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Proyecto Nº SC93-155Proyecto Nº SC93-155

INMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LAINMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LADETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE YDETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE Y

CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.CARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTECARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE

LEUCOCITOS PORCINOS.LEUCOCITOS PORCINOS.

Equipo Investigador:Equipo Investigador:Javier Domínguez Juncal (Dr. Med.)Angel Ezquerra Martínez (Dr C.Q.)Fernando Alonso Moreno (Dr. C.B.)Antonio Bernabé Salazar (Dr. Vet.)Joaquin Sánchez Campillo (Dr. Vet.)Mª del Carmen Babín Vich (Dra. C.B.)Rosario Bullido de las Heras (L.V.)Manuel Gómez del Moral (L.B.)

Equivalente de jornada completa: 2,30

Centro de Investigación:Centro de Investigación:Centro de Investigación en Sanidad Animal (C.I.S.A.). INIA.28130 VALDEOLMOS (MADRID)Tel: 91/620 23 00 - Fax: 91/620 22 47

Duración:Duración:Enero 1993 - Diciembre 1995

Coste:Coste:Miles de pesetas: 24.668Financiación INIA 100 %

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PLANTEAMIENTO Y OBJETIVOSPLANTEAMIENTO Y OBJETIVOS

El cerdo representa uno de los sectores ganaderos económicamente más importantes de

nuestro país. Varias de las líneas de trabajo del Centro de Investigación en Sanidad

Animal (CISA) tienen por objetivo la obtención o mejora de vacunas frente virus que

afectan al cerdo (Virus de la Peste porcina africana (VPPA), de la fiebre aftosa (VFA),

de la gastroenteritis transmisible (VGT), etc). La consecución de estos objetivos

requiere un mejor conocimiento del sistema inmune del cerdo y de los mecanismos

inmunológicos que confieren protección en las distintas infecciones. Para ello es

necesario el desarrollo de técnicas y reactivos que ya están siendo utilizados en modelos

experimentales de ratón y humano y que han permitido un gran avance en la

comprensión de la inmunología de las enfermedades infecciosas en estas especies.

En el presente proyecto se pretenden desarrollar reactivos y técnicas que permitan un

análisis más profundo del sistema inmune, particularmente de los mecanismos de

inmunidad celular, en el cerdo. Estos reactivos y técnicas serán utilizados en el estudio

de la respuesta inmune frente virus que son objeto de estudio de otros grupos del

Centro. Los objetivos concretos que se pretenden alcanzar son los siguientes:

1) Obtención de una colección de anticuerpos monoclonales (Acmo) frente a

antigenos de diferenciación de leucocitos porcinos, con especial interés en antígenos

específicos de monocitos-macrófagos porcinos y antígenos de activación de linfocitos T.

2) Puesta a punto de técnicas para la detección de citoquinas porcinas. Nos

proponemos obtener antisueros policlonales, anticuerpos monoclonales (Acmo) y/o

sondas de cDNA frente a diversas citoquinas porcinas (IFNα, IFNγ, TNFα, IL1,etc), de

las que se dispone de material purificado (IFNα, IFNγ) o se conoce su secuencia (TNFα,

IL1, IL10, IFNα, IFNγ). Con estos reactivos se desarrollarán inmunoensayos (ELISA) o

técnicas de RT-PCR para la cuantificación de estas citoquinas en sueros y/o secreciones

corporales y en órganos de animales sanos e infectados. Estos reactivos serán también

utilizados en técnicas inmunohistológicas y de hibridación "in situ" para la detección de

células productoras de citoquinas en cortes de tejidos de animales sanos y en lesiones e

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infiltrados inflamatorios en animales infectados. Estas técnicas nos servirán para

analizar (en próximos proyectos y en colaboración con otros grupos) el papel que juegan

las distintas citoquinas en las infecciones por VPPA, VFA, virus del síndrome

respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP), etc.

3) Clonaje y caracterización del complejo CD3-TCR (receptor de antígeno de los

linfocitos T). Este objetivo es un paso previo al análisis de la diversidad y del repertorio

de linfocitos T en respuesta a distintos virus de interés. La disponibilidad de sondas

derivadas de los genes del TCR permitirá analizar la distribución y diversidad de los

linfocitos Tαß y Tγδ en tejidos y lesiones o infiltrados inflamatorios, por hibridación in

situ.

RESULTADOSRESULTADOS

Antígenos de diferenciación de leucocitos porcinosAntígenos de diferenciación de leucocitos porcinos

Se ha obtenido una colección de 40 anticuerpos monoclonales frente linfocitos activados

(con ConA+PMA) y macrófagos alveolares porcinos. De ellos, cinco Acmo reconocen

antígenos de activación, no expresados o expresados a niveles muy bajos en células en

reposo; y tres reconocen antígenos específicos de monocito-macrófagos. Entre las

moléculas reconocidas por este panel de Acmo se han podido identificar las siguientes:

CD5, CD11b, CD25, CD45, CD45RA, CD46, SWC7, SLA I y SLA II (DR y DQ).

