instrumentalne metode analize · klasifikovani kao kvalitativni i kvantitativni parametri izbora...

INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi

PB 1

EUROPEAN UNION

EUROPEAN UNION

Mira Pucarević

INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE

u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi

2019.

Mira Pucarević



2019.

Mira Pucarević



2019.

INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi

2 3

Scientia potentia est(Znanje je moć.)

INSTRUMENTALNE METODE ANALIZEu upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi

I IZDANJE

Autor:

Dr Mira Pucarević, dipl.ing.tehnol.

Redovni profesor

Univerzitet Educons, Sremska Kamenica

Izdavač:

Univerzitet Educons, Vojvode Putnika 87, Sremska Kamenica

Za izdavača:

Prof. Dr Aleksandar Andrejević

Recenzenti:Dr Radojka RAZMOVSKI, dipl.ing.tehnol.

redovni profesor u penziji,Tehnološki fakultet Univerzitet uNovom Sadu

Dr Miroslav M. VRVIĆ, diplomirani hemičarnaučni savetnik

redovni profesor u penzijiHemijski fakultet, Univerzitet u Beogradu

Direktor BREM GROUP d.o.o.

Likovna obrada

Lena Pucarević

Tehnička obrada, priprema za štampu, štampa i povez:

RVB Studio Bačka Palanka

Tiraž:

100 primeraka

Copyright

Autor

Ovaj udžbenik je odlukom Nastavno-naučnog veća Fakulteta zaštite životne sredineUniverziteta Educons na sedinici održanoj 19. marta 2019. predložen u izdavački plan,a na sednici NNV održanoj 27. maja 2019. prihvaćen kao udžbenik za predmetInstrumentalne metode analize. ISBN: 978-86-87785-87-8

⸎

3.1.TAČKA TOPLJENJA I TAČKA KLJUČANJA................................ 27

3.2. VISKOZITET..................................................................................... 29

3.3. GUSTINA...........................................................................................30

3.4. INDEKS REFRAKCIJE.....................................................................31

3.5. pH VREDNOST................................................................................. 31

3.6. KONDUKTIVITET............................................................................33

4. OPTIČKE METODE.....................................................................................34

4.1. VRSTE OPTIČKIH TEHNIKA......................................................... 43

4.2. KOLORIMETRIJA............................................................................ 43

4.3. FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA............................................ 43

4.4. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIJA.................................................43

4.5. PLAMENA FOTOMETRIJA.............................................................44

4.6. INFRACRVENA SPEKTROMETRIJA - IR.....................................45

4.7. ATOMSKA SPEKTROFOTOMETRIJA.......................................... 49

4.7.1. OPTIČKA ATOMSKA APSORPCIONASPEKTROMETRIJA.........................................................................49

4.7.2. ATOMSKA EMISIONA SPEKTROFOTOMETRIJA...........56

5. HROMATOGRAFIJA...................................................................................59

5.1. PODELA HROMATOGRAFSKIH TEHNIKA.................................61

5.2.TIPOVI HROMATOGRAFSKIH MEHANIZAMA........................ 61

5.3.TERMINOLOGIJA U HROMATOGRAFIJI..................................... 63

5.4.TEORIJA HROMATOGRAFIJE........................................................66

5.5. GASNA HROMATOGRAFIJA.........................................................713.1.TAČKA TOPLJENJA I TAČKA KLJUČANJA................................ 27

3.2. VISKOZITET..................................................................................... 29

3.3. GUSTINA...........................................................................................30

3.4. INDEKS REFRAKCIJE.....................................................................31

3.5. pH VREDNOST................................................................................. 31

3.6. KONDUKTIVITET............................................................................33

4. OPTIČKE METODE.....................................................................................34

4.1. VRSTE OPTIČKIH TEHNIKA......................................................... 43

4.2. KOLORIMETRIJA............................................................................ 43

4.3. FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA............................................ 43

4.4. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIJA.................................................43

4.5. PLAMENA FOTOMETRIJA.............................................................44

4.6. INFRACRVENA SPEKTROMETRIJA - IR.....................................45

4.7. ATOMSKA SPEKTROFOTOMETRIJA.......................................... 49

4.7.1. OPTIČKA ATOMSKA APSORPCIONASPEKTROMETRIJA.........................................................................49

4.7.2. ATOMSKA EMISIONA SPEKTROFOTOMETRIJA...........56

5. HROMATOGRAFIJA...................................................................................59

5.1. PODELA HROMATOGRAFSKIH TEHNIKA.................................61

5.2.TIPOVI HROMATOGRAFSKIH MEHANIZAMA........................ 61

5.3.TERMINOLOGIJA U HROMATOGRAFIJI..................................... 63

5.4.TEORIJA HROMATOGRAFIJE........................................................66

5.5. GASNA HROMATOGRAFIJA.........................................................71

SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2

2.2. TIPOVI INSTRUMENTALNIH METODA........................................3

2.3. PROCES INSTRUMENTALNOG MERENJA................................... 3

2.4. IZBOR ANALITIČKE METODE....................................................... 3

2.5. IZBOR INSTRUMENTALNE TEHNIKE..........................................4

2.6. KALIBRACIJA INSTRUMENTALNIH METODA...........................7

2. UZORKOVANJE I PRIPREMA UZORAKA.............................................. 10

2.1. PROCES UZORKOVANJA.............................................................. 10

2.2. SMANJENJE VELIČINE UZORKA.................................................11

2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11

2.4. GREŠKA UZORKOVANJA..............................................................12

2.5. MERNA NESIGURNOST................................................................ 12

2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13

2.7. NAJČEŠĆI POSTUPCI PRIPREME................................................. 14

2.8. VRSTE ANALITA I MATRIKSA.....................................................15

2.9. PRIPREMA GASOVITIH UZORAKA............................................. 15

2.10. PRIPREMA ČVRSTIH UZORAKA................................................17

2.11. PRIPREMA TEČNIH UZORAKA.................................................. 21

3. ODREĐIVANJE FIZIČKIH OSOBINA.......................................................27

SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







SADRŽAJ

1. ......................................................................................................................... 9

2. UVOD..............................................................................................................2

2.1. METODE ANALIZE........................................................................... 2









2.3. ČUVANJE UZORAKA......................................................................11



2.6. PRIPREMA UZORKA.......................................................................13







18

5115

4212

4111

3911

3911

3810

3710

18

51

19

51

19

51

20

52

20

53

21

57

22

57

23

64

23

67

25

69

29

69

35

71

35

74

79


6 7

PREDGOVOR

Donošenje pravilnih zaključaka o stanju i kvalitetu nekog materijala ili sredine(zemljišta, vode, vazduha, formulacije leka za humanu ili veterinarsku upotrebu,poljoprivrednog ili prehrambenog proizvoda, agrohemikalija,...)vezano je zapoznavanje vrednosti parametara koji mogu da posluže za ocenu kvaliteta. Pokazateljikoji se vezuju za kvalitet i stanje nekog medijuma ili materijala mogu da budumnogobrojni, ali se ipak mogu grupisati u dve velike grupe: fizičkih i hemijskihparametara. Hemijski parametri su najčešće izraženi kao koncentracije prisutnihorganskih i neorganskih supstanci dok su fizički parametri specifična masa,konduktivitet, viskozitet, tačka topljenja i tačka očvršćavanja.

Ova publikacija će se baviti instrumentima kojima se mere koncentracije organskih ineorganskih jedinjenja i nastala je kao rezultat projekta prekogranične saradnjeFakulteta zaštite životne sredine Univerziteta Educons u Sremskoj Kamenici iBiotehničkog fakulteta Univerziteta u Osijeku pod nazivom IMPACT-ENVI(Referentni broj projekta: IPA HR-RS182) „Implementation of cross-border jointaction toward environment protection in agriculture“.

Poljoprivreda je izvor mnogobrojnih jedinjenja koja dospevaju u životnu sredinu,menjajući je i utičući dalje na druge sisteme. Da bi se sprovele adekvatne mere zaublažavanje ovog uticaja, a istovremeno dobili stabilni visoki prinosi i kvalitetnipoljoprivredni i prehrambeni proizvodi, potrebno je pratiti šta se dešava saagrohemikalijama kada one obave svoj zadatak u okviru poljoprivredne proizvodnje.Osnova svakog održivog sistema je upravljanje i praćenje stanja sistema. Zato ćemo sebaviti merenjima parametara stanja životne sredine koji su rezultat uticaja poljoprivrede,kao što su nitrati, pesticidi i metali.

Danas postoji trend u zakonskoj regulativi da se dozvoljene koncentracije ostatakazagađujućim supstancama sve više snižavaju. Za pouzdano merenje niskihkoncentracija razvijaju se i sve osetljiviji uređaji.

Merenja su danas vezana za instrumente koji su automatizovani i kompjuterizovani.Njihovo korišćenje zahteva stručnost i poznavanje osnovnih principa na kojima seinstrumentalna tehnika zasniva, kao i osnovnih tehnika pripreme uzoraka za analizu.Priprema uzoraka je nezaobilazan prvi korak kojim se analiti iz matriksa dovode ustanje koje odgovara instrumentalnoj tehnici koja će biti upotrebljena. Pripremauzoraka takođe zavisi od agregatnog stanja matriksa, kao i od fizičko-hemijskihosobina analita koje je potrebno izvući iz matriksa u što većem procentu, tako da se onine promene. Konačan rezultat merenja treba da bude prosečna vrednost tri ili višeponovljenih merenja, i varijabilan je više ili manje. Zbog uticaja koji dovode do ovevarijacije, potrebno je tokom merenja obezbediti poverenje u ovaj rezultat.

5.5.1. DELOVI GASNOG HROMATOGRAFA.............................. 72

5.6.TEČNA HROMATOGRAFIJA.......................................................... 78

5.6.1. DELOVI TEČNOG HROMATOGRAFA.............................. 79

5.7. HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (Thin LayerChromatography) ili PLANARNA HROMATOGRAFIJA...................... 85

6. SISTEM OBEZBEĐENJA KVALITETA U LABORATORIJI SRPS ISO17025................................................................................................................. 86

7.LITERATURA............................................................................................... 87

8. INDEKS.........................................................................................................89

⸎

80

94

86

95

87

97

93


8 9

Na kraju je kao 7. deo navedena Literatura, koju je autor koristio tokom pisanja, a kojaje tako odabrana da i korisnicima ove knjige, na fakultetima, ali drugim kolegama upraksi, može biti od koristi, kao i sama knjiga. Poslednji deo je Indeks, koji je uvekizuzetno upotrebljiv deo svake knjige.

Sremska Kamenica, maja 2019. Autor

⸎

Ova knjiga se sastoji od šest poglavlja. U knjizi su predstavljene najznačajnijeinstrumentalne merne tehnike, kao i fizičko-hemijske osnove mehanizma odgovoramernog uređaja na prisustvo određenih organskih ili neorganskih analita.

U poglavlju Uvod opisan je proces merenja i način izbora analitičke metode koji suklasifikovani kao kvalitativni i kvantitativni parametri izbora analitičke metode.Prikazani su parametri validacije analitičke metode: preciznost, greška, osetljivost,granica detekcije, granica kvantifikacije, koncentracioni opseg, selektivnost,kalibraciona kriva, metoda standardnog dodatka i metoda internog standarda.

Uzorkovanje je prvi i veoma važan korak u dobijanju informacije o koncentracijamaanalita. Poglavlje 2. opisuje uzorkovanje i postupke pripreme gasovitih, tečnih i čvrstihuzoraka: apsorpciju u tečnosti, “head-space” uzorkovanje gornjeg prostora, ekstrakcijučvrsto-tečno, sonifikaciju, sokslet ekstrakciju, ubrzanu čvrsto-tečnu ekstrakciju (ASE),ekstrakciju superkritičnim fluidom, ekstrakciju pomognutu mikrotalasima, liofilizaciju,tečno-tečnu ekstrakciju, čvrsto-faznu ekstrakcijui čvrsto-faznu mikroekstrakciju.

Prisustvo niskih koncentracija primesa u čistim supstancama menja njihove fizičkekonstante. Merenjem ovih vrednosti se dobija informacija o čistoći supstanci. Upoglavlju 3. se govori o metodama i uređajima za određivanje najvažnijih fizičkihkonstanti kao što su: tačke topljenja i ključanja, viskoziteta, gustine, indeksa refrakcije-prelamanja, pH vrednost i konduktiviteta.

Poglavlje 4. opisuje osnove optičkih metoda, gde je u uvodu objašnjena osnova dualneprirode svetlosti, elektromagnetni spektar i njegove osobine, Lamber-Berov zakon,glavni delovi optičkih uređaja, UV-VIS spektrofotometrija, plamena fotometrija, IRspektroskopija, atomska apsorpciona spektrofotometrija, zatim određivanje metala uzprimenu grafitne kivete, tehnike hladnih para, kao i atomska emisiona tehnika saoptičkim i masenim detektorom.

U poglavlju 5. je opisana teorija hromatografskih razdvajanja uz prikaz gasne, tečne iplanarne hromatografije. Opisani su osnovni parametri efikasnosti razdvajanja,koeficijent raspodele, retenciono vreme, faktor selektivnosti, teorija ekvivalentnihpodova i teorija efektivne difuzije. Prikazane su vrste hromatografskih kolona,detektori, kvalitativni i kvantitativni parametri hromatograma, zatim i optimizacijahromatografskih razdvajanja. Kod tečne hromatografije prikazani su mehanizmirazdvajanja, rastvarači koji se koriste, detektori i ostali elementi važni za što efikasnijerazdvajanje.

U poslednjem 6. poglavlju prikazan je sistem kvaliteta ISO 17025, danas nezaobilazandeo radnih zadataka laboratorije, koja daje pouzdane rezultate merenja. Tehnički ikadrovski sistem kvaliteta u laboratoriji je sastavljen od elemenata koji se kontinualnoplaniraju, prate, proveravaju i poboljšavaju.


10 11

INSTRUMENTALNEMETODE ANALIZE u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi

3

do pojave brojnih spektrofotometrijskih, elektromigracionih i tehnika razdvajanja,koje mogu biti korišćene isključivo uz pomoć komplikovanih električnih instrumenata.

2.2. TIPOVI INSTRUMENTALNIH METODA

Instrumentalnim metodama se mere promene različitih fizičkih veličina u interakciji saanalitom, kao izvor informacije o sadržaju i vrsti analita u matriksu. Emisionaspektroskopija, fluorescencija, fosforescencija i luminiscencija mere emisiju urazličitim oblastima elektromagnetnog spektra. Spektrofotometrija, fotometrija (UV,VIS, X-zraci, IR), nuklearna magnetna rezonanca mere absorpiciju u različitimoblastima elektromagnetnog spektra. Rasipanje zračenja se meri turbidimetrijom,nefelometrijom i ramanskom spektrometrijom. Prelamanje zračenja se merirefraktometrijom. Difrakcija zračenja se koristi kod difrakcije x-zraka i elektrondifrakcionih metoda. Električni potencijal se meri u potenciometrijskim metodama.Električni naboj se meri u kolonometrijskim metodama, a jačina struje uamperometrijskim metodama. Odnos mase i naelektrisanja se meri u masenojsprektrometriji itd.

2.3. PROCES INSTRUMENTALNOG MERENJA

Proces instrumentalnog merenja se može posmatrati i tako što instrument za hemijskuanalizu, informacije sadržane u fizičkim i hemijskim karakteristikama analita,konvertuje u podatke koji mogu biti interpetirani od strane analitičara.

Primer: uzorak postavljen na svetlosni put apsorbuje svetlo. Razlika u intenzitetuulaznog i propuštenog svetla je proporcionalna koncentraciji analita u uzorku. Žutoobojeni rastvor će apsorbovati svetlo u žutom opsegu talasnih dužina vidljivog delaspektra.

2.4. IZBOR ANALITIČKEMETODE

Danas postoji izuzetno veliki broj instrumenata i alata pomoću kojih se izvodehemijske analize. Kako izabrati pravu? Pre pristupanja procesu analize potrebno jeodabrati analitičku metodu i jasno definisati prirodu hemijskog problema. Izboranalitičke metode će zavisiti od sledećih parametara:

- Potrebne preciznosti (koja ukazuje na to koliko vremena i pažnje treba posvetitianalizi);

- Količine uzorka koji je na raspolaganju (za manju količinu uzorka potrebna jeosetljivija metoda);


2

2. UVOD

Predmet instrumentalne metode analize (IMA) bavi se instrumentima, metodama ianalizama.

IMA objašnjava osnovne principe na kojima je zasnovan rad mernih uređaja iliinstrumenata konstruisanih sa ciljem da izmere promenu neke veličine i daju brojčanuvrednost kao rezultat određene osobine uzorka.

Metode predstavljaju niz precizno definisanih fizičkih i hemijskih postupaka, koji seizvode na uzorku. Analiza se može posmatrati kao alatka za dobijanje informacija osadržaju ili koncentraciji određenog jedinjenja u uzorku.

Uzorak je sve ono što stiže u laboratoriju naanalizu. Uzorak se sastoji od matriksa i analita.Matriks je medijum u kojem se nalaze analiti čijukoncentraciju treba odrediti. Analit je supstancaili hemijsko jedinjenje koje se određuje, a nalazise u matriksu u manjoj ili većoj koncentraciji.

2.1. METODE ANALIZE

Hemijska analiza sadržaja analita u matriksu sastoji se iz dva dela. Prvi korak jeizdvajanje analita iz matriksa, a nakon toga se pogodnom tehnikom određuje količinaizdvojenog analita. Metode određivanja mogu biti klasične i instrumentalne, takođemogu biti kvalitativne i kvantitativne.

Klasične metode za izdvajanje analita iz matriksa, u cilju određivanja njihovekoncentracije, uključuju neku od tehnika, kao što su taloženje, ekstrakcija ili destilacija.Klasične metode takođe podrazumevaju i analizu kvalitativnih osobina uzorka, kao štosu: boja, tačka ključanja/topljenja, rastvorljivost u seriji rastvarača, miris, optičkaaktivnost ili indeks refrakcije sa ciljem sakupljanja što većeg broja podataka o uzorku,da bi se na kraju izveli zaključci o sastavu uzorka i sadržaju analita u uzorku. Nakonizdvajanja analita klasičnim metodama, kvantifikacija se izvodi gravimetrijski ilivolumetrijski. Gravimetrijsko određivanje podrazumeva merenje masa analita iliproizvoda reakcije, dok volumetrijsko određivanje znači da se meri zapreminastandardnog reagensa potrebna za kompletnu reakciju.

Instrumentalne metode su počele da se razvijaju početkom XX veka kada se došlodo saznanja da različite fizičke osobine, kao što su: konduktivitet (provodljivost),potencijal između elektroda, apsorpcija i emisija svetlosti, fluorescencija, mogu dabudu korišćene u cilju dobijanja analitičkih informacija. Izuzetno brz razvoj je uslediokada je počela primena računara za kontrolisanje procesa i instrumenata. To je dovelo


2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





12 13


5

greške se otklanja samodisciplinom i kompjuterskom kontrolom procesa. Tu je i greškametode, kojoj izvor može biti sporost reakcije, gubici usled isparavanja, adsorpcijaanalita na zidove pribora, kontaminacija reagenasa, hemijske interference. Ova vrstagreške se teško otkriva, a otklanja se validacijom metode uz upotrebu standardnogreferentnog materijala.

Osetljivost instrumenta je njegova sposobnost da izmeri malu razliku u koncentracijianalita. Na osetljivost utiču nagib kalibracione krive i preciznost (reproduktivnost)instrumenta. Osetljivost se može kvantifikovati po IUPAC-u ( Union of Pure andApplied Chemists) kao kalibraciona osetljivost m i analitička osetljivost .

Kalibraciona osetljivost m predstavlja nagib kalibracione krive. Pošto se teži tome dakalibracione krive budu linearne, merni signal je definisan jednačinom prave. Kod kojeje odsečak prave signal koji daje slepa proba, a nagib prave m je istovremenokalibraciona osetljivost. Jasno je da nagib kalibracione krive m zavisi od koncentracije

S = Ssp + mc (4)

gde je:

S – izmereni signal

c – koncentracija analita

Ssp – signal izmeren kod slepe probe ili odsečak prave

m - nagib prave linije

Analitička osetljivost je definisana kao odnos nagiba kalibracione krive m istandardne devijacije merenja s.

= m/ s (5)

Granica detekcije ili limit detekcije (LOD) je količina analita (Cm) koja merenjemdaje signal veći od tri standardne devijacije šuma mernog instrumenta. Zavisi od obimavariranja šuma instrumenta.Ukoliko merni signal nije nekoliko puta veći od šumabazne linije, nije moguće sa sigurnošću razlikovati analitički signal od šuma. LODpredstavlja količinu analita (Cm) koja daje minimalni analitički signal (SLOD) koji jeveći od prosečnog signala šuma bazne linije (Ssp) za tri standardne devijacije šumabazne linije:

SLOD = Ssp + 3 sp (6)


4

- Koji je red veličine koncentracije analita (da bi se pokrio odgovarajući koncentracioniopseg);

- Da li postoje interference i koje su (ukazuje na to koliko metoda treba da budeselektivna);

- Koje su fizičke i hemijske osobine matriksa (neke analitičke metode mogu bitiprimenjene samo na tečne uzorke, ili samo na gasovite ili samo na čvrste) i

- Koji broj uzoraka će se analizirati, što je važno sa ekonomskog stanovišta, Ako imamanje uzoraka može se koristiti neka složenija metoda.

2.5. IZBOR INSTRUMENTALNE TEHNIKE

Kriterijumi na osnovu kojih se može proceniti da li je neka instrumentalna metodapogodna za rešenje analitičkog problema, mogu biti kvalitativni (brzina, jednostavnost,obučenost analitičara, cena i dostupnost opreme, troškovi analize po uzorku), kao ikvantitativni. Kvantitativni parametri su oni koji se mogu izraziti brojčanimvrednostima. Neki od važnijih kvantitativnih parametara su: preciznost, greška,osetljivost, granica detekcije, granica kvantifikacije, koncentracioni opseg iselektivnost. Ovi parametri su numeričke vrednosti i omogućuju sužavanje brojapogodnih instrumentalnih metoda .

Preciznost je međusobno slaganje podataka dobijenih na isti način. Preciznost ukazujena slučajne nepredvidive greške koje se javljaju tokom analize.Kvantitativne mere preciznosti su:

Apsolutna standardna devijacija (σ), δ = i=1N (xi−x�∑ )2

N−1(1)

Relativna standardna devijacija (RSD) RSD = δx�

(2)

Koeficijent varijacije (CV) i varijansa (2). CV = δx�x100 (3)

Greška ili BIAS ili sistematska greška, predstavlja grešku koja se u ponovljenimmerenjima ponavlja u istoj meri. Može biti identifikovana kao greška instrumentačiji izvori mogu biti male promene u elektronskim komponentama, temperaturi, voltaži,nekalibrisane vage ili odmerne posude. Uklanja se kalibracijom uređaja saodgovarajućim standardima. Moguća je igreška analitičara koja nastaje zbog razlikeu sposobnostima raznih osoba. Na primer, procena boje završne tačke titracije, otklonakazaljke na mernom uređaju, visina tečnosti u odmernoj posudi ili pipeti. Ova vrsta


2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





14 15


7

Ako se izvede koeficijent selektivnosti supstance A u odnosu na supstancu B:

kB,A = mB /mA mB= kB,AmA (9)

Koeficijenti selektivnosti tada daju relativni odgovor metode na supstancu B u odnosuna supstancu A.

Isto važi za supstancu C u odnosu na A:

kC,A = mC /mA mC= kC,AmA (10)

Kada se koeficijenti zamene u gornjoj jednačini, dobija se izraz:

S = mA(CA + kB,ACB + kC,ACC )+ Ssp (11)

Kada nema interferenci, koeficijent selektivnosti je 0. Kada je koeficijent negativanbroj, interferenca smanjuje signal instrumenta. Kada je koeficijent pozitivan broj,interferenca povećava signal instrumenta.

2.6. KALIBRACIJA INSTRUMENTALNIH METODA

Kalibracija je proces kojim se povezuje signal instrumenta sa koncentracijom analita.Sve analitičke metode zahtevaju kalibraciju. Tri najčešća metoda kalibracije su:kalibraciona kriva, metoda standardnog dodatka i metoda internog standarda

Kalibraciona kriva podrazumeva merenje signala instrumenta dobijenog za serijurastvora poznatih koncentracija u rastućem nizu (standarna serija). Postupakkonstruisanja kalibracione krive podrazumeva sledeće operacije: 1. U instrument seubaci nekoliko standarda sa tačno definisnom rastućom koncentracijom analita. 2.Izmeri se signal instrumenta za seriju standarda. 3. Izmeri se signal instrumenta saslepom probom (sve hemikalije, ali bez analita). 4. Od signala standarda se odbijesignal slepe probe i na kraju se konstruiše grafik zavisnosti signala instrumenta odkoncentracije analita, slika 2.


6

Ssp je prosečna vrednost signala šuma bazne linije

sp je standardna devijacija šuma bazne linije

Ponavljanjem analize sve razblaženijeg rastvora analita, može se odrediti koncentracijaanalita (Cm) koja daje signal koji odgovara LOD (viši je za tri standardne devijaciješuma bazne linije).

Granica kvantifikacije ili limit pouzdane kvantifikacije (LOQ) je najnižakoncentracija analita koja se može pouzdano i reproduktivno odrediti. Predstavljaveličinu signala mernog instrumenta koji je definisan kao zbir vrednosti signala slepeprobe i deset standardnih devijacija šuma bazne linije (šuma slepe probe):

SLOQ = Ssp+10 sp (7)

Koncentracioni opseg ili radni opseg analitičke metode ili instrumenta. Najnižakoncentracija radnog opsega analitičke metode je LOQ, a najveća koncentracija jekoncentracija (LOL) za koju je signal mernog uređaja još uvek linearan. LOL = limitlinearnosti kalibracione krive, slika 1.

Slika 1. Radni opseg analitičke metode

Selektivnost govori o tome u kom stepenu je metoda zavisna od interferenci.Interferirajuće supstance su one koje povećavaju ili smanjuju signal instrumenta.

Ako u uzorku imamo analit A i interferirajuće supstance B i C, u koncentracijama CA,CB i CC i kalibracionim osetljivostima mA, mB i mC, tada one takođe učestvuju u signalu:

S = mACA+ mBCB + mCCC+ Ssp (8)


2

2. UVOD





2.1. METODE ANALIZE





16 17


9

internog standarda (Cistd) koji predstavlja faktor odgovora instrumenta (RF)(12).Odgovor instrumenta dobijen analizom uzorka se pomoću faktora odgovorapreračunava u koncentraciju analita (13). Važno je pronaći odgovarajući internistandard koji se uobičajeno ne nalazi u vrsti uzoraka koji se ispituju. To su čestodeuterizovani derivati istog analita koji se ispituje.

Cst*Aistd

Cistd*AstRF (12)

RF*Aistd

Cistd*AuzCuz (13)

Na primer, za analizu kvaliteta biodizela, koji se proizvodi esterifikacijom biljnih ulja,interni standard je metil-heptadekanoat (C17:0) koji se uobičajeno ne može naći ubiljnim uljima. Za analizu kvaliteta pesticidnih preparata, često se kao interni standardikoriste ftalatni estri.

⸎


8

Slika 2. Primer kalibracione krive

Kalibraciona kriva treba da bude prava linija definisana nagibom i odsečkom. Može dabude i zakrivljena linija, ali to zahteva veći broj tačaka i definisanje pouzdane (najčešćekvadratne) zavisnosti signala instrumena od koncentracije analita. Kalibraciona krivamože biti nacrtana na milimetarskom papiru ili se odsečak i nagib mogu izračunatimetodom najmanjih kvadrata uz pomoć programa za tabelarne obračune (Excel). Nagibse dobija pomoći funkcije “slope”, a odsečak se dobija pomoću funkcije “intercept”.Funkcija “correl” daje podatak (broj koji treba da bude što bliže jedinici) o tome kolikose jednačina prave poklapa sa realnim vrednostima.

Najbolji rezultati se dobijaju kada se kalibraciona kriva pravi u realnim uzorcima kojisa sobom nose uticaj matriksa. To nije uvek jednostavno, jer je potrebno nabavitistandardizovan matriks bez analita koji se ispituju. Danas se može kupiti sve veći brojovakvih matriksa. Analiti se dalje dodaju u rastućim koncentracijama. Meri se odgovorinstrumenta. Ovako je uključen efekat matriksa. Jedini nedostatak ove kalibracionemetode je to što kalibracija važi isključivo za matriks kojim je instrument kalibrisan.

Metoda standardnog dodatka je metod kalibracije kada se u uzorak koji se ispitujedodaje poznata količina analita. Meri se signal instrumenta u uzorku sa dodatkom i uuzorku bez dodatka analita. Iz razlike se izračunava koncentracija analita u uzorku.Metoda standardnog dodatka takođe obezbeđuje smanjenje uticaja interferenci matriksana rezultat.

Metoda internog standarda se često koristi u hromatografskim analizama. Internistandard je supstanca koja se u istoj količini dodaje u sve uzorke, standarde i slepuprobu koji se ispituju. Ovom metodom se kompenzuju sistemske i slučajne greške. Akoje došlo do nekog propusta u analitičkoj proceduri, taj propust će se isto odraziti i nainterni standard preko koga se obračun obavlja. Koncentracija internog standarda(Cistd) je ista u svim probama. Analizom standarda i internog standarda dobija seodnos signala (Ast) i koncentracije analita (Cst) i signala (Aistd) i koncentracije


18 19


11

se odvija u laboratoriji. Nakon odgovarajuće pripreme (mlevenje, sejanje, filtriranje isl.)od laboratorijskog uzorka se uzimaju manje količine ili alikvoti. Veličina alikvota jenajčešće nekoliko grama ili manje i zavisi od analitičkog postupka koji će bitiprimenjen, na primer, uzrokovanje sirovina za proizvodnju stakla (pesak, dolomit ikrečnjak). Sirovine se najčešće transportuju železnicom. Vagoni sadrže po 2 tmaterijala koji je tokom transporta i truckanja podložan vertikalnom raslojavnju na baziveličina čestica. Da bi se dobio reprezentativan zbirni uzorak za uzorkovanje, koristi sekonusna nerđajuća sonda koja se vertikalno zabada u rastresiti materijal. Količina kojase uzme sondom u jednom navratu je oko 500 g. Ukupno se po vagonu uzme šestuzoraka na različitim mestima; objedinjeni, oni čine reprezentativni zbirni uzorak.Ukupna količina uzetog materijala je 3 kg po jednom vagonu. Ova količina se uvećevakada se uzorkuju vagoni iz čitave kompozicija voza.Veoma je teško uzetireprezentativan uzorak, naročito ako je za analizu potrebno samo 0,5 g materijala.Homogenisanje kompozitnog uzorka je od presudne važnosti za reprezentativnostuzetog uzorka.

2.2. SMANJENJE VELIČINE UZORKA

Homogeni laboratorijski uzorak je najčešće mase oko 1 kg. Za analizu se uzimajukoličine manje od 10 g. Da bi se obezbedila homogenost uzorka, potrebno ga je samleti.Mlevenjem se smanjuje veličina čestica koje sačinjavaju kompozitni uzorak. Nakonmlevenja uzorak se deli na manje porcije nekim od prihvaćenih definisanih postupaka.Postoji više načina ručnog i automatskog formiranja poduzorka. Tokom postupkapodele uzorka, važno je da se izvede tako da sve porcije poduzorka imaju iste fizičkeosobine (granulometrijski sastav, gustinu itd.).

2.3. ČUVANJE UZORAKA

Sastav uzorka može da se menja tokom čuvanja. Hemijske promene mogu da nastanukao posledica reakcije sa vazduhom ili reakcije sa materijalom od koga je posuda.Staklo je poznat menjač jona i utiče na promenu koncentraciju metalnih jona urastvorima, na primer natrijuma. Plastične posude takođe mogu da utiču na stabilnostanalita u uzorku. Teflon i polietilen mogu da apsorbuju male količine analita. Naprimer, 40-95 % od 0,2 μM HgCl2 se apsorbuje za četiri časa u polietilenskim bocama.Takođe, 2 % od 2 μM Ag+ se apsorbuje u teflonskim bocama za jedan dan, a 28 % zamesec dana. Dokazano je da se prethodnim ispiranjem plastičnih boca za uzorke,smanjuje gubitak analita. Tokom čuvanja uzorka takođe može doći do kontaminacijeuzorka. Primera radi, za analize tragova olova potrebna je filtrirana radna atmosfera,jer je olovo u tragovima prisutno u atmosferi kao posledica upotrebe antidetonatoratetraetil-olova. Metalne igle mogu da kontaminiraju uzorke za biohemijske analize.


10

2. UZORKOVANJE I PRIPREMA UZORAKA

Hemijska analiza postaje besmislena ako se uzorkovanje ne izvede na pravi način.Analiza uzorka koji je loše uzorkovan dovodi do netačnih rezultata, a ovi do pogrešnihzaključaka.

Uzorak je manji deo skupa koji ima osobine celog skupa. Uzorkovanje je procesuzimanja manje količine materijala za potrebe analize. Na primer, za određivanjeprocenta vlage kukuruza u prikolici od 5 000 kg, uzima se uzorak sa više mesta uprikolici, i njegova masa ne treba da bude veća od 1 kg.

Kvantitativna analiza započinje uzorkovanjem i završava tumačenjemrezultata.Tehnika uzorkovanja zavisi od vrste uzorka. Za uzorke iz životne sredine(voda, vazduh, zemljište i biljke) razmatranje načina reprezentativnog uzorkovanja seodvija na mestu uzorkovanja, uz osnovnu pretpostavku da su voda, vazduh i zemljištenehomogeni matriksi. Poznato je da su mineralne materije zemljišta neravnomernoraspoređene. Raspodela toksičnih zagađivača u akviferu je takođe neravnomerna.Ispuštanje hemikalija u površinske vode isto tako nije ravnomerno raspoređeno, dok jevazduh urbanih područja zagađen komplikovanom smešom kontaminanata za čiju jeanalizu potrebna specijalizovana oprema. Ovo je naročito značajno kada se ispituju vrloniske koncentracije polutanata.

Primer određivanja nitrata u sedimentu je tipična osetljiva analiza kod koje se moravoditi računa o tome da se koncentracija nitrata menja po dubini. Koncentracija nitratazavisi od dubine sa koje je uzet uzorak sedimenta. Ukoliko se, međutim, taj uzorakuzme sa dubine veće od 4 mm, nitrati neće biti detektovani, što će dovesti do lažno-negativnog rezultata.(Anal. Chem. 1997, 69, 3527-3531).

2.1. PROCES UZORKOVANJA

Uzorkovanje se sastoji od više koraka. Cela količina materijala koji se analizira, takođese naziva i lot ili šarža, i predstavlja količinu materijala iz kojeg se uzima jedan deo.Deo koji se uzme od osnovnog skupa zove se reprezentativni zbirni uzorak.Reprezentativni zbirni uzorak se uzima sa više mesta i nastaje spajanjem pojedinačnihporcija uzetog materijala. Na primer, zemljište se uzorkuje na osnovu mrežastograsporeda tako da se sa jedinice površine, koja je najčešće 1-5 hektara, uzme oko 0,2kg zemljišta na 15 mesta. Sve porcije zemljiišta se objedine, pažljivo homogenizuju ičine reprezentativni zbirni uzorak. Na terenu se reprezentativni zbirni uzorak,odbacivanjem viška, smanjuje na masu od oko 1 kg. Reprezentativni zbirni uzorak jedeo koji se uzima za analizu i mora da predstavlja ceo lot. Smanjenjemreprezentativnog zbirnog uzorka dobija se laboratorijski uzorak. Laboratorijski uzorakje manji od zbirnog i mora imati isti sastav kao i lot. Priprema laboratorijskog uzorka


20 21


13

ili rastresitih metrijala), fizičko stanje matriksa koji se uzorkuje (čvrsto, tečno, gas),uticaj temperature i pritiska, uticaj procesa uzorkovanja na sastav uzorka (dolazi doadsorpcije analita na pribor za uzrkovanje), kontaminacija, transport i konzerviranjeuzorka, homogenizacija i/ili efekti poduzorkovanja. Svaki od koraka tokom pripremeuzorka za analizu može biti izvor merne nesigurnosti iz procesa pripreme uzorka.Najčešći postupci koji se primenjuju tokom pripreme su: sušenje, mlevenje, rastvaranje,ekstrakcija, kontaminacija, derivatizacija (hemijski efekti), greške rastvaranja,koncentrisanje i drugo. Svi faktori koji utiču na povećanje merne nesigurnosti se moguprikazati pomoću Išikava dijagrama, slika 3.

Slika 3. Išikava dijagram procene merne nesigurnosti

2.6. PRIPREMA UZORKA

Priprema uzorka za analizu predstavlja niz određenih, manje ili više komplikovanihpredradnji, koje analite dovode u stanje u kojem ih je moguće analizirati nekom odtehnika. To je proces koji uzima najviše vremena tokom analize i najčešće je obavezanprvi korak pre primene neke od instrumentalnih tehnika. Priprema uzorka može bitijednostavno rastvaranje, ekstrakcija analita iz kompeksnog matriksa, koncentisanjerazblaženog analita do nivoa koji može biti izmeren, hemijsko konvertovanje u oblikkoji se može detektovati ili uklanjanje i maskiranje interferirajućih supstanci,rastvaranje određene količine uzorka u odgovarajućem rastvaraču pre primeneinstrumentalne tehnike, ili može biti sastavljena od niza komplikovanih postupakaprimenjenih sa namerom da se izdvoji željeni analit i uklone interference.


13






13






12

2.4. GREŠKA UZORKOVANJA

Važno je imati u vidu da poverenje u rezultat zavisi od veličine uzorka kojireprezentuje ceo lot, kao i od koraka koji su preduzeti da bi se obezbedila ujednačenostcelog skupa.Takođe, treba znati da uzorkovanje uvodi i grešku uzorkovanja koja utičena krajnji rezultat merenja u većoj ili manjoj meri. Cilj je svesti ovu grešku naminimum. Greška uzorkovanja je u funkciji veličine uzorka - što je uzeti uzorak veći,greška uzorkovanja je manja.

Nije praktično raditi sa velikim uzorkom. Greška uzorkovanja se smanjuje povećanjemveličine uzorka; ako je uzorak 90 % od osnovne količine koju reprezentuje, tada jegreška manja od 0,1 %. Smanjenjem veličine uzorka greška se povećeva ; ako je uzeto0,1 % osnovne količine, greška je 10 %. Greška uzorkovanja se smanjuje i mlevenjemuzorka. Mlevenje se izvodi samo u slučajevima kada ne utiče na stabilnost analita.Mlevenjem uzorka voća ditiokarbamati dolaze u dodir sa vazdunom i raspadaju se, pase homogenizacija izbegava ili se obavlja dok je voće u smrznutom stanju.

Ponavljanjem analize postoji disperzija dobijenih rezultata ili varijabilnost rezultatamerenja – varijansa (σ2) koja zavisi od varijanse poreklom od uzorkovanja (σu2) i odvarijanse poreklom od primenjenog analitičkog postupka (σa2). Pošto je varijansaaditivna osobina, ukupna varijansa σ 2 je zbir varijanse uzorkovanja σu2 i varijanseanalitičke metode σa2(14).

σ 2= σu2+ σa2 (14)

2.5. MERNA NESIGURNOST

Glavni cilj merenja je donošenje valjanih odluka na osnovu merenja izvedenih nauzorku koji je deo osnovnog skupa. Rezultati merenja zavise od poznavanja faktorakoji utiču na rezultat ili nesigurnost mernih rezultata. Svaki korak procesa merenja dajedoprinos ukupnoj nesigurnosti merenja. Rezultat merenja (X) se prikazuju kaoizmerena vrednost (x) sa udruženom proširenom mernom nesigurnošću, U.

X = x ±U (15)

Merna nesigurnost nastaje tokom svih operacija koje se izvode nad uzorkom, počev oduzorkovanja, preko pripreme uzorka do procesa merenja. Neki izvori mernenesigurnosti poreklom od uzorkovanja su: heterogenost ili nehomogenost uzorka, uticajstrategije uzorkovanja (slučajni uzorak, uzorak uzet po šemi mreže, proporcionalniuzorak), uticaj nehomogenosti osnovnog skupa (raslojavanje tečnosti različitih gustina

Heterogenost

Veličinačesticai oblik

Uzorak/stabilnost

analitaDistribucija

Varijacija gustine

Varijacija veličine

Proporcionalna

SlučajnaSlojevito

slučajna

Strategija uzorkovanja

Kontaminacija

Veličina uzorka

Brojuzoraka

OperaterOprema za

uzorkovanje

Temperatura

Vlažnost

Vrstaposude

Vreme

U lab. uslovim

a

Rukovanjeuzorkom

Transport ikonzervisanje

Tipuzorka


22 23


15

mikrotalasna ekstrakcije traju neuporedivo kraće, ali je cena analize značajna zbogskupih uređaja.

2.8. VRSTE ANALITA I MATRIKSA

Matriks u kome se analiti određuju može biti: gasovit, tečan ili čvrst.

Analiti koji se pojavljuju u životnoj sredini, mogu biti veoma različita jedinjenjaorganske ili neorganske prirode.

Neorganska jedinjena, na primer metali, rastvaraju se pomoću kiselina; taj proces sezove digestija. Cilj pripreme je da se metali, vezani u raznim komplikovanimjedinjenjima, prevedu u soli. Kiseline kao što su: HCl, HBr, HF, H3PO4, razblaženaH2SO4 i razblažena HClO4 su neoksidujuće kiseline i rastvaraju metale redoksreakcijom. Ovim postupkom mogu biti izgubljeni C, S, P, F i Br, jer tokom rastvaranjanastaju isparljiva jedinjenja. Metalni halidi (HgCl2 i SnCl4) se takođe mogu izgubiti naovaj način. Vrela HCl je dobro sredstvo za rastvaranje silikata. Za rastvaranje pomoćuHCl, HBr, H3PO4, H2SO4 i HClO4, koriste se staklene ili platinske posude, a zarastvaranje sa HF, teflonske, srebrne ili polietilenske. Oksidujuće kiseline su HNO3,vruća koncentrovana H2SO4 i vruća koncentrovana HClO4 rastvaraju većinu metala.Vruća azotna kiselina ne rastvara zlato i platinu, ali u smeši 3:1 (HCl:HNO3), koja sezove carska voda, rastvara i zlato i platinu. Digestija se danas najčešće obavlja uzatvorenim teflonskim posudama, uz pomoć mikrotalasa. Vrlo često se za analizemetala koriste bojene reakcije i spektrofotometrija.

Danas postoji ogroman broj prirodnih i sintetisanih organskih jedinjenja. Organskajedinjenja mogu biti veoma različita po svojim osobinama: isparljiva, neisparljiva,termo-labilna ili termo-stabilna, jonizovana ili nejonizovana, malih molekula ili velikihmolekula itd..

Analiza uzoraka sa organskim jedinjenjima zavisi od osobina tih jedinjenja. Uzorcitreba da budu tako pripremljeni da se jedinjenja ne promene, odnosno da ostanu uoriginalnom hemijskom obliku. Ključna stvar kod pripreme organskih jedinjenja zaodređivanja jeste da ekstrakt koji se analizira mora da bude dovoljno prečišćen,oslobođen od ostalih supstanci iz matriksa i koncentrisan dovoljno da može bitidetektovan odgovarajućom tehnikom.

2.9. PRIPREMA GASOVITIH UZORAKA

Gasoviti uzorci (na primer vazduh) uzimaju se na dva suštinska načina. Prvi jeuzorkovanje koje traje kraće, na primer manje od 60 minuta, kada se dobijaju rezultatikoji važe samo za taj, slučajno odabrani vremenski interval. Takav uzorak uzet za kraćevreme zove se jednokratni uzorak ili pojedinačni slučajni gasoviti uzorak.


14

2.7. NAJČEŠĆI POSTUPCI PRIPREME

Postupci koji se koriste u toku pripreme uzoraka za analizu nekom od instrumentalnihtehnika, veoma su različiti. Postoje manuelni i automatizovani postupci pripreme. Štoje automatizacija na višem nivou, uređaj je skuplji i komplikovaniji. Automatizovanjelaboratorijskih procedura doprinosi poboljšanju produktivnosti u laboratoriji.Automatizacija istovremeno zahteva posebne instalacije, validacije, kontinualnoodržavanje uređaja, čime se ceo proces dodatno komplikuje. Neke od tehnika pripremesu: filtracija i centrifugiranje, uklanjanje nerastvorljivih komponenti, taloženjeneželjenih komponenti praćeno filtriranjem ili centrifugiranjem, tečno/čvrstaekstrakcija praćena filtriranjem i centrifugiranjem, tečno/tečna ekstrakcija,ultrafiltracija, ekstrakcija uparivanjem jona (Ion-pair extraction), derivatizacija,kompleksiranje, liofilizacija (Freeze-drying), čvrsto fazna ekstrakcija, jonska izmena,predkoncentrisanje ili dovođenje analita do veće koncentracije pre analize i slično.

Najbolji metod pripreme je kada nema pripreme već se uzorak direktno uvodi u uređajkoji daje analitičke podatke. Ovo je moguće u malom broju slučajeva, na primer kododređivanja koncentracije Na i K u vodi plameno-fotometrijski ili kod analizetrihalometana u vodi primenom „head space“ tehnike praćene analizom gasnomhromatografijom.

U laboratorijama su jednostavniji postupci pripreme, kao što je merenje, podešavanjepH vrednosti, filtriranje, razblaživanje najzastupljeniji, dok su, istovremeno, složeneinstrumentalne tehnike ređe zastupljene zbog visoke cene, specifičnog održavanja,posebnih reagenasa i potrebe za obučavanjem za rad na uređaju.

Tokom analiza tragova jedinjenja, najčešće se primenjuje više postupaka pripreme.Nakon uzorkovanja potrebno je odlučiti da li se analizira ceo uzorak ili samo jedannjegov deo. Za analize tragova analizira se ceo uzorak. Kada su analiti koji se ispituju uuzorku u većoj koncentraciji, moguće je analizirati samo jedan deo uzorka. Jedino uslučaju kada je uzeti uzorak u potpunosti homogen, poduzorak valjano reprezentuje ceouzorak i rezultat predstavlja osobinu celog skupa.

Na primer, zemljište predstavlja vrlo nehomogen matriks. Potrebno je izdvojitikamenčiće i ostatke biljnog materija iz zemljišta, samleti ga i tek tada je uzorakhomogen i spreman za poduzorkovanje.Uzorak se priprema tako da se analiti umatriksu, čiji se sadržaj želi odrediti, dovedu na koncentracioni nivo koji je mogućedetektovati odgovarajućim instrumentom. Treba minimizirati i ukloniti interferencijematriksa sa analitima koji se određuju. Najčešće je potrebno potpuno izdvojiti analite izmatriksa. Izbor metoda analize i pripreme uzorka zavisi od prirode matriksa i analita.

Najčešće je cena analize obrnuto proporcionalna utrošku vremena. Najjeftinija jeekstrakcija u soksletu, ali najduže traje. Ekstrakcija superkritičnim fluidom (SFE) i


24 25


17

2.10. PRIPREMA ČVRSTIH UZORAKA

Čvrsti uzorci zahtevaju više kreativnosti tokom pripreme. Jedino je uzorke lekovamoguće analizirati nakon prostog rastvaranja i razblaživanja. U analizi lekova aktivnasupstanca koja se analizira, može se lako rastvoriti, nakon čega je najčešće potrebnorazblažiti i filtrirati rastvor pre injektiranja u hromatograf. Ako su lekovi u čvrstomobliku, potrebno ih je samleti, ekstrahovati, razblažiti i filtrirati. Važno je da se celakoličina odmerenog alikvota rastvori. Ovde je najznačajnije odabrati odgovarajućirastvarač koji rastvara organsko jedinjenje, ne utiče na njegovu strukturu ikompatibilan je sa instrumentalnom tehnikom koja će se koristiti za analizu dobijenograstvora.

Čvrsti uzorci se moraju homogenizovati tako da cela količina laboratorijskog uzorkaima isti sastav. Čvrste uzorke često treba i osušiti pre mlevenja. Rezultati analizezemljišta se uvek izražavaju na apslutno suvo zemljište. Mlevenjem se čvrsta supstancadovodi u praškasto stanje, čime se u procesima ekstrakcije dobija veća dodirnapovršinu između čvrstog matriksa i ratvarača. Mlevenje se ne preporučuje za termo-labilne supstance. Sušenje uzoraka sa isparljivim analitima treba obaviti liofilizacijom.Za mlevenje čvrstih uzoraka može da se koristi avan sa tučkom ili kuglični mlin. Svežbiljni materijal se takođe može mleti u avanu uz pomoć tečnog azota. Kugličnimmlinom se mogu samleti najtvrđi materijali. Kuglični mlin predstavlja čelični loptastisud-rotor u koji se sipa materijal koji se melje, i zajedno sa njim kuglice od tungsten-karbida ili keramike. Rotor se zatim obrće i trese velikom brzinom, a kuglice u njemuposkakujući melju materijal. Ovaj postupak se koristi i za razbijanje ćelija radiekstrakcije masti iz mesa. U tom slučaju se u rotor stavljaju kuglice, meso i organskirastvarač. Homogenizacija traje nekoliko minuta.

Danas se koriste brojni postupci pripreme uzoraka u čvrstom stanju: ekstrakcijačvrsto – tečno, sonifikacija, sokslet ekstrakcija, ubrzana čvrsto-tečna ekstrakcija (ASE),ekstrakcija superkritičnim fluidom, ekstrakcija pomognuta mikrotalasima.Ekstrakcija čvrsto-tečno je postupak rastvaranja analita u rastvaraču, koji ne mora darastvara ceo uzorak. Ovo je najjednostavnija tehnika ekstrakcije. Uzorak se stavi uposudu i doda se pogodan rastvarač u dovoljnoj količini. Posuda se zatim mućkaodređeni vremenski period. Nerastvorene supstance se odvoje filtriranjem ilicentrifugiranjem. Postupak je dobar za supstance koje su lako rastvorljive i nisu jakovezane za matriks. Često se uzorak tokom ekstrakcije zagreva uz refluks radiubrzavanja procesa ekstrakcije, u slučajevima kada temperatura ne utiče na analite.

Sonifikacija je tehnika koja ultrazvukom potpomaže ekstrakciju čvrsto-tečno.Ultrazvuk su zvučni talasi frekvence veće od 20 KHz. Primenjuje se tako da se finosamleveni čvrsti uzorak suspenduje u rastvaraču i postavi u ultrazvučno kupatilo.Ultrazvuk pomaže rastvaranje, a temperatura povećava efikasnost ekstrakcije.Američka agencija za zaštitu životne sredine (US EPA) je usvojila i validizovala


16

Jednokratni gasoviti uzorak vazduha, uzet u jednom vremenskom perodu, na određenojlokaciji, u samo jednom ponavljanju, daje podatke o trenutnom stanju. Drugi, češćimetod uzorkovanja vazduha je uzorkovanje tokom dužeg vremenskog perioda, naprimer 8 sati ili više, gde se dobija prosečan sadržaj analita u vazduhu. Prosek sedobija kada se ukupna nađena količina analita iz vazduha podeli sa brojem časovatrajanja uzorkovanja.

Tehnike koje se primenjuju za uzorkovanje gasovitih uzoraka su: apsorpcija na čvrstomnosaču, apsorpcija u tečnosti, „head-space samping” uzorkovanje gornjeg prostora i“Purge and trap” uzorkovanje, “isperi pa uhvati”

Apsorpcija na čvrstom nosaču (solid-phase trapping) - gasoviti uzorak se usisavakroz porozni čvrsti apsorpcioni materijal kao što je silika gel ili poliuretanska pena(PUF). Na ulazu je, najčešće, postavljen sinter filter radi uklanjanja čvrstih čestica.Ovatehnika se koristi za srednje isparljiva jedinjenja kao što su policiklični aromatičniugljovodonici i pesticidi. Apsorpcioni materijal se zatim ekstrahuje pogodnimrastvaračima, a dobijeni ekstrakt se analizira pogodnom tehnikom. Apsorpcionimaterijal može biti pakovan u obliku diska ili u staklene cevčice. U oba slučajapotrebno je određeno vreme pumpati gasoviti uzorak kroz apsorpcioni materijal.

Apsorpcija u tečnosti - gas se pomoću pumpe usisava u sitnim mehurićima, krozpogodan rastvarač koji zadržava analite iz gasne faze. Rastvor se analizira pogodnomtehnikom.

Uzorkovanje gornjeg prostora (head-space samping) - ova tehnika jeautomatizovana. Postupak je takav da se čvrst ili tečan uzorak sipa u posudu zauzorkovanje – vijal određene zapremine (5 - 20 ml). Vijal se hermetički zatvori itemperira na odgovarajućoj temperaturi. Kada se postigne koncentracioni ekvilibrijumizmeđu donjeg i gornjeg prostora u vijalu, gasna faza se ubacijuje u gasni hromatograf.Ova tehnika se koristi za određivanje tragova lakoisparljivih supstanci, na primer kododređivanja tragova etanola u krvi.

Uzorkovanje “isperi pa uhvati” (purge and trap) – predstavlja metod za izdvajanjeisparljivih analita iz tečnih ili čvrstih matriksa, koncentrisanja i nakon toga uvođenja ugasni hromatograf. Ova tehnika je slična tehnici uzorkovanja gornjeg prostora . Uzorakse stavlja u temperiran i hermetički zatvoren vijal i ispira se inertnim gasom kojiprolazi kroz porozni čvrsti apsorber, gde se analiti koncentrišu. Apsorber može biti nasobnoj temperaturi, ali i na temperaturi znatno nižoj od sobne. Analiti sa apsorbera senakon završene ekstrakcije desorbuju povećanjem temperature apsorbera i uvode ugasni hromatograf. Ova tehnika se primenjuje kod analize isparljivih organskihjedinjenja u vodi (trihalometani).


26 27


19

temperature ne može se prevesti u gasovito stanje. Fluid u superkritičnom stanjuistovremeno poseduje osobine i gasa i tečnosti. Fluid difunduje u materijal kao gas, aima moć rastvaranja kao tečnost.

Slika 4. Fazni dijagram ugljen-dioksida

SFE se koristi za ekstrakciju nepolarnih do srednje polarnih analita iz čvrstih uzoraka.Uzorak se postavlja u specijalnu posudu kroz koji prolazi fluid u superkritičnom stanju.Fluid je određene gustine, koja zavisi od primenjenog pritiska i temperature, rastvaraanalite; nakon ekstrakcije fluid se dovodi na prihvatnu kolonu gde isparava u atmosferu,a analiti se vezuju za čvrsti adsorbens. Prednost ove tehnike je bolja difuzivnost, manjiviskozitet i bolja selektivnost ekstracije. Fluid rastvara različite klase jedinjenja uzavisnosti od gustine koju ima na određenoj temperaturi i pritiska. Menjanjem gustinemenjaju se osobine fluida. Na većim gustinama fluid ima osobine nepolarnograstvarača. Polarnost raste sa opadanjem gustine. Polarnost fluida se može podešavatidodatkom modifikatora polarnosti, i to mogu biti metanol, aceton i drugi rastvarači kojise u manjem procentu dodaju u superkritični fluid.

Tabela 1. Kritična parametri različitih supstanci za superkritično stanje

Fluid Molekulskamasa, (g/mol)

Kritičnatemperatura,

(K)

Kritičnipritisak, (atm)

Kritičnagustina, (g/cm3)

Ugljen-dioksid 44,1 304,1 72,8 0,469Voda 18,0 647,1 217,5 0,322Metan 16,4 190,4 45,4 0,162

Najvažnija prednost ekstrakcije superkritičnim fluidom je automatizacija procesa, štoobezbeđuje reproduktivnost ekstrakcionih uslova. Druga važna prednost je da semenjanjem uslova pritiska i temperature fluida, menjaju osobine fluida i polarnost. Nanižem pritisku i temperaturi fluid ima manju gustinu i veću polarnost, i rastvara polarneanalite. Na višem pritisku i temperaturi fluid je veće gustine i rastvara nepolarnajedinjenja. Značajna prednost korišćenja CO2 kao ekstrakcionog fluida je manje


19







(K)






19







(K)






18

metode kod kojih se ekstrakcija obavlja uz pomoć ultrazvuka. Rastvarač se bira uskladu sa analitom koji se ekstrahuje. Ova tehnika je jednostavna i zbog toga vrlopopularna, a takođe i vrlo efikasna. Na primer, poliuretanska pena korišćena zamonitoring vazduha u blizini mesta gde se primenjuju pesticidi, može se ekstrahovatipomoću acetona uz pomoć ultrazvuka.

Sokslet ekstrakcija je najčešće korišćena metoda ekstrakcije čvrstih uzoraka. Uzorakse postavlja u čauru sokslet aparata. Rastavarač se nalazi u balonu aparata. Iznad čaurese nalazi vodeni hladnjak (kondenzator). Grejanjem balona rastvarač isparava i odlazi ukondenzator i iz kondenzatora se sliva u ekstrakcionu čauru gde polako natapa uzorak učauri i rastvara analite. Sistem je tako konstruisan da kada rastvarač napuni čauru doodređene zapremine, dolazi do pretakanja rastvarača u balon, i ceo ciklus se ponavlja.Brzina izmene rastvarača podesi se tako da dođe 4-5 izmena za 60 minuta,podešavanjem temperature zagrevanja balona sa rastvaračem. Ekstrakcija najčešće traje18–24 časa. Analiti moraju biti temperaturno stabilni na temperaturi ključanjarastvarača. Rastvarač treba da bude tako odabran da dobro rastvara analite od interesa.Široko je u upotrebi u analizi životne sredine. Jedini nedostatak sokslet aparata jevelika količina rastvarača koji se troši za ekstrakciju. Poslednjih godina razvijen jesistem sokslet aparata, koji za kraće vreme ekstrahuju analite od interesa uz pomoćmikrotalasa (Focused microwaveassisted Soxhlet extracion - FMASE); primenjuje seza analizu PAH-ova u zemljištu, i ultrazvuka (ultrasound-assisted Soxhlet extraction);primenjuje se za ekstrakciju ulja iz semena. Mikrotalasi i ultrazvuk ubrzavaju procesekstrakcije uz isti prinos.

Ubrzana čvrsto-tečna ekstrakcija (ASE Accelerated Solvent Extraction) - ovainstrumentalna tehnika za ekstrakciju koristi različite kombinacije organskih rastvaračapod povećanim pritiskom i temperaturom. Proces počinje postavljanjem uzorka učeličnu čauru – ćeliju, gde se automatski ubacuje rastvarač ili smeša rastvarača, ćelijase zagreva i drži na konstantnom pritisku. Nakon određenog vremena (10-20 minuta)ćelija se ispere svežom porcijom rastvarača koji odlazi u prihvatnu posudu. Zatim sećelija ispere azotom i spremna je za novu ekstrakciju. Ceo proces ASE jeautomatizovan, koristi se manje rastvarača (20 ml), vreme ekstrakcije je skraćeno (10-20 minuta), a ekstrakcije se izvode u serijama. Američka agencija za zaštitu životnesredine (EPA) razvila je standardizovane metode koje koriste ovu tehniku zaodređivanje polihlorisanih bifenila, policikličnih aromatičnih ugljovodonika,organohlornih i organofosfornih pesticida iz zemljišta (US EPA SW Method 3545).

Ekstrakcija superkritičnim fluidom SFE (Supercritical Fluid Extraction)jemoderna tehnika koja kao ekstrakciono sredstvo koristi fluid u superkritičnom stanju.Najčešće se kao superkritični fluid koristi ugljen-dioksid. Ugljen-dioksid prelazi usuperkritično stanje iznad kritične tačke. Kritična tačka (KT) u faznom dijagramuugljen-dioksida (slika 4) je definisana kritičnim pritiskom (KP) i kritičnomtemperaturom (KT). Kritične temperature i pritisci za različite supstance predstavljenesu u tabeli 1. Fluid koji je na kritičnoj ili višoj temperaturi, podizanjem pritiska nemože se kondenzovati u tečnost. Fluid na kritičnom ili višem pritisku, povećanjem


28 29


21

magnetno mešaju, čime se obezbeđuje: brža reakcija, bolji kontakt rastvarača i uzorka,sprečavanje raslojavanja u posudi i obezbeđuje se efikasnija distribucija temperature.

2.11. PRIPREMA TEČNIH UZORAKA

Tečni uzorci mogu u nekim slučajevima biti analizirani direktno bez pripreme(trihalometani u vodi, tvrdoća,). Nekada je potrebno vodeni uzorak upariti do određenezapremine i direktno injektirati. Nekada je dovoljno upariti do suva i ostatak rastvoritiu nekom rastvaraču. Najčešći slučaj je kada su neke od supstanci rastvorenih u vodiinterference koje se moraju ukloniti dodatnim postupcima prečišćavanja filtracijom,centrifugiranjem, tečno-tečnom ekstrakcijom, čvrsto-faznom ekstrakcijaom i čvrsto-faznom mikroekstrakcijom.

Tečno-tečna ekstrakcija - Za tečno-tečnu (T/T) ekstrakciju se koriste dva rastvaračakoja se ne mešaju, od kojih je jedan polaran, a drugi nepolaran. Izvodi se u levku zaodvajanje. Analit koji se ekstrahuje se raspoređuje između dve tečnosti na bazi njegoverastvorljivosti. Nepolarni veliki molekuli se bolje rastvaraju u organskim rastvaračima.Polarne supstance se bolje rastvaraju u vodi. Na primer, pesticidi prisutni u vodi semogu ekstrahovati heksanom, dihlormetanol ili pentanom.

Distribucija analita između dve tečnosti (ili dve faze) tokom tečno-tečne ekstrakcije jedefinisana Nerstovim izrazom za raspodelu između dve faze koje se ne mešaju:

(16)

Gde su :

KD je koeficijent raspodele,

Co je koncentracija analita u organskoj fazi i

Caq je koncentracija analita u vodenoj fazi.

Udeo analita koji je ekstrahovan organskom fazom je E. Predstavlja odnos količineanalita u organskoj fazi i ukupne količine analita:

= (17)

Gde su:


20

zagađivanje životne sredine organskim rastvaračima. SFE se u industrijskim uslovimakoristi za dekafeinizaciju kafe, ekstrakciju organskih analita, pesticida, PAH-ova, PCB-a, ulja i drugih organskih jedinjenja.

Ekstrakcija pomognuta mikrotalasima – Mikrotalasi se koriste za ubrzavanjeekstrakcije, kako neorganskih, tako i organskih analita iz čvrstog matriksa. Mikrotalasisu elektromagnetni talasi talasne dužine od 1mm do 1 m. Postoji tri vrste interakcijamikrotalasa sa materijalima. Refleksija ili odbijanje mikrotalasa, do kojeg dolazi ukontaktu mikrotalasa sa metalima. Tako ne dolazi do apsorpcije zračenja, nego sezračenje odbija. Prolazak kroz materije koje su transparentne, kao što je većinatečnosti (izuzev vode). Mikrotalasi prolaze kroz providne tečnosti i apsorbuju se umalom procentu. Apsorpcija - kada su mikrotalasi u kontaktu sa materijalima kojeapsorbuju zračenje, kao što je voda. Materijal se zagreva. Stepen apsorpcije mikrotalasazavisi od dielektričnih osobina materije.

Mikrotalasi proizvode toplotu kada materija zaustavlja ili usporava zračenje.Zaustavljanjem ili usporavanjem prolaska mikrotalasa kroz materijal dolazi do prenosaenergije i materijal se zagreva. Mikrotalasi zagrevaju čestice iznutra. Klasičnomtečnom ekstrakcijom dolazi do prenosa toplote iz pravca površine čestice ka unutra, akod mikrotalasnog zagrevanja, čestica se greje iznutra i prenos toplote je obrnut,odnosno od središta ka periferiji čestice.

Mikrotalasi zagrevaju materijal pomoću njihove jedinstvene osobine - oscilirajućegelektričnog i magnetnog polja. Samo polarne supstance reaguju na mikrotalasezagrevanjem. Polarni molekuli sa pozitivnim i negativnim krajem, kao što je voda,orijentišu se u zavisnosti od primenjenog polja, pokušavajući da promene orijentacijuuvek kada se promeni polarnost polja. Ako je frekvenca mikrotalasa prevelika, inercijasprečava molekule da se okrenu pre nego se polje promeni. Ako je frekvenca suvišeniska, svi molekuli će se jednako okretati i neće biti haotičnog kretanja. Kada jefrekvenca mikrotalasa adekvatna, molekuli će delom zauzimati položaj u skladu sapolarnošću polja, ali ne svi, i tada dolazi do haotičnog kretanja. Haotično kretanjemolekula proizvodi toplotu usled trenja između molekula.

Uređaji za mikrotalasnu ekstrakciju mogu biti izvedeni kao otvoren i kao zatvorensistem. Vrata mikrotalasne su izolovana sa pet slojeva teflona. Teflon je otporan natemperaturama do 350 °C, kao i na isparenja jakih mineralnih kiselina (HNO3, H2SO4,HCl, H3PO4 i HF). Mikroprocesor kontroliše distribuciju mikrotalasa u posudamasprečavajući pojavu vrućih tačaka. U zatvorenom sistemu posude za ekstrakciju suhermetički zatvorene i napravljene od inertnog materijala velike čistoće. Poklopac jeopremljen sigurnosnim ventilom, za slučaj kada pritisak u posudi pređe dozvoljeni,ventil se na trenutak otvara tada se smanjuje pritisak u reakcionoj posudi.Temperaturau posudama se kontroliše pomoću senzora.U uređaju se prati prisustvo isparenja prekosenzora za rastvarač. Senzor reaguje na: isparenja pobegla iz nepravilno zatvorenihposuda, isparenja koja je ispustio sigurnosni poklopac posude i isparenja kojadifunduju kroz mikropore posuda. Osetljivost senzora može da se podešava. Posude se


30 31


23

Ekstrakcija na normalnim fazama je slučaj kada su rastvarači nepolarni, a čvrstafaza polarna. Nepolarne čvrste faze su diol, cijano i amino supstituisane. Analiti se začvrstu fazu vezuju na bazi hidrofilnih interakcija polarno/polarno, vodoničnih veza, π-πinterakcija, interakcija dipol-dipol i interakcija dipol/indukovani dipol.

Ekstrakcija na bazi jonske izmene, gde je osnovni mehanizam privlačenje izmeđuanalita i čvrste faze na bazi elektrostatičkog privlačenja između naelektrisanih grupaanalita u rastvoru i naelektrisanih grupa na površini čvrste faze. Čvrste faze koje imajuosobine menjača jona, mogu biti:

SAX “Strong Anion Exchanger” – jaki anjonski menjač čije funkcionalne grupe sualifatični kvaternerni amini, baznog karaktera i pozitivno naelektrisani i zbog togaprivlače anjone iz rastvora.

SCX “Strong Cation Exchanger” – jaki katjonski menjač. Funkcionalne grupe napovršini silika gela su alifatične sulfonske kiseline jako kiselog karaktera, negativnonaelektrisane i privlače katjone iz rastvora.

WCX “Weak Cation Exchanger” – slabi katjonski menjač,kod koga su funkcionalnegrupe na površini silika gela alifatične karbonske kiseline, slabo kiselog karaktera,negativno naelektrisane i privlače slabe katjone iz rastvora.

WAX “Weak Anion Exchanger” – slabi anjonski menjač, funkcionalne grupe slabobaznog karaktera, privlače slabe anjone iz rastvora.

Ekstrakcija na bazi adsorpcije se odvija na površini nemodifikovane čvrste faze, kojamože biti aluminijum-oksid (Al2O3), florisil (magnezijum-silikat), envi-karb ili čistugljenik. Tokom apsorpcije dolazi do hidrofobnih i hidroflnih interakcija, u zavisnostiod toga koja čvrsta faza se koristi.

Polimerne čvrste faze sa hidrofilno-lipofilnim balansom – HLB, imaju na istomnosaču i hidrofilne i lipofilne funkcionalne grupe. To omogućuje zadržavanje i polarnihi nepolarnih analita na istoj čvrstoj fazi. Postoje HLB faze katjonskog i anjonskog tipasa funkcionalnim grupama, koje su jaki i slabi menjači jona; HLB čvrsta faza jepogodna za polarna i nepolarna jedinjenja. Dobro se kvasi sa vodom, sušenjem nemenja osobine.

Uticaj pH na SPE Rastvori koji se koriste kod SPE imaju širok oseg pH vrednosti.Sve faze na bazi silika gela su stabilne u intervalu pH 2 – 7,5. Na višim pHvrednostima može da dođe do hidrolize funkcionalnih grupa na površini silika gela(funkcionalne grupe se oslobađaju sa površine silika gela). Silika gel na višim pHvrednostima počinje da se rastvara. Ako je potrebno koristiti SPE kolone na višim pHvrednostima, mogu se koristiti polimerske ili ugljenične kolone, na primer kolone sa


22

Vo zapremina organske faze,

Vaq je zapremina vodene faze,

V je odnos Vo/Vaq.

Organski rastvarač treba da bude nerastvoran u vodi, lako isparljiv i sa velikimafinitetom prema analitu. Koeficijent raspodele KDse može se povećati zamenomorganskog rastvarača koji ima veći afinitet prema analitu, podešavanjem naboja analitasa ciljem da bude neutralan i kao takav rastvorljiviji u organskom rastvaraču, iisoljavanjem – dodatkom inertne soli u vodeni sloj. Zapremine rastvarača kod T/Tekstrakcije su više desetina mililitara. Ekstrakcija se ponavlja sa 2-3 porcije rastvarača.Ekstrakti se spajaju. Ekstrakt je potrebno upariti. Uparava se u rotacionom vakuumuparivaču ili u struji inertnog gasa. T/T ekstrakcija je jednostavna za izvođenje i čestose koristi.

Ekstrakcija na čvrstoj fazi - SPE (Solid Phase Extraction) se koristi kod pripremetečnih uzoraka za prečišćavanje i ekstrakciju srednje isparljivih i neisparljivih analita.Koristi se i za prečišćavanja ekstrakata nastalih ekstrakcijom različitih matriksa. Čvrstefaze koje su u upotrebi, danas su modifikovani silika gel, florisil, ugljenik, kao ipolimerni materijali sa hidrofilno-lipofilnim funkcionalnim grupama.

Slika 5. Silika gel

Osnova čvrstih faza je silika gel, slika 5. Hidroksilne funkcionalne grupe na površinisilika gela zamenjene su funkcionalnim grupama koje menjaju karakter površine injegove osobine. Supstitucija je izvedena nepolarnim (C-18, C-8, C-4, fenil) ipolarnim (CN, NH2, diol) fukcionalnim grupama.

Ekstrakcija na čvrstoj fazi može biti na bazi reverznih faza (C-18, C-18, C-4, fenil),normalnih faza (CN, Diol, NH2), jonske izmene (SAX, SCX, WCX, WAX) i adsorpcije(Al2O3, florisil, envi-karb).

Ekstrakcija na reverznim fazama predstavlja slučaj kada je čvrsta faza nepolarnog, arastvarači polarnog karaktera. Analiti nepolarnog karaktera, rastvoreni u polarnomrastvaraču, vezuju se za čvrstu fazu na bazi hidrofobnih interakcija, jer nepolarni analitiimaju afinitet prema nepolarnoj čvrstoj fazi.


32 33


25

Čvrsta faza može biti ugrađena u filtracioni disk (prečnik 47 mm) i tako je pogodna zaekstrakcije organskih jedinjenja iz velikih zapremina vode. Disk sa čvrstom fazom sepriprema kao i čvrsta faza u kolonama, ali omogućuje veće protoke, čime se ubrzavaproces ekstrakcije. Za njihovo korišćenje potreban je specifičan laboratorijski pribordizajniran za tu namenu. .

Rastvarači koji se najčešće koriste za ekstrakciju na čvrstoj fazi poređani po polarnosti,prikazani su u tabeli 2. Niz rastvarača poređanih na osnovu polarnosti, naziva seelutropska serija. Nepolarni rastvarači se koriste sa polarnom čvrstom fazom, a polarnirastvarači sa nepolarnom čvrstom fazom.

Tabela 2. Rastvarači i njihova polarnost.aPolarnost se povećava od gore prema dole.

bKarakter reverzne faze slabi, a normalne se povećava, od gore prema dole.

Izbor prave metode ekstrakcije na čvrstoj fazi podrazumeva poznavanje svih početnihuslova. Potrebno je znati vrstu matriksa u kome je analit od interesa rastvoren,rastvorljivost analita u vodi i organskim rastvaračima, da li je analit naelektrisanojedinjenje ili neutralno, anjonskog ili katjonskog tipa, polarno ili nepolarno, i takodalje.

Čvrsto-fazna mikro ekstrakcija ili SPME (Solid Phase Micro Extraction) predstavljaposebnu tehniku kod koje se koristi ekstrakcija na čvrstoj fazi SPE. Čvrsta faza jenanesena na vlakno. Vlakno se izlaže procesu adsorpcije u atmosferi koja se ispituje,analiti koji imaju afinitet prema čvrstoj fazi apsorbuju se na čvrstu fazu na vlaknu.Nakon određenog vremena, kada se uspostavi ravnoteža, vlakno se uvodi u GC iliHPLC gde se u zagrejanom injektoru odvija proces termalne desorpcije. Prednosti ove

Polarnosta Karakter reverzne inormalne fazeb Rastvarač Meša se sa

vodom

Nepolaran

Polaran

Jakareverzna faza

Slabareverzna faza

Slabanormalna faza

Jakanormalna faza

Heksan NeIzooktan Ne

Ugljen-tetrahlorid NeHloroform Ne

Metilen-hlorid NeTetrahidrofuran DaDietil-etar NeEtil-acetat LošeAceton Da

Acetonitril DaIzopropanol DaMetanol DaVoda Da

Sirćetna kiselina Da


25

Čvrsta faza može biti ugrađena u filtracioni disk (prečnik 47 mm) i tako je pogodna zaekstrakcije organskih jedinjenja iz velikih zapremina vode. Disk sa čvrstom fazom sepriprema kao i čvrsta faza u kolonama, ali omogućuje veće protoke, čime se ubrzavaproces ekstrakcije. Za njihovo korišćenje potreban je specifičan laboratorijski pribordizajniran za tu namenu. .

Rastvarači koji se najčešće koriste za ekstrakciju na čvrstoj fazi poređani po polarnosti,prikazani su u tabeli 2. Niz rastvarača poređanih na osnovu polarnosti, naziva seelutropska serija. Nepolarni rastvarači se koriste sa polarnom čvrstom fazom, a polarnirastvarači sa nepolarnom čvrstom fazom.

Tabela 2. Rastvarači i njihova polarnost.aPolarnost se povećava od gore prema dole.

bKarakter reverzne faze slabi, a normalne se povećava, od gore prema dole.

Izbor prave metode ekstrakcije na čvrstoj fazi podrazumeva poznavanje svih početnihuslova. Potrebno je znati vrstu matriksa u kome je analit od interesa rastvoren,rastvorljivost analita u vodi i organskim rastvaračima, da li je analit naelektrisanojedinjenje ili neutralno, anjonskog ili katjonskog tipa, polarno ili nepolarno, i takodalje.

Čvrsto-fazna mikro ekstrakcija ili SPME (Solid Phase Micro Extraction) predstavljaposebnu tehniku kod koje se koristi ekstrakcija na čvrstoj fazi SPE. Čvrsta faza jenanesena na vlakno. Vlakno se izlaže procesu adsorpcije u atmosferi koja se ispituje,analiti koji imaju afinitet prema čvrstoj fazi apsorbuju se na čvrstu fazu na vlaknu.Nakon određenog vremena, kada se uspostavi ravnoteža, vlakno se uvodi u GC iliHPLC gde se u zagrejanom injektoru odvija proces termalne desorpcije. Prednosti ove

Polarnosta Karakter reverzne inormalne fazeb Rastvarač Meša se sa

vodom

Nepolaran

Polaran

Jakareverzna faza

Slabareverzna faza

Slabanormalna faza

Jakanormalna faza

Heksan NeIzooktan Ne

Ugljen-tetrahlorid NeHloroform Ne

Metilen-hlorid NeTetrahidrofuran DaDietil-etar NeEtil-acetat LošeAceton Da

Acetonitril DaIzopropanol DaMetanol DaVoda Da

Sirćetna kiselina Da


24

oznakom ENVI-Chrom ili ENVI-Carb. Polimerske i ENVI-Carb kolone su stabilne ipH ospegu od 1 do 14.

Proces ekstrakcije na čvrstoj fazi je proces u pet koraka, i to: izbor odgovarajućečrste faze, kondicioniranje čvrste faze, nanošenje uzorka, spiranje nečistoća (pranje) ieluiranje analita vezanih za čvrstu fazu.

Kondicioniranje reverzne faze se obavlja organskim rastvaračem koji se meša savodom, nakon čega se kolona ispira vodom ili vodenim puferom. Metanol kvasipovršinu faze i alkil lanci se opružaju, što omogućuje vodi da prodre do površine silikagela. Kondicioniranje normalne faze se obavlja organskim rastvaračem u kome surastvoreni analiti. Kondicioniranje faza menjača jona SAX i SCX se, za uzorkerastvorene u nepolarnom organskom rastvaraču, obavlja sa istim organskimrastvaračem. Za uzorke rastvorene u polarnom rastvaraču, menjači jona sekondicioniraju sa organskim rastvaračem koji se meša sa vodom, nakon čega se isperuvodenim rastvorom odgovarajućeg pH, odgovarajućeg sadržaja organskog rastvarača isoli. Pranje kolona se obavlja pogodnim rastvaračima koji će rastvarati interference, aneće rastvarati analite od interesa koji su vezani za čvrstu fazu. Eluiranje se izvodirastvaračima koji će rastvoriti analite vezane za čvrstu fazu, odnosno rastvaračimaprema kojima analiti od interesa imaju veći afinitet nego prema čvrstoj fazi.

Čvrsta faza može biti pakovana u plastične ili staklene kolone, može biti vezana nainertnom nosaču u obliku diskova ili naneta na iglu za potrebe tehnike čvrsto-faznemikro ekstrakcije (Solid Phase Micro Extraction). Čvrsta faza različitih dimezijačestica i pora je pakovana u kolone u količininama od 100 mg do nekoliko grama. Dabi se obezbedio protok kroz kolone sa čvrstom fazom, potrebno je primeniti vakuum nadonjem kraju kolone ili pritisak na gornjem kraju kolone, slika 6.

Slika 6. Vakuum postolje za ekstrakciju na čvrstoj fazi


24

oznakom ENVI-Chrom ili ENVI-Carb. Polimerske i ENVI-Carb kolone su stabilne ipH ospegu od 1 do 14.

Proces ekstrakcije na čvrstoj fazi je proces u pet koraka, i to: izbor odgovarajućečrste faze, kondicioniranje čvrste faze, nanošenje uzorka, spiranje nečistoća (pranje) ieluiranje analita vezanih za čvrstu fazu.

Kondicioniranje reverzne faze se obavlja organskim rastvaračem koji se meša savodom, nakon čega se kolona ispira vodom ili vodenim puferom. Metanol kvasipovršinu faze i alkil lanci se opružaju, što omogućuje vodi da prodre do površine silikagela. Kondicioniranje normalne faze se obavlja organskim rastvaračem u kome surastvoreni analiti. Kondicioniranje faza menjača jona SAX i SCX se, za uzorkerastvorene u nepolarnom organskom rastvaraču, obavlja sa istim organskimrastvaračem. Za uzorke rastvorene u polarnom rastvaraču, menjači jona sekondicioniraju sa organskim rastvaračem koji se meša sa vodom, nakon čega se isperuvodenim rastvorom odgovarajućeg pH, odgovarajućeg sadržaja organskog rastvarača isoli. Pranje kolona se obavlja pogodnim rastvaračima koji će rastvarati interference, aneće rastvarati analite od interesa koji su vezani za čvrstu fazu. Eluiranje se izvodirastvaračima koji će rastvoriti analite vezane za čvrstu fazu, odnosno rastvaračimaprema kojima analiti od interesa imaju veći afinitet nego prema čvrstoj fazi.

Čvrsta faza može biti pakovana u plastične ili staklene kolone, može biti vezana nainertnom nosaču u obliku diskova ili naneta na iglu za potrebe tehnike čvrsto-faznemikro ekstrakcije (Solid Phase Micro Extraction). Čvrsta faza različitih dimezijačestica i pora je pakovana u kolone u količininama od 100 mg do nekoliko grama. Dabi se obezbedio protok kroz kolone sa čvrstom fazom, potrebno je primeniti vakuum nadonjem kraju kolone ili pritisak na gornjem kraju kolone, slika 6.

Slika 6. Vakuum postolje za ekstrakciju na čvrstoj fazi


34 35


27

3. ODREĐIVANJE FIZIČKIH OSOBINA

Kada se zahteva brzina u proceni kvaliteta materijala, tada jednostavne tehnike iinstrumenti imaju prednost. Određivanje fizičkih osobina je najstariji metod procenečistoće supstanci. Ovaj metod polazi od pretpostavke da čista supstanca imajedinstvene vrednosti za tačku topljenja, ključanja, gustine, indeks refrakcije.Viskozitet i konduktivitet daju podatak o opštim osobinama materijala. Postoje tablicesa karakterističnim vrednostima za gustinu, viskozitet, konduktivitet vodenih iorganskih rastvora. Sve ove osobine se jako menjaju sa udelom prisutnih nečistoća.Osnovne fizičke osobine supstanci su tačka topljenja, tačka ključanja, viskozitet,gustina, indeks refrakcije i konduktivitet.

3.1.TAČKA TOPLJENJA I TAČKA KLJUČANJA

Topljenje nastaje kada se supstanca (kristalne struktura) zagreje do temperature kada jekinetička energija molekula veća od energije kristalne rešetke. Niža energija kristalnerešetke znači i nižu tačku topljenja supstance. Ključanje nastaje kada se temperaturatečnosti podigne toliko da je napon pare tečnosti jednak atmosferskom pritisku.

Topljenje je proces prelaska iz čvrstog u tečno stanje. Topljenje se odigrava nakonstantnoj temperaturi, sve dok postoje i čvrsta i tečna faza istovremeno. Tako se iključanje odigrava na konstantnoj temperaturi, sve dok je prisutna tečna faza. Na slici 7.segment A predstavlja zagrevanje čvrste supstance do trenutka topljenja, segment Bpredstavlja ravnotežu čvrsto/tečno tokom procesa topljenja (temperatura je konstantnatokom topljenja), segment C predstavlja zagrevanje tečnosti, segment D predstavljaravnotežu tečnost/gas tokom procesa isparavanja gde se vidi da dovođenjem toplote nedolazi do povećanja temperature i da je temperatura konstantna sve dok ne ispari celakoličina tečnosti; segment E predstavlja zagrevanje pare.


26

tehnike su mali utrošak vremena za pripremu uzorka, nema upotrebe rastvarača ikratko je vreme analize. SPME može da se koristi za ispitivanje tečnih i gasovitihuzoraka. Nedostatak ove tehnike je cena aparature, kao i opadanje efikasnosti vlaknatokom vremena. Vlakno se mora u određenim vremenskim intervalima menjati.

⸎


36 37


29

gde se vizuelno opaža da li dolazi do topljenja supstance. Sadržaj nečistoća veći od 1%uočljivo snižava Tt. Atmosferski pritisak vrlo malo utiče na Tt.

Određivanje Tk – Tečnost počinje da ključa kada se napon pare izjednači saatmosferskim pritiskom. Aparatura za određivanje Tk je izrađena od stakla; tečnost sezagreva u balonu i istovremeno joj se meri temperatura koja raste sve do početkaključanja. Kada ključanje počne, temperatura se ustali i ostaje konstantna sve doktečnost ključa. Nečistoće povećavaju Tk.

3.2. VISKOZITET

Viskozitet je pojava unutrašnjeg trenja pri kretanju tečnosti ili viskozitet je za tečnostimera otpora kretanju. Merenja viskoziteta se još zovu reološka merenja. Česticetečnosti se “lepe” za susedne čestice i za zidove posude, čime se kretanje tečnostiusporava. Viskozitet proizvoda je važna karakteristika (šamponi, sirupi). Kod polimeraviskozitet zavisi od dužine lanaca polimera, kao i od grananja. Na viskozit ne utičumale količine prisutnih nečistoća.

Postoji dinamički i kinematički viskozitet.

μ – dinamički viskozitet

ν - kinematički viskozitet ν = 𝜇𝜇𝜌𝜌

ρ - gustina tečnosti

Jedinice kojima se izražava dinamički viskozitet je P ili Poaz (g/cms) ili po SI sistemujedinica Paskal sekunda (Pas). 10 P = 1 kg·m−1·s−1 = 1 Pa·s,1 cP = 0.001 Pa·s = 1mPa·s. Voda na 20 oC ima viskozitet 1.0020 cP.

Jedinica za kinematički viskozitet je Stoks (cm2/s) ili 1 Stoks = 1 cm2/s. Viskozitetzavisi od temperature. Viskozitet vode se kreće od 1.79 cP na 0oC do 0.28 cP na 100oC.Viskozitet maslinovog ulja na 20 oC je 84 cP , a glicerina 1490 cP.

Određivanje viskoziteta - Merenje viskoziteta se zove reologija. Viskozitet se možeizmeriti na više načina. Izbor metode će zavisiti od opsega viskoznosti, kao i od togada li su tečnosti njutnovske ili nenjutnovske. Osobine njutnovskih tečnosti zavise samood temeprature i pritiska, a kod nenjutnovskih tečnosti osobine se menjaju saprimenjenom silom (skrob u vodi).

Za merenje viskoziteta koriste se različiti tipovi viskozimetara.To su Ubelodeovviskozimetar, kojim se viskozitet određuje merenjem brzine isticanja tečnosti,


28

Slika 7. Kriva zagrevanja čiste supstance na konstantnom pritisku

Fazni dijagram predstavljen je na slici 8. i pokazuje zavisnost agregatnog stanjasupstance od temperature i pritiska. Tačka topljenja ne zavisi mnogo od pritiska. Tačkaključanja značajnije zavisi od pritiska. Da bi se tačke ključanja mogle porediti, utabelama se nalaze tačke ključanja na normalnim uslovima (Tk ili Tt merene naatmosferskom pritisku od 1 atm). Nečistoće smanjuju Tt i povećavaju Tk supstance. Zaodređen broj jedinjenja postoji veza između molekulske mase i sniženja Tt, odnosnopovišenja Tk. Ova veza može da se iskoristi za izračunavanje MM supstance.

Slika 8. Fazni dijagram supstance

Određivanje Tt - Tačka topljenja se određuje pomoću aparata “Kofler bench”.Aparat je konstruisan tako da ima metalnu traku sa temperaturnim gradijentom odsobne temperature do 300°C. Supstanca se postavlja na bilo koji deo zagrejane trake,


28

Slika 7. Kriva zagrevanja čiste supstance na konstantnom pritisku

Fazni dijagram predstavljen je na slici 8. i pokazuje zavisnost agregatnog stanjasupstance od temperature i pritiska. Tačka topljenja ne zavisi mnogo od pritiska. Tačkaključanja značajnije zavisi od pritiska. Da bi se tačke ključanja mogle porediti, utabelama se nalaze tačke ključanja na normalnim uslovima (Tk ili Tt merene naatmosferskom pritisku od 1 atm). Nečistoće smanjuju Tt i povećavaju Tk supstance. Zaodređen broj jedinjenja postoji veza između molekulske mase i sniženja Tt, odnosnopovišenja Tk. Ova veza može da se iskoristi za izračunavanje MM supstance.

Slika 8. Fazni dijagram supstance

Određivanje Tt - Tačka topljenja se određuje pomoću aparata “Kofler bench”.Aparat je konstruisan tako da ima metalnu traku sa temperaturnim gradijentom odsobne temperature do 300°C. Supstanca se postavlja na bilo koji deo zagrejane trake,


38 39


31

Gustina čvrstih supstanci se meri na bazi zapremine tečnosti koju čvrsto telo istisne.Takođe je moguće izmeriti gustinu tako da se izmeri masa tela, a zatim se telo uroni utečnost poznate gustine i opet se izmeri masa.

Gustina gasova se može izmeriti pomoću piknometra. Posuda poznate zapremine senapuni gasom i izmeri se njena masa. Zatim se vakuumom izvuče gas i izmeri se masaprazne posude. Drugi način određivanja gustine gasa je pomoću jednačine gasnogstanja: PV=nRT, gde je n broj mola gasa, R je gasna konstanta 8,315 i n/V, (n/V=P/RT).

Merenjem pritiska i temperature gasa izračunava se gustina gasa (n/V) izražena umol/m3. Množenjem sa molekulskom masom gasa dobija se gustina u kg/m³.

3.4. INDEKS REFRAKCIJE

Indeks refrakcije je odnos brzine svetla u vazduhu i u supstanci od interesa. Zavisi odtemperature, a veoma zavisi i od čistoće supstance.

Merenje indeksa refrakcije - Svetlo se prelama prolazeći kroz dva medija koji imajurazličit indeks refrakcije. Ovo se može videti kada se uroni slamka u čašu sa vodom,gde slamka izgleda prelomljeno. Indeks refrakcije zavisi od temperature i čistoćesupstance.

Indeks refrakcije se meri refraktometrom. Refraktometar je jednostavan za upotrebu.Uzorak se postavlja između dve prizme. Pošto indeks refrakcije zavisi od temperature,prizme su temperirane. Preko optičkog sistema se očitava indeks refrakcije. Kružnopolje koje se posmatra kroz okular instrumenta sadrži skalu na kojoj se očitavavrednost indeksa refrakcije. Njime se najčešće određuje sadržaj šećera u rastvoru.

3.5. pH VREDNOST

pH vrednost je pokazatelj aktivne-stvarne kiselosti rastvora i čvrstih supstanci uodredjenim koncentracijama ili suspenzijama i zasićenim rastvorima, na primerzemljišta.

pH se definiše sledećim izrazom: pH=-logcH3O+, gde je cH3O+ koncentracijavodonikovog-jona, odnosno hidratisanog jona vodonika-hidroksonijum-jona (H3O’),izražena u mol/l. pH vrednost rastvora sa kojima se radi u praksi je od 0 do 14. pHnajčistije vode bi trebalo da bude 7-neutralna sredina. Sredina je kisela ako ima pHvrednost u granicama 0 do 6, a bazna u granicama 8-14, što znači da kiselost opada od0 do 7, baznost se povećava od 7 do 14. Ovaj odnos je proistekao iz jonskog proizvodavode: KH2O=10-14=cH3O+•cOH-, ako se ovaj izraz logaritmuje i promeni znak sledi:pH+pOH=14. Analogno pH, pOH=-logcOH-, što je merilo koncentracije hidroksilnih-


30

viskozimetar sa padajućom kuglicom, gde se viskozitet određuje merenjem brzineponiranja metalne kugle u tečnosti (za njutnovske tečosti, viskozitet je proporcionalanvremenu za koje kuglica treba da pređe kroz tečnost ili gas koji se ispituje, okretanjemviskozimetra, merenje se može ponoviti i meri se dinamički viskozitet (mPas). Posebantip je rotacioni ili Brukfildov viskozimetar, gde se meri otpor obrtanja klipaodređenog profila u viskoznoj tečnosti.Na osnovu očekivanog opsega viskoziteta birase rotor rotacionog viskozimetra. Za veći viskozitet bira se rotor manje površine.Podešavanjem brzine rotacije meri se otpor obrtanju preko torzione opruge. Viskozitetzavisi i od geometrije posude i geometrije rotora – spindla.Viskozimetar sa mehuromje konstruisan tako da se meri brzina kretanja vazdušnog mehura u tečnosti i takoizračunava viskozitet.Viskozimetrom sa mehurom se određuje kinematički viskozitettečnosti. Brzina prolaska mehura je proprocionalna viskozitetu - što se brže mehurpodiže u cevi, viskozitet je niži. Postoje cevi sa standardnim viskozitetom, koje sukalibrisane na određenoj temperaturi.

3.3. GUSTINA

Gustina ili specifična masa je masa po jedinici zapremine. Gustina zavisi odtemperature. Jedinice su g/cm3 ili kg/dm3. Specifična gustina je gustina izražena kaoodnos gustine supstance i gustine vode na istoj temperaturi.

Određivanje gustine- Gustina je odos mase i zapremine supstance ρ = m/V (kg/dm3);relativna gustina je gustina u odnosu na vodu na nekoj temperaturi. Specifična težina jeγ = ρ g (N/m2), gde je g = 9,81 m/s2 ubrzanje zemljine teže.

Za određivanje gustine tečnosti koriste se hidrometar i piknometar. Za određivanjegustine čvrstih supstanci, meri se zapremina istisnute tečnosti. Gustina gasova seodređuje merenjem mase određene zapremine gasa ili primenom jednačine gasnogstanja: n/V=P/RT.

Gustina tečnosti se meri hidrometrom-areometrom ili piknometrom.

Hidrometar predstavlja najjednostaviji način merenja gustine. Hidrometar jegraduisani zatopljeni kalibrisani cilindar napunjen vazduhom određene mase. Kalibrišese na 20 oC. Tečnost se nalije u cilindar, koji se temperira na temperaturi na kojoj jebaždaren hidrometar. Hidrometar se uroni u tečnost u koju potone u zavisnosti odgustine. Na vratu hidrometra nalazi se skala sa koje se pročita gustina. Gustina jeobrnuto proporcionalna dubini na koju potone hidrometar.

Pinkometar je posuda tačno definisane zapremine. Tečnost nepoznate gustine se sipa upiknometar. Piknometar se temperira na temperaturi na kojoj je određena zapreminapiknometra. Nakon temperiranja masa piknometra se izmeri na analitičkoj vagi.Zapremina piknometra ili vodena vrednost se određuje pomoću vode. Voda na 20 oCima gustinu 1 g/cm3.


40 41


33

3.6. KONDUKTIVITET

Konduktivitet ili elektroprovodljivost je mera sadržaja jona u rastvoru koji se meri.Konduktivitet je koristan kao opšta karakteristika rastvora. Konduktivitet se meritokom procesa dejonizacije i destilacije vode. Različite jonske vrste različito provodestuju - imaju različit konduktivitet. Merenje konduktiviteta - Čista voda je lošprovodnik elektriciteta. Struja se provodi jonima u rastvoru. Tipična konduktivnostultra čiste vode je 5.510-6 S/m, pijaće vode 0.005 – 0.05 S/m i morske vod 5 S/m.

Konduktivitet je proporcionalan sadržaju jona u rastvoru. Konduktivitet sistema jeveličina obrnuta otpornosti. Otpornost ima jedinice Ohm, a jedinica provodljivosti jeMho. Za konduktivitet je jedinica Mho/cm ili po SI sistemu S/cm (Simens po cm).Mernu ćeliju konduktometra čini par platinskih elektroda, površine 1.0cm2 koje su nafiksnoj udaljenosti jedna od druge. Ćelija se kalibriše rastvorom poznatogkonduktiviteta.

⸎


32

jona (OH-), odnosno baznosti rastvora. Dakle, što je pH veći kiselost je manja, tj.baznost je veća i obrnuto.

Određivanje pH vrednosti. Merenje pH vrednosti je važno za sve oblasti primenehemije, odnosno fizičko-hemijskih pokazatelja, kao što su, npr. „kisele kiše“, zemljišta,sredstva za zaštitu bilja,...

Teorijska osnova merenja pH je Nernstova jednačina, koja daje odnos potencijala-napona i koncentracije vodoničnog jona, praktično protona, čija je koncentracija urastvorima nemerljiva, zbog čega se „jon vodonika“ vezuje za molekul vode, odnosnohidratizuje se, pri čemu u rastvorima postoji samo hidroksonijum jon, čijukoncentraciju je moguće meriti. U Nernstovoj jednačini kao direktno proporcionalnafiguriše i temperatura, o čemu treba voditi računa pri odredjivanju pH, odnosno uvektreba navesti temperaturu na kojoj je izvršeno merenje. Moderni uređaji imaju ugrađentermometar za temperaturnu kompenzaciju.

pH se meri pomoću instrumenata koji se zovu pH-metri, koji su po konstrukcijielektronski voltametri, što znači da mere napon-elektromotornu silu (EMS); sprega sudve elektrode, jedne indikatorske i jedne referentne. Vrednost napona koji je redaveličine mV, na instrumentu se direktno očitava kao pH vrednost. Kao indikatorskaelektroda najčešće se upotrebljava staklena elektroda (specijalno staklo koje menjapotencijal/napon u zavisnosti od pH, a kao referentne elektrode, one u odnosu na kojese meri EMS, su zasićena kalomelova elektroda i srebro-srebro-hloridna (Ag/AgCl)elektroda. U praksi se skoro isključivo upotrebljavaju kombinovane staklene elektrode,koje su tako konstruisane da u sebi sadrže i referentnu elektrodu, kao što se vidi našematskom prikazu, sa internom referentnom Ag/AgCl elektrodom, slika 9.

Slika 9. Staklena elektroda

Instrument se obavezno pre početka merenja kalibriše rastvorom poznatog i stabilnogpH. Ovi rastvori se zovu puferi.


32

jona (OH-), odnosno baznosti rastvora. Dakle, što je pH veći kiselost je manja, tj.baznost je veća i obrnuto.

Određivanje pH vrednosti. Merenje pH vrednosti je važno za sve oblasti primenehemije, odnosno fizičko-hemijskih pokazatelja, kao što su, npr. „kisele kiše“, zemljišta,sredstva za zaštitu bilja,...

Teorijska osnova merenja pH je Nernstova jednačina, koja daje odnos potencijala-napona i koncentracije vodoničnog jona, praktično protona, čija je koncentracija urastvorima nemerljiva, zbog čega se „jon vodonika“ vezuje za molekul vode, odnosnohidratizuje se, pri čemu u rastvorima postoji samo hidroksonijum jon, čijukoncentraciju je moguće meriti. U Nernstovoj jednačini kao direktno proporcionalnafiguriše i temperatura, o čemu treba voditi računa pri odredjivanju pH, odnosno uvektreba navesti temperaturu na kojoj je izvršeno merenje. Moderni uređaji imaju ugrađentermometar za temperaturnu kompenzaciju.

pH se meri pomoću instrumenata koji se zovu pH-metri, koji su po konstrukcijielektronski voltametri, što znači da mere napon-elektromotornu silu (EMS); sprega sudve elektrode, jedne indikatorske i jedne referentne. Vrednost napona koji je redaveličine mV, na instrumentu se direktno očitava kao pH vrednost. Kao indikatorskaelektroda najčešće se upotrebljava staklena elektroda (specijalno staklo koje menjapotencijal/napon u zavisnosti od pH, a kao referentne elektrode, one u odnosu na kojese meri EMS, su zasićena kalomelova elektroda i srebro-srebro-hloridna (Ag/AgCl)elektroda. U praksi se skoro isključivo upotrebljavaju kombinovane staklene elektrode,koje su tako konstruisane da u sebi sadrže i referentnu elektrodu, kao što se vidi našematskom prikazu, sa internom referentnom Ag/AgCl elektrodom, slika 9.

Slika 9. Staklena elektroda

Instrument se obavezno pre početka merenja kalibriše rastvorom poznatog i stabilnogpH. Ovi rastvori se zovu puferi.


42 43


35

Elektromagnetno zračenje se manfestuje na mnogo načina koje oko nije u stanju dazapazi: IR infracrveno zračenje – osećamo ga kao toplotu, radio zračenje – radiotalasinose informacije koje dekodira radio prijemnik, UV zračenje –zračenje visoke energijekoja oštećuje kožu, a telo prozvodi pigment kao zaštitni mehanizam protiv UV zraka.Postoje lampe sa UV zračenjem koje se koriste za dezinfekciju prostorija. X – zraci suzraci još veće energije nego UV i prodiru kroz meke delove organizma, ali ne i krozkosti, pa se tako mogu na fotografskoj ploči videti obrisi skeleta. Dugotrajnaekspozicija X zracima oštećuje organizam. Gama zraci su zraci sa najviše energijeinastaju u toku nuklearnih reakcija.Temperatura i elektromagnetno zračenje – bojazagrejanog tela zavisi od temperature. Porastom teperature tela maksimum krivetermalnog spektra se pomera ka manjim talasnim dužinama, odnosno većimfrekvencama. Hladnija tela su crveno narandžaste boje, toplija tela postaju žuta ili bela,a vrlo vruća tela su plava ili ljubičasta. To se može zapaziti kod dimera (prigušivač) nasijalici u sobi. Prigušeno svetlo je narandžaste boje, kako se pojačava postaje svesvetlije, i na kraju je belo.

Slika 11. Elektromagnetni spektar

Na osnovu boje se može oceniti temperatura udaljenih nebeskih tela: Sunce 5 840 K,zveze 2 600- 40 000 K. Na slici 11. je predstavljen elektromagnetni spektar - odnajnižih talasnih dužina najviše energije, koje imaju gama zraci, pa sve do najvećihtalasnih dužina i najmanje energije radio talasa.

Energetski status atoma i molekula - Atomi, joni i molekuli mogu da postoje natačno definisanim energetskim nivoima. Kada dolazi do promene energetskog stanja,atomi, molekuli ili joni apsorbuju ili emituju tačno onu količinu energije kojapredstavlja razliku između dva energetska stanja.

Apsorpcija zračenja - Kada se sloj gasa, tečne ili čvrste materije ozračielektromagnetnim zracima određene talasne dužine, zračenje će biti apsorbovano.


35

Elektromagnetno zračenje se manfestuje na mnogo načina koje oko nije u stanju dazapazi: IR infracrveno zračenje – osećamo ga kao toplotu, radio zračenje – radiotalasinose informacije koje dekodira radio prijemnik, UV zračenje –zračenje visoke energijekoja oštećuje kožu, a telo prozvodi pigment kao zaštitni mehanizam protiv UV zraka.Postoje lampe sa UV zračenjem koje se koriste za dezinfekciju prostorija. X – zraci suzraci još veće energije nego UV i prodiru kroz meke delove organizma, ali ne i krozkosti, pa se tako mogu na fotografskoj ploči videti obrisi skeleta. Dugotrajnaekspozicija X zracima oštećuje organizam. Gama zraci su zraci sa najviše energijeinastaju u toku nuklearnih reakcija.Temperatura i elektromagnetno zračenje – bojazagrejanog tela zavisi od temperature. Porastom teperature tela maksimum krivetermalnog spektra se pomera ka manjim talasnim dužinama, odnosno većimfrekvencama. Hladnija tela su crveno narandžaste boje, toplija tela postaju žuta ili bela,a vrlo vruća tela su plava ili ljubičasta. To se može zapaziti kod dimera (prigušivač) nasijalici u sobi. Prigušeno svetlo je narandžaste boje, kako se pojačava postaje svesvetlije, i na kraju je belo.

Slika 11. Elektromagnetni spektar

Na osnovu boje se može oceniti temperatura udaljenih nebeskih tela: Sunce 5 840 K,zveze 2 600- 40 000 K. Na slici 11. je predstavljen elektromagnetni spektar - odnajnižih talasnih dužina najviše energije, koje imaju gama zraci, pa sve do najvećihtalasnih dužina i najmanje energije radio talasa.

Energetski status atoma i molekula - Atomi, joni i molekuli mogu da postoje natačno definisanim energetskim nivoima. Kada dolazi do promene energetskog stanja,atomi, molekuli ili joni apsorbuju ili emituju tačno onu količinu energije kojapredstavlja razliku između dva energetska stanja.

Apsorpcija zračenja - Kada se sloj gasa, tečne ili čvrste materije ozračielektromagnetnim zracima određene talasne dužine, zračenje će biti apsorbovano.


34

4. OPTIČKE METODE

Svetlost, elektricitet i magnetizam predstavljaju elektromagnetno zračenje.Elektromagnetno zračenje jeste oscilovanje električnog i magnetnog polja uspravno naravan prostiranja zraka. Metode koje koriste uzajamno dejstvo materije ielektromagnetnog zračenja za dobijanje kvalitativnih ili kvantitativnih informacija oispitivanoj materiji su optičke metode.

Elektromagnetni zraci imaju dvojnu prirodu: korpuskularnu i talasnu.

Neke osobine elektromagnetnih zraka se mogu objasniti talasnom prirodom, a neke kaošto su apsorbovanje i emitovanje zračenja mogu da se objasne korpuskularnomprirodom elektromagnetnog zračenja. Osnovna čestica elektromagnetnog zračenja jefoton.

Osnovne talasne karakteristike e-m zračenja su:

Brzina prostiranja svetlosti C koja iznosi 299.792.458 m/s ili 300 000 km/s.

Talasna dužina, λ (m) i predstavlja rastojanje između dve susedne tačke u istoj fazi,slika 10.

Slika 10. Elektromagnetni talas

Talasni broj, ν� = 1λ(m-1) je broj talasa po jedinici dužine. Talasni broj je srazmeran

energiji elektromagnetnih zraka.

Frekvenca, ν (Hz, 1 Hz= 1 talas u sekundi) je broj talasa u jedinici vremena.

Dualna priroda svetlosti Otkriće foto-efekta objašnjeno je korpuskularnom prirodomsvetlosti. Foto-efekat je pojava izbijanja elektrona iz katode kada se ona osvetli.Godine 1900. Maks Plank je utvrdio da telo ne zrači energiju kontinualno, nego uodređenim iznosima – kvantima. E = h* ν, gde je h- Plankova konstanta koja iznosi6,63 x 10-34 Js. Ajnštajn je 1905. godine objavio postulat da energija može bitiemitovana samo u porcijama koje su nazvani kvanti.


34

4. OPTIČKE METODE













34

4. OPTIČKE METODE













44 45


37

E=Ep-Eo= h* ν (18)

Frekvencija (talasna dužina) emitovanog elektromagnetnog zraka pri povratku atoma uosnovno stanje je jednaka frekvenciji (talasnoj dužini) apsorbovanog zraka koji jeizazvao ekscitaciju (18). Udaljavanjem od jezgra, rastojanje između dozvoljenih nivoase osetno povećava. Ceo broj koji karakteriše energiju stabilne putanje elektronanazvan je glavni kvantni broj. Energije dozvoljenih putanja u atomu međusobno seodnose kao recipročne vrednosti kvadrata celih brojeva (19):

E1:E2:E3:....= 1/12 : 1/22 : 1/32 (19)

Energija se osetno smanjuje udaljavanjem elektrona od jezgra.

Molekulski spektri - U slučaju apsorpcije elektromagnetnog zračenja od stranemolekula, promene energije stanja su složenije. Unutrašnja energija molekula jedefinisana: energijom elektrona E01, energijom vibracije Ev i energijom rotacije Er, paje promena energetskog stanja molekula: ΔE=ΔE01+ΔEv+ΔEr

Ekscitovani elektroni u molekulu, vraćajući se na osnovno stanje, izazivaju promenevibracija molekula, indukujući sudare među molekulima. Za promenu energijeelektrona u molekulu potrebna je energija od 1-10 eV, što odgovara energiji talasnihdužina od 1 250 do 125 nm. Ova oblast se zato zove oblast elektronskih spektara, jerdolazi do prelaza valentnih elektrona. Kako je ova energija relativno velika, dolazi i doniza vibracija i rotacija u molekulu. To se manifestuje pojavom čitavog nizaapsorpcionih traka slabijeg intenziteta. Rotacioni spektri se javljaju samo kod spektarasnimljenih u gasnom stanju. Rotacione spektre mogu imati samo molekuli koji imajustalni dipolni moment (polarni molekuli). Za promene vibracione energije molekulapotrebno je 0.1 eV, a to odgovara energiji IR talasa 2.5-50m. Za promenu rotacioneenergije molekula potrebna je najmanja energija od oko 0.001 eV, koja odgovaraenergiji IR i mikrotalasne oblasti.

Apsorpcioni spektri poliatoma – molekula su mnogo složeniji zbog većeg brojamogućih energetskih stanja molekula, u poređenju sa pojedinačnim atomima. Molekulimogu da vibriraju i rotiraju na različite načine, što rezultuje velikim brojem spektralnihlinija.

Kvalitativne i kvantitativne karakteristike elektromagnetnog zračenja -Propuštanjem elektromagnetnih zraka poznatog intenziteta kroz materiju, i merenjemintenziteta propuštenih zraka na različitim talasnim dužinama, dobija se apsorpcionispektar. Talasne dužine na kojima je uočena promena intenziteta, govore o vrstimaterije koja apsorbuje zračenje. Intenzitet apsorpcije na određenoj talasnoj dužinigovori o koncentraciji materije koja je stupila u reakciju sa elektromagnetnim zrakom.


36

Energija zračenja se prenosi na atome, jone i molekule. Apsorpcijom zračenja atomi,joni i molekuli se iz osnovnog stanja prebacuju u više energetsko - ekscitovano stanje.Atomi, joni i molekuli jedino imaju mogućnost da budu na određenim energetskimnivoima. Da bi došlo do ekscitacije energija, zračenja mora da bude jednaka razlicienergija između osnovnog stanja i nivoa ekscitacije.

Atomski spektri - Atomi i molekuli prirodno teže da zauzmu stanje najniže energije,pri čemu raspolažu najnižom potencijalnom energijom. Osnovno stanje je kada seatomi i molekuli nalaze na stabilnim energetskim nivoima. Pobuđeno (ekscitovano)stanje nastaje zagrevanjem ili ozračivanjem, a atomi i molekuli prelaze na višeeneregetsko stanje. Pri povratku u osnovno stanje, atomi i molekuli emituju primljenuenergiju u vidu zračenja, koja predstavlja razliku između pobuđenog i osnovnog stanja(izuzev kod fluoresciranja kada je emitovana energija manja).

Vreme koje elektron provede u pobuđenom elektronskom nivou je vrlo kratko i iznosi10-8 s. Vreme koje elektron provede na pobuđenom vibracionom nivou je mnogo kraće-10-15 s. Elektroni ekscitovanih poliatoma (molekula) se vraćaju na neki od vibracionihnivoa osnovnog stanja, pri čemu emituju različite porcije energije. Ovo za rezultat dajeveliki broj pojedinih spektralnih linija. Uz to, energija koju emituju dovodi do sudaramolekula jer im se povećava energija

Ispitivanjem spektara emitovanog zračenja, dobijaju se podaci o potencijalnimenergetskim stanjima atoma ili molekula. Elektromagnetni zraci ultravioletnog (UV) ividljivog (VIS) dela spektra ekscituju elektrone u valentnim orbitalama. Kada sepobuđivanje izvodi pomoću svetlosti, mogu se u tu svrhu ispitivati i apsorpcioni spektri,jer u svetlosti koje ispitivani uzorak propusti, nedostaju talasne dužine koje odgovarajukvantima apsorbovane energije. Rentgensko zračenje (RTG) pobuđuje elektrona ublizini jezgra atoma (jer su RTG zraci velike energije). Spektri dobijeni infracrvenim(IR),VIS ili UV zracima daju podatke o stanjima ostalih elektrona u elektronskomomotaču.

Borov model atoma - Posle Raderfordovog planetarnog modela atoma i saznanja okvantnoj prirodi emisije i apsorpcije zračenja, Nils Bor je 1913. godine dao savršenijimodel atoma sa tri osnovna postulata:

1. Elektroni se oko jezgra kreću na dopuštenim putanjama;

2. Kada se kreću po dopuštenim putanjama čiji je obrtni momenat jednak celobrojnomumnošku kvantnog dejstva, on je u energetski stabilnom ili stacionarnom stanju - nitiprima niti otpušta energiju;

3. Do promene energije može doći pri prelasku sa jedne na drugu stabilnu putanju.Ovaj prelaz je praćen apsorpcijom ili emisijom zračenja čija frekvenca odgovara razlicienergetskih nivoa.


46 47


39

Slika 13. Apsorpcioni i emisioni spektri vodonika, helijuma i neona

Apsorpcione metode koriste merenje apsorpcije elektromagnentog zračenja od straneanalita. Meri se intenzitet propuštenog svetla.

Transmisija (T) predstavlja odnos upadne (Io) i izlazne svetlosti (I) (slika 14.) i možeda bude uzražena u procentima. 𝑇𝑇 𝑇 𝐼𝐼

𝐼𝐼𝑜𝑜𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖𝑖 𝑇𝑇 𝑖 𝑇 𝐼𝐼

𝐼𝐼𝑜𝑜∗ 100

Slika 14. Transmisija

Apsorbanca (A) raste kada intenzitet propuštene svetlosti opada

𝐴𝐴 𝑇𝐴 log 𝑇𝑇 𝑇𝐴 𝑖𝑖𝑜𝑜𝑇𝑇 𝐼𝐼𝐼𝐼𝑜𝑜. (20)

Lamber-Berov zakon povezuje koncentraciju i apsorbanciju. Za monohromatskozračenje, apsorbancija je poporcionalna dužini puta (b) kroz medijum koji apsorbuje ikoncentraciji materije u rastvoru (c) koja apsorbuje zračenje. 𝐴𝐴 𝑇 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 gde je ε –koeficijent apsorbancije predstavlja apsorbanciju 1 % rastvora u sloju debljine 1 cm iliapsorbanciju rastvora koncentracije 1mol/dm3 u sloju od 1 cm.

Lamber-Berov zakon može da se primeni na rastvore sa više analita koji apsorbujuzračenje, pa je tako ukupna apsorbanca zbir apsorbanci svake vrste u rastvoru.


39












39












39












39












38

Na slici 12. a prikazan je kontinualni spektar nastao propuštanjem elektromagnetnogzračenja u vidljivoj oblasti kroz prizmu. Prizma zaokreće različite talasne dužine podrazličitim uglovima; kao rezultat toga vidljivi deo spektra je razložen i vidi se kaodugina serija boja. Na slici 12. b prikazan je emisioni spektar nastao vraćanjemekscitovanih atoma u osnovno stanje, tokom čega atomi emituju elektromagnetnozračenje tačno definisanih talasnih dužina što se vidi kao linije – linijski spektar. Slika12. c predstavlja spektar nastao apsorpcijom elektromagnetnog zračenja određenihtalasnih dužina (tamne linije u kontiunalnom spektru). Apsorpcioni spektar nastajekada atomi apsorbuju određene talasne dužine prelazeći u ekscitovano stanje.

Slika 12. Kontinualni, emisioni i apsorpcioni spektar

Slika 13. prikazije emisioni i apsorpcioni spektar vodonika, kao i emisione spektre živei neona. Vodonik koji ima samo jedan elektron u elektronskoj ljusci, ima siromašanspektar. Elektron može da ekscituje apsorbujući elektromagnetno zračenje na četiritalasne dužine. Svetle linije u emisionom spektru su tamne linije u apsorpcionomspektru. Veći i komplikovaniji atomi helijuma i neona imaju složeniji spektar, samnogo više emisionih linija, što znači da više elektrona u elektronskoj ljusci atomaimaju više mogućih energetskih stanja na koje ekscituju apsorpcijom elektromagnetnogzračenja.


38

Na slici 12. a prikazan je kontinualni spektar nastao propuštanjem elektromagnetnogzračenja u vidljivoj oblasti kroz prizmu. Prizma zaokreće različite talasne dužine podrazličitim uglovima; kao rezultat toga vidljivi deo spektra je razložen i vidi se kaodugina serija boja. Na slici 12. b prikazan je emisioni spektar nastao vraćanjemekscitovanih atoma u osnovno stanje, tokom čega atomi emituju elektromagnetnozračenje tačno definisanih talasnih dužina što se vidi kao linije – linijski spektar. Slika12. c predstavlja spektar nastao apsorpcijom elektromagnetnog zračenja određenihtalasnih dužina (tamne linije u kontiunalnom spektru). Apsorpcioni spektar nastajekada atomi apsorbuju određene talasne dužine prelazeći u ekscitovano stanje.

Slika 12. Kontinualni, emisioni i apsorpcioni spektar

Slika 13. prikazije emisioni i apsorpcioni spektar vodonika, kao i emisione spektre živei neona. Vodonik koji ima samo jedan elektron u elektronskoj ljusci, ima siromašanspektar. Elektron može da ekscituje apsorbujući elektromagnetno zračenje na četiritalasne dužine. Svetle linije u emisionom spektru su tamne linije u apsorpcionomspektru. Veći i komplikovaniji atomi helijuma i neona imaju složeniji spektar, samnogo više emisionih linija, što znači da više elektrona u elektronskoj ljusci atomaimaju više mogućih energetskih stanja na koje ekscituju apsorpcijom elektromagnetnogzračenja.


48 49


41

Slika 15. Lampa sa šupljom katodom

Neke analitičke tehnike koriste laser kao izvor zračenja. Laser daje zrak velikogintenziteta, izuzetno uskog opsega talasnih dužina (0,01 nm). Skraćenica LASER jenastala od reči: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation. Koristi sekod molekularne apsorpcione spektrofotometrije, ramanske spektrofotometrije,MALDI – TOF –MS (Matriks Assisted Laser Desorption-Time of Fligt - Massspectrometry) za analize proteina.

Selekcija talasne dužine–optički filteri - Stabilan svetlosni izvor daje zračenje većegopsega talasnih dužina. Radi preciznosti u selekciji talasne dužine zračenja, izdvajanjeodređene talasne dužine se može izvesti pomoću filtera (interferentni ili apsorpcioni) imonohromatora (prizma i difrakciona rešetka). Idealan slučaj je kada filter ilimonohromator izdvoji zrak samo jedne talasne dužine. U praksi monohromator ili filterdaju određeni opseg talasnih dužina.

Interferentni filter je optički filter koji reflektuje jednu ili više talasnih dužina, dokostale propušta. Sastoji se od više slojeva dielektrika koji imaju različite indekserefrakcije. Efektivna širina spektra je 10 nm.

Apsorpcioni filter sekoristi u vidljivom delu spektra. Apsorbuju zračenje u vidljivomdelu spektra. Mogu biti od obojenog stakla ili obojenog želatina, između dve staklenepločice. Efektivna širina spektra je 50 nm.

Monohromator omogućuje snimanje apsorpcionih spektara u širokom opsegu iliskeniranje spektara. Slika 16. prikazuje selekciju talasnih dužina primenommonohromatora. Monohromator se sastoji od: ulaznog proreza (slit), ogledala,difrakcione rešetke i izlaznog proreza.


41


Neke analitičke tehnike koriste laser kao izvor zračenja. Laser daje zrak velikogintenziteta, izuzetno uskog opsega talasnih dužina (0,01 nm). Skraćenica LASER jenastala od reči: Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation. Koristi sekod molekularne apsorpcione spektrofotometrije, ramanske spektrofotometrije,MALDI – TOF –MS (Matriks Assisted Laser Desorption-Time of Fligt - Massspectrometry) za analize proteina.

Selekcija talasne dužine–optički filteri - Stabilan svetlosni izvor daje zračenje većegopsega talasnih dužina. Radi preciznosti u selekciji talasne dužine zračenja, izdvajanjeodređene talasne dužine se može izvesti pomoću filtera (interferentni ili apsorpcioni) imonohromatora (prizma i difrakciona rešetka). Idealan slučaj je kada filter ilimonohromator izdvoji zrak samo jedne talasne dužine. U praksi monohromator ili filterdaju određeni opseg talasnih dužina.

Interferentni filter je optički filter koji reflektuje jednu ili više talasnih dužina, dokostale propušta. Sastoji se od više slojeva dielektrika koji imaju različite indekserefrakcije. Efektivna širina spektra je 10 nm.

Apsorpcioni filter sekoristi u vidljivom delu spektra. Apsorbuju zračenje u vidljivomdelu spektra. Mogu biti od obojenog stakla ili obojenog želatina, između dve staklenepločice. Efektivna širina spektra je 50 nm.

Monohromator omogućuje snimanje apsorpcionih spektara u širokom opsegu iliskeniranje spektara. Slika 16. prikazuje selekciju talasnih dužina primenommonohromatora. Monohromator se sastoji od: ulaznog proreza (slit), ogledala,difrakcione rešetke i izlaznog proreza.


40

Atotal= ε1bc1 + ε2bc2 + ε3bc3 +...+ εnbcn (21)

U slučaju merenja apsorbance više analita u istom rastvoru, merenje apsorbance seobavlja na onoliko talasnih dužina koliko analita ima u rastvoru. Iz sistema n jednačinasa n analita, izračunaju se koncentracije svakog analita pojedinačno.

Ograničenja Lamber-Berovog zakona - Pretpostavka da je apsorbancija linearnozavisna od koncentracije analita u rastvoru, važi samo kada je rastvor dovoljnorazblažen < 0,01 M. Kod koncentrovanijih rastvora dolazi do interakcija međumolekulima, koje utiču na to kako supstanca apsorbuje zračenje. Kod dovoljnorazblaženih rastvora devijaciju može da uzrokuje i prisustvo veće koncentracije drugihvrsta analita, pogotovo elektrolita. Do devijacije dolazi i u prisustvu velikih organskihmolekula. Na devijaciju utiče i indeks refrakcije medijuma, koji utiče na koeficijentapsorbancije ε.

Glavni delovi optičkih uređaja – Svi optički uređaji treba da imaju stabilan izvorzračenja, selektor talasne dužine na kojoj se izvodi merenje, transparentnu kivetu zauzorak, detektor zračenja koji konvertuje energiju zračenja u neku električnu veličinu,digitalni ili analogni merni uređaj i kompjuter.

Izvor zračenja mora biti takav da kontinualno isporučuje stabilno zračenje određenetalasne dužine. Stabilnost izvora zračenja zavisi od stabilnosti napajanja. Nestabilnostelektrične mreže se prevazilazi dvozračnim sistemom. U uređaju postoje dva paralelnaizvora zračenja; slepa proba i proba se mere istovremeno, pa promene napona iintenziteta zračenja jednako utiču i na probu i na slepu probu. Izvori zračenja mogu bitikontinualni, koji emituje ceo elektromagnetni spektar, i linijski, koji emituje ograničenbroj talasnih dužina.

Izvori kontinualnog zračenja su za UV oblast – deuterijumova lampa sa električnimlukom, pod visokim pritiskom punjena argonom, ksenonom ili živom, a za VIS oblasttungstenova lampa sa užarenim filamentom. Za IR oblast izvor spektra je užarenainertna čvrsta materija.

Izvori linijskog zračenja, odnosno zračenja određene talasne dužine, jesu natrijumovalampa, živina lampa, lampe sa šupljom katodom koje se koriste kod atomskeapsorpcione spektrofotometrije (AAS).

Lampa sa šupljom katodom za AAS sastoji se od anode od tungstena i cilindričnekatode napravljene od metala za koji se lampa koristi. Lampa je napunjena inertnimgasom neonom ili argonom. Pod dejstvom napona izmeđi anode i katode u lampi dolazido jonizacije gasa, jonizovan gas izbija atome metala iz katode. Ovi atomi metala su upobuđenom (ekscitovanom) stanju. Pri povratku u osnovno stanje emituju elektro-magnetno zračenje karakteristično za taj metal, slika 15.


50 51


43

4.1. VRSTE OPTIČKIH TEHNIKA

Najpoznatije optičke metode su kolorimetrija, fotoelektrična fotometrija, UV-VIS-spektrofotometrija, plamena fotometrija, IR spektrofotometrija, atomska apsorpcionatehnika i atomska emisiona tehnika sa optičkim ili masenim detektorom.

4.2. KOLORIMETRIJA

Ova tehnika je najstarija i najjednostavnija optička metoda. Kolorimetrijski se moguodređivati samo obojeni rastvori ili oni koji se odgovarajućom reakcijom mogu prevestiu obojene proizvode. Pri kolorimetrijskom merenju određivanje se izvodi poređenjemboje ispitivanog rastvora sa jednim ili više standardnih rastvora.. Takođe je mogućepoređenje boje rastvora sa standardnim obojenim staklenim diskovima, uz pomoćHeligeovog komparatora.

4.3. FOTOELEKTRIČNA FOTOMETRIJA

U fotometriji se meri intenzitet propuštene svetlosti i na osnovu toga se određujekoncentracija. Ulazna svetlost je svetlost uže spektralne oblasti izdvojena pomoćuoptičkih filtera, prizme ili difrakcione rešetke. Mogu se određivati samo obojenajedinjenja.

Pri fotometrijskom merenju rastvora u kiveti, intenzitet ulazne svetlosti je jednak zbiruintenziteta reflektovane, rasute, apsorbovane i propuštene svetlosti. Za fotometrijskomerenje je interesantan samo intenzitet propuštene i apsorbovane svetlosti. Zbog togase izvodi kompenzacija rasute i reflektovane svetlosti pomoću iste kivete u kojoj senalazi čist rastvarač – slepa proba. Merenje se izvodi tako da se slepa proba postavi usvetlosni zrak jednozračnog fotometra, podesi se skala na 100 % transmisije ili 0 %apsorbancije, zatim se u svetlosni zrak postavi uzorak i izmeri se % transmisije(apsorbancija).

Nedostatak jednozračnog fotometra je taj što promene napona električne mreže moguda utiču na intenzitet svetla svetlosnog izvora, kao i na rezultat. Kalibraciona kriva sepravi tako da apsorbancija svih razblaženja bude između 0,2 i 0,8, gde je apsorbancijalinearno zavisna od koncentracije.

4.4. UV-VIS SPEKTROFOTOMETRIJA

Za razliku od fotometrije, u spektrofotometriji se upotrebljava monohromatsko svetlo –svetlo jedne talasne dužine. Izvori svetla su za UV oblast deuterijumova, a za VISoblast volframova ili tungstenova lampa. Monohromatori se koriste za dobijanje


42

Slika 16. Monohromator

Zrak svetla ulazi kroz ulazni otvor B, dospeva do ogledala C, odbija se i pada nadifrakcionu rešetku D, koja različito prelama zrake različite talasne dužine. Razdvojenetalasne dužine se odbijaju od drugog ogledala E i samo određene talasne dužine prolazekroz izlazni otvor F.

Transparentna merna kiveta - Ćelija ili kiveta u koju se unosi uzorak, treba da budeod takvog transparentnog materijala koji propušta spektar zračenja na kome će seizvoditi merenje. Za UV oblast < 350 nm koristi se kvarcna kiveta, za VIS oblast 350 –2 000 nm koristi se silikatno staklo ili plastika, za IR oblast uzorak se postavlja izmeđupločica od kristalnog NaCl.

Detektor–pretvarač zračenja - U ranim godinama razvoja spektrofotometrije,detektorje najčešće bilo ljudsko oko, fotografska ploča ili film. Danas, idealan detektor imasledeće osobine: visoku osetljivost, visok odnos signal/šum, konstantan odgovor zaširok opseg talasnih dužina, kratko vreme odziva i nulu kao izlazni signal kada nijeosvetljen.

Vrste detektora – Postoje tri glavne grupe detektora: fotoelektrični ili kvantnidetektori koji imaju aktivnu površinu koja ima sposobnost apsorbovanja fotonazračenja; fotomultiplikator sa fotoosetljivom emulzijom na svojoj površini, kojaozračena emituje elektrone čiji se broj uvećava (nedostatak fotoelektričnih detektora jenelinearnost odgovora na različitim talasnim dužinama) i termalni detektori, kojireguju na toplotu i koriste se kod infracrvene spektrofotometrije i napravljeni su od dvametala različitih termičkih koeficijenata širenja (termopar). Osetljivost termopara jenezavisna od talasnih dužina, ali je mnogo slabija nego kod fotoelektričnih detektora.

Digitalni ili analogni merni uređaj, kompjuter - Merni uređaj je električni uređajkoji pojačava električni signal detektora. To mogu biti: digitalni merači, skalapotenciometri, rekorderi ili katodne cevi.


52 53


45

4.6. INFRACRVENA SPEKTROMETRIJA - IR

IR koristi infracrveni deo elektromagnetnog spektra. To su elektromagnetni talasi većihtalasnih dužina i manje frekvence od vidljivog dela spektra. Infracrveni deoelektromagnetnog spektra je podeljen u tri regiona: bliska, srednja i daleka IR oblast,nazvane na osnovu njihove udaljenosti od vidljivog dela spektra. Bliska IR oblast jeelektromagnetno zračenje najviše energije. Opseg talasnih brojeva je od 14 000 do4000 cm−1, a opseg talasnih dužina i 0.8–2.5 μm. Bliska IR oblast dovodi do pojaveharmonijskih vibracija. Srednja IR oblast, talasnih brojeva približno 4 000–400 cm−1 italasnih dužina 2.5–25 μm, dovodi do pojave rotaciono-vibracionih spektara.Daleka IRoblast, talasnih brojeva 400–10 cm−1 i talasnih dužina 25–1 000 μm, na koji senastavlja mikrotalasni region elektromagnetnih talasa, ima malu energiju i služi zaispitivanje rotacionih spektara.

IR spektroskopija koristi činjenicu da molekuli apsorbuju određene frekvencije, što jekarakteristika njihove strukture. Molekul apsorbuje one frekvencije (to su rezonantnefrekvencije) koje odgovaraju frekvencijama vibracije veza i funkcionalnih grupa u

molekulu. Energije zavise od oblika molekula i mase atoma. Takođe, frekvencevibracija mogu biti pokazatelj prisustva određenih veza u molekulu. IR spektroskopijase koristi za kvalitativna i kvantitativna određivanja, određivanje tipa hemijske veze,praćenje kinetike hemijskih reakcija i određivanja strukture organskih jedinjenja.Materija izložena IR zračenju može da apsorbuje, emituje ili reflektuje IR zračenje uzavisnosti od svojih osobina.

Slika 18. Polarnost molekula HCl

Raspodela naelektrisanja oko molekula HCl nije ravnomerna. Gustina elektronskogoblaka u blizini hlora je veća i zbog toga je hlor parcijalno negativno naelektrisan, avodonik parcijalno pozitivno naelektrisan. HCl ima dipolni momenat i predstavlja dipol.Dipolni momenat zavisi od razlike naboja dva pola, kao i od njihove udaljenosti.

Apsorbovanjem IR zračenja molekuli menjaju energetsko stanje. IR zraci, kao zraciniske energije, ne dovode do ekscitacije elektrona, ali dovode do promena vibracija irotacija molekula. Samo polarni molekuli mogu da apsorbuju IR zračenje. Polarnimolekuli prirodno vibriraju, slika 18. Oscilacijom molekula HCl, koji imaneravnomernu distribuciju naelektrisanja, dolazi do oscilacija veličine dipolnogmomenta. Kada IR zračenje ima frekvencu jednaku frekvenci oscilacije prirodnog


45









45









45









44

monohromatskog svetla. To mogu biti prizme i difrakcione rešetke. Prizma vrlo malosmanjuje intenzitet svetlosti, ali ne daje simetričnu raspodelu spektra, pošto sedisperzija svetla menja sa talasnom dužinom. Difrakciona rešetka ima veću moćrazdvajanja i simetričan spektar, ali znatno smanjuje intenzitet svetla. U UV oblastikiveta je od kvarcnog stakla, a u VIS oblasti od običnog stakla. Detektori su fotoćelije ifotomultiplikatori. Kod dvozračnog spektrofotometra u jedan svetlosni zrak se stavljaslepa proba, podešava se nula instrumenta, u drugi svetlosni zrak se stavlja uzorak imeri intenzitet svetla. Svetlosni zrak prolazi istovremeno kroz slepu probu i probu,čime se eliminišu sve električne smetnje koje utiču na rezultat.

Funkcionalne grupe jedinjenja koje apsorbuju svetlost su hromoforne grupe. Oneatomske grupe koje ne apsorbuju zračenje su auksohromne grupe. UV i VIS spektrimogu poslužiti za potvrdu identiteta jedinjenja.

4.5. PLAMENA FOTOMETRIJA

Plamena fotometrija se koristi mnogo u neorganskoj analizi, za određivanje jonaalkalnih i zemnoalkalnih metala, i to najčešće Na, K, Ca i Li. Intenzitet plamena jeproporcionalan koncentraciji. Boja plamena je kvalitativna karakteristika, slika 17.

Slika 17. Boja plamena koji daje natrijum, kalijum, litijum i CuSO4

Plamena fotometrija spada u emisione tehnike. Metoda se zasniva na ekscitaciji metalau plamenu i merenju intenziteta svetlosti koju oslobađaju ekscitovani atomi.Temperatura plamena treba da bude dovoljno visoka da u celosti izazove ekscitacijusvih atoma metala u ispitivanom rastvoru. Uspešno se plamenom fotometrijomodređuju zemnoalkalni i alkalni metali, jer je za njih potrebna relativno niskatemperatura (1 900o C) koja se može dobiti i u plamenu butan-vazduh. Plamenomfotometrijom se mogu takođe određivati i Cu, Ni, Pb, Fe, In, Mn, Cr, Co, Ti, B, Al, alije potreban plamen znatno više temperature. Za to se koristi plamen acetilien-vazduh(2450o C), vodonik-kiseonik (2 700o C) ili acetilen-azot-suboksid (3 000o C). Tačnostmetode je 2-5 %. Na tačnost utiče efikasnost ekscitacije atoma iz rastvora.


44

monohromatskog svetla. To mogu biti prizme i difrakcione rešetke. Prizma vrlo malosmanjuje intenzitet svetlosti, ali ne daje simetričnu raspodelu spektra, pošto sedisperzija svetla menja sa talasnom dužinom. Difrakciona rešetka ima veću moćrazdvajanja i simetričan spektar, ali znatno smanjuje intenzitet svetla. U UV oblastikiveta je od kvarcnog stakla, a u VIS oblasti od običnog stakla. Detektori su fotoćelije ifotomultiplikatori. Kod dvozračnog spektrofotometra u jedan svetlosni zrak se stavljaslepa proba, podešava se nula instrumenta, u drugi svetlosni zrak se stavlja uzorak imeri intenzitet svetla. Svetlosni zrak prolazi istovremeno kroz slepu probu i probu,čime se eliminišu sve električne smetnje koje utiču na rezultat.

Funkcionalne grupe jedinjenja koje apsorbuju svetlost su hromoforne grupe. Oneatomske grupe koje ne apsorbuju zračenje su auksohromne grupe. UV i VIS spektrimogu poslužiti za potvrdu identiteta jedinjenja.

4.5. PLAMENA FOTOMETRIJA

Plamena fotometrija se koristi mnogo u neorganskoj analizi, za određivanje jonaalkalnih i zemnoalkalnih metala, i to najčešće Na, K, Ca i Li. Intenzitet plamena jeproporcionalan koncentraciji. Boja plamena je kvalitativna karakteristika, slika 17.

Slika 17. Boja plamena koji daje natrijum, kalijum, litijum i CuSO4

Plamena fotometrija spada u emisione tehnike. Metoda se zasniva na ekscitaciji metalau plamenu i merenju intenziteta svetlosti koju oslobađaju ekscitovani atomi.Temperatura plamena treba da bude dovoljno visoka da u celosti izazove ekscitacijusvih atoma metala u ispitivanom rastvoru. Uspešno se plamenom fotometrijomodređuju zemnoalkalni i alkalni metali, jer je za njih potrebna relativno niskatemperatura (1 900o C) koja se može dobiti i u plamenu butan-vazduh. Plamenomfotometrijom se mogu takođe određivati i Cu, Ni, Pb, Fe, In, Mn, Cr, Co, Ti, B, Al, alije potreban plamen znatno više temperature. Za to se koristi plamen acetilien-vazduh(2450o C), vodonik-kiseonik (2 700o C) ili acetilen-azot-suboksid (3 000o C). Tačnostmetode je 2-5 %. Na tačnost utiče efikasnost ekscitacije atoma iz rastvora.


54 55


47

IR spektri daju informacije o tipu veza u molekulu i funkcionalnim grupama koje suprisutne. Sa porastom jačine veze raste i talasni broj na kojem veza apsorbuje zračenje.Sa porastom mase atoma (i redukovane mase), opada talasni broj. Tipičan IR spektar jeprikazan na slici 20. gde region od 4 000 cm-1 do 1 500 cm-1 predstavlja “otisak prsta”jedinjenja, a region od 1 500 cm-1 do 500 cm-1 predstavlja deo u kome apsorbujufunkcionalne grupe.

Slika 20. Tipičan IR spektar

Slika 21. IR spektar toluola

Na slici 21. prikazan je IR spektar toluola, aromatičnog ugljovodonika. Vidi seprisustvo alifatičnih i aromatičnih CH vibracija, kao i dva apsorpciona pika zaaromatične C=C vibracije. Kod acetona (2-propanon) vidi se veliki pik kao posledicaprisutva C=O vibracije u sredini spektra. Kod toluola je ovaj pik slabiji i oštriji, slika22.


47






47






46

dipola, dolazi do apsorpcije zračenja i promene u amplitudi molekularnih vibracija.Homonuklearni molekuli (O2, N2, ili Cl2 ) ne apsorbuju IR zračenje, zato što tokomnjihovih oscilacija i rotacija ne dolazi do promene dipolnog momenta.

Postoji više vrsta vibracija: valentne - duž ose koja spaja atome, menjajući rastojanjeizmeđu atoma; mogu biti simetrične ili asimetrične; deformacione - dovode dopromene ugla između atoma u odnosu na osu. Energija oscilacija zavisi od mase atoma,njihovog prostornog rasporeda i jačine veze.

Metan može da ima valentne simetrične vibracije na 921,6 cm-1 , valentne asimetričnevibracije na 1 303 cm-1, deformacione vibracije u vidu simetričnog krivljenja na 439,9cm-1 i asimetričnog krivljenja na 637,9 cm-1.. Drugim rečima, metan apsorbuje IRzračenje ovih talasnih brojeva i nakon toga vibrira na različite načine koji zavise odprostornog rasporeda i funkcionalnih grupa.

Voda apsorbuje na ν1 3835 cm-1, ν2 1648 cm-1, ν3 3939 cm-1, a to znači da će se u IRspektru pojaviti pikovi na ovim talasnim brojevima.

Kretanje dvoatomskog molekula se može porediti sa istezanjem i skupljanjem opruge,kao da su dve mase (atoma) spojene oprugom. Ovo kretanje može biti opisanoHukovim zakonom opruge, koji kaže da je sila koja teži da vrati oscilujuće čestice ustanje mirovanja srazmerna udaljenosti od ravnotežnog položaja, slika 19.

Slika 19. Oscilacije između dva atoma

Tamo gde je r0 dužina hemijske veze i istovremeno rastojanje sa minimalnompotencijalnom energijom, dok su rmin i rmax su najmanji i najveći razmak između atomakoji osciluju.

Oscilacije mogu biti harmonijske, koje izaziva IR zračenje manje energije imanifestuje se simetričnim kretanjem, i neharmonijske, koje nastaju kao posledicameđuatomskih sila privlačenja i odbijanja. IR zračenje veće energije dovodi do pojaveneharmonijskih oscilacija.

Ukupna energija koja se može dovoditi molekulu je ograničena energijom disocijacije.Kada se dovoljno velika energija dovede molekulu, atomi koji se udaljavaju jedan oddrugog neće se vratiti u prvobitno stanje, hemijska veza puca i dolazi do disocijacije.


46











46










r0

rmin

rmax


56 57


49

u rastvaraču koji nema pikove koji se preklapaju sa uzorkom. Peletiranje se izvodi takoda se fino sprašeni čvrsti uzorak pomeša sa KBr u odnosu 1:100 . Smeša se presuje podvelikim pritiskom i vakuumom. Tako se dobija providan disk koji može biti upotrebljenza snimanje IR spektara.

4.7. ATOMSKA SPEKTROFOTOMETRIJA

Atomska spektrofotometrija je instrumentalna tehnika koja meri apsorpciju ili emisijuzračenja od strane atoma. Atomi, ozračeni elektromagnetnim talasima, apsorbujuodređene talasne dužine iz spektra. Svaka vrsta atoma apsorbuje tačno određene talasnedužine iz elektromagnetnog spektra. Te talasne dužine elektromagnetnog spektra kojeatom apsorbuje dovode do ekscitacije elektrona na više energetske nivoe – atom jepobuđen. Vraćanjem elektrona u osnovno stanje dolazi do emisije određenih talasnihdužina elektromagnetnog spektra, koje su karakteristične za vrstu atoma koji je bio upobuđenom stanju. Atomskom spektrometrijom može da se meri apsorpcijaelektromagnetnog zračenja, ili da se meri emisija elektromagnetnog zračenja. To su dveosnovne tehnike atomske spektrometrije. Atomska emisiona spektrometrija može bitisa optičkim sistemom detekcije ili sa masenim sistemom detekcije.

4.7.1. OPTIČKA ATOMSKA APSORPCIONA SPEKTROMETRIJA

Na sobnoj temperaturi svi atomi su u osnovnom stanju. Elektronske ljuske se sastoje odmanjeg ili većeg broja elektrona. Na primer, atom natrijuma ima 1 elektron u spoljnojvalentnoj 3s orbitali, slika 24.

Slika 24. Moguće pozicije ekscitovanog valentnog elektrona natrijuma

Ovaj elektron može da ekscitira (skoči) na viši energetski nivo kada se natrijum izložiplamenu, plazmi ili električnoj varnici.


49









49









48

Slika 22. IR spektar acetona

Izopropanol, alkohol sa OH grupom; vidi se široki pik vezan za OH grupu, slika 23.

Slika 23. IR spektar izopropanola

Priprema uzoraka za IR analizu zavisi od agregatnog stanja uzorka. UV-VISmolekularni spektri dobijaju se iz razblaženog rastvora analita, što nije primenljivokod IR spektrofotometrije jer nema rastvarača koji je transparentan u potrebnomopsegu talasnih dužina. Gasoviti uzorci se analiziraju u cilindričnim ćelijama različitedužine (od nekoliko cm do nekoliko metara). Ćelija treba da bude ispunjena samogasom koji se meri. Ćelija ima odgovarajuće prozore od NaCl. Rastvoreni uzorci -Moguće je meriti IR spektar supstance rastvorene u pogodnom rastvaraču, ali postojeograničenja vezana za IR apsorpciju samog rastvarača. Za rastvarače postoje određeniopsezi talasnih dužina u kojima se može izvoditi merenje. Optimalne koncentracijeanalita su 1-10 %.Tečni uzorci se stavljaju između dve pločice od NaCl, jedna kapuzorka je dovoljna za merenje IR spektra. Stisnut između dve pločice, uzorak imadebljinu od 0,01 mm. Kapilarne sile drže pločice zajedno. Prisustvo vode u uzorkuzamućuje pločice NaCl, koje u tom slučaju treba ispolirati. Čvrsti uzorci se dispergujuili peletiraju za potrebe IR analize. Dispergovanje se izvodi tako što se čvrsti uzorakfino spraši na veličinu čestica manju od talasnih dužina; one se primenjuju i disperguje


48






48






58 59


51

suprotnoj strani od katode smešten je prozor od stakla ili kvarca. Katoda u lampi je uatmosferi inertnog gasa Ar ili Ne pritiska od 2- 4 mbar, slike 15. i 26. Inertni gas služikao energetski pufer jer energija jonizacije gasa određuje maksimalnu energijuekscitacije. Ovako se sprečava pojava drugih rezonantnih linija.


Inertni gas se jonizuje u električnom polju između anode i katode. Jonizovani inertnigas udara površinu šuplje katode i izbija atome. Izbijeni atomi se sudaraju međusobnoi sa jonizovanim gasom dovode do ekscitacije, i nakon toga do emisije zračenjatalasnih dužina karakterističnih za metal od kog je izrađena šuplja katoda, slike 26 i 27.

Slika 27. Jonizacija gasa u lampi sa šupljom katodom

Za elemente koji koji apsorbuju u UV oblasti (manje od 190 nm), kao što su C, H, N,O, S, P, halogeni elementi i inertni gasovi, ne postoje lampe sa šupljom katodom.

Apsorpcioni deo – atomizer ima zadatak da stvori dovoljno atoma u osnovnomstanju koji mogu da apsorbuju svetlost izvora. Osetljivost uređaja zavisi od broja atomapo jedinici zapremine, u osnovnom stanju nastalih atomizacijom. Atomizacija se izvodipomoću plamena. Rastvor metala se pneumatski raspršuje u što finije kapljice, koje seuvode u plamen. U plamenu dolazi do isparavanja rastvarača, nakon čega nastaje sometala u čvrstom stanju. Zbog visoke temperature plamena, dolazi do sublimacije soli.Molekuli pod dejstvom temperature disociraju, nakon čega dolazi do ekscitacije atoma.


51








51








51








51








51








50

Atomi nekog elementa apsorbovaće samo onu energiju koja im omogućava prelaz sanižeg na više energetsko stanje, slika 25. Kako su ovi prelazi kvantirani, apsorbovanaenergija je strogo selektivna i zavisi od vrste ispitivanih atoma.Atomi u osnovnomstanju (Me) mogu da prime određen iznos energije (hν) i da potom pređu u pobuđenoili energetski više stanje (Me*). Me + hν= Me*

Količina energije koja izaziva ekscitaciju zavisi od elektronske strukture atoma.

Slika 25. Ekscitacija valentnog elektrona

Ekscitacija - Ako se kroz paru atoma propušta elektromagnetno zračenje odgovarajućeenergije potrebne za ekscitaciju atoma, doći će do apsorbcije zraka i ekscitacije.Smanjenje intenziteta propuštenog elektromagnetnog zračenja, zavisi od broja atoma uosnovnom stanju. Transmisija je obrnuto proporcionalna količini atoma, jer atomiapsorbuju zračenje i prelaze u ekscitovano stanje. U ekscitovanom stanju atomiprovode 10-8 sekundi. Vraćanjem u osnovno stanje energija se oslobađa. Može se meritiprocenat transmisije, odnosno procenat smanjenja intenziteta elektromagnetnogzračenja. Procenat transmisije opada kada koncentracija atoma raste.Takođe se možemeriti i apsorbanca, koja raste sa povećanjem koncentracije atoma.

Delovi AAS - Atomski apsorpcioni spektrometar se sastoji od emisionog dela kojipredstavlja izvor zračenja odgovarajuće talasne dužine, apsorpcionog dela ili atomizerasa plamenom ili bez plamena, selekcionog dela koji izdvaja određene talasne dužine imernog dela ili detektora koji služi za pojačanje signala.

Izvor elektromagnentog zračenja određene talasne dužine (monohromatski izvor)treba da bude konstantnog intenziteta i definisane talasne dužine koja odgovaraelementu koji se pobuđuje. Kao izvor zračenja za AAS koristi se lampa sa šupljomkatodom načinjenom od elementa koji se meri. Širina spektralne linije lampe sašupljom katodom je oko 0,01 nm.

Lampa sa šupljom katodom napravljena je u obliku staklene cevi sa katodom kojaima šupljinu, iznutra presvučenu elementom koji se ispituje. Anoda je od volframa. Na


50









50









50








praznaorbitala

h v 1

2

e-

jezgro

e-

e-

e-


60 61


53

Tabela 3. Gasovi za AAS

Merni deo - Nakon apsorpcije zračenja od strane atoma, i posle toga, emisijeodređenih talasnih dužina vraćanjem ekscitovanih atoma u osnovno stanje, potrebno jeizdvojiti zrake određene talasne dužine iz okolnog spektra. Izdvajanje talasnih dužinase može izvesti pomoću prizme ili difrakcione rešetke. Prizma je napravljena odkvarcnog stakla. Prizma ili difrakciona rešetka razdvajaju talasne dužine na bazirazličitog prelamanja. Pomoću otvora (slit) selektuje se određena talasna dužina.Izdvojene talasne dužine se detektuju i kvantifikuju pomoću detektora (fotoćelije).

Gorivi gas Oksidant Temperaturaplamena, oC

Elementi koji se određuju

Vodonik Vazduh 1800 Alkalni metali, Zn, Cu, Cd,Pb

Propan Vazduh 1900 Alkalni metali, Zn, Cu, Cd,Pb i drugi isparljivielementi i plemeniti metali

Acetilen(siromašnasmeša)

Vazduh 2300 Zemnoalkalni metali

Acetilen (bogatasmeša)

Vazduh 2300 Sn, Ba, Cr, ...

Azot -suboksid Acetilen 2955 Metali koji grade teškoisparljive okside ihidrokside, Al, Si, Ti, V,Zr, Ge, Be,...


53

Tabela 3. Gasovi za AAS

Merni deo - Nakon apsorpcije zračenja od strane atoma, i posle toga, emisijeodređenih talasnih dužina vraćanjem ekscitovanih atoma u osnovno stanje, potrebno jeizdvojiti zrake određene talasne dužine iz okolnog spektra. Izdvajanje talasnih dužinase može izvesti pomoću prizme ili difrakcione rešetke. Prizma je napravljena odkvarcnog stakla. Prizma ili difrakciona rešetka razdvajaju talasne dužine na bazirazličitog prelamanja. Pomoću otvora (slit) selektuje se određena talasna dužina.Izdvojene talasne dužine se detektuju i kvantifikuju pomoću detektora (fotoćelije).

Gorivi gas Oksidant Temperaturaplamena, oC

Elementi koji se određuju

Vodonik Vazduh 1800 Alkalni metali, Zn, Cu, Cd,Pb

Propan Vazduh 1900 Alkalni metali, Zn, Cu, Cd,Pb i drugi isparljivielementi i plemeniti metali

Acetilen(siromašnasmeša)

Vazduh 2300 Zemnoalkalni metali

Acetilen (bogatasmeša)

Vazduh 2300 Sn, Ba, Cr, ...

Azot -suboksid Acetilen 2955 Metali koji grade teškoisparljive okside ihidrokside, Al, Si, Ti, V,Zr, Ge, Be,...


52

Neki od atoma se jonizuju, gube valentne elektrone, drugi deo atoma stvara hidroksidei okside koji dalje ekscituju. Broj atoma koji ekscituju zavisi od temperature plamena,slika 28.

Slika 28. Procesi u plamenu

Plamen i plamenici - Plamen, temperaturom i sastavom, utiče na proces atomizacije.Plamen atomskog apsorpcionog spektrofotometra (AAS) nema ulogu pobuđivanja ipobuđenih atoma treba da bude što manje. U AAS se primenjuje laminarni plamen.Izbor smeše gorivih gasova zavisi od elemenata koji će se ispitivati, tabela 3.Plamenici za AAS su izduženog, pljosnatog oblika, dužine 10-12 cm. Izdužen oblikplamenika omogućuje podešavanje potrebne osetljivosti. U slučaju određivanjaelemenata u većim koncetracijama, potrebna je manja osetljivost. Kada se određujuelementi u tragovima, osetljivost mora da bude veća.

Raspršivanje - Da bi rastvor koji se analizra dospeo u plamen, potrebno ga je usisati iraspršiti. Pneumatski raspršivači za raspršivanje koriste vazduh (pomaže gorenje).Jedan kraj kapilarne cevi je uronjen u rastvor, a drugi izložen vakuumu pod dejstvomstrujanja vazduha. Količina rastvora koja dospeva u plamen zavisi od raspršivača.Veličina i uniformnost kapljica takođe utiču na osetljivost. Komore za raspršivanjemogu biti kondenzacione ili homogenizacione. U komorama dolazi do mešanja gorivihgasova i kapljica tečnosti. Veće kapljice se talože, a u plamen dospevaju samonajsitnije. U cilju poboljšanja mešanja gasova, u komore se često postavljaju pera zaometanje protoka ili prepreke koje poboljšavaju mešanje.


52

Neki od atoma se jonizuju, gube valentne elektrone, drugi deo atoma stvara hidroksidei okside koji dalje ekscituju. Broj atoma koji ekscituju zavisi od temperature plamena,slika 28.

Slika 28. Procesi u plamenu

Plamen i plamenici - Plamen, temperaturom i sastavom, utiče na proces atomizacije.Plamen atomskog apsorpcionog spektrofotometra (AAS) nema ulogu pobuđivanja ipobuđenih atoma treba da bude što manje. U AAS se primenjuje laminarni plamen.Izbor smeše gorivih gasova zavisi od elemenata koji će se ispitivati, tabela 3.Plamenici za AAS su izduženog, pljosnatog oblika, dužine 10-12 cm. Izdužen oblikplamenika omogućuje podešavanje potrebne osetljivosti. U slučaju određivanjaelemenata u većim koncetracijama, potrebna je manja osetljivost. Kada se određujuelementi u tragovima, osetljivost mora da bude veća.

Raspršivanje - Da bi rastvor koji se analizra dospeo u plamen, potrebno ga je usisati iraspršiti. Pneumatski raspršivači za raspršivanje koriste vazduh (pomaže gorenje).Jedan kraj kapilarne cevi je uronjen u rastvor, a drugi izložen vakuumu pod dejstvomstrujanja vazduha. Količina rastvora koja dospeva u plamen zavisi od raspršivača.Veličina i uniformnost kapljica takođe utiču na osetljivost. Komore za raspršivanjemogu biti kondenzacione ili homogenizacione. U komorama dolazi do mešanja gorivihgasova i kapljica tečnosti. Veće kapljice se talože, a u plamen dospevaju samonajsitnije. U cilju poboljšanja mešanja gasova, u komore se često postavljaju pera zaometanje protoka ili prepreke koje poboljšavaju mešanje.

. . . atomsko stanje

+Me

+Me

Me O2

Me O2

Me

Me

MeOH

MeY

MeY

x

*

** * *

(MeX)

MeOH

MeX

MeX

MeX

. . . molekularno stanje

.. . so u čvrstom stanju

.. . rastvor

(termička disoci jaci ja)

( isparavanje sol i )

( isparavanje rastvarača)


62 63


55

plamenu dovoljna za jonizaciju. Zbog toga ne dolazi do apsorpcije zračenja naodgovarajućoj talasnoj dužini. Ovaj problem se rešava dodatkom inhibitora jonizacije,koji je takođe so elemenata iz prve grupe, na primer CeCl. Dodati inhibitor takođe sejonizuje i daje slobodne elektrone, koji vraćaju Na+ ili K+u osnovno stanje, gde oniapsorbuju na odgovarajućim talasnim dužinama. To se radi tako što se rastvor CeClkoncentracije 10 mg/l dodaje u uzorke i standarde u količini od 10 % .

Fizičke smetnje- Do njih dolazi usled različitih vrednosti viskoziteta ili površinskognapona uzoraka i standarda. Ovo dovodi do različite brzine aspiriranja uzorka istandarda u plamen. To se dešava kod analiza sirupa. Ova vrsta interferenci se uklanjatako što se prave standardi u istom matriksu u kojem su i uzorci (“Match matrix”).Drugi način je metoda standardnog dodatka kod koje se pravi standardna kriva uuzorku i ekstrapolira koncentracija analita u uzorku.

Priprema uzoraka podrazumeva da se metali oslobode iz svih organskih jedinjenja iprevedu u soli mineralnih kiselina. Ovaj postupak se zove razaranje ili digestija.Digestija uzorka za AAS se može obaviti mokrim i suvim postupkom. Mokri postupakse obavlja kuvanjem uzorka uz refluks sa jakim mineralnim kiselinama (azotna,sumporna, perhlorna), sa ili bez vodonik-peroksida. Danas se ovaj postupak ubrzavaprimenom mikrotalasa. Suvi postupak pripreme uzoraka se obavlja spaljivanjem uzorkana visokim teperaturama, najčešće u peći za žarenje. Ovaj postupak dovodi do gubitakaisparljivih metala.

Pored atomizacije u plamenu u AAS se koriste još i tehnike grafitne kivete, hidridnatehnika i tehnika hladnih para.

Grafitna kiveta je tehnika koja snižava limit detekcije olova. LOD Pb u plamenu je100 ppb, a LOD Pb pomoću grafitne kivete je 0.1 ppb. Ova tehnika produkuje većibroj atoma na svetlosnom putu, moguće je analizirati više elementa, uključujući iprelazne elemente, postižu se veće temperature elektrotermalne vaporizacije do3.000oC. Više atoma se ekscituje na višim temperaturama, što znači i veću osetljivostgrafitne kivete.

Hidridna tehnika je razrađena za određivanje elemenata koji grade isparljive hidrideGe, Sn, Pb, As, Bi, Se i Te. Ovi elementi su veoma toksični i u malim koncentracijama,a njihovo određivanje plamenom AAS ima visok LOD (As LOD u plamenoj AAS 1mg/cm3). Hidridnom tehnikom pored 100-strukog povećanja osetljvosti određivanjapostiže se i izdvajanje elemenata iz složenog matriksa. Hidrid se gradi hemijskomredukcijom. Kao redukciono sredstvo se koristi koristi natrijum-borhidrid. Redukcija seodvija u kiseloj sredini prema sledećoj jednačini NaBH4 + 3H2O + HCl H3BO3 +NaCl + 8H++ MHn + H2(višak). Prednosti hidridne tehnike su vrlo brza reakcija, možeda redukuje sve pomenute elemente, reagens za hidriranje se može dodavati i u oblikurastvora i tableta. Nastali hidrid se skuplja i gasnom strujom i ubacuje u kvarcnu cevkoja se zagreva, gde se odvija atomizacija. U atomizeru se hidrid razlaže i nastajeatomska para koja apsorbuje atomsko zračenje.


54

Osetljivost i tačnost određivanja - Atomskom apsorpcionom spektrofotometrijom seodređuju metali koji imaju rezonantne linije (apsorbuju talasne dužine) u opsegu190 – 850 nm i mogu se prevesti u atomsko stanje. Osetljivost je ona koncentracijaispitivanog elementa u vodenom rastvoru (μg/dm3) koja izazove apsorpciju od 1 %.Granica detekcije je ona koncentracija metala u rastvoru koja proizvede signal tri putaveći od signala šuma aparata.Osetljivost određivanja zavisi od mnogih uslova ipodešava se tokom prethodnih ispitivanja koja obuhvataju optimizaciju: uslovaraspršivanja, sastava gorućeg gasa, brzine strujanja gasova, visine i položaja plamena,intenziteta izvora svetlosti.

Smetnje - Atomska spektrofotometrija je vrlo osetljiva tehnika merenja na koju utičusmetnje različitog porekla. Smetnje mogu biti spektralnog i hemijskog porekla, mogunastati usled apsorpcije pozadine ili kao posledica jonizacije ili razlike fizičkihparametara između uzorka i standarda.

Spektralne smetnje - AAS je vrlo selektivna i specifična metoda. Talasne dužine nakojima apsorbuju pojedini elementi su dobro definisane i mala je verovatnoća da će dvaelementa apsorbovati na istoj talasnoj dužini. U retkim slučajevima talasne dužineinterferenci (drugih metala) se preklapaju sa talasnim dužinama metala koji se određuje(kada se određuju tragovi u prisustvu velikih količina drugih). Tada se bira drugaspektralna linija metala kod koje ne dolazi do interferiranja.

Hemijske smetnje se javljaju u slučajevima kada metal (najčešće je to Ca li Mg) gradijedinjenja sa anjonima koji ne disosuju u plamenu (fosfati). Tada ne dolazi doatomizacije i nema slobodnih atoma metala koji treba da ekscituju i apsorbuju energiju.Ovaj problem se rešava dodatkom jedinjenja koje jače vezuje fosfate nego Ca ili Mg.Jednjenje koje se dodaje je najčešće LaCl3.

Smetnje usled apsorpcije pozadine - U plamenu mogu biti prisutni različiti molekulikoji su u stanju da apsorbuju zračenje. Apsorpcija energije od strane molekula dovodido lažno pozitivnih rezultata. Molekulska apsorpcija je posledica prisustvanedisosovanih soli u plamenu. Molekuli apsorbuju u širokim trakama zbog rotacija ivibracija. Molekularni spektri povećavaju atomsku apsorbciju. Ovo se dešava ukoncentrovanim rastvorima soli, kao što je morska voda. Problem previšekoncentrovanih uzoraka koji imaju visoku pozadinsku apsorpciju se rešava tako što sestandardi prave u istom matriksu u kojem su i uzorci (“Match matrix”). Moguće je,takođe, koristiti korekciju pozadine pomoću deuterijumove lampe. Pomoću UVsvetlosti se meri vrednost smetnji usled apsorpcije pozadine i automatski se obavljakompenzacija merenog signala.

Jonizacione smetnje se javljaju kod određivanja metala prve grupe (Li+, Na+, K+, Ce+)koji imaju mali jonizacioni potencijal. Idealano bi bilo da su svi elementi u plamenu uosnovnom atomiziranom stanju gde apsorbuju maksimalno kao standardi, tako i uzorak.Međutim, kod elemenata sa niskim potencijalom jonizacije, u plamenu dolazi dojonizacije. Elektron se ne pobuđuje nego napušta atom, jer je energija koju je primio u


64 65


57

Atomska emisiona masena spektrofotometrija (ICP-MS) je novija tehnika zaodređivanje tragova elemenata u rastvoru. Ima veću osetljivost od AAS sa grafitnomkivetom, a istovremeno ima brzinu ICP-a sa optičkom detekcijom, jer omogućujeanalizu više elemenata istovremeno. Spektri koji se dobijaju upotrebom ICP-MS sumnogo jednostavniji (maseni spektri) u poređenju sa spektrima dobijenim ICPOES(emisioni spektri). Najteži elementi imaju stotine emisionih linija, ali imaju samo 1-10prirodnih izotopa u masenom spektru. Uzorak se rastvara primenom kisele digestije;rastvor se raspršuje pomoću argona i uvodi u plamenik zagrevan induktivno vezanomplazmom. Na visokoj temperaturi plazme sve se atomizuje i jonizuje formirajućiplazmu bogatu i ekscitiranim i jonizovanim atomima. Pozitivni joni iz plazme sefokusiraju i prebacuju u kvadropolni maseni spektrometar. Snimanjem masenogspektra plazme, podaci o elementima iz celog periodnog sistema se mogu dobiti za vrlokratko vreme. LOD je niži od 0.1 μg/L za većinu elemenata.

Maseni detektor – kvadropol je srce masenog detektora i čine ga četiri paralelnešipke – elektrode. Dve nasuprot dve su spojene za suprotne polove električnog izvora.Propuštanjem struje 5-10 V kroz šipke, generiše se elektromagnetno polje.U zavisnostiod jačine elektromagnetnog polja, samo joni određene mase prolaze kroz kanal izmeđušipki kvadropola, koji nastaje superponiranjem elektromagnetnog polja nastalogpropuštanjem struje kroz četiri šipke (elektrode).

Za rad masenog detektora potreban je visok vakuum 10-5 mbar. Atomizacija i jonizacijau plazmi se odigravaju na atmosferskom pritisku. Spoj između ICP-a i MS-a je odpresudne važnosti za obezbeđenje uslova visokog vakuuma u masenom detektoru. Joninastali u plazmi prolaze kroz mali otvor (1 mm) i dolaze u zonu smanjenog pritiska.Joni velikom brzinom ulaze u komoru gde ekspanduju pod vakuumom. Cela zapreminamasenog detektora mora biti održavana pod konstantnim vakuumom gde se jonislobodno kreću bez kolizija (sudara) sa molekulima vazduha. Sistem pumpi konstantnoodržava sistem masenog detektora pod vakuumom od 10-5 mbar. Joni dospevaju dokvadropola u uslovima vakuuma.

Nakon prolaska kroz kvadropol, joni dospevaju do elektron multiplikatora ili fotoćelijekoja registruje jone. Fotoćelija ovog tipa je cev levkastog oblika slična rogu.Naelektrisana je suprotno od jona koji prolaze kroz kvadropol. Joni koji prođu krozkvadropol bivaju privučeni ka unutrašnjoj površini levkastog dela fotoćelije. Kada jonipogode površinu fotoćelije, izazivaju izbijanje elektrona iz površine; joni koji se krećuduž cevi lančano izbijaju sve više elektrona iz površine. Ovim procesom jedan jon nakraju produkuje 108 elektrona. Čišćenje fotoćelije je od velike važnosti za dobar radMS detektora. Limit detekcije ICP-MS-a je izuzetno nizak. Neke elemente je mogućeodrediti na ppt nivou koncentracija (ppt = pg/dm3).

Osnova prednost ICP-MS-a je što daje jednostavnije masene spektre, jer svi elementiimaju najmanje jedan izotop jedinstvene mase. Moguće je izmeriti odnose atomskihizotopa, što se koristi za utrđivanje geografskog porekla.


56

Tehnika hladnih para se primenjuje za određivanje žive u različitim uzorcima.Tehnika se zasniva na osobini žive da ima visok napon pare (lako isparava) na sobnojtemperaturi i da je para stabilna. Potrebno je Hg(II) ili Hg(I) redukovati do metala inakon toga paru strujom inertnog gasa ili vazduha uneti u atomizer. Živa se možeanalizirati na AAS bez primene plamena ili grafitne kivete. Živa se u zatvorenomsistemu redukuje uz pomoć SnCl2 ili NaBH4 (stano-hlorid, natrijum-borhidrid).Reakcijom se kvantitativno oslobađa živa, i nošena vazduhom ili argonom, prolazi krozkvarcnu cevčicu na svetlosnom putu AAS. LOD za Hg je 0.02 mg/L.

4.7.2. ATOMSKA EMISIONA SPEKTROFOTOMETRIJA

Atomska emisiona spektrofotometrija je tehnika u kojoj se prati emisija energijepobuđenih elektrona tokom vraćanja u osnovno stanje ili se prate određene masejonizovanih atoma metala i njihovih izotopa.

Atomi se uvode u indukcionu plazmu (ICP - Inductively Coupled Plasma).

Plazma je jedno od osnovnih agregatnih stanja materije, pored čvrstog, tečnog igasovitog. Plazma je slična gasovitom stanju. Kao kod gasovitog stanja i u plazmidolazi do sudara između čestice, ali se čestice plazme zbog veće kinetičke energijekreću mnogo većim brzinama. Burne kolizije čestica u plazmi dovode do izbijanjaelektrona iz atoma. Kao rezultat ovoga, plazma je sastavljena od pozitivnih jona ielektrona, tako da su čestice u plazmi naelektrisane i pod uticajem elektromagnetnogpolja.

U plazmi koja je temperature oko 10.000o C dolazi do ekscitacije valentnih elektronaatoma na više energetske nivoe. Visoka temperatura plazme dovodi istovremeno i dojonizacije atoma. Na osnovu ovih pojava u plazmi razvijena su dva pravca detekcijeproizvoda nastalih u plazmi i to optički sistem detekcije i maseni sistem detekcije.

Jonizacija atoma u plazmi je nepoželjna kod optičkog sistema detekcije (ICP-OES).Zbog toga se jonizacija u plazmi minimizira dodatkom donora elektrona, na primerSeCl. Nakon ekscitacije u plazmi elektroni se vraćaju u osnovno stanje i emitujuenergiju odgovarajuće talasne dužine. Svaki energetski nivo odgovara energetskimnivoima elektronskih orbitala i podorbitala. Svako pomeranje elektrona izmeđuelektronskih nivoa dovodi do emitovanja svetlosti određene talasne dužine. Prelaziviših energija emituju kraće talasne dužine. Intenzitet emitovanog svetla jeproporcionalan količini metala u plamenu. Detektor emitovanih talasnih dužina dajeemisione spektre metala. Oni su veoma komplikovani, broje više desetina emisionihlinija, naročito kada je prisutno više metala istovremeno. Kompjuterizovani sistemiomogućuju analizu spektralnih linija na bazi poznatih kombinacija talasnih dužinakarakterističnih za svaki elemenat.


66 67


59

5. HROMATOGRAFIJA

Osnovna definicija hromatografije po IUPAC-u (International Union of Pure andApplied Chemistry) je:

Hromatografija je metoda fizičkog razdvajanja u kome se komponenteraspodeljuju između dve faze, od kojih je jedna nepokretna, a druga se kreće uodređenom pravcu.

Danas postoje brojne hromatografske tehnike i sve se koriste za razdvajanje smešejedinjenja. Glavni delovi hromatografa su sistem za snabdevanje mobilnom fazom,injektor, kolona i detektor.

Reč hromatografija nastala je od grčkih reči: hroma – boje i grafein – pisati.Hromatografiju je izumeo ruski naučnik M. S. Cvet 1901. tokom istraživanja biljnihpigmenata. On je za razdvajanje hlorofila i karotenoida u ekstraktima biljaka koristiocev (kolonu) punjenu sa polisaharidom inulinom kao adsorbentom, i mešavinomugljovodonika kao eluentom, slika 29. Kako je biljni

Slika 29. Kolona sa razdvojenim komponentama biljnog ekstrakta

ekstrakt (koji je smeša različitih fito-hemikalija) putovao kroz kolonu, došlo je dopojave više obojenih zona u staklenoj koloni. Svaka obojena zona je bila jedna odkomponenti biljnog ekstrakta. Cvet je objavljivao samo na ruskom i njegovi radovipostali su dostupni tek mnogo godina kasnije. Za dalji razvoj hromatografije zaslužnisu britanski naučnici A. Martin i R. Singe, koji su objasnili proces hromatografskograzdvajanja, i za to dobili Nobelovu nagradu za hemiju 1942. godine. Do šire primenehromatografije je došlo tek 1952. godine kada su R. Martin i A. Džejms opisaliprimenu gasa kao mobilne faze umesto tečnosti, i kao stacionarne faze česticapresvučenih vrlo viskoznom tečnošću. Godine 1956. Van Demter, Ziderveg iKlinkenberg su opisali procese u gasno-hromatografskoj koloni sa stanovišta kinetike.


59

5. HROMATOGRAFIJA

Osnovna definicija hromatografije po IUPAC-u (International Union of Pure andApplied Chemistry) je:

Hromatografija je metoda fizičkog razdvajanja u kome se komponenteraspodeljuju između dve faze, od kojih je jedna nepokretna, a druga se kreće uodređenom pravcu.

Danas postoje brojne hromatografske tehnike i sve se koriste za razdvajanje smešejedinjenja. Glavni delovi hromatografa su sistem za snabdevanje mobilnom fazom,injektor, kolona i detektor.

Reč hromatografija nastala je od grčkih reči: hroma – boje i grafein – pisati.Hromatografiju je izumeo ruski naučnik M. S. Cvet 1901. tokom istraživanja biljnihpigmenata. On je za razdvajanje hlorofila i karotenoida u ekstraktima biljaka koristiocev (kolonu) punjenu sa polisaharidom inulinom kao adsorbentom, i mešavinomugljovodonika kao eluentom, slika 29. Kako je biljni

Slika 29. Kolona sa razdvojenim komponentama biljnog ekstrakta

ekstrakt (koji je smeša različitih fito-hemikalija) putovao kroz kolonu, došlo je dopojave više obojenih zona u staklenoj koloni. Svaka obojena zona je bila jedna odkomponenti biljnog ekstrakta. Cvet je objavljivao samo na ruskom i njegovi radovipostali su dostupni tek mnogo godina kasnije. Za dalji razvoj hromatografije zaslužnisu britanski naučnici A. Martin i R. Singe, koji su objasnili proces hromatografskograzdvajanja, i za to dobili Nobelovu nagradu za hemiju 1942. godine. Do šire primenehromatografije je došlo tek 1952. godine kada su R. Martin i A. Džejms opisaliprimenu gasa kao mobilne faze umesto tečnosti, i kao stacionarne faze česticapresvučenih vrlo viskoznom tečnošću. Godine 1956. Van Demter, Ziderveg iKlinkenberg su opisali procese u gasno-hromatografskoj koloni sa stanovišta kinetike.


58

Visoka cena uređaja je najvažniji nedostatak ove tehnike. Takođe se javlja velikoodstupanje (drift), 5-10 % za samo jedan sat rada, pa je potrebna češća kalibracija.

Tokom rada ICP-MS-a javljaju se različite interference od prisutnih molekula nastalihu plazmi. Ovo se rešava ubrizgavanjem razblaženih rastvora ili pomoću tehnologijekolizione ćelije. U kolizionoj ćeliji reakcioni gas reaguje sa jonizovanim molekulima izplazme, čime ih neutrališe. Kao reakcioni gas koristi se helijum. U plazmi argonanastaju molekulski joni (joni poliatoma). Dva molekularna jona nastaju od samogargona: argon-dimer (Ar2+), argon-oksid (ArO+) koji nastaje u prisustvu vode. MMAr2+ je 80 g/mol, što intereferira sa masom glavnog izotopa selena (Se). Selen MM =78,96 g/mol i ima nekoliko izotopa, i to: 74Se, 76Se, 77Se, 78Se, S0Se. Masa ArO+ je 56 iinterferira sa MM gvožđa (Fe). Kod klasične ICP-MS-ove interference su razlog da seza određivanje Se i Fe biraju manje zastupljeni izotopi. Merenje koncentracije Se i Fe,preko izotopa koji su manje zastupljeni, dovodi do manje osetljivosti određivanja ovihelemenata. Za Se i Fe LOD je 2-20 ug/dm3 zbog prisutnih poliatoma. Pomoću kolizionećelije LOD se snižava do<1 ug/dm3. Reakciona ćelija se nalazi na putu jona, a prekvadropola. Ona je je pod blagim pritiskom reakcionog gasa. Ćelija sadrži posebankvadropol, odnosno oktopol, koji fokusira jone. U slučaju Fe i ArO+, reakcioni gas jeamonijak: ArO+ + NH3 --> ArO + NH3+. Ovako se argon-oksid neutrališe; pošto višenije naelektrisan neće prolaziti kroz oktopol i, dalje, kroz kvadropol,56Fe+ se tako možeodrediti sa većom osetljivošću.

ICP MS se koristi kod određivanja elemenata: u tragovima u medicini, farmaciji, hrani,životnoj sredini itd., u slučajevima kada ima malo uzorka za analizu. Dobijaju semaseni spektri elemenata od mase 6 do 250, što pokriva ceo periodni sistem elemenata.Ovako se mogu određivati retki elementi. EPA je razvila standardizovane metode zaanalizu u oblasti životne sredine, vode vazduha, zemljišta (EPA Methods 200.8 &6020). Pojedini elementi se mogu određivati metodom razblaženja izotopima (isotopedillution), dodatkom poznate količine standarda obogaćenih izotopima, tehnika koja jevrlo popularna i pouzdana.

⸎


68 69


61

5.1. PODELA HROMATOGRAFSKIH TEHNIKA

Na osnovu agregatnog stanja, mobilne i stacionarne faze hromatografske tehnike seklasifikuju kao gasno-tečna hromatografija (GLC), gasno-čvrsta hromatografija(GSC), tečno-tečna hromatografija (LLC) i tečno-čvrsta hromatografija (LSC). Naosnovu mehanizama razdvajanja, hromatografija se deli na apsorpcionu, podeonu,jonoizmenjivačku i gelpermeativnu. Takođe, postoji i podela hromatografskih tehnikapo polarnosti stacionarne i mobilne faze hromatografija na normalnim fazama, gde jestacionarna faza polarna (npr. silika gel), a mobilna faza nepolarna (.heksan). Postoji,takođe, i hromatografija na obrnutim fazama, gde je stacionarna faza nepolarna (C-18,C-8), a mobilna faza polarna (metanol, voda).

5.2.TIPOVI HROMATOGRAFSKIH MEHANIZAMA

Adsorpcija je mehanizam privlačenja između jedinjenja koje poseduju dipolnimomenat i površine stacionarne faze. Slabe hemijske veze koje se ovde ostvaruju suvodonične, dipol-dipol i Van der Valsove veze, slika 30.

.

Slika 30. Apsorpcija i adsorpcija

Najpoznatiju adsorpcioni materijal je silika gel (SiO2 x nH2O). Ima veliku specifičnupovršinu, do 800 m2/g, i ogromnu sposobnost vezivanja vode; koristi se kao sredstvoza sušenje. Netoksičan je i nezapaljiv. Silika gel je inertan sa velikim brojem


61

5.1. PODELA HROMATOGRAFSKIH TEHNIKA

Na osnovu agregatnog stanja, mobilne i stacionarne faze hromatografske tehnike seklasifikuju kao gasno-tečna hromatografija (GLC), gasno-čvrsta hromatografija(GSC), tečno-tečna hromatografija (LLC) i tečno-čvrsta hromatografija (LSC). Naosnovu mehanizama razdvajanja, hromatografija se deli na apsorpcionu, podeonu,jonoizmenjivačku i gelpermeativnu. Takođe, postoji i podela hromatografskih tehnikapo polarnosti stacionarne i mobilne faze hromatografija na normalnim fazama, gde jestacionarna faza polarna (npr. silika gel), a mobilna faza nepolarna (.heksan). Postoji,takođe, i hromatografija na obrnutim fazama, gde je stacionarna faza nepolarna (C-18,C-8), a mobilna faza polarna (metanol, voda).

5.2.TIPOVI HROMATOGRAFSKIH MEHANIZAMA

Adsorpcija je mehanizam privlačenja između jedinjenja koje poseduju dipolnimomenat i površine stacionarne faze. Slabe hemijske veze koje se ovde ostvaruju suvodonične, dipol-dipol i Van der Valsove veze, slika 30.

.

Slika 30. Apsorpcija i adsorpcija

Najpoznatiju adsorpcioni materijal je silika gel (SiO2 x nH2O). Ima veliku specifičnupovršinu, do 800 m2/g, i ogromnu sposobnost vezivanja vode; koristi se kao sredstvoza sušenje. Netoksičan je i nezapaljiv. Silika gel je inertan sa velikim brojem


60

Gasno-tečna hromatografija (danas gasna hromatogrfija) je tada počela ubrzano da serazvija. Hemijskim vezivanjem stacionarne faze za čvrsti nosač, povećana jetemperaturna stabilnost stacionarne faze u koloni. Tako je gasna hromatografijaprilagođena za rad na višim temperaturama. Jedinjenja veće molekulske mase na ovajnačin mogu da se kreću kroz kolonu, a da ne dođe do procesa ispravanja stacionarnefaze (column bleeding). Gas koji se koristi kao mobilna faza mora biti veoma čist, pasu tako dobijeni hromatogrami bez prisutnih inerferenci poreklom od mobilne faze.

Tokom vremena oblik kolona je evoluirao. U početku vertikalne kolone, prečnika 2-3cm, postale su tanje i duže. Kada je zapaženo da to povećava efikasnost razdvajanja,punjene staklene kolone su zamenjene kolonama kapilarnih prečnika (manjim od 1mm) i dugim više desetina metara. Kod kapilarnih kolona stacionarna faza je nanesenana unutrašnji zid kapilare. Paraleno sa kolonskim tehnikama razvijale su se i tehnikeplanarne hromatografije, u koje spada papirna hromatografija i tehnika razdvajanja natankom sloju (Thin Layer Chromatography). Stacionarna faza kod TLC je nanesena utankom sloju na staklenu ili plastičnu površinu. Sredinom 70-tih, interes za tečnemobilne faze se vratio kada je otkriveno da se efikasnost razdvajanja može značajnopovećati pumpanjem mobilne faze kroz kolonu. Do tada je mobilna faza proticala krozvertikalnu punjenu kolonu pod dejstvom gravitacije. Ovakvo razdvajanje je trajalo višečasova. Primenom pumpi proces se značajno ubrzao, kolone su postale kraće, a novatehnika je nazvana “High pressure liquid chromatography”, ili “High performanceliquid chromatography”, skraćeno HPLC. Kada su otkrivene prednosti fluida usuperktritičnom stanju, počela je sa razvojem i superkritična tečna hromatografija(SFC). Kao mobilna faza koristi se gas u superkritičnom stanju, najčešće CO2. Danasova tehnika ima široku industrijsku upotrebu.

Na kraju kolone se nalazi osetni elemenat ili detektor koji reaguje na prisustvoradvojenih jedinjenja. Većina hemijskih jedinjenja je bezbojna i razdvajanje koje jeM.S. Cvet mogao da vidi golim okom, nemoguće je za ovakva jedinjenja. Razdvajanjesmeše bezbojnih hemijskih jedinjenja je bespredmetno ako se ne može videti kada kojejedinjenja izlazi iz kolone. Zbog toga svaki hromatograf mora da ima uređaj koji je ustanju da detektuje jedinjenja i pisač koji crta pikove. Kod gasne hromatografije postojiviše vrsta detektora, koji se mogu podeliti na univerzalne i selektivne. Detektori semogu podeliti i po osetljivosti i selektivrnosti. Danas se kontinuirano razvijaju novi ipoboljšavaju postojeći detektori, sa ciljem povećanja njihove osetljivosti.

Hromatografski instrumenti se tokom poslednjih dekada povezuju sa drugim tipovimaanalitičkih uređaja. Tako nastaju “Hyphenated Techniques” ili tehnike sa crticom GC-ICP-MS, HPLC-ICP-MS, CE-ICP-MSHPLC-DAD, HPLC-IR, kod kojih su spojenenajbolje osobine dveju ili triju tehnika.


70 71


63

5.3.TERMINOLOGIJA U HROMATOGRAFIJI

Koeficijent raspodele između faza - Hromatografsko razdvajanje se može objasnitiNernstovim koeficijentom raspodele supstance između dve faze ili rastvarača, koji sene mešaju. Supstance A i B nanesene na kolonu na početku hromatografske kolone susmeše, slika 32. a. Tokom vremena, nošene mobilnom fazom, supstance A i B se krećukroz hromatografsku kolonu. Brzina kretanja zavisi od vremena koje je svaka od njihprovela u mobilnoj, odnosno u stacionarnoj fazi. Supstanca B se kreće brže, jer viševremena provodi u mobilnoj fazi, slika 32. b. Raspodela između faza ne zavisi odkoncentracije supstance, ali zavisi od temperature, prirode supstance, tipa stacionarne imobilne faze.

Slika 32. Hromatografsko razdvajanje

Raspodelu između faza definiše Nernstov izraz za koeficijent raspodele (22) kojipredstavlja količnik između koncentracije supstance u stacionarnoj i koncentracijesupstance u mobilnoj fazi. Za supstancu B koeficijet raspodele KB je manji od 1, jer jekoncentracija u mobilnoj fazi veća od koncentracije u stacionarnoj fazi, pa je zatoKA>KB (slika 32.).

(22)

Retenciono vreme je vreme koje je potrebno supstanci da nakon injektovanja dođe dodetektora i obeležava se sa tR.Mrtvo vreme je vreme koje je potrebno supstanci koja se

Slika 33. Mrtvo vreme i retenciono vreme


63





(22)




63





(22)




62

Slika 31. Površina silika gela i interakcija se hidrofilnim molekulom

hidroksilnih gupa na površini, što dovodi do toga da se supstance sa silika gelomvezuju vodoničnim vezama, slika 31.

Raspodela između dve tečnosti na bazi rastvorljivosti, mahnizam je koji postoji tokomrastvaranja supstance u dvema tečnostima koje se ne mešaju. Supstanca se raspoređujeizmeđu tečne stacionarne i tečne mobilne faze.

Izmena jona ili jonoizmenjivački mehanizam u hromatografiji razdvaja jonizovanevrste na bazi različite snage vezivanja za jonsku smolu. Smole mogu biti katjonski ianjonski menjači. Katjonski menjači jona na površini imaju anjone koji reaguju sakatjonima iz rastvora. Anjonski menjači imaju katjone na površini smole koji vezujuanjone iz rastvora. Postoje slabi i jaki katjonski i anjonski menjači, u zavisnosti odfunkcionalnih grupa na površini menjača jona.

Gel filtracija ili gel-permeativni hromatografski mehanizam, omogućuje razdvajanjena bazi veličine molekula. Mali molekuli imaju duži put kroz pore gela i sporije sekreću, treba im više vremena da prođu kroz kolonu i izlaze kasnije. Veliki molekuli nezalaze u pore gela i kretanje kroz kolonu im je brže.

Afinitetna hromatografija koristi stacionarne faze od hemijski modifikovanogmaterijala. Kod ovog tipa hromatografije jedinjenja se vezuju za stacionarnu fazu zatošto je stacionarana faza tako modifikovana da ima centre (ligande) za koje može da seveže samo određeni tip hemijskih jedinjenja. Ovo je najselektivniji adsorptivnimehanizam. Ako jedinjenja u smeši nemaju nikakve interakcije sa stacionarnom fazom,ona će bez zadržavanja proći kroz kolonu i neće doći do razdvajanja. Ako se jedinjenjau smeši suviše jako vežu za stacionarnu fazu, ostaće zauvek u koloni.

Protok mobilne faze

Površina silika gela

CH3 O

CH3

OH

OHOHOHOHHOOHOHHO

Si Si Si Si Si

Sig

nal

dete

ktor

a

Vreme

t R

t M


72 73


65

Zamenom jednačina (23) i (24) u jednačinu (29) dobija se:

(30)

I na kraju, preuređenjem jednačine (30) dobija se izraz ra retencioni faktor za analit A:

(31)

Retencioni faktor govori o efikasnosti procesa razdvajanja.Ako je k’ > 20 ilirazdvajanje traje predugo; ako je k’ < 1 elucija je suviše brza. Optimalna vrednostretencionog faktora je: 2 < k’ <10.

Faktor selektivnosti α-Faktor selektivnosti kolone α za dva analita A i B je definisanodnosom koficijenata raspodele:

(32)

KB je koficijent raspodele za analit koji se jače vezuje za kolonu; KA je koeficijentraspodele za analit koji se slabije vezuje za kolonu, α>1. Zamenom jednačine (28) u(32) dobija se:

(33)

veza između faktora selektivnosti i njihovih retencionih faktora se dobija zamenom (31)u (33) dobija se izraz:

(34)

koji omogućuje izračunavanje faktora selektivnosti iz hromatograma i procenu moćirazdvajanja kolone.


64

ne zadržava u koloni da dođe do detektora i obeležava se sa tM, slika 33. Prosečnalinearna brzina kretanja analita kroz kolonu dužine L je (ν):

ν= L/tR (23)

Prosečna linearna brzina kretanja analita koji se ne zadržava odgovara brzini mobilnefaze (u) :

u= L/tM (24)

Linearna brzina kretanja analita (ν) kroz kolonu na drugi način može da se prikaže kaoumnožak brzine mobilne faze (u) i vremena koje analit provede u mobilnoj fazi:

ν = u xvreme koje analit provede u mobilnoj fazi (25)

Linerana brzina može da se prikaže i kao:

(26)

Kada se u ovoj jednačini izrazi broj molova, dolazimo do veze linerane brzine analita iNernstovog koeficijenta raspodele,

(27)

gde je: CM - koncentracija analita u mobilnoj fazi, CS - koncentracija analita ustacionarnoj fazi, VM - zapremina mobilne faze i Vs- zapremina stacionarne faze.

Retencioni faktor k’ je parametar koji opisuje brzinu kretanja analita A kroz kolonu iobeležava se k’A

(28)

Zamenom izraza za retencioni faktor (28) u jednačinu za linearnu brzinu (27) dobija se:

(29)


74 75


67

(40)

Zamenom dužine kolone (L) sa retencionim vremenom (tR), dobija se izraz koji govorio vezi broja teoretskih podova sa retencionim vremenom i širinom baze pika (W). Ovajednačina ukazuje da je broj teoretskih podova direktno proporcionalan retencionomvremenu, a obrnuto širini baze pika (40). Znači, broj teoretskih podova raste kada rasteretenciono vreme i kada pada širina pika: N tRW.

(41)

Kako je merenje širine baze pika (W) nepraktično, uvedena je širina pika na polovinivisine koja iznosi: W1/ 2 = 2,345δ, kako se vidi na slici 34. Kada se zameni W sa W1/2 ijednačina sredi, dobija se konačan izraz za broj teoretskih podova (42).

(42)

Slika 34. Gausova kriva normalne rapodele


67

(40)

Zamenom dužine kolone (L) sa retencionim vremenom (tR), dobija se izraz koji govorio vezi broja teoretskih podova sa retencionim vremenom i širinom baze pika (W). Ovajednačina ukazuje da je broj teoretskih podova direktno proporcionalan retencionomvremenu, a obrnuto širini baze pika (40). Znači, broj teoretskih podova raste kada rasteretenciono vreme i kada pada širina pika: N tRW.

(41)

Kako je merenje širine baze pika (W) nepraktično, uvedena je širina pika na polovinivisine koja iznosi: W1/ 2 = 2,345δ, kako se vidi na slici 34. Kada se zameni W sa W1/2 ijednačina sredi, dobija se konačan izraz za broj teoretskih podova (42).

(42)

Slika 34. Gausova kriva normalne rapodele


66

5.4.TEORIJA HROMATOGRAFIJE

Do danas postoji dva pristupa u objašnjenju teorije hromatografskog razdvajanja. Prvije teorija ekvivalentnih podova, koju su razradili A. Martin i R Singe. Drugi pristup jeteorija efektivne difuzije, koju je razradio Van Deemter.

Teorija ekvivalentnih podova polazi od analogije hromatografske kolone sadestilacionom kolonom. Smatra se da je hromatografska kolona izdeljena na veliki brojsegmenata, u kojima se u svakom pojedinačno uspostavlja ravnoteža. Kako merenja ukoloni nisu moguća, o broju uspostavljenih ravnoteža se sudi na osnovu hromatograma.Po ovoj teoriji se, kao mera efikasnosti hromatografske kolone, koriste dva parametrakoja se mogu brojčano izraziti, i to visina teoretskog poda H i broj teoretskih podova N.Veza između ova dva parametra je:

(35)

L predstavlja dužinu kolone u cm. Efikasnost hromatografske kolone raste kada rastebroj teoretskih podova i kada je manja visina teoretskog poda.

Visina teoretskog poda H: Pošto hromatografski pik ima oblik Gausove krivenormalne raspodele, a standardna devijacija je mera širine tog pika, onda se visinateoretskog poda H može definisati kao varijansa po jedinici dužine kolone(36).

(36)

(37)

(38)

Kako je širina osnove pika W jednaka 4 standardne devijacije (37), može da se zameni(38) u (36) i tako dobijamo izraz za visinu teroretskog poda (39).

(39)

Zamenom izraza (35) u jednačinu (39) dobija se izraz koji govori o vezi brojateoretskih podova sa dužinom kolone i širinom baze pika (40).

tR(L)

H

50%

2 σ

W=

2,34

5 σ

1/2

W = 4 σ Vreme


76 77


69

gde je γ – lavirint faktor definisan ograničenom difuzijom u napunjenoj koloni DM –koeficijent difuzije u mobilnoj fazi

Faktor brzine transfera mase između faza (Cu). Brzina transfera mase ima većiuticaj kada su linearne brzine mobilne faze veće. Njime se definiše uticaj otporaprenosa mase iz stacionarne u mobilnu fazu i obrnuto,

Cu = (Cs +Cm)u (46)

gde je Cs vreme koje supstanca provede u stacionarnoj fazi, a Cm vreme kojesupstanca provede u mobilnoj fazi.

Optimizacija hromatografskog razdvajanja. Cilj hromatografskog razvajanja jerazdvojiti smešu jedinjenja za što kraće vreme, bez gubitka kvaliteta razdvajanja.Vremerazdajanja se skraćuje smanjenjem širine pika i skraćenjem vremena zadržavanja,retencionog vremena (tR). Faktor razdvajanja kolone RS govori o efikasnostirazdvajanja (47). Kada je faktor razdvajanja Rs > 1 razdvajanje je zadovoljavajuće,slika 36,

(47)

gde je tRB retenciono vreme supstance B, a tRA retenciono vreme supstance A.

Optimalni uslovi razdvajanja se dobijaju podešavanjem i pravilnim izboromtemperature kolone, sastava mobilne faze, dužine i pakovanja kolone, veličine česticapunjenja stacionarne faze, debljine filma stacionarne faze, prečnika kolone i protokamobilne faze.

Slika 36. Efiksanost hromatografskog razdvajanja


69

gde je γ – lavirint faktor definisan ograničenom difuzijom u napunjenoj koloni DM –koeficijent difuzije u mobilnoj fazi

Faktor brzine transfera mase između faza (Cu). Brzina transfera mase ima većiuticaj kada su linearne brzine mobilne faze veće. Njime se definiše uticaj otporaprenosa mase iz stacionarne u mobilnu fazu i obrnuto,

Cu = (Cs +Cm)u (46)

gde je Cs vreme koje supstanca provede u stacionarnoj fazi, a Cm vreme kojesupstanca provede u mobilnoj fazi.

Optimizacija hromatografskog razdvajanja. Cilj hromatografskog razvajanja jerazdvojiti smešu jedinjenja za što kraće vreme, bez gubitka kvaliteta razdvajanja.Vremerazdajanja se skraćuje smanjenjem širine pika i skraćenjem vremena zadržavanja,retencionog vremena (tR). Faktor razdvajanja kolone RS govori o efikasnostirazdvajanja (47). Kada je faktor razdvajanja Rs > 1 razdvajanje je zadovoljavajuće,slika 36,

(47)

gde je tRB retenciono vreme supstance B, a tRA retenciono vreme supstance A.

Optimalni uslovi razdvajanja se dobijaju podešavanjem i pravilnim izboromtemperature kolone, sastava mobilne faze, dužine i pakovanja kolone, veličine česticapunjenja stacionarne faze, debljine filma stacionarne faze, prečnika kolone i protokamobilne faze.

Slika 36. Efiksanost hromatografskog razdvajanja


68

Teorija efektivne difuzije koju je kreirao Van Deemter govori da su oblik pika i visinaekvivalentnog teoretskog poda (H) posledica tri procesa koja se, istovremeno, odvijajuu hromatografskoj koloni: 1) molekuli analita imaju različite dužine puta koji prelazenošeni kroz kolonu, i koji se označava (A), 2) proces molekularne difuzije (B/u) i 3)transfer mase između stacionarne i mobilne faze (Cu). Van Deemterova jednačina (43)istovremeno govori da visina teoretskog poda (H), ne zavisi od linerane brzine (član A),obrnuto je proporcionalna lineranoj brzini (član B/u) i direktno je proporcionalnalineranoj brzini (član Cu). U trećem članu (C) je koeficijent prenosa mase i predstavljazbir CS - efekta debljine filma stacionarne faze na difuziju u stacionarnoj fazi i Cm -efekta veličine čestica i molekulane difuzije u mobilnoj fazi na transport mase.

(43)

Slika 35. Različite dužine putanja molekula analita kroz kolonu

Faktor različitih putanja (A). U trenutku ulaska molekula analita u kolonu svimolekuli su zajedno u zoni iste širine, a na kraju kolone oblik pika je oblik Gausovekrive normalne raspodele; molekuli putuju različitim brzinama kroz kolonu i krivapredstavlja distribuciju brzina kretanja čestica (pojedinih molekula analita). Član Ajednačine predstavlja različitu dužinu puta molekula analita kroz kolonu. Pik na krajukolone je širi kada molekuli koji prolaze kroz punjenje kolone imaju više putanjarazličitih dužina; dužina puta značajno varira, a molekuli dospevaju do kraja kolone unekom vremenskom intervalu. Ovaj član A značajno zavisi od dimenzija česticapakovanja kolone, slika 35.

(44)

gde je dp - prečnik čestica pakovanja λ- konstanta zavisna od kvaliteta pakovanja.

Faktor molekularne difuzije, (B/u) opisuje proces transfera molekula analita iz zoneveće koncentracije u zonu manje koncentracije. Faktor molekularne difuzije je obrnutoproporcionalan linearnoj brzini mobilne faze. Veći je kada je linearna brzina mobilnefaze manja,

B = 2γDM (45)


68

Teorija efektivne difuzije koju je kreirao Van Deemter govori da su oblik pika i visinaekvivalentnog teoretskog poda (H) posledica tri procesa koja se, istovremeno, odvijajuu hromatografskoj koloni: 1) molekuli analita imaju različite dužine puta koji prelazenošeni kroz kolonu, i koji se označava (A), 2) proces molekularne difuzije (B/u) i 3)transfer mase između stacionarne i mobilne faze (Cu). Van Deemterova jednačina (43)istovremeno govori da visina teoretskog poda (H), ne zavisi od linerane brzine (član A),obrnuto je proporcionalna lineranoj brzini (član B/u) i direktno je proporcionalnalineranoj brzini (član Cu). U trećem članu (C) je koeficijent prenosa mase i predstavljazbir CS - efekta debljine filma stacionarne faze na difuziju u stacionarnoj fazi i Cm -efekta veličine čestica i molekulane difuzije u mobilnoj fazi na transport mase.

(43)

Slika 35. Različite dužine putanja molekula analita kroz kolonu

Faktor različitih putanja (A). U trenutku ulaska molekula analita u kolonu svimolekuli su zajedno u zoni iste širine, a na kraju kolone oblik pika je oblik Gausovekrive normalne raspodele; molekuli putuju različitim brzinama kroz kolonu i krivapredstavlja distribuciju brzina kretanja čestica (pojedinih molekula analita). Član Ajednačine predstavlja različitu dužinu puta molekula analita kroz kolonu. Pik na krajukolone je širi kada molekuli koji prolaze kroz punjenje kolone imaju više putanjarazličitih dužina; dužina puta značajno varira, a molekuli dospevaju do kraja kolone unekom vremenskom intervalu. Ovaj član A značajno zavisi od dimenzija česticapakovanja kolone, slika 35.

(44)

gde je dp - prečnik čestica pakovanja λ- konstanta zavisna od kvaliteta pakovanja.

Faktor molekularne difuzije, (B/u) opisuje proces transfera molekula analita iz zoneveće koncentracije u zonu manje koncentracije. Faktor molekularne difuzije je obrnutoproporcionalan linearnoj brzini mobilne faze. Veći je kada je linearna brzina mobilnefaze manja,

B = 2γDM (45)

tRAtRB

tRAtRB

-

WA WB


78 79

Norm.

Mnorm

Match = 9902.72 ng pyrene

nm

Time (min)

standard

zemljište200

100

200 225 250 275 300 325 350 375

80

60

40

20

0

150

100

50

0

5 10 15 20 25

Norm.

Mnorm

Match = 9902.72 ng pyrene

nm

Time (min)

standard

zemljište200

100

200 225 250 275 300 325 350 375

80

60

40

20

0

150

100

50

0

5 10 15 20 25


71

Slika 38. UV spektri pirena sa detektora sa nizom dioda

Kvantitativne karakteristike koje se mogu videti na hromatogramu su visina ipovršina pika. Visina pika se lako meri, ali je greška 5-10 % kao posledicanereproduktivnog injektiranja. Takođe, pik može da bude preveliki i da izlazi iz okvirahromatograma. Površina pika se dobija vrlo precizno izračunavanjem digitalnimelektronskim integratorima. Pikovi treba da budu idealnog oblika Gausove krive.

Kalibracija - Da bi se iz površine pika mogla izračunati koncentracija analita,potrebno je pod istim uslovima hromatografisati standarde poznatih koncentracija.Pravi se serija standarda rastuće koncentracije. Dobijena zavisnost između odgovoradetektora (površina pika) i koncentracije analita, koristi se za izračunavanjekoncentracije u uzorku. Kod gasne hromatografije su zapremine koje se ubaciju ukolonu oko 1 μl, i to je najčešći izvor greške. Dodatkom internog standarda koji sedodaje u uzorke i u standarde u istoj količini, greška se smanjuje. Korišćenjeautomatskog injektora takođe smanjuje grešku. Standardi koji se koriste moraju bitisertifikovani, poznate koncentracije i roka važenja. Ukoliko se koriste nepouzdanistandardi nestabilnih jedinjenja, koji su manje koncentracije nego što je daklarisano,dobijaju se veći rezultati i greška u merenju.

5.5. GASNA HROMATOGRAFIJA

U gasnoj hromatografiji mobilna faza je inertni gas nosač, a stacionarna faza je visokomolekularna tečnost nanesena na površinu finih čestica (nosač) ili na unutrašnje zidovedugačke kapilarne cevi. Najčešći gasovi nosači su helijum, vodonik i azot. Dotok gasau aparat je kontrolisan manometrima, koji obezbeđuju kontinuirano snabdevanje gasom.Kolona je spojena za injekcioni blok i uzorak se uvodi u struju gasa nosača natemperaturi dovoljno visokoj da obezbedi isparavanje svih komponenti smeše. Uzorakse unosi mikrolitarskim špricem koji probija gumeni septum pri ulasku u isparivač.Detektor je direktno spojen za kraj kolone i registruje pojedine komponente uzorka,redom kojim izlaze iz kolone. Detektor treba da bude neosetljiv na gas nosač.


70

Hromatografija se koristi za razdvajanje smeše sličnih jedinjenja, kvalitativno ikvantitativno određivanje razdvojenih jedinjenja. Pri izboru kolone i analita osnovniprincip je “slično sa sličnim”. Polarna jedinjenja se razdvajaju na polarnim kolonama.Na primer, alkoholi i estri su polarni i razdvajaju se na polarnim kolonama wax-tipa(Omegawax, Supelcowax, Carbowax). Organohlorni pesticidi i policiklični aromatičniugljovodonici su nepolarna jedinjenja, i kolona koja se koristi za njihovo razvajanje jenepolarna (stacionarna faza je polidimetil-siloksan).

Rezultat hromatografskog razdvajanja je hromatogram sa pikovima razdvojenihjedinjenja i njihovim vremenima zadržavanja ili retencionim vremenima. Vremezadržavanja nekog jedinjenja u hromatografskoj koloni ili retenciono vreme jekvalitativna karakteristika tog jedinjenja. Na hromatogramu se vide visine pojedinihpikova (koje odgovarajuu određenoj površini ispod pikova) i koje govore o količinijedinjenja. Poređenjem retencionog vremena standarda i uzorka dobijenih pod istimuslovima, utvrđuje se identitet jedinjenja. Na slici 37. su prikazani hromatogramiuzorka zemljišta preklopljeni sa hromatogramom standarda. Poklapanje pikova ustandardu i uzorku je potvrda prisustva jedinjenja u uzorku. Retenciona vremenapojedinih pikova se poklapaju u uzorku i standardu.

Slika 37. Hromatogrami ekstrakta zemljišta i hromatogram standarda

Neki detektori daju spektre jedinjenja kao potvrdu identiteta. Na primer, detektor sanizom dioda (DAD) daje UV spektar jedinjenja koji se može porediti sa spektrom izbiblioteke spektara i tako doprineti pouzdanijem određivanju, slika 38.


70

Hromatografija se koristi za razdvajanje smeše sličnih jedinjenja, kvalitativno ikvantitativno određivanje razdvojenih jedinjenja. Pri izboru kolone i analita osnovniprincip je “slično sa sličnim”. Polarna jedinjenja se razdvajaju na polarnim kolonama.Na primer, alkoholi i estri su polarni i razdvajaju se na polarnim kolonama wax-tipa(Omegawax, Supelcowax, Carbowax). Organohlorni pesticidi i policiklični aromatičniugljovodonici su nepolarna jedinjenja, i kolona koja se koristi za njihovo razvajanje jenepolarna (stacionarna faza je polidimetil-siloksan).

Rezultat hromatografskog razdvajanja je hromatogram sa pikovima razdvojenihjedinjenja i njihovim vremenima zadržavanja ili retencionim vremenima. Vremezadržavanja nekog jedinjenja u hromatografskoj koloni ili retenciono vreme jekvalitativna karakteristika tog jedinjenja. Na hromatogramu se vide visine pojedinihpikova (koje odgovarajuu određenoj površini ispod pikova) i koje govore o količinijedinjenja. Poređenjem retencionog vremena standarda i uzorka dobijenih pod istimuslovima, utvrđuje se identitet jedinjenja. Na slici 37. su prikazani hromatogramiuzorka zemljišta preklopljeni sa hromatogramom standarda. Poklapanje pikova ustandardu i uzorku je potvrda prisustva jedinjenja u uzorku. Retenciona vremenapojedinih pikova se poklapaju u uzorku i standardu.

Slika 37. Hromatogrami ekstrakta zemljišta i hromatogram standarda

Neki detektori daju spektre jedinjenja kao potvrdu identiteta. Na primer, detektor sanizom dioda (DAD) daje UV spektar jedinjenja koji se može porediti sa spektrom izbiblioteke spektara i tako doprineti pouzdanijem određivanju, slika 38.


80 81


73

sistem podele uzorka nakon injektiranja. Uzorak koji ispari u isparivaču se deli uizabranom odnosu (split odnos) i samo manji deo zapremine uzorka dospeva u kolonu,dok se ostatak izbacuje kao višak.

Kolone - U početki razvoja gasne hromatografije kolone su bile od stakla ili čelika,prečnika 3-7 mm, dužine 3-5 m. Punile su se fino sprašenim inertnim nosačem na kojije nanesena stacionarna tečna faza. Kapilarne kolone, mnogo manjih dimenzija, nastalesu nešto kasnije.Unutrašnji prečnik kapilarne kolone je od 0,1 mm do 0,5 mm, dužina10 do 100 m, a stacionarna faza je nanesena u određenoj debljini na unutrašnji zidkapilare. Kapilarne kolone se danas koriste mnogo češće nego punjene, jer imajumnogo bolje performanse.

Postoji dva osnovna tipa kapilarnih kolona, i to: WCOT- (wall-coated open tubular)gde je stacionarna faza nanesena na unutrašnji zid kapilarne cevi, i SCOT – (supportcoated open tubular) je kapilarna cev sa tankim slojem (debljine ≈30 μm) inertnognosača (najčešće dijatomejska zemlja) na unutrašnjem zidu cevi. Ovakva kolona sadržimnogo više stacionarne faze, što znači veći kapacitet kolone (podnosi veće količineanalita).

Kapilarne kolone se prave od čelika, aluminijuma, plastike, a najčešće od stakla. Stakloje specijalno prečišćeno, tako da su metalni oksidi u tragovima. Nanošenjempoliimidnog sloja na spoljni zid kapilarne cevi, postiže se mehanička otpornost ifleksibilnost.

Prečnici kapilarnih kolona su od 150 μm do 320μm, i u poslednje vreme 530 μm(megabor kolone). Manji prečnik kolone znači da prima manju količinu uzorka.Karakteristike kolona su prikazane u tabeli 4.

Stacionarne faze - Osnovna karakteristika svake stacionarne faze je slaba isparljivost,odnosno temperatura ključanja stacionarne tečne faze treba da bude za 100o C viša odgornje radne temperature kolone. Stacionarna faza treba da bude termički stabilna ihemijski inertna. Moć rastvaranja analita treba da bude takva da retencioni faktor (k’) ifaktor selektivnosti (α) budu u prihvatljivim granicama. Izbror stacionarne faze zavisiod vrste analita, koji treba da budu kompatibilni. Kada se dobro slože stacionarna faza ianaliti, tada je redosled eluiranja sa kolone u zavisnosti od tačke ključanja analita.Danas se koriste polarne, nepolarne i srednje polarne stacionarne faze. Polarnestacionarne faze imaju -CN, -CO, -OH funkcionalne grupe ili su poliestri. Nepolarne suna bazi ugljovodonika i dialkil-siloksana, slika 40. Primena različitih stacionarnih fazaje prikazana u tabeli 5.


72

Vrste gasne hromatograije su: GLC- gasno/tečna hromatografija, gde je stacionarnafaza – tečnost; Bazirana je na raspodeli analita između gasne-mobilne faze i tečne-stacionarne faze, imobilizirane na površini čvrstog nosača, i GSC – gasno/čvrstahromatografija, gde je stacionarna faza čvrsta i mehanizam zadržavanja je adsorptivni.

Slika 39. Razdvajanje u gasnoj hromatografiji

Razdvajanje smeše supstanci nastaje na bazi njihovog različitig afiniteta premamobilnoj i stacionarnoj fazi. Jedinjenje koje više vremena provede u mobilnoj fazi,brže se kreće kroz kolonu i prvo stiže do detektora. Ono takođe ima i kraće retencionovreme od onog jedinjenja koje ima veći afinitet prema stacionarnoj fazi, zato se sporijekreće kroz kolonu, slika 39.

5.5.1. DELOVI GASNOG HROMATOGRAFA

Svaki uređaj ima sistem za snabdevanje gasom nosačem. Izbor gasa nosača zavisi odtipa detektora, a gas nosač treba da bude visoke čistoće i hemijski inertan. Gas nosač naputu do kolone prolazi kroz različite vrste filtera koji uklanjaju prisutne tragove vode,ugljovodonika i kiseonika. Snabdevanje gasom nosačem treba da bude kontinuirano.Gruba regulacija pritiska gasa nosača odvija se na dvostepenom regulatoru pritiska, afinija u okviru uređaja. Protok gasa nosača reba da bude konstantan i kontroliše seelektronski meračem protoka. Radni pritisci gasa nosača su 2-200 bara, a radni protoci1-150 ml/min.

Sistem za ubacivanje uzorka – injektor, ili isparivač preko koga se ubacuje najčešće 1μl tečnog ili gasovitog uzorka. Za injektiranje se koristi mikro špric zapremine 1-10 μl.Igla šprica prolazi kroz septum, koji obezbeđuje zaptivanje sistema (GC je podpritiskom). Injektiran jedan mikrolitar uzorka u isparivaču trenutno ispari dajućiodređenu zapreminu pare u zavisnosti od vrste rastvarača i temperature. Injekcionazapremina za punjene kolone koje su većeg prečnika je 1-20 μl, a za kapilarne kolone 1μl. Međutim, to je previše za kapilarne kolone prečnika manjih od 0,5 mm i zato postoji


72

Vrste gasne hromatograije su: GLC- gasno/tečna hromatografija, gde je stacionarnafaza – tečnost; Bazirana je na raspodeli analita između gasne-mobilne faze i tečne-stacionarne faze, imobilizirane na površini čvrstog nosača, i GSC – gasno/čvrstahromatografija, gde je stacionarna faza čvrsta i mehanizam zadržavanja je adsorptivni.

Slika 39. Razdvajanje u gasnoj hromatografiji

Razdvajanje smeše supstanci nastaje na bazi njihovog različitig afiniteta premamobilnoj i stacionarnoj fazi. Jedinjenje koje više vremena provede u mobilnoj fazi,brže se kreće kroz kolonu i prvo stiže do detektora. Ono takođe ima i kraće retencionovreme od onog jedinjenja koje ima veći afinitet prema stacionarnoj fazi, zato se sporijekreće kroz kolonu, slika 39.

5.5.1. DELOVI GASNOG HROMATOGRAFA

Svaki uređaj ima sistem za snabdevanje gasom nosačem. Izbor gasa nosača zavisi odtipa detektora, a gas nosač treba da bude visoke čistoće i hemijski inertan. Gas nosač naputu do kolone prolazi kroz različite vrste filtera koji uklanjaju prisutne tragove vode,ugljovodonika i kiseonika. Snabdevanje gasom nosačem treba da bude kontinuirano.Gruba regulacija pritiska gasa nosača odvija se na dvostepenom regulatoru pritiska, afinija u okviru uređaja. Protok gasa nosača reba da bude konstantan i kontroliše seelektronski meračem protoka. Radni pritisci gasa nosača su 2-200 bara, a radni protoci1-150 ml/min.

Sistem za ubacivanje uzorka – injektor, ili isparivač preko koga se ubacuje najčešće 1μl tečnog ili gasovitog uzorka. Za injektiranje se koristi mikro špric zapremine 1-10 μl.Igla šprica prolazi kroz septum, koji obezbeđuje zaptivanje sistema (GC je podpritiskom). Injektiran jedan mikrolitar uzorka u isparivaču trenutno ispari dajućiodređenu zapreminu pare u zavisnosti od vrste rastvarača i temperature. Injekcionazapremina za punjene kolone koje su većeg prečnika je 1-20 μl, a za kapilarne kolone 1μl. Međutim, to je previše za kapilarne kolone prečnika manjih od 0,5 mm i zato postoji


82 83


75

One povećavaju polarnost stacionarne faze i tako od nepolarnih postaju srednje i slabonepolarne.

Stacionalna faza može biti i potpuno polarna, a to je faza na bazi polietilen-glikola:HO-CH2-(O-CH2-CH2)n-OH). Ova polarna faza se koristi za razdvajanje polarnihanalita (alkohola, estara i sl.).

Danas se proizvode i kapilarne kolone sa stacionarnom fazom, koja je hemijski vezanaza zid kolone “bonded and cross linked”. Ovo obezbeđuje duži vek kolone, boljustabilnost i smanjeno je isparavanje stacionarne faze. Primena različitih stacionarnihfaza je prikazana u tabeli 5.

Tabela 5. Stacionarne faze gasne hromatografije i njihova primena

Stacionarna faza Skraćeninaziv

Maksimalnatemperatura,

oC

Primena

Polidimetil-siloksan OV-1,SE-30

350 Nepolarna , PAH, ugv,PCB, lekovi, steroidi

Poli(fenil-metil-dimetil)siloksan (10 %fenil)

OV-3,SE-52

350 FAME, alkaloidi,lekovi, halogenovanajedinjenja


OV-17 250 Lekovi, steroidi,pesticidi, glikoli

Poli (trifluoro-propil-dimetil) siloksan

OV-210 200 Hlorisani aromati,nitroaromati, alkil-benzeni

Polietilen-glikol Carbovaw-20M

250 Slobodne masnekiseline, alkoholi, etri

Poli(dicijano-alil-dimetil)siloksan

OV-275 240 Polinezasićene masnekiseline, slobodnekiseline, alkoholi

Debljina filma stacionarne faze utiče takođe i na efikasnost razdvajanja. Postoje kolonesa različitim debljinama stacionarne faze, od 0,1 do 5 μm, što utiče na retencionovreme, pa tako deblji sloj stacionarne faze znači i duže zadržavanje, a to je pogodno


75







oC

Primena




OV-3,SE-52












75







oC

Primena




OV-3,SE-52












75







oC

Primena




OV-3,SE-52












75







oC

Primena




OV-3,SE-52












74

Tabela 4. Karakteristike tipičnih kolona za gasnu hromatografiju

Slika 40. Poli-dimetil-siloksan

Osnovna najčešće korišćena stacionarna faza je na bazi polidimetil-siloksana, slika 38.Metil grupe daju nepolaran karakter ovoj stacionarnoj fazi. One mogu biti zamenjenedrugim funkcionalnim grupama. Tako se od 10 do 50 % CH3 grupa zamenjuje sa fenilgrupama -C6H5, cijano-propil grupama -C3H6CN ili trifluoro-propil grupama -C3H6CF3.

WCOT SCOT Pakovane

Dužina, m 10-100 10-100 1-6

Unutrašnji prečnik, mm 0,25-0,75 0,5 2-4

Efikasnost, broj podova/m 1 000-4 000 600-1200 500-1 000

Ukupan broj podova 10-400 x 103 6-120 x 103 1-10 x 103

Veličina uzorka, ng 10-1 000 10-1 000 10-106

Relativna brzina velika velika Mala

Hemijska inertnost Najlošija

Fleksibilna ne ne ne


74

Tabela 4. Karakteristike tipičnih kolona za gasnu hromatografiju

Slika 40. Poli-dimetil-siloksan

Osnovna najčešće korišćena stacionarna faza je na bazi polidimetil-siloksana, slika 38.Metil grupe daju nepolaran karakter ovoj stacionarnoj fazi. One mogu biti zamenjenedrugim funkcionalnim grupama. Tako se od 10 do 50 % CH3 grupa zamenjuje sa fenilgrupama -C6H5, cijano-propil grupama -C3H6CN ili trifluoro-propil grupama -C3H6CF3.

WCOT SCOT Pakovane

Dužina, m 10-100 10-100 1-6

Unutrašnji prečnik, mm 0,25-0,75 0,5 2-4

Efikasnost, broj podova/m 1 000-4 000 600-1200 500-1 000

Ukupan broj podova 10-400 x 103 6-120 x 103 1-10 x 103

Veličina uzorka, ng 10-1 000 10-1 000 10-106

Relativna brzina velika velika Mala

Hemijska inertnost Najlošija

Fleksibilna ne ne ne

C C C

C C C

C C C

C C C

OH HO O OSi Si Si

H H H

H H H

H H H

H H H

3 3 3

3 3 3

3 3 3

3 3 3


84 85


77

Slika 42. Detektor sa prihvatom elektrona - “Electron Capture Detector”

Elektroni koji se nalaze u ćeliji stvaraju određenu konstantnu struju. Kada jedinjenjekoje ima afinitet prema elektronima prođe kroz ćeliju, privuče elektrone i time promenistruju, što se registruje kao pik. Ovaj detektor je neosetljiv na alkohole, ugljovodonike iamine.

Azot-fosforni detektor NPD. Ovaj detektor reaguje na azotna i fosforna jedinjenja.Građa detektora je vrlo slična FID-u, samo je dodata perlica rubidijumove solizagrejana do usijanja. Perlica je postavljena na izlazu iz kolone. Rubidijumova perlicajonizuje jedinjenja koja u sebi sadrže N i P, što dovodi do promene napona koji semože registrovati. Za pravilan rad detektora potrebna je smeša vodonika i vazduha, čijije odnos presudan.U cilju sprečavanja jonizacije ugljovodonika, koristi se deset putamanji protok vodonika nego kod FID-a. NPD spada u vrlo osetljive selektivnedetektore.

Detektor termičke provodljivosti ili TCD, radi na bazi termistora.Termistor je zagrejanausijana žica; temperatura žice zavisi od temperaturne provodljivosti gasa koji protičeoko termistora. U detektoru se, pri pojavi organskog jedinjenja, registruje promenatemperaturne provodljivosti gasa. Ovo dovodi do promene temperature termistora, štose registruje kao pik. Detektor nije destruktivan i spada u srednje osetljive detektore,slika 43.

Slika 43. Detektor termičke provodljivosti


77

Slika 42. Detektor sa prihvatom elektrona - “Electron Capture Detector”

Elektroni koji se nalaze u ćeliji stvaraju određenu konstantnu struju. Kada jedinjenjekoje ima afinitet prema elektronima prođe kroz ćeliju, privuče elektrone i time promenistruju, što se registruje kao pik. Ovaj detektor je neosetljiv na alkohole, ugljovodonike iamine.

Azot-fosforni detektor NPD. Ovaj detektor reaguje na azotna i fosforna jedinjenja.Građa detektora je vrlo slična FID-u, samo je dodata perlica rubidijumove solizagrejana do usijanja. Perlica je postavljena na izlazu iz kolone. Rubidijumova perlicajonizuje jedinjenja koja u sebi sadrže N i P, što dovodi do promene napona koji semože registrovati. Za pravilan rad detektora potrebna je smeša vodonika i vazduha, čijije odnos presudan.U cilju sprečavanja jonizacije ugljovodonika, koristi se deset putamanji protok vodonika nego kod FID-a. NPD spada u vrlo osetljive selektivnedetektore.

Detektor termičke provodljivosti ili TCD, radi na bazi termistora.Termistor je zagrejanausijana žica; temperatura žice zavisi od temperaturne provodljivosti gasa koji protičeoko termistora. U detektoru se, pri pojavi organskog jedinjenja, registruje promenatemperaturne provodljivosti gasa. Ovo dovodi do promene temperature termistora, štose registruje kao pik. Detektor nije destruktivan i spada u srednje osetljive detektore,slika 43.

Slika 43. Detektor termičke provodljivosti


76

za lako isparljiva jedinjenja. U debljem sloju stacionarne faze lako isparljiva jedinjenjase duže zadržavaju, čime im se produžava retenciono vreme.

Detektori – U gasnoj hromatografiji se koristi veliki broj različitih detektora kojiregistruju supstance koje izlaze iz kolone. Detektor treba da bude osetljiv uodgovarajućem opsegu, da ima dobru stabilnost, reproduktivnost i linearan odgovor uširokom opsegu koncentracija. Takođe, treba da ima brzo vreme odgovora, da budejednostavan i da ima sličan odgovor za sve analite. Detektori koji se danas najvišekoriste su plameno-jonizacioni FID, detektor sa prihvatom elektrona ECD, azot-fosforni NPD, termal-konduktivni TCD i maseni detektor MDS.

Plameno-jonizacioni detektor (FID) reagistruje C-H jedinjenja. Jedinjenja se jonizuju uplamenu, detektor ne registruje vodu i gasove koji ne sagorevaju (CO2 i SO2). FID jeosetljiv na nivou 10-13 g/s, ima širok linearni opseg. Nedostatak ovog detektora jedestruktivnost. Za ispravan rad potreban mu je gorivi gas i gas koji pomaže gorenje(vodonik i vazduh). Detektor je prikazan na slici 41. Kolona (A ) je instalirana tako daulazi u gorionik (E -džet). Vodonik (C) se uvodi u telo detektora u komoru (B), vazduhulazi u detektor kroz dovod (D). Vodonik i vazduh se mešaju u odgovarajućem odnosui sagorevaju dajući plamičak (F) u kome se ugljovodonici jonizuju (sagorevaju). Telodetektora i džet su u električnom kolu i jonizovani molekuli prolaskom menjaju naponkoji se registruje.

Slika 41. Plameno-jonizacioni detektor - FID

Detektor sa prihvatom elektrona ECD je osetljiv je na organohalogena jedinjenja.Detektor ima visoku osetljivost, ali ograničenu linearnost odgovora. Princip detekcijeje zasnovan na ćeliji koja sadrži određenu količinu elektrona koje emituje radioaktivniizotop nikla (63Ni), slika 42.


76

za lako isparljiva jedinjenja. U debljem sloju stacionarne faze lako isparljiva jedinjenjase duže zadržavaju, čime im se produžava retenciono vreme.

Detektori – U gasnoj hromatografiji se koristi veliki broj različitih detektora kojiregistruju supstance koje izlaze iz kolone. Detektor treba da bude osetljiv uodgovarajućem opsegu, da ima dobru stabilnost, reproduktivnost i linearan odgovor uširokom opsegu koncentracija. Takođe, treba da ima brzo vreme odgovora, da budejednostavan i da ima sličan odgovor za sve analite. Detektori koji se danas najvišekoriste su plameno-jonizacioni FID, detektor sa prihvatom elektrona ECD, azot-fosforni NPD, termal-konduktivni TCD i maseni detektor MDS.

Plameno-jonizacioni detektor (FID) reagistruje C-H jedinjenja. Jedinjenja se jonizuju uplamenu, detektor ne registruje vodu i gasove koji ne sagorevaju (CO2 i SO2). FID jeosetljiv na nivou 10-13 g/s, ima širok linearni opseg. Nedostatak ovog detektora jedestruktivnost. Za ispravan rad potreban mu je gorivi gas i gas koji pomaže gorenje(vodonik i vazduh). Detektor je prikazan na slici 41. Kolona (A ) je instalirana tako daulazi u gorionik (E -džet). Vodonik (C) se uvodi u telo detektora u komoru (B), vazduhulazi u detektor kroz dovod (D). Vodonik i vazduh se mešaju u odgovarajućem odnosui sagorevaju dajući plamičak (F) u kome se ugljovodonici jonizuju (sagorevaju). Telodetektora i džet su u električnom kolu i jonizovani molekuli prolaskom menjaju naponkoji se registruje.

Slika 41. Plameno-jonizacioni detektor - FID

Detektor sa prihvatom elektrona ECD je osetljiv je na organohalogena jedinjenja.Detektor ima visoku osetljivost, ali ograničenu linearnost odgovora. Princip detekcijeje zasnovan na ćeliji koja sadrži određenu količinu elektrona koje emituje radioaktivniizotop nikla (63Ni), slika 42.


86 87


79

5.6.1. DELOVI TEČNOG HROMATOGRAFA

Sistem za snabdevanje mobilnom fazom se sastoji od rezervoara za mobilnu fazu,degazera, visokopritisne pumpe i mešača za rastvarače. Rezervoari za mobilnu fazu susvetle ili zatamnjene staklene boce. Mobilnu fazu čini jedan ili više rastvaračafiltriranih kroz 0,45 μm i prešićenih (UV Cut off) tako da nemaju apsorpciju u UVoblasti elektromagnetnog spektra. Rastvarači se mogu umešati u različitim odnosima itako sipati u rezervoare mobilne faze. Takođe je moguće mešanje rastvarača tokomtrajanja hromatografskog razdvajanja. Odnos rastvarača u mobilnoj fazi može bitipromenljiv u vremenu hromatografski gradijent. Pumpe za HPLC su pumpe kojepostižu visoke pritiske i do 1 200 bara, zahvaljujući safirnom klipu malog prečnika.Pumpe mogu biti binarne i kvaternerne. Binarne pumpe mešaju dva rastvarača, akvaternerne pumpe mogu da mešaju četiri rastvarača. Pre pumpe a posle rezervoara senalazi sistem za degazaciju mobilne faze, koji pomoću polupropustljive cevčice podvakuumom, izvlači gasove rastvorene u mobilnoj fazi. Ukoliko se mobilna faza nedegazira, dolazi do izdvajanja vazduha u hromatografskom sistemu, što dovodi dovariranja pritisaka i protoka.

Uzorak u tečnom stanju se injektira u injekcioni blok HPLC-a, automatski ili ručno.Zapremine koje se injektiraju su od 1-50 μL i zavise od dimenzija kolone. Uzorke jepotrebno pre injektiranja profiltrirati ili centrifugirati, da bi se uklonile suspendovanečestice koje mogu da dovedu do porasta pritiska u sistemu i začepljenja.

Kolone za tečnu hromatografiju su metalne ili plastične cevi različitog prečnika idužine. Na početku razvoja HPLC tehnike prečnik kolona je bio 1-5 cm, dužina 50 -500 cm. Kolone su bile punjene česticama većih dimenzija, prečnika 150-200 μm. Prviuređaji su radili pod atmosferskim pritiskom, što je za rezultiralo malim protokom, arazdvajanje je trajalo više sati. Danas su kolone manjeg prečnika, 0,21-0,5 cm i manje,dužine 5-25 cm, dok je prečnik čestica pakovanja drastično smanjen na 3-10 μm.Čestice stacionarene faze takvih dimenzija stvaraju veliki otpor proticanju mobilne faze.Protok 1-5 ml/min se zato može ostvariti samo primenom pumpi visokog pritiska.Najnoviji uređaji hromatografsko razdvajanje završavaju za samo nekoliko minuta.

Detektori za tečnu hromatografiju mogu biti univerzalni i selektivni. Detektor kojimeri indeks refrakcije u eluentu je selektivni detektor i može da meri samo jedinjenjakoja zakreću ravan polarizacije svetla, kao što su šećeri. Neki detektori mogu da dajuinformaciju o identitetu jedinjenja. Najčešće korišćeni univerzalni detektor je UV-VISdetektor, koji meri apsorbancu analita koji izlazi sa kolone, na nekoj određenoj talasnojdužini u ultravioletnoj ili vidljivoj oblasti elektromagnetnog spektra. Detektor sa nizomdioda daje kontinualne spektre koji se mogu porediti sa bibliotekom spektara i takodobiti potvrda identiteta jedinjenja. Detektor ima niz dioda koje emitujuelektomagnetno zračenje na nizu talasnih dužina. Kada neko jedinjenje prođe krozćeliju detektora, ono apsorbuje određene talasne dužine i to se može izmeriti i uporeditisa podacima o apsorpcionom spektru iz biblioteke spektara. Nezaobilazan detektor koji


78

Maseni detektor MSD spada u univerzalne detektore koji daju potvrdu identitetajedinjenja na bazi poređenja masenih spektara jedinjenja sa masenim spektrima izbiblioteke. Ovaj detektor je složen uređaj, koji svako jedinjenje koje se eluira sahromatografske kolone, podvrgava jonizaciji u snopu elektrona određene energije.Najčešće je energija od 70 eV. Jonizacija se može izvesti hemijskim putem, gde sejedinjenja podvrgavaju koliziji sa jonizovanim reagens gasom (na primer, amonijak ilimetan). Tokom procesa jonizacije u jonskom izvoru masenog detektora dolazi dofragmentacije jedinjenja. Fragmenti mogu biti neutralni delovi molekula, a poželjno jeda budu jonzovani (naelektrisani). Nastali fragmenti koji imaju naboj, sprovode se doanalizatora mase. Analizator mase može biti kvadropol, magnet ili elektromagnet.Suština rada analizatora mase je da fragmente razdvajaju na bazi odnosa mase inaelektrisanja (m/z) u električnom, magnetnom ili elektromagnetnom polju.Podešavanjem napona na krajevima kvadropola selektuju se joni koji imajuodgovarajući odnos m/z i dovoljnu kinetičku energiju da prođu kroz elektromagnetnopolje do fotoćelije koja registruje jone i multiplikuje signal tako da se on može izmeriti.Maseni fragmenti nastali u jonskom izvoru predstavljaju maseni spektar (“otisak prsta”)nekog organskog jedinjenja. Jonizacija u snopu elektrona daje bogatiji maseni spektar,za razliku od hemijske jonizacije, koja se zove i “soft” jonizacija.

Postoje i drugi tipovi masenih detektora kao što su jonska zamka (“Ion trap” - IT) ivreme leta (“Time of flight” - TOF) koji imaju svoje specifične prednosti i nedostatke.

5.6.TEČNA HROMATOGRAFIJA

Tečna hromatografija ili HPLC (High Pressure Liquid Chromatography ili HighPerformance Liquid Chromatography), koristi tečnost kao mobilnu fazu, dok jestacionarna faza čvrsta ili visokomolekularna tečnost, koja je čvrsta na temperaturi nahromatografskog razdvajanja.

HPLC je danas najčešće korišćena analitička tehnika razdvajanja zbog osetljivostiadaptabilnosti, pouzdanosti kvantifikacije, mogućnosti razdvajanja neisparljivih itermo-labilnih jedinjenja. Koristi se u industriji, nauci i u javnom sektoru. Mogu da seanaliziraju termo-labilna jedinjenja, amino kiseline, proteini, nukleinske kiseline,ugljovodonici, antibiotici, pesticidi, lekovi, terpenoidi, steroidi, organometalnajedinjenja, kao i mnoga neorganska jedinjenja.

Osnovni delovi tečnog hromatografa su sistem za snabdevanje mobilnom fazom,injekcioni blok, kolona, detektor i kompjuter.


88 89


81

Slika 44. Vrste tečno-hromatografskih mehanizama

Efikasnost kolone kod tečne hromatografije se može definisati Van Deemterovomjednačinom. Visina teoretskog poda (H) i broj teoretskih podova (N) opisuju efikasnostkolone kod tečne hromatografije, zajedno sa faktorom veličine čestica stacionarne fazekoji značajno utiče na izgled hromatografskog pika. Kod tečne hromatografije takođevaži da se povećanje efikasnosti kolone postiže smanjenjem visine teoretskog poda.

Uticaj veličine čestica stacionarne faze na efikasnost u Van Demterovoj jednačini zavisinu teoretskog poda, uključen je u član Cu = (CS +CM)u, gde je Cs, jednačina (48)vreme koje supstanca provede u stacionarnoj fazi, a CM, jednačina (49),je vreme kojesupstanca provede u mobilnoj fazi koje zavisi od prečnika čestice. Visina teoretskogpoda raste kada df i dp rastu i kada Ds i DM opadaju. Varijable iz jednačina (48) i (49)su prikazane u tabeli 6.

(48)

(49)

Polarnost raste

Nerastvorljivo u vodi Rastvorljivo u vodi

Nepolarne

Adsorpcija

Raspodela

Jonskaizmena

Na obrnutim fazama

Na normalnim fazama

Po veličini

Gel permeativna Gel filtracija

Jonske (polarne)Nejonske (polarne)


80

se koristi za identifikaciju jedinjenja u HPLC tehnici je maseni detektor. Masenidetektor, kao i kod gasne hromatografije, ima iste osnovne delove. Osnovni problemkoji se mora rešiti jeste uklanjanje mobilne faze, jer maseni detektor mora da imaobezbeđen visoki vakuum (10-4 Tora). Termosprej je interfejs kojim se mobilna fazauklanja zajedno sa isparavanjem jona iz mobilne faze. Sistem za jonizaciju analita sebira u zavisnosti od vrste analita. Najčešće se jonizacija obavlja u mobilnoj fazi,dodatkom jedinjenja koje protonuje analite, a to je uglavnom mravlja kiselina. Postojerazličite metode jonizacije, pa se za jonizaciju policikličnih aromatičnih ugljovodonikakoristi fotojonizacija na atmosferskom pritisku. Joni se nakon toga razdvajaju umasenom analizatoru (kvadropol, magnet ili elektromagnet) na bazi odnosa m/z.Maseni spektri, nastali na neki od ovih načina, ne mogu da se porede između različitihuređaja i ne postoje biblioteke masenih spektara nastalih na HPLC-MS. Danas sve višelaboratorija koristi HPLC sa MS/MS detektorom. Ovako konfigurisan uređaj ima dvamasena detektora redno spojena. Do jonizacije dolazi dva puta: prvo se jonizujeosnovno jedinjenje, a onda se određeni jon produkt uvodi u kolizionu ćeliju, gde se i onjonizuje dajući nove jone. Kombinacija jon/ćerka jon je podatak koji govori o identitetupočetnog jedinjenja. Ova tehnika HPLC-MS-MS je danas standard u svakoj laboratorijikoja se bavi ispitivanjem ostataka pesticida u namirnicama. Interesantno jenapomenuti da su kolone za ova određivanja dužine 5 cm i efikasnost hromatografskograzdvajanja nije u prvom planu. Najvažnije je da se korišćenjem standarda podeseenergije prve i druge jonizacije za svako jedinjenje koje se traži, a maseni analizator ćeutvrditi prisustvo očekivanih jona u uzorku ukoliko su prisutni.

Vrste tečne hromatografije. Tečna hromatografija može biti podeona hromatografijaili tečno/tečna hromatografija, gde je tečna stacionarna faza nanesena na česticeinertnog nosača. Na vezanim fazama (“bonded phase”) stacionarna faza je hemijskivezana za čestice inertnog nosača; može biti na normalnim fazama kada je stacionarnafaza polarna, a mobilna faza nepolarna i na obrnutim fazama gde je stacionarnanepolarna a mobilna polarna. Kod adsorpcione ili tečno/čvrste hromatografije,stacionarna faza je čvrsta (silika ili aluminijum-oksid), a mobilna faza su različitirastvarači ili njhove mešavine. Postoji, takođe, i jonoizmenjivačka hromatografija,gde razdvajanje zavisi od izmene jona između mobilne faze i jonskih grupa na površinistacionarne faze. Razdvajanje u velikoj meri zavisi od polarnosti i pH mobilne fazekoje treba optimizovati. Koristi se za određivanje amino kiselina i karbamata.Stacionarne faze mogu biti jonski menjači različite jačine. Gel permeativnahromatografija se koristi za razdvajanje jedinjenja na bazi veličine molekula. Na izbortehnike razdvajnja utiču osobine jedinjenja i molekulska masa, slika 44.


90 91

Linearna brzina, cm/s

k’ = 1.244.7 µm

34.9 µm

22.6 µm13.2 µm8.8 µm6.1 µm

1.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

2.0 3.0 4.0

Vis

ina teore

tskog p

od H

, m

m


83

Manje čestice daju bolju efikasnost jer obezbeđuju uniformni protok kroz kolonu, članA (“multiple path”) u Van Deemterovoj jednačini je manji. Takođe, put koji supstancadifundujući treba da pređe između čestica je manji i zavisi od dimenzija čestica,smanjuje se C član Van Deemterove jednačine. Jedini problem sa malim česticama ješto pružaju veći otpor proticanju mobilne faze i potrebni su veći pritisci.

Uticaj kapilara na oblik pika. Na oblik pika utiče i proticanje kroz cevi od i dokolone. Kad je uzorak injektiran, ulazi u sistem cevi nošen mobilnom fazom na putu dokolone. Tokom ovog puta dolazi do razvlačenja pika analita. Razlog je različita brzinaobilne faze u centralnom delu cevi, gde protiče brže u odnosu na sloj mobilne fazeneposredno uz cev koji protiče sporije.

Razvoj metode podrazumevada se za smešu analita odabere stacionarna faza (kolona) iodgovarajuća mobilna faza. Ukoliko se koristi podeona hromatografija, razdvajanje jebazirano na polarnosti. Struktura molekula, kao što je raspored funkcionalnih grupa iveza između njih, određuje fizičko-hemijske osobine molekula. Funkcionalne grupeodređuju molekul kao polaran ili kao nepolaran. Organski molekuli su podeljeni ugrupe na osnovu funkcionalnih grupa koje sadrže. Zadržavanje u hromatografskojkoloni zavisi od prirode i rasporeda funkcionalnih grupa u molekulu. Klase molekulamogu da se poređaju po retenciji ili po polarnosti - od jako polarnih do jako nepolarnih.Voda (mali molekul sa velikim dipolnim momentom) je polarna supstanca. Benzen(aromatični ugljovodonik) je nepolarna supstanca. Molekuli slične polarnosti imajutendenciju privlačenja, oni sa različitom polarnosti se slabije privlače, pa čak i odbijaju.Drugi način razmišljanja je sledeći ako je ulje nepolarno, voda je polarna, oni se nemešaju.Hromatografsko razdvajanje bazirano na polarnosti se odvija na baziprivlačenja molekula slične polarnosti, pri čemu slično privlači slično. Na primer usmeši koju treba razdvojiti, nalaze se molekuli različite polarnosti. Za razdvajanje sekoriste stacionarna i mobilna faza različitih polarnosti. Odabrana je nepolarnastacionarna i polarna mobilna faza. Nepolarni molekuli imaju afinitet premastacionarnoj fazi i kreću se sporije, polarni molekuli imaju afinitet prema mobiloj fazi ikreću se brže. Tako dolazi do razdvajanja.

Izbor mobilne faze je veoma važan elemenat razvoja metode. Mobilnu fazu čine jedanili više rastvarača. Rastvarači su različite polarnosti i tako poređani čine elutropskuseriju.Voda je na polarnom kraju, a heksan na nepolarnom kraju elutropske serije.Rastvarači i njihove smeše su između. Voda i heksan su mobilne faze najveće jačine,slika 45


82

Tabela 6. Varijable Van Deemterove jednačine za CS i CM

.

Kod tečne hromatografije smanjenjem veličina čestica pakovanja, dolazi do povećanjapritiska i skraćenja vremena razdvajanja. Efikasnost kolone se značajno povećavasmanjenjem veličine čestica pakovanja. Na grafiku 1. se vidi da smanjenje prečnikačestica pakovanja od 44,7 do 6,1mm dovodi do desetostrukog smanjenja visineteoretskog poda. (analit: N,N-dietil-n-amino-azobenzen, kolona 30 cm x 2,4 mm, MF:heksan/MeCl/ izo-propanol).

Grafik 1. Uticaj veličina čestica pakovanja na efikasnost kolone

Varijabla Simbol jedinice

Linearna brzina mobilne faze u cm/s

Difuzioni koeficijent u mobilnoj fazi DM cm2/s

Difuzioni koeficijent u stacionarnoj fazi DS cm2/s

Retencioni faktor k’ -

Prečnik čestice pakovanja dp cm

Debljina sloja tečne faze na čestici pakovanja df cm


82


.











82


.











92 93


84

Slika 45. Mobilne faze poređane po polarnosti

Polarnost stacionarnih faza. Silika gel ima afinitet prema vodi zbog hidroksilnihgrupa na površini i zato je silika gel polarna stacionarna faza. Aktivitet –OH grupa semože modifikovati njhovom zamenom drugim manje polarnim funkcionalnim grupama.Te funkcionalne grupe su cijanopropilsilil- [CN], n-oktilsilil- [C8] i oktadecilsilil- [C18,ODS]. ODS ima hidrofobni nepolaran karakter. Na slici 46 je prikazan niz stacionarnihfaza poređanih po polarnosti.

Slika 46. Stacionarne faze poređane po polarnosti

Analiti – polarnost molekula - Razvoj HPLC metode podrazumeva, najpre, izborstacionarne faze, u zavisnosti od analita koji se razdvajaju, a zatim izbor mobilne faze.Stacionarna i mobilna faza treba da budu izabrane tako da se molekuli zadržavaju, aline previše kada ne bi ni izašli iz kolone.

Ako bi imali prevelik afinitet prema mobilnoj fazi, ne bi bilo razvajanja i svi molekulibi izašli u jednom piku odmah na početku hromatograma. Zato se biraju stacionarna imobilna faza suprotne polarnosti. Tada se molekuli zadržavaju se na principu “slično sasličnim” i prolaze kroz kolonu za različito vreme.


84

Slika 45. Mobilne faze poređane po polarnosti

Polarnost stacionarnih faza. Silika gel ima afinitet prema vodi zbog hidroksilnihgrupa na površini i zato je silika gel polarna stacionarna faza. Aktivitet –OH grupa semože modifikovati njhovom zamenom drugim manje polarnim funkcionalnim grupama.Te funkcionalne grupe su cijanopropilsilil- [CN], n-oktilsilil- [C8] i oktadecilsilil- [C18,ODS]. ODS ima hidrofobni nepolaran karakter. Na slici 46 je prikazan niz stacionarnihfaza poređanih po polarnosti.

Slika 46. Stacionarne faze poređane po polarnosti

Analiti – polarnost molekula - Razvoj HPLC metode podrazumeva, najpre, izborstacionarne faze, u zavisnosti od analita koji se razdvajaju, a zatim izbor mobilne faze.Stacionarna i mobilna faza treba da budu izabrane tako da se molekuli zadržavaju, aline previše kada ne bi ni izašli iz kolone.

Ako bi imali prevelik afinitet prema mobilnoj fazi, ne bi bilo razvajanja i svi molekulibi izašli u jednom piku odmah na početku hromatograma. Zato se biraju stacionarna imobilna faza suprotne polarnosti. Tada se molekuli zadržavaju se na principu “slično sasličnim” i prolaze kroz kolonu za različito vreme.

Mobile Phases

Water Alcohol Acetronitrite THF Hexane

Mobile Phases

Water Alcohol Acetronitrite THF Hexane

Stationary Phases

Silica CN C (COS)18C8


85

Slika 47. Grupe jedinjenja poređane po polarnosti

Na slici 47. su predstavljene grupe jedinjenja poređane po polarnosti od vode, soli ikiselina koje su na polarnoj strani preko ketona, etara, halogenovanih organskihjedinjenja srednje polarnosti pa do nepolarnih aromata, alifatičnih i fluorisanihugljovodonika na nepolarnoj strani niza.

5.7. HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (Thin Layer Chromatography)

ili PLANARNA HROMATOGRAFIJA

Tankoslojna hromatografija je jednostavna tehnika kojom se dobijaju semikvantitativni podaci o sastavu smeše. Kao tehnika razdvajanja, tankoslojnahromatografija takođe koristi stacionarnu i mobilnu fazu. Stacionarna faza je papir iliadsorbens nanesen na nosač, koji može biti staklena ili aluminujumska ploča. Mobilnufazu čine različite smeše rastvarača. Uzorak se nanosi na jedan kraj ploče ili papira,koja se zatim delimično uroni u posudu za razdvajanje, u kojoj je mobilna faza. Zatimse mobilna faza, nošena kapilarnim silama, polako penje noseći analite iz smeše kojiputuju različitom brzinom. Nakon određenog vremena, analiti se razdvajaju zbograzličite vertikalne brzine kretanja na tankom sloju ili papiru. Kada je front mobilnefaze stigao do kraja tankog sloja, razdvajanje je završeno. Na tankom sloju se moguuočiti mrlje, poreklom od pojedinih supstanci. Pošto neka jedinjenja nisu obojena,mrlje se mogu videti samo pod UV svetlom ili se koristi reagens da bi se mrlje učinilevidljivim.

Tankoslojna hromatografija je vrlo često primenjivana za brze provere prisustva analitau uzorku, nakon pozitivnog nalaza sledi potpuna analiza odgovarajućomhromatografskom tehnikom sa kvantifikacijom. Danas postoje različiti instrumenti zatankoslojnu hromatografiju.

⸎


94 95


87

7.LITERATURA

Analytical Instrument Qualification and System Validation, L. Huber, Publisher:Agilent technologies, (2009), 1-61, Publication Number: 5990-3288EN.

Analytical Solid-Phase Extraction, J.S. Fritz, Publisher; Wiley-VCH, (1999), 1-209,ISBN: 0-471-24667-0.

Basic gas-chromatography - mass spectrometry, principles and techniques, KarasekF.W. and Clement R.E., Elesevier Science Publishers B.V.(1988), 1-201, ISBN 0-444-42760-0.

Electronic Pressure Control in Gas Chromatography, S.S. Stafford, Editor, Publisher:Hewlett-Packard Company, (1999), 1-190, HP Part No. 5182-0842.

Ettre L. S., Nomenclature for Chromatography, Pure &Appl, Chem., Vol. 65, No. 4,(1993) pp. 819-872, IUPAC.

GC Inlets - An Introduction, M. S. Klee, Publisher: Hewlett-Packard Co., (1999), 1-132,Part Number: 5958-9468.

Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, L. Huber,Publisher: Hewlett-Packard Company (1994), 1-152, Publication Number: 12-5963-2115E.

Goosens E.C.: On-line Coupling of Liquid-liquid Extraction and Reversed-phaseLiquid Chromatography with Capillary Gas Chromatography, AcademischProefschrift, de Vrije Universiteit te Amsterdam, defended: 1. december 1996.(1996), 1-229.

Hihg Performance Liquid Chromatography in Plant Science, Edited by H.F. Linskensand J.F. Jackson, Publisher: Springer-Verlag, New York, Berlin, Hidelberg,(1999)1-248, ISBN: 0-387-17243-2.

Honing M.: Study of LC-MS interfacing techiques for the detrmination of carbamatepesticides, Academisch Proefschrift, de Vrije Universiteit te Amsterdam, defended:30. october 1995. (1995), 1-215.

Maintaining and Troubleshooting HPLC Systems, a user guide, D. J. Runser, Publisher:John Wiley & Sons Inc., (1981), 1-163, ISBN: 0-471-06479-3.


86

6. SISTEM OBEZBEĐENJA KVALITETA U LABORATORIJI

SRPS ISO 17025

Laboratorije u današnje vreme treba da obavljaju svoje aktivnostu u skladu sastandardima. Standard za rad u laboratoriji je SRPS ISO 27025. i predstavlja opštezahteve za kompetentnost laboratorija za ispitivanje i laboratorija za etaloniranje. Prvoizdanje (1999. godina) ovog međunarodnog standarda bilo je rezultat velikog iskustvau primeni ISO/IEC Uputstva 25 iEN 45001, koje on sad zamenjuje. Ovaj standardsadrži sve zahteve koje laboratorije za ispitivanje i etaloniranje moraju da zadovolje,ako žele da pokažu da imaju sistem menadžmenta, da su tehnički kompetentne, kao i dasu sposobne da daju tehnički valjane rezultate.

ISO 9001 i ISO 17025 Sve učestalije korišćenja sistema menadžmenta uopšte,povećao je potrebu za obezbeđenjem da laboratorije koje pružaju usluge, mogu da radeu sistemu menadžmenta kvalitetom, koji je saglasan sa ISO 9001. Zbog toga su svizahtevi ISO 9001, koji se odnose na usluge ispitivanja i etaloniranja, uključeni usistem menadžmenta laboratorije.

Laboratorija kao osnovni dokument ima poslovnik, u kome su opisani svi elementistandarda i način kako ih laboratorija sprovodi. Ovaj standard obuhvata zahteve koji seodnose na menadžment, kao i na tehničke zahteve.

Zahtevi koji se odnose na menadžment su definisani u pogledu organizacije sistemamenadžmenta, upravljanja dokumentacijom, preispitivanja zahteva, ponuda i ugovora,podugovaranja ispitivanja i etaloniranja, nabavke usluga i proizvoda, praćenja odnosaprema korisnicima, žalbama, upravljanje neusaglašenim ispitivanjima i/ilietaloniranjima. Laboratorija mora planirati neprekidna poboljšanja, korektivne ipreventivne mere, način upravljanja zapisima, dinamiku internih provera i redovnosprovođenje preispitivanja od strane rukovodstva.

Tehnički zahtevi definišu planiranje i praćenje napredovanja osoblja, uslove smeštaja iokoline, metode ispitivanja i etaloniranja, kao i metoda validacije, uslove vezane zaopremu, obezbeđuju sledljivost merenja, procedure uzorkovanja, način rukovanjauzorcima za ispitivanje i etaloniranje, utvrđuje obezbeđenje poverenja u kvalitetrezultata ispitivanja i etaloniranja i način izveštavanja o rezultatima.

⸎


87

7.LITERATURA













87

7.LITERATURA













87

7.LITERATURA













87

7.LITERATURA













87

7.LITERATURA













87

7.LITERATURA













96 97


89

8. INDEKSadsorpcija 60afinitet 61analit 7, 8, 9, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12,

13, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23,24, 38, 39, 47, 54, 63, 64, 67, 69,

70, 71, 72, 78, 82, 83, 84apsorpcija 2, 15, 48, 53apsorpcioni spektri 36atomizer 50atomska emisiona 48, 55, 56auksohromne grupe 43azot-fosforni detektor 76bonded and cross linked 74čestica 10, 19, 23, 33, 47, 55, 58, 67,

68, 70, 78, 80, 81, 82čvrsti uzorci 16, 47čvrsto-fazna ekstrakcija 8detektor 8, 39, 41, 49, 52, 56, 58, 59,

62, 63, 69, 70, 71, 75, 76, 77, 78difrakciona rešetka 40, 42, 52efikasnost 65, 80, 81ekscitacija 49elektromagnetno zračenje 33, 34, 37,44, 49

elektronske ljuske 48eluiranje 23emisija 2, 48, 55energetske nivoe 47, 55energija 35, 36, 45faktor selektivnosti 64filtracija 13, 61fotomultiplikator 41, 42gas nosač 70, 71gasna hromatogrfija 59gasoviti uzorci 14, 47gel filtracija 61grafitna kiveta 54granica detekcije 8, 3, 5, 53granica kvantifikacije 8, 3head-space samping 15hidridna tehnika 54homogenisanje 10HPLC 24, 59, 77, 78, 79, 83, 86, 87

hromoforne grupe 43inertni gas 49, 50injektor 24, 58, 70, 71interference 3, 20, 57IR spektri 45Išikava dijagram 12izmena jona 61izvor zračenja 39jednokratni uzorak 14joni 34, 35, 56, 57, 77jonizacija atoma 55kalibracija 6, 70kalibraciona kriva 8, 6, 7kapilara 82kapilarne kolone 72kiveta 41, 42, 54kolona 23, 58, 59, 65, 69, 72, 73, 78,

81kondicioniranje 23konduktivitet 2, 26, 32kvadropol 56, 57, 77, 79laboratorijski uzorak 9, 10Lamber-Berov zakon 8, 38lampa sa šupljom katodom39, 40, 49,50

linearna brzina 63, 67LOD 5, 54, 55, 56, 57maseni detektor 56, 77, 79matriks 7, 9, 3, 12, 13, 14, 16, 24menadžment 85merenje 9, 6, 28, 38, 39, 42, 47, 66mikrotalasi 17, 19mobilna faza 59, 60, 70, 78, 79, 82,83, 84

molekularna difuzija 67molekuli apsorbuju 44monohromator 40mrtvo vreme 62jonska izmena 22normalne faze 22, 79reverzne faze 21Nernstov izraz 20, 62optički filter 40


88

Mol H.: Trace analysis with gas chromatography using on-line enrichment and largevolume injection, Academisch Proefschrift, de Vrije Universiteit te Amsterdam,defended: 19. septemberl 1995. (1995), 1-204.

Principles in preparative HPLC, U. Huber, and RE. Majors, Publisher: AgilentTechnologies Company (2004), 1-77, Publication Number: 5989-0652EN.

Quantitative Chemical Analysis, Seventh edition, D.C. Harris, Publisher: W.H.Freeman and Company, (2007), 1-663, ISBN: 0-7167-7041-5.

Rudakova L.V., Rudakov O.B.,One hundred and ten years of Russian chromatography,Сорбционные и хроматографические процессы.. Т. 14. Вып. 1, (2014), 8-13.

The HPLC Solvent Guide, P.C. Sadek, Publisher: John Wiley & Sons Inc.(1996), 1-346. ISBN: 0-471-11855-9.

Uzorkovanje zemljišta i biljaka nezagađenih i zagađenih staništa, R. Kastori, D.Bogdanović, I. Kadar, N. Milošević, P. Sekulić, M. Pucarević, Izdavač: Naučniinstitut za ratarstvo i povrtarstvo Novi Sad, Maksima Gorkog 30.(2006), 1-244,ISBN 86-80417-13-0.

Validation of Analytical Methods, L. Haber, Publisher; Agilent Technologies, (2010),1-65, Publication Number: 5990-5140EN.

van Deemter JJ, Zuiderweg FJ and Klinkenberg A . "Longitudinal diffusion andresistance to mass transfer as causes of non ideality in chromatography". Chem.Eng. Sci.5, (1956), 271–289.

Zegers N.: Use of selective gas Chromatographic Detectors in Packed Capillary LiquidChromatography and Supercritical Fluid Chromatography, AcademischProefschrift, de Vrije Universiteit te Amsterdam, defended: 11. april 1995. (1995),1-183.

⸎

INSTRUMENTALNE METODE ANALIZE u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi

98 99


90

optimizacija 8, 68organski molekuli 82oscilacije 45osetljivost 8, 3, 4, 6, 41, 51, 54, 56,57, 59, 75, 77

pH 5, 8, 13, 22, 23, 30, 31, 79piknometar 29plamen 8, 13, 41, 43, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 75

plamenici 51plameno-jonizacioni detektor 75planarna hromatografija 8, 59plazma 55polarni molekuli 36, 44, 82polarnost 18, 24, 44, 83polidimetil-siloksan 69, 73polietilen-glikol 74poverenje u rezultat 11površina pika 70preciznost 8, 3, 4, 40priprema uzoraka 7, 47, 54prizma 37, 42, 52punjene kolone 71purge and trap 15raspodela 9, 44, 61, 62rastvarači 24razdvajanja 8, 2, 42, 58, 59, 60, 61,64, 65, 68, 69, 74, 77, 78, 79, 81,82, 84

refraktometar 30retencioni faktor 63, 64, 81retenciono vreme8, 62, 66, 68, 69, 71,

74selektivnost 8, 3, 6, 18, 64, 72smetnje 53sokslet 8, 17

Solid Phase Extraction 21sonifikacija 16špric 70, 71SRPS ISO 27025 85stacionarna faza 58, 59, 60, 61, 63,67, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 79,

82, 83, 84standard 85superkritični fluid 17, 18tačka ključanja 9, 26tačnost 43, 52talasna dužina 36, 52tankoslojna hromatografija 84tečni uzorci 20, 47tečno-tečna ekstrakcija 8, 20tehnički zahtevi 85tehnika hladnih para 55teorija efektivne difuzije 67transmisija 38, 49ugljen-dioksid 17, 18ultrazvuk 17UV spektri 70uzorak 9, 13, 15, 16, 17, 18, 30, 56,70, 72, 78, 84

uzorkovanje 8, 9, 15, 87vakuum 21, 23, 56, 79validacija 8Van Deemter 65, 67, 80, 81, 82varijabilnost rezultata 11vibracija 36, 44, 46, 53visina pika 70visina teoretskog poda 65, 80viskozitet 7, 8, 18, 26, 28, 54zbirni uzorak 9zemljište 9, 13

⸎

CIP - Каталогизација у публикацијиБиблиотеке Матице српске, Нови Сад

502:338.43]:543.08(075.8)

ПУЦАРЕВИЋ, Мира, 1962- Instrumentalne metode analize u upravljanju životnom sredinom u poljoprivredi / Mira Pucarević. - 1. izd. - Sremska Kamenica : Educons, Fakultet zaštite životne sredine, 2019 (Bačka Palanka : RVB studio). - 91 str. : ilustr. ; 26 cm

Tiraž 100. - Bibliografija. - Registar.

ISBN 978-86-87785-87-8

а) Заштита животне средине - Пољопривреда - Анализе - Инструменталне методе

COBISS.SR-ID 329620999

instrumentalne metode analize · klasifikovani kao kvalitativni i kvantitativni parametri izbora...

Documents