institut de recerca hospital universitari vall d’hebron

Institut de Recerca

Hospital Universitari Vall d’Hebron

Curs de Proteòmica i

Metabolòmica

25 Marzo 2014

Mª Ángeles Artaza (UAT)

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

Desarrollo de un método

• ¿Que queremos medir?

• ¿Como lo vamos a medir?

• ¿Cómo vamos a comprobar que medimos lo que decimos que estamos midiendo?

Huellametabólica

Análisis espectral de todos los metabolitos pero sin saber que es cada compuesto

Perfil metabólico

Detección, identificación y cuantificación aproximada de un conjunto de compuestosdiana.

Análisis diana

Detección y cuantificaciónprecisa de un metabolito o, frecuentemente, un pequeñogrupo de metabolitosquimicamente similares.

Diseño de un experimento

Gary J. Patti, Oscar Yanes and Gary Siuzdak J. Metabolomics: the apogee of the omics trilogy. Nat Rev Mol Cell Biol. 2012 Mar 22;13(4):263-9

http://www.scirus.com/srsapp/sciruslink?src=mdl&url=http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=15814023



Información del analito/sEstructuraPropiedades químicas

Optimización del métodoDetección (UV,Fluorometría, MS/MS)Separación (cromatografía)

Preparación de un rango apropiado, QCEvaluación de las estrategias de extracción (PP, LLE/SLE, SPE)RecuperaciónEstabilidad de la matrizEstabilidad del extractoEvaluación inicial de carryoverValidación del método

Técnicas

Técnicas que utilizamos en la UCT

Cromatografía líquida de alta resolución

UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography)

Espectrometría de masas

MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Técnicas.- Cromatografía Líquida

Waste

Bomba Inyector

Detector

Mezclador fase móvil

Fase móvil

C

Fase móvil

D

Horno

Técnicas.- Espectrometria de masas

03-Feb-2010 12:26:43XEVO-TQMS#VBA071Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50

Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

5

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 3: MS2 ES- TIC

2.05e9

1.57

1.02

1.80

7.28

2.90

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 1 (0.008) 3: MS2 ES- 2.07e6174.85

174.52

131.06

112.70

112.50

112.37

113.04

113.30

114.51

130.33

119.05

147.15

141.41

174.39

158.43

147.35

163.10

164.44

178.99

179.73

249.27

206.62

190.87

180.39

206.29

191.07

205.36

191.41

248.73

235.45226.51

226.31

216.70

221.31

280.16259.21

264.35

284.50

289.64

297.05

298.38

EspectroTIC (SCAN)

Cuantificación absoluta :MRM (Multiple Reaction Monitoring)

El método más simple de cuantificar analitos con LC-MS es Total Ion Chromatograms (TIC). Los datos se obtienen con el

MS en modo barrido y se procesan los datos una vez adquiridos para reconstruir el perfil de elución de los iones de

interés. Las áreas o las alturas de los picos dan una idea de la abundancia de un analito.

Podemos limitar el rango de adquisición de m/z a los iones de interés (SIM Selected Ion Monitoring), cuanto más estrecho

sea el rango mayor será la sensibilidad pero no se podrá discriminar entre los iones con la misma m/z.

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 1 (0.008) 3: MS2 ES- 2.07e6174.85

174.52

131.06

112.70

112.50

112.37

113.04

113.30

114.51

130.33

119.05

147.15

141.41

174.39

158.43

147.35

163.10

164.44

178.99

179.73

249.27

206.62

190.87

180.39

206.29

191.07

205.36

191.41

248.73

235.45226.51

226.31

216.70

221.31

280.16259.21

264.35

284.50

289.64

297.05

298.38

03-Feb-2010 12:26:43XEVO-TQMS#VBA071Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50

Time1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00

%

5

Mix 4 compuestos 1ppm 10_20_30_40_50 3: MS2 ES- TIC

2.05e9

1.57

1.02

1.80

7.28

2.90

Cuantificación absoluta :MRM (Multiple Reaction Monitoring)

El modo MRM (Multiple Reaction Monitoring) no es una técnica de barrido. Se utiliza un triple cuadrupolo, el 1º y 3º

se utilizan como filtros de masas estáticos mientras que el 2º cuadrupolo es la celda de colisión que fragmenta el

ion seleccionado en el 1er cuadrupolo.