Es interesante resaltar la obtención por vez primera de Acmo frente CD11b, CD45RA,

SWC7, asi como frente a varios antígenos específicos de macrófagos.

TCRTCR

Se ha abordado el análisis de la expresión y diversidad del TCR porcino mediante RT-

PCR. Para ello se diseñaron una serie de oligonucleótidos que permiten la amplificación

de porciones de los segmentos constantes de los genes alfa, beta y delta del TCR. Se

comprobó la especificidad de la amplificación mediante el clonaje y secuenciación de los

productos obtenidos, que correspondían efectivamente a los genes del TCR.Mediante

esta tecnología se ha determinado la expresión de los genes α y β del TCR en un clon de

linfocitos T especifico frente al virus de la fiebre aftosa.

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CitoquinasCitoquinas

Se han producido antisueros policlonales y/o Acmo frente IFNγ e IFNα recombinantes

porcinos y frente TNFα recombinante bovino. Con estos anticuerpos se han

desarrollado ELISAs para la detección de IFNγ e IFNα. Por otra parte, se ha puesto a

punto una técnica de RT-PCR, tras diseño asistido por ordenador de los "primers"

correspondientes, para la detección y semi-cuantificación de la expresión de los genes de

IFNγ, IL-1β, IL-10, TNF-α en tejidos y suspensiones celulares.

INFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR ELINFORMACION CIENTIFICA Y TECNICA PROPORCIONADA POR EL

PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES.PROYECTO. POSIBLES APLICACIONES.

Antígenos de diferenciación de leucocitos porcinosAntígenos de diferenciación de leucocitos porcinos

Se han realizado una fusión inmunizando con leucocitos de sangre periférica (PBL), 5

fusiones frente a linfocitos activados con Con A y PMA, y dos fusiones inmunizando con

macrófagos alveolares porcinos. De los híbridos obtenidos se han seleccionado 40 AcMo

para su posterior caracterización.

Se ha analizado por citometría de flujo la distribución en las distintas poblaciones

celulares de los antígenos, estudiando la reactividad de los AcMo con linfocitos en

reposo o activados, monocitos, macrófagos alveolares, granulocitos, plaquetas,

eritrocitos y con diferentes líneas celulares porcinas (PK-15, 38A1D). La distribución

tisular de estos antígenos se ha analizado mediante tecnicas de inmunoperoxidasa

indirecta sobre cortes de congelación de timo, bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer,

amígdalas, hígado, riñón y piel. El peso molecular de los antígenos reconocidos por estos

AcMo se ha determinado por inmunoprecipitación y/o Western blotting. También

hemos estudiado la posible reactividad cruzada con PBL humanos, equinos,bovinos,

ovinos y caninos.

En la tabla 1tabla 1 se refleja la reactividad de los AcMo con linfocitos, en reposo o activados

con ConA+PMA, granulocitos, plaquetas, eritrocitos y macrófagos alveolares. Estos

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datos se han obtenido por citometría de flujo, y corresponden al porcentaje de células

positivas.

Cinco AcMo tienen alta reactividad con linfocitos activados, y no reaccionan o

reaccionan débilmente con linfocitos circulantes. Se han realizado estudios de la

expresión de los antígenos a distintos tiempos y con distintos mitógenos. De este grupo,

un Acmo (6E2/12) reconoce la cadena α del receptor de IL-2 (CD25) y dos Acmo (2F6/8

y 2A10/8) reconocen un antígeno expresado en células B de centros germinales (SWC7).

Siete Acmo, obtenidos frente macrófagos alveolares, reconocen antígenos específicos de

la serie mielomonocítica. Tres de estos Acmo (2A10/11, 3B11/11 y 3F7/11) parecen

reconocer antígenos presentes en macrófagos alveolares, cuya expresión es más débil en

monocitos y negativa en granulocitos, y que podrían servir como marcadores de

maduración. De los cuatro restantes, dos (1E12/11 y 4E9/11) muestran una reacción

muy débil con monocitos y granulocitos, y otros dos (2C12/10 y 2F4/11) reconocen por

igual monocitos, macrófagos alveolares y granulocitos. Uno de estos (2F4/11) reconoce la

cadena a del receptor de complemento tipo 3 porcino o CD11b. Este anticuerpo es capaz

de bloquear la fagocitosis de partículas de zymosan opsonizado por macrófagos

alveolares y granulocitos PMN, así como la adhesión al plástico de estos últimos cuando

se activan con PMA. En cuanto a la distribución tisular, todos marcan macrófagos en

los órganos linfoides, pero con distintos patrones de tinción. En hígado, las células de

Kupffer se tiñen fuertemente con los AcMo 1E12, 3B11, 4E9 y 2A10, mientras que el

AcMo 2C12 reacciona con las células endoteliales de los sinusoides hepáticos. Los AcMo

3B11 y 1E12 muestran un patrón de tinción similar, y en gánglios linfáticos parecen

reconocer células foliculares dendríticas en los centros germinales.

