proteínas de membrana sólo pueden activar el receptorexpresado en las células vecinas.

La enzima conversora de TNF-α (TACE), también deno-minada ADAM-17, desempeña un papel central en el des-prendimiento de dominios externos (87). La liberación delRANKL unido a la membrana puede ser revertida parcial-mente por un inhibidor de TACE (15). Otras MMP, como MMP-1, MMP-3, MMP-7, MMP-14 y ADAM-19, también pueden es-cindir RANKL, pero todas ellas parecen proporcionar menospotencia para el desprendimiento que TACE (25, 88, 112). Eldesprendimiento de RANKL soluble es un componente im-portante de la función de RANKL sobre la homeostasis óseae inmunitaria (87). Existen multitud de evidencias que indi-can que RANKL soluble es la forma más eficaz de RANKL queinterviene en la diferenciación de osteoclastos (88, 95). Losanimales transgénicos que expresan una versión soluble deRANKL muestran una osteoporosis amplia (95). Los ratonescon deficiencia de MMP-7, los cuales no pueden escindir elRANKL soluble a partir de su forma anclada a la membrana,mostraban una reducción del 66 % en la destrucción ósea(también muchos menos osteoclastos) en comparación conlos controles sin manipular genéticamente (88). De este modo,la solubilización de RANKL representa una posible diana parala intervención sobre el proceso de resorción ósea (88).

Con respecto a la destrucción del hueso periodontal, se dis-pone de escasa información que documente el papel de lasenzimas en la escisión de RANKL soluble a partir del RANKLanclado a la membrana presente en los linfocitos. Presumi-blemente, las intervenciones dirigidas hacia la actividad deTACE puedan interferir en la liberación de RANKL y conduz-can a una reducción en la resorción del hueso periodontal.Hemos examinado si el bloqueo de la actividad de TACE, uti-lizando un anticuerpo anti-TACE, puede suprimir la libera-ción de RANKL por linfocitos B y T estimulados in vitro. Sibien se encontraron cambios significativos en el RANKL an-clado a la membrana en los linfocitos T y B tras el tratamientocon el anticuerpo anti-TACE, el bloqueo de la enzima produ-cido por éste dio lugar a una disminución drástica en los va-lores de RANKL soluble derivado de linfocitos T (23,3%) y B(24,4%) estimulados (T. Kawai, observaciones sin publicar).Resulta muy importante señalar que la administración localde un inhibidor de TACE (p. ej., galardina) suprimía de formasignificativa la resorción del hueso periodontal mediada porlinfocitos T en el modelo de enfermedad periodontal en ra-tas basado en la transferencia adoptiva de linfocitos T y ex-posición a antígeno (T. Kawai, observaciones sin publicar).Por lo tanto, el bloqueo inmunológico de la actividad de TACE,ya sea por anticuerpos frente a TACE o por un inhibidor deésta, podría constituir un posible tratamiento para reducir laresorción del hueso periodontal mediada por las células in-munitarias.

Además de su capacidad para liberar RANKL soluble, TACEpuede escindir proteínas de la superfamilia de TNF-α (20). Deeste modo, el abordaje terapéutico dirigido hacia TACE nosólo puede ofrecer la inhibición de la pérdida del hueso pe-riodontal, sino también la supresión de respuestas inflama-torias que estén mediadas por citocinas proinflamatorias,como TNF-α. Apoyando a esta hipótesis, se señala que el blo-queo de TNF-α en un modelo de cicatrización de heridas pos-quirúrgicas en primates no humanos estimulaba de formasignificativa la cicatrización periodontal tras una administra-ción a corto plazo (154).