El par específico de valores m/z del ion precursor y del fragmento seleccionados es lo se llama “transición” 263< 145

Solo deja

pasar el ion

de m/z 263

Solo deja

pasar el ion

“hijo” de m/z

145

Q1 : Selecciónmasa

q2 : ColisiónQ3 : Selección

fragmentoIntroduccion de la muestra

Ionización

x

xx

x

x x

x

x

Validación de un método de HPLC

Validación

Proceso para verificar que un método es adecuado para resolver un problema analítico particular


La validación proporciona una idea de las capacidades y limitaciones que posee un método analítico

¿Porqué es necesario validar un método? Es necesario para tener confiaza en los resultados obtenidos

¿Quien establece los requisitos? Food and Drug Administration (FDA), European Medicines Agency(EMA)...


Validación del método

•Exactitud, Trazabilidad•Precisión, Incertidumbre•Sensibilidad•Selectividad•Límites•Robustez

CarryoverEstabilidad en varias series Congelado/descongeladoEstabilidad durante pre y procesadoEstabilidad de larga duraciónRecuperaciónEfecto Matriz


Punto de mayor concentración 200 μg/ml

Punto de menor concentración 1 μg/ml

área

área

nombre

Validación de un método de HPLC : LOD y LQD

Muestra concentración 0 μg/ml

Método de comparación de Señal / RuidoDeterminación:

Se preparan muestras de concentración conocida a bajos niveles, de acuerdo al método en estudio. Se

prepara un blanco, y se mide la señal de las soluciones preparadas.

El límite de cuantificación es la concentración de analito en la que se pueden darcualquiera de las

siguientes situaciones:•Relación señal / ruido es 10:1.

•Relación señal / ruido es al menos 10 y la precisión de menos de 10% (Desviación estándar relativa)

•Relación señal / ruido es mayor de 20 y la precisiónmenor de 5% (Desviación estándar relativa)

Validación de un método de HPLC: linealidad, LOD y LOQ

Límite de detección LOD XLOD=-(YLOD-a)/b

XLOD= 3sa/b

Límite de cuantificación LQDXLQD= 10sa/b

sa= desviación estándar de la ordenada

Validación de un método de HPLC: linealidad, LOD y LOQ

Validación de un método de HPLC: Recuperación

El desarrollo de un método incluye la optimización de cada uno de los pasos

• Separación cromatográfica

• Ionización

• Detección espectrometrica

• Preparación de la muestra


Preparación de las muestras

Extracción fase sólida

Precipitación

Extracción líquido-líquido

Métodos de extracción

Extracción Líquido-Liquido: Partición en una de dos fases líquidas

Es un clásico.

Suele ser el método de elección para tejidos.

Agitación o vortex con solventes orgánicos.

Los metabolitos polares se extraen con isopropanol, etanol, metanol, acetonitrilo…

Los metabolitos más lipofílicos con cloroformo o etil acetato.

Se modifica el pH para forzar el paso a una u otra fase

Extracción en fase sólida (SPE): Adsorción/partición en un sorbente sólido

Uno de los más utilizados en la extracción de analitos de fluidos biológicos

Gran variedad de fases estacionarias, p.ej. mixtos utilizan múltiples mecanismos de

retención incorporando diferentes ligandos al sorbente, lo que permite, cambiando el

pH, extraer de la misma columna de modo sucesivo las fracciones acidas, básicas y

neutras.

Gran variedad de soportes; columnas discos, placas, extracción online

Inyección directa

Procedimientos de extracción

3Ejemplo práctico

Detección y cuantificación de

Fenilacetilglutamina y Fenilacetato

en orina de ratas

Tratamiento de la

hiperamonemia y la

encepalopatia hepática con

L-ornitina y fenilacetato.