Entre las moléculas reconocidas por los restantes Acmo se han podido identificar CD5

(1H6/8), CD45 (2A5), CD45RA (6E3/7 y 3C3/9), CD46 (1C5, 6D8/8, 2C11), SLA I

(4B7/8) y SLA II-DR ( (2F4, 1F12 y 2E9) y SLA II-DQ (2H5/13, 4H2/13).

TCRTCR



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productos obtenidos, que correspondían efectivamente a los genes del TCR. Mediante



En el proceso de análisis de la expresión de los genes β del TCR se observó un fenómeno

que consiste en la acumulación de mensajeros inmaduros, es decir aquellos que aún

conservan secuencias intrónicas. Se clonaron y secuenciaron los productos amplificados

de estos mensajeros y se comprobó que esta acumulación no era debida a la existencia

de genes defectuosos, ya que las secuencias de "splicing" podían ser identificadas en los

extremos de los exones.

También se ha abordado el análisis de la variabilidad en la región hipervariable de los

genes α y β del TCR que se denomina CDR3, es decir la región hipervariable que

resulta de la unión del segmento variable y el segmento J en los genes α, y en el caso de

la cadena β de la unión de los segmentos V, D y J. Para este análisis se diseñaron

oligonucleótidos específicos de un segmento Vα, y de un segmento Vβ, y se clonaron los

productos amplificados. Se han secuenciado 46 clones pertenecientes a genes TCRα, 38

de los cuales mostraron secuencias diferentes, identificándose 27 segmentos J. De los

clones correspondientes a genes TCR β se han secuenciado 9, todos ellos con secuencias

diferentes, identificándose 3 segmentos J y un segmento D.


Se han producido antisueros policlonales en conejo frente IFNγ e IFNα recombinantes

porcinos y frente TNFα recombinante bovino (la homología con TNFα porcino es

superior al 85%) y anticuerpos monoclonales frente IFNγ e IFNα recombinantes

porcinos. Los Acmo obtenidos frente IFNγ recombinante aunque reconocen el IFNγ

presente en trofoblasto, no reaccionan o lo hacen muy débilmente con el IFNγ producido

en sobrenadantes de linfocitos T estimulados con ConA, posiblemente debido a

diferencias postraduccionales entre el IFNγ recombinante y el linfocitario. Por ello

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hemos utilizado los antisueros policlonales para el desarrollo de ensayos ELISA para la

detección de IFNγ. Este ensayo permite detectar 50 ng/ml de IFNγ recombinante

porcino, y ha servido para cuantificar la producción de IFNγ en sobrenadantes de

cultivo de linfocitos circulantes obtenidos de cerdos infectados con aislados atenuados

del virus de la peste porcina africana y reestimulados in vitro. Para la detección de IFNα

se dispone de un ELISA que utiliza 2 Acmo cedidos por Dr. B. Charley (INRA, Jouy-en-

Josas) que permite detectar hasta 1ng/ml de IFNα. Para la detección de TNFα porcino

se ha puesto a punto un ensayo biológico utilizando la línea PK-15,que permite detectar

concentraciones de 10 ng/ml en sobrenadantes de cultivo.

Además se ha puesto a punto una técnica de RT-PCR, tras diseño asistido por

ordenador de los "primers" correspondientes, para la detección (y semi-cuantificación)

de la expresión de los genes de IFNγ, IL-1β, IL-10, TNF-α . Con estas técnicas se está

analizando la cinética de expresión de estas citoquinas en diversos tipos celulares y

organos tras infecciones experimentales con aislados virulentos de VPPA. (Mientras en

los cerdo control no se detecta expresión de IFNγ, en los cerdos infectados con VPPA

éste se puede detectar a los 3 días postinoculación en ganglios linfáticos y bazo,

alcanzando un máximo a los 5 días postinoculación y desapareciendo a los 7 días

postinoculación, cuando el animal ha entrado ya en fase terminal. La cinética de IFNα

parece más temprana, con niveles detectables en bazo e higado desde los primeros días).

LEYENDA DE LA FIGURALEYENDA DE LA FIGURA

Fig. 1 Análisis por citometría de flujo de la reactividad del Acmo 2F4/11 con células

mononucleares de sangre periférica (PBMC), granulocitos polimorfonucleares (PMN),

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macrófagos alveolares (MO), eritrocitos (E) y plaquetas. La línea gris corresponde al

control negativo, incubando las células con un Acmo irrelevante.

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FORMACION DE PERSONALFORMACION DE PERSONAL

Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Rosario Bullido de las Heras,titulada “Producción y caracterización de anticuerpos monoclonales frente a antígenosde diferenciación de leucocitos porcinos”, en la Facultad de Veterinaria de laUniversidad Complutense de Madrid..

Elaboración y presentación de la tesis doctoral de Manuel Gómez del Moral,

titulada “Análisis de citoquinas en infecciones víricas porcinas: Peste porcina africana”,

en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de Madrid.

PUBLICACIONESPUBLICACIONES

Artículos científicos

Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.,

Maurer, S., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Tlaskalova, H., Valpotic, I.,

Vizcaíno, J.S., Weiland, E., Zuckermann, F. 1994. Summary of workshop findings for

porcine T-lymphocyte antigens. Vet. Immunol. Immunopathol. 43. 219-228.

Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A, Dominguez, J., Goldman, T., Lunney, J.K.,

Maurer, S., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Trebichavsky, I., Valpotic, I.,

Vizcaíno, J.S., Zuckerman, F., 1994. Analyses of mAb reactive with porcine CD8. Vet.

Immunol. Inmunopathol, 43. 249-254.

Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.,

Maurer, S., Pauly, T., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Trebichavsky, I., Valpotic,

I., Vizcaíno, J.S., Weiland, E., Zuckermann, F., 1994. Analyses of mAb reactive with

porcine CD6. Vet. Immunol. Immunopathol. 43, 243-247.

Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.K.,

Maurer, S., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Summerfield, A., Tlaskalova, H.,

Valpotic, I., Vizcaíno, J.S., Weiland, E., Zuckermann, F., 1994. Analyses of mAb

reactive with porcine CD5. Vet. Immunol. Immunopathol, 43. 237-242.

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Saalmuller, A., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Goldman, T., Lunney, J.K.,

Pauly, T., Pescovitz, M., Pospisil, R., Salmon, H., Sinkora, J., Summerfield, A.,

Valpotic, I., Vizcaíno, J.S., Zuckermann, F., 1994. Analysis of mAb reactive with the

porcine SWC1. Vet Immunol.Immunopathol, 43. 255-258.

Pescovitz, M., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Vizcaino, J.S., Pospisil, R.,

Trebichavsky, I., Salmon, H., Valpotic, I., Davis, W., Arn, S., Sachs, D., Lunney, J.,

Zuckerman, F., Weiland, E., Saalmuller, A., 1994. Analysis of monoclonal antibodies

reactive with the porcine CD4 antigen. Vet. Immunol. Immunopathol, 43. 233-236.

Pescovitz, M., Aasted, B., Canals, A., Domínguez, J., Vizcaino, J.S., Pospisil, R.,

Sinkora, J., Salmon, H., Valpotic, I., Davis, W., Arn, S., Sachs, D., Lunney, J.,

Zuckerman, F., Weiland, E., Saalmuller, A., 1994. Analysis of monoclonal antibodies

reactive with the porcine CD2 antigen. Vet. Immunol. Immunopathol. 43. 229-232.

Sánchez, C., Alvarez, A., Castillo, A., Zapata, A., Villena, A., Domínguez, J. (1995). Two

different subpopulations of Ig-bearing cells in lymphoid organs of rainbow trout.Dev.

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Editorial Labor. Barcelona.

Trabajos presentados a congresos, reuniones o simposios

11

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R. Bullido, M. Gomez del Moral, B. Alvarez, E. Ortuño, A. Ezquerra, F. Alonso, J.

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R. Bullido, M. Gomez del Moral, B. Alvarez, E. Ortuño, A. Ezquerra, F. Alonso, J.

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Domínguez. Análisis por anticuerpos monoclonales de la susceptibilidad de las

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porcina africana. XXII Congreso de la Sociedad Española de Inmunología. Oviedo

(España). Mayo, 1996.

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Patentes y obtenciones

Se está tramitando a través de la OTRI-INIA un convenio con BIOVET-UCO para la

distribución y comercialización de varios de los Acmo frente leucocitos porcinos.

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MEMORIA DEL PROYECTO SC93-155MEMORIA DEL PROYECTO SC93-155:

INMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LAINMUNOLOGIA PORCINA:DESARROLLO DE METODOS PARA LA

DETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE YDETECCION Y/O CUANTIFICACION DE CITOQUINAS. CLONAJE Y

CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.CARACTERIZACION DEL COMPLEJO CD3-TCR PORCINO.

CARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTECARACTERIZACION DE ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE

LEUCOCITOS PORCINOS.LEUCOCITOS PORCINOS.

CENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMALCENTRO DE INVESTIGACION EN SANIDAD ANIMAL

VALDEOLMOS, MADRID 28130VALDEOLMOS, MADRID 28130

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1.- INTRODUCCION1.- INTRODUