www.medfak.ni.ac.rs/amm 35

Originalni rad UDK: 616.314-089.8:615.46 doi:10.5633/amm.2011.0406s

INTERAKCIJA BIOMATERIJALA NA BAZI KALCIJUM HIDROKSIAPATITA /POLI-L-LAKTIDA I SIMULIRANE TELESNE TEČNOSTI

Marija Vukelić1, Žarko Mitić2, Miroslav Miljković3, Jelena Živković1, Nenad Ignjatović4,

Dragan Uskoković4, Perica Vasiljević5, Marija Petković1, Jelena Živanov-Čurlis1

i Stevo Najman1 Svrha biomaterijala je da zamene deo ili funkciju dela tela na siguran, fiziološki i

ekonomski prihvatljiv način. Rekonstrukcija koštanih defekata oduvek je predstavljala veliki problem ortopedije i maksilofacijalne hirurgije. Otkrićem hidroksiapatita (Hap) kao sastavnog i najzastupljenijeg dela kostiju sisara omogućen je razvoj fosfatnih keramika kao potencijalnog materijala za implantaciju. U ovom radu ispitivano je da li i na koji način biomaterijal kalcijum hidroksiapatit/poli-L-laktid (HAp/PLLA) interaguje sa jonskim sastavom ljudske plazme. Simulirana telesna tečnost (SBF) je veštački napravljena tečnost jonskog sastava i jonske koncentracije bliske ljudskoj plazmi. HAp/PLLA je inkubiran 1, 2, 3 i 5 nedelja u SBF-u. Površina tretiranog i netretiranog materijala ispitivana je skening elektronskom mikroskopijom (SEM) i EDS analizom (Energy dispersive X-ray spectroscopy), dok je SBF u kome je materijal inkubiran podvrgnut merenju električne provodljivosti i pH vrednosti.

Dobijeni rezultati pokazuju da u SBF-u degradacija materijala HAp/PLLA kreće od površine materijala i da je uzrokovana rastvaranjem njegove polimerne komponente i precipitacije materijala sličnog hidroksiapatitu na njegovoj površini. Ovaj materijal pokazuje karakteristike koje ga svrstavaju u kandidate za primenu u ortopediji i maksilofacijalnoj hirurgiji. Acta Medica Medianae 2011;50(4):35-39.

Ključne reči: biomaterijali, HAp/PLLA, SBF, SEM, EDS

Institut za biologiju i humanu genetiku, Medicinski fakultet, Niš, Srbija1 Odsek za farmaciju, Medicinski fakultet, Niš, Srbija2 Laboratorija za Elektronsku mikroskopiju, Medicinski fakultet, Niš, Srbija3 Institut tehničkih nauka SANU, Beograd, Srbija4 Odsek biologija i ekologija, Prirodno-matematički fakultet, Niš, Srbija5

Kontakt: Marija Vukelić Medicinski fakultet, Bul. dr Zorana Đinđića 81 18000 Niš, Srbija E-mail: marijavukelic@medfak.ni.ac.rs

Uvod

Svrha biomaterijala je da zamene deo ili funkciju dela tela na siguran, fiziološki i ekonomski prihvatljiv način (1). Rekonstrukcija koštanih defe-kata je oduvek predstavljala veliki problem orto-pedije i maksilofacijalne hirurgije. Otkrićem HAp kao sastavnog i najzastupljenijeg dela kostiju sisara omogućen je razvoj fosfatne keramike kao poten-cijalnog materijala za implantaciju. Eksperimentalna i klinička istraživanja su pokazala da se granule i prah HAp mogu uspešno primeniti za rekonstrukciju koštanih defekata (2,3). Poli-L-laktid (PLLA), polimer dobijen sintetskim putem, nudi svojstva koja ga čine zanimljivim za kombinovanje sa HAp (4,5), jer vlakna PLLA mogu ojačati HAp koji je sam po sebi veoma krt, jer prirodnoj kosti elastičnost i otpornost na istezanje obezbeđuju kolagena vlakna.

Variranjem parametara sinteze dobija se PLLA različite molekulske mase, od čega direktno zavise mehaničke ali i fizičko-hemijske karakteristike ovakvog kompozitnog biomaterijala (6,7,8). Procena biokompatibilnosti uključuje sagledavanje efekta fiziološke okoline na materijal i efekat materijala na okolinu. Simulirana telesna tečnost (SBF) je veštački dobijena tečnost koja ima sastav i koncentraciju neorganskih jona skoro identičan ljudskoj plazmi (9). Testiranje biomaterijala u jednom ovakvom okruženju, koji omogućava uvid u promene na materijalu koje izaziva jonski sastav plazme, predstavlja jednostavan i lak metod testiranja stabilnosti materijala u organizmu. Cilj istraživanja U ovom radu ispitivana je interakcija između biomaterijala kalcijum hidroksapatita/poli-L-laktida (HAp/PLLA) i simulirane telesne tečnosti (SBF), a sve u cilju šireg istraživanja da li i u kojoj meri jonski sastav ljudske plazme dovodi do promena na navedenom materijalu.

Materijal i metode

Biomaterijal: Prah kompozitnog biomaterijala

HAp/PLLA sintetisan je prema proceduri koja je detaljno prikazana u radu Ignjatović i sar.(10).

Interakcija biomaterijala na bazi kalcijum hidroksiapatita /poli-L-laktida... Marija Vukelić i sar.

Polimerna komponenta kompozitnog materijala predstavljena je poli-L-laktidom molekulske mase 430000 g/mol.

U radu su korišćene cevčice dužine 10mm, a širine 1mm napravljene mešanjem praha HAp/PLLA sa hloroformom i propuštanjem kroz biopsijsku iglu. Neposredno pre početka ekspe-rimenta sterilisane su potapanjem u 70% etanola u vremenskom intervalu od 1 h. Po jedna cevčica potopljena je u 10 cm3 SBF-a i inkubirana 1, 2, 3 i 5 nedelja na 37 °C.

Simulirana telesna tečnost (SBF): Simulirana telesna tečnost pripremljena je po Kokubo protokolu (11), rastvaranjem sledećih supstanci u destilovanoj i dejonizovanoj vodi (500 cm3): NaCl (4,0175 g), NaHCO3 (0,1775 g), KCl (0,1125 g), K2HPO4 (0,1155 g), MgCl2 × 6 H2O (0,1555 g), 1 mol/dm HCl (19,5 cm3), CaCl2 × 2 H2O (0,19339 g), Na2SO4 × 10H2O (0,0816 g) i Tris (3,059 g) pH rastvora podešen je na 7,40 dodavanjem rastvora hloridne kiseline koncentracije 1 mol/dm3.

Fizičkohemijska ispitivanja: SBF u kojem su uzorci inkubirani podvrgnut je merenju pH vrednosti i merenju električne provodljivosti. pH vrednost SBF-a merena je na 37 °C pH metrom Metrohm 827 pH lab. Električna provodljivost SBF-a merena je na konduktometru Hanna EC-215 Conductivity Meter na 37 °C.

SEM i EDS: Morfološke promene materijala ispitivane su skening elektronskim mikroskopom (SEM) JEOL 5300, dok su kvalitativne promene materijala ispitivane SEM-EDS analizom. Pre mikroskopiranja, uzorci su osušeni na vazduhu i presvučeni zlatom u jonskom naparavaču.

Rezultati i diskusija

Inicijalna pH vrednost SBF-a neposredno

nakon dodavanja materijala iznosila je 7,4. Posle nedelju dana inkubacije HAp/PLLA u SBF-u, uočava se pad pH vrednosti na 6,62. Inkubacijom u rastvoru tokom narednih nedelja pH vrednost rastvora održava se slabo kiselom i osciluje oko vrednosti izmerene posle prve nedelje (Grafikon 1).

Poli-L-laktid spontano hidrolizuje u vodenim rastvorima i pri njegovoj hidrolizi se oslobađa mlečna kiselina. Kako je SBF vodeni rastvor, inkubacijom je očekivana promena pH vrednosti SBF-a iz slabo bazne u slabo kiselu sredinu (12).

Električna provodljivost rastvora direktno je proporcionalna koncentraciji elektrolita i relativnoj pokretljivosti prisutnih jona. Pad električne provodljivosti samog SBF-a sa 17,4mS/cm na 11,89mS/cm posle nedelju dana inkubacije ukazuje na formiranje slaborastvo-renih jedinjenja i njihovo eventualno taloženje na površini materijala. Kako su daljim tokom inku-bacije zabeležene vrednosti električne provodljivosti pokazale sličan trend kao i vrednosti pH-metrijskih merenja, odnosno oscilaciju oko vrednosti zabeleženih na kraju prve nedelje (Grafikon 2), dobijeni rezultati ukazuju na to da je prvih nedelju dana inkubacije kritično za

formiranje slaborastvorljivih precipitata, a da kasnije postoji ustaljena dinamika razmene jona između materijala i SBF-a.

SEM analiza netretiranog materijala otkriva cevčice relativno glatke površine. Nema vidljivih pukotina niti erozija, što može ukazati na kompaktnost strukture. Na površini tretiranog materijala uočena su plitka i široka polja erozije nepravilnog oblika i površine, čije dno je pokriveno jasno vidljivim zrnima HAp, ali i uske pukotine koje zadiru u dubinu materijala. Broj, veličina i dubina erozija i pukotina raste sa dužinom stajanja u SBF-u, što jasno ukazuje na to da u SBF-u degradacija počinje od površine materijala i da je degradacija posledica hemijske interakcije između komponenti SBF-a i sastojaka cevčica (Slika 1, Slika 2, Slika 3).

Grafikon 1. Zavisnost pH u funkciji vremena

Grafikon 2. Zavisnost električne provodljivosti u funkciji

vremena

Grafikon 3. Ca/P odnos u funkciji vremena

36

Acta Medica Medianae 2011, Vol.50(4) Interakcija biomaterijala na bazi kalcijum hidroksiapatita /poli-L-laktida...

Odnos Ca/P netretiranog HAp/PLLA dobijen SEM-EDS analizom iznosio je 1.53. Izračunavanjem srednje vrednosti odnosa Ca/P za svaki uzorak, uočava se blagi trend porasta odnosa Ca/P u toku inkubacije sa SBF-om (Grafikon 3). Kako su vrednosti pojedinačnih merenja, ali i srednje vrednosti odnosa Ca/P za svaki uzorak bliske onima koje su zabeležene kod različitih apatita (1,5–1,75) (13), možemo govoriti o taloženju materijala sličnog apatitima na površini tretiranih cevčica.

Prekidanje estarskih veza u poli-L-laktidu dovodi do stvaranja karboksilnih grupa. Karboksilne grupe, koje mogu da se prevedu u karboksilatne anjone u rastvorima čija se pH vrednost kreće oko 7,4, daju negativno naelektrisanu površinu koja može da apsorbuje pozitivne kalcijumove jone u svom okruženju. Višak lokalnog Ca2+ indukuje nukleaciju apatita kombinujući se sa fosfatnim jonima u okruženju. Apatitni sloj raste na račun Ca2+ i HPO4

2− iz zasićenog rastvora, čime bi se mogli objasniti i rezultati našeg istraživanja (14, 15).

Slika 1. SEM mikrografija HAp/PLLA posle 1 nedelje inkubacije u SBF-u

Da bi se veštački materijal vezao za živu kost neophodno je da se na njegovoj površini prvo formira sloj sličan apatitu (16). Kako je u našem istraživanju pokazano da se na površini ovog materijala u okruženju koje odgovara okruženju ljudskog organizma formira sloj sličan apatitima, dobijeni rezultati upućuju da HAp/PLLA sam ili u kombinaciji sa krvlju i kostnom srži može biti dobar kandidat za potencijalnu primenu u otopediji i maksilofacijalnoj hirurgiji (17).

Zaključak Na površini tretiranog materijala uočena su

plitka i široka polja erozije nepravilnog oblika i površine, čije dno je pokriveno jasno vidljivim zrnima HAp, ali i uske pukotine koje zadiru u dubinu materijala. Broj, veličina i dubina erozija i pukotina raste sa dužinom stajanja u SBF-u što jasno ukazuje na to da u SBF-u degradacija kreće od površine materijala i da je degradacija posledica hemijske interakcije između komponenti SBF-a i sastojaka cevčica.

Slika 2. SEM mikrografija HAp/PLLA posle 2 nedelje inkubacije u SBF-u

T

Rezultati pokazuju da je u osnovi morfo-loških promena utvrđenih na materijalu HAp/PLLA posle inkubacije u simuliranoj telesnoj tečnosti rastvaranje njegove polimerne komponente i precipitacija materijala sličnog hidroksiapatitu na njegovoj površini. Ovaj materijal pokazuje dobre karakteristike, koje ga svrstavaju u kandidate za primenu u ortopediji i maksilofacijalnoj hirurgiji.

Zahvalnost Rad je realizovan u okviru projekata III 41017,

koje finansira Ministarstvo nauke i tehnološkog razvoja Republike Srbije.

Slika 3. SEM mikrografija HAp/PLLA posle 3 nedelje

inkubacije u SBF-u

37

Interakcija biomaterijala na bazi kalcijum hidroksiapatita /poli-L-laktida... Marija Vukelić i sar.

38

Literatura

1. Hench LL, Etheridge EC. Biomaterials: An Interfacial Approach. New York: Academic Press; 1982. 87 p.

2. Kurashina K, Kurita H, Takeuchi H, Hirano M, Klein CP, de Groot K.Osteogenesis in muscle with composite graft of hydroxyapatite and autogenous calvarial periosteum: a preliminary report. Biomaterials. 1995 ;16(2): 119-23. [CrossRef] [PubMed]

3. Ripamonti U, Duneas N. Tissue engineering of bone by osteoinductive biomaterials. MRS Bull. 1996 ; 21: 36-9.

4. Angelova N, Hunkeler D. Rationalizing the design of polymeric biomaterials. Trends Biotechnol. 1999 ; 17: 409-21. [CrossRef] [PubMed]

5. Rodriguez-Lorenzo LM, Salinas AJ, Vallet-Regi M, San Roman J. Composite biomaterials based on ceramic-polymers. I. Reinforced systems based on Al2O3/ PMMA/PLLA. J Biomed Mater Res. 1996 ; 30: 515–22. [CrossRef] [PubMed]

6. Ignjatović N, Tomić S, Dakić M, Miljković M, Plavšić M, Uskoković D. Synthesis and properties of hydroxyapatite/poly-L-lactide composite biomaterials. Biomaterials. 1999 ; 20: 809-16. [CrossRef] [PubMed]

7. Ignjatovic NL, Plavsic M, Miljkovic MS, Zivkovic LM, Uskokovic DP. Microstructural characteristics of calcium hydroxyapatite/poly-L-lactide based composites. J Microsc. 1999 ; 196: 243-8. [CrossRef] [PubMed]

8. Ignjatović N, Savić V, Najman S, Plavgić M, Usko ković D. A study of HAp/PLLA composite as a substi tute for bone powder, using FT-IR spectro scopy. Biomaterials. 2001; 22(6): 571-5. [CrossRef] [PubMed]

9. Kokubo T. Formation of biologically active bone-like apatite on metals and polymers by a biomimetic process. Thermochimica Acta. 1996 ; 280-281: 479-90. [CrossRef]

10. Ignjatovic N, Plavsic M, Uskokovic D. Composite

biomaterial hydroxyapatite/poli-L-lactide (collagen) with poli-L-lactide different molecular weigth. Advanced Enginering Materials. 2000 ; 2: 511-4. [CrossRef]

11. Kokubo T, Kushitani H, Sakka S, Kitsugi T, Yamamuro T. Solutions able to reproduce in vivo surface-structure changes in bioactive glass-ceramic A-W. J Biomed Mater Res. 1990 ; 24(6): 721-34. [CrossRef] [PubMed]

12. Södergård A, Stolt M. Properties of lactic acid based polymers and their correlation with composition. Prog Polym Sci 2002 ; 27:1123-63. [CrossRef]

13. Mucalo MR, Toriyama M, Yokogawa Y, Suzuki T, Kawamoto Y, Nagata F, Nishizawa K. Growth of calcium phosphate on ion exchange resins presatu rated with calcium or hydrogen phosphate ions: an SEM/EDX and XPS. J Mater Sci-Mater M. 1995 ; 6: 409–19. [CrossRef]

14. Zhang R, Ma PX.Porous poly(L-lactic acid)/apatite composites created by biomimetic process. J Biomed Mater Res. 1999; 45(4): 285-93. [CrossRef] [PubMed]

15. Murphy WL, Kohn DH, Mooney DJ.Growth of continuous bonelike mineral within porous poly (lactide-co-glycolide) scaffolds in vitro. J Biomed Mater Res. 2000 ; 50(1): 50-8.[CrossRef] [PubMed]

16. Takadama H, Kim H, Kokubo T. X-ray Photoelectron Spectroscopy Study on the Process of Apatite Formation on a Sodium Silicate Glass in Simulated Body Fluid. J Am Ceram Soc. 2002 ; 85: 1933–6. [CrossRef]

17. Vasiljevic P, Najman S, Djordjevic Lj, Savic V, Vukelic M, Zivanov-Curlis J, Ignjatovic N, Uskokovic D. Ectopic osteogenesis and hematopoiesis after implantantion of bone marrow cells seeded on HAp/PLLA scaffold. Hem Ind. 2009; 63: 301-7. [CrossRef]

Acta Medica Medianae 2011, Vol.50(4) Interakcija biomaterijala na bazi kalcijum hidroksiapatita /poli-L-laktida...

39

INTERACTION OF BIOMATERIALS CONTAINING CALCIUM HYDROXYAPATITE/POLY-L-LACTIDE WITH THE SIMULATED BODY

FLUID

Marija Vukelić, Žarko Mitić, Miroslav Miljković, Jelena Živković, Nenad Ignjatović, Dragan Uskoković, Perica Vasiljević, Marija Petković, Jelena Živanov-Čurlis and

Stevo Najman The purpose of biomaterials is to replace a part or a function of the body in a safe,

physiologically and economically acceptable way. The process of the reconstruction of bone defects has always been a big problem in orthopedics and maxillofacial surgery. Since hydroxyapatite (HAp) was detected as a component, the predominant constituent and the integral element of Mammalian bones, the development of the phospate ceramics as potential materials for implantation was enabled. This study investigated whether and in which way biomaterial calcium hydroxyapatite/poly-L-lactide (HAp/PLLA) interacts with the ionic composition of the human plasma. The simulated body fluid (SBF) is an artificial fluid that has the ionic composition and ionic concentration similar to the human blood plasma. HAp/PLLA was incubated for 1, 2, 3 and 5 weeks in SBF. The surfaces of both treated and untreated materials were analyzed on a scanning electron microscopy (SEM), and were also exposed to the energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS), while SBF was submitted to the measuring of pH and electrical conductivity. However, our results indicate that the degradational changes of the material HAp/PLLA in SBF start from the surface of the treated material and that observed changes are the consequence of dissolution of its polymer component and the precipitation of the material similar to hydroxyapatite on its surface. This material shows good characteristics that place it among good candidates for the application in orthopedics and maxillofacial surgery. Acta Medica Medianae 2011;50(4):35-39.

Key words: biomaterials, HAp/PLLA, SBF, SEM, EDS