Grup Malalties Hepàtiques:

Marc Oria, Joan Córdoba

Servei de Metabolopaties

Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina (FAG) y Fenilacetato (FA) en orina de ratas


04-Feb-2010 14:59:48Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_2

Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4

Mix 4 compuestos 1ppm SIR grad2 2coma5 ppm_3 SIR of 4 Channels ES- TIC

2.43e6

0.93

0.56

1.10

2.22

1.55

FAG

263<145

263<127

FA

135<91

FB

163<91

IS

165<121

Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina y Fenilacetato en orina de ratas

Voltaje de

cono

04-Feb-2010 16:47:18XEVO-TQMS#VBA071Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50

Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

%

1

0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80

%

1

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 2: Daughters of 263ES- TIC

3.00e7

0.93

0.721.04

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 1: Daughters of 263ES- TIC

3.00e7

0.93

1.05

Ejemplo: Detección y cuantificación de Fenilacetilglutamina y Fenilacetato en orina de ratas

Energía de colisión

transición 263 <145

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50

m/z100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300

%

0

100

%

0

100

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 73 (0.929) Cm (69:77) 2: Daughters of 263ES- 3.00e5144.95

126.99

126.39

108.96

116.31

127.26

128.12

145.08

145.28

145.41

Fenilacetilglutamina Daugthers 10 to 50 73 (0.927) Cm (66:84) 1: Daughters of 263ES- 3.00e5

263.21144.88

144.75

144.41

108.90 127.26

262.41

145.15

145.35

262.28

244.86218.57

263.48

YtrebøLM. Hepatology. 2009 Jul;50(1):165-74.

En un tubo de 4,5 ml de polipropileno poner

50 µl de orina ultrafiltrada

50 µl de tampón fosfato 0,1 mM (pH2,4)

50 µl de IS 60M (3-(4-hidroxifenil)propionico)

1 mL tert-butil metil eter

Agitar 1 min

Centrifugar 1700xg 180 seg

Transferir 750 µl del sobrenadante a un tubo de polipropileno

Evaporar con nitrogeno en un baño de 40°C.

Reconstituir en 100µl de fase móvil.




Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4


2.43e6

0.93

0.56

1.10

2.22

1.55

FAG

263<145

263<127

FA

135<91

IS

165<121



Time0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40

%

4


2.43e6

0.93

0.56

1.10

2.22

1.55

FAG

263<145

263<127

FA

135<91

IS (FAG-d)

268<145

YtrebøLM. Hepatology. 2009 Jul;50(1):165-74.


50 µl de orina ultrafiltrada

50 µl de tampón fosfato 0,1 mM (pH2,4)

50 µl de IS 60M (3-(4-hidroxifenil)propionico)

1 mL tert-butil metil eter

Agitar 1 min

Centrifugar 1700xg 180 seg

Transferir 750 µl del sobrenadante a un tubo de polipropileno

Evaporar con nitrogeno en un baño de 40°C.

Reconstituir en 100µl de fase móvil.


Larvea MD. J Inherit Metab Dis. 2010 Aug 7


100 µl de orina ultrafiltrada y diluida 1:10

100 µl de IS (FAG-d) en metanol

100 µl de metanol para precipitar las proteínas

Vortex 30”

Centrifugar a 1000xg 5min

Transferir el sobrenadante a viales del inyector automático


Compound name: Fenilacetilglutamina 145

Correlation coefficient: r = 0.998920, r^2 = 0.997841

Calibration curve: 1.94349 * x + 1.48257

Response type: Internal Std ( Ref 4 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

uM0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

Re

sp

on

se

0

100

200

300

400

500

600

700

Compound name: Fenilacetato

Correlation coefficient: r = 0.995499, r^2 = 0.991019

Calibration curve: 0.141022 * x + -0.161316

Response type: Internal Std ( Ref 4 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

Conc0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

Re

sp

on

se

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

institut de recerca hospital universitari vall d’hebron

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