6. Aplicación de compuestos farmacéuticos:potencia y efectos secundarios de los bisfosfonatos

Los bisfosfonatos son análogos de un compuesto naturaldenominado pirofosfato. Los bisfosfonatos han sido emplea-dos con éxito para tratar la osteoporosis, la enfermedad dePaget, las enfermedades óseas metastásicas y osteolíticas, in-cluida la enfermedad de Gorham –en la que las lesiones man-dibulares se asemejan a la enfermedad periodontal (60, 136)–y la pérdida ósea inducida por cáncer (hipercalcemia en lasmalignidades) (23). Los bisfosfonatos pueden fijarse a crista-les que contienen calcio en el hueso, y actuar sobre el meta-bolismo óseo mediante la unión a la enzima farnesil-difos-fato-sintasa y el bloqueo de esta enzima, de la ruta de lahidroximetilglutaril-coenzima A reductasa (103). El meca-nismo biológico que subyace a la supresión de la pérdida óseamediada por los bisfosfonatos deriva de su inhibición de laproliferación y la diferenciación de los osteoclastos (113) y lainducción de apoptosis en los osteoclastos maduros (60, 103).Estos fármacos no sólo reaccionan con los osteoclastos, sinotambién con los osteoblastos, con el fin de reducir su expre-sión de RANKL (113). El tratamiento de osteoblastos huma-nos con bisfosfonatos da lugar a una reducción en la expre-sión de la proteína RANKL que se asocia con el aumento deexpresión de TACE en los osteoblastos (113).

La exploración actual de las dianas y mecanismos de ac-ción de los bisfosfonatos ha revelado que estos fármacos pro-ducen diversos efectos, además de los originariamente des-critos sobre los osteoclastos (32). Estudios recientes handemostrado que los bisfosfonatos inhibían la expresión deRANKL inducida por glucocorticoides no sólo en los osteo-blastos, sino también en los linfocitos T, lo que sugiere queestos efectos podrían tener potencial terapéutico en la resor-ción ósea mediada por linfocitos (71). Sin embargo, un cre-ciente número de casos constata los efectos secundarios ad-versos tras el tratamiento con bisfosfonatos a largo plazo, quese manifiestan como osteonecrosis de los maxilares, espe-cialmente en aquellos pacientes que recibieron altas dosis deestos fármacos por vía intravenosa (43). Se ha implicado a lainsuficiencia vascular localizada del hueso en la patogenia deeste proceso osteonecrótico, lo que origina una microlesiónque conduce a una pérdida de cierta cantidad de masa ósea,o incluso da lugar a fracturas (109). Para reducir dichos efec-tos secundarios de los bisfosfonatos, se han hecho intentosde potenciar su biodisponibilidad utilizando otras rutas deadministración distintas a la intravenosa, como la vía nasal,las inyecciones por vía subcutánea e intramuscular, los im-plantes y los sistemas osteotrópicos de liberación dirigida (42).

No obstante, las bisfosfonatos aún pueden constituir unaopción terapéutica prometedora para la pérdida ósea perio-dontal, siempre que dichos fármacos se administren local-mente sin afectar a los sistemas microvasculares existentesen el hueso alveolar.

Resumen

Tanto los estudios de la enfermedad periodontal en sereshumanos como en animales de experimentación respaldan lahipótesis de que la periodontitis es desencadenada por la res-puesta inmunitaria del hospedador ante una constelación deagentes infecciosos asociados a la biopelícula periodontal. En

Han et al.

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especial, los linfocitos T y B presentes en las lesiones infla-matorias desempeñan un papel crucial en la estimulación dela resorción ósea periodontal a través de mecanismos depen-dientes e independientes de RANKL. Resulta muy importanteseñalar que los linfocitos, en especial los diferentes subtiposde linfocitos T, parecen participar en la activación o la inhibi-ción de la resorción ósea periodontal mediada por RANKL. Porejemplo, los linfocitos Th1 estimulan la pérdida de hueso, mien-tras que los linfocitos T reguladores suprimen dicha pérdidamediada por los Th1. A medida que se conoce de forma gra-dual el papel crucial de la respuesta inmunitaria del hospe-dador en la progresión de la enfermedad periodontal, se es-tán haciendo esfuerzos para evaluar estrategias dirigidas ainterferir los efectos perjudiciales de la activación de linfoci-tos T y B, con el fin de aminorar la resorción ósea periodon-tal. Proponemos que la inhibición de la producción de RANKLpor parte de las células inmunitarias activadas constituirá unpotente abordaje terapéutico para reducir dicha resorción (fig.3). Entre los abordajes dirigidos hacia la producción de RANKLpor estas células se encuentran: a) interferencia con molécu-las coestimuladoras necesarias para la producción de RANKLpor las células inmunitarias activadas (p. ej., B7/CD28, CD40/li-gando de CD40); b) control de las rutas de señalización queregulan la expresión de RANKL en las células inmunitarias (p.ej., ruta de Ca2+/calcineurina, ruta del canal de K+, ruta deTRAF6, ruta de los TLR), y c) inhibición de la expresión deRANKL en los linfocitos mediante la manipulación del equili-brio de citocinas (p. ej., IL-10, IL-4, IL-13). Además de los abor-dajes descritos, que suprimen directamente la expresión deRANKL por las células inmunitarias, la remisión de la activi-dad del RANKL ya expresado y la supresión de los procesos dediferenciación mediados por RANKL en los precursores oste-oclásticos también proporcionan regímenes terapéuticos via-

bles, entre los que se pueden incluir: d) el bloqueo fisiológicode la interacción RANKL/RANK (p. ej., osteoprotegerina Fc oanticuerpo anti-RANKL); e) desactivación de la enzima con-versora de TNF-α que libera RANKL soluble a partir del RANKLunido a la membrana y que se expresa en los linfocitos acti-vados (p. ej., inhibidores de la enzima conversora de TNF-α,tales como galardina), y f) administración local de compues-tos farmacéuticos que interfieren en la osteoclastogénesis de-rivada de los linfocitos y mediada por RANKL (p. ej., los bis-fosfonatos). Para reducir al máximo los posibles efectossecundarios, recomendaríamos el desarrollo de metodologíasde administración local, gingival, para estos regímenes. En laactualidad, se encuentran bajo una investigación intensa porparte de investigadores de nuestro laboratorio y de otros lasdiversas pautas orientadas a inhibir la expresión de RANKLpor linfocitos T y B activados, así como la posterior reducciónde la resorción ósea periodontal dependiente de RANKL. Estalínea de investigación también puede ayudar a desarrollarabordajes terapéuticos frente a la progresión de otros trastor-nos resortivos del hueso mediados por células inmunitarias.

Agradecimientos

Nuestro trabajo y esta revisión han sido financiados por lassubvenciones de los National Institutes of Health DE-03420,DE-14551, y DE-15722, del National Institute of Dental andCraneofacial Research (NIDCR).

Periodontology 2000, Vol. 45, 2007, 76-94

Bibliografía disponible en la versión electrónicade la revista: www.ArsXXI.com/PERIO

Interferencia en la resorción ósea mediada por células inmunitarias en la enfermedad periodontal

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Fig. 3. Resumen de los posibles abordajes para interferir la resor-ción de hueso periodontal dependiente del ligando del receptor ac-tivador del factor nuclear κB (RANKL). APC: célula presentadora deantígenos; CD40L: ligando de CD40; CRAC: canales de Ca2+ activa-dos por la liberación de Ca2+; IL-10: interleucina 10; mRANKL:

RANKL unido a la membrana; NFAT: factor nuclear de los linfoci-tos T activados; OPG: osteoprotegerina; RANK: receptor activadorde NF-κB; RANKL: ligando de RANK; sRANKL: RANKL soluble;TACE:enzima conversora del TNF-α; TRAF6: factor 6 asociado al recep-tor del TNF.

CTLA-4 Ig

Anticuerpo anti-CD40L

Ciclosporina A

Kaliotoxina

Inhibición de TRAF6

IL-10

IL-4 o IL-13

OPG o anticupero frente a RANKL

Anticuerpo/inhibidor de TACE

Bifosfonatos

CD40L

Cambio de clase

Sinestimulación

CD28

B7mRANKL

sRANKL

RANKL

TACE

TRAF6

NFAT [ca2+] [K+]

CRAC

Kv 1.3

Regulación superiorRANKL

PRECURSOROSTEOCLÁSTICO

Maduración yresorción ósea

LINFOCITO T/B

APC

Interferencia en la resorción óseamediada por células inmunitariasen la enfermedad periodontal

Xiaozhe Han, Toshihisa Kawai & MartinA. Taubman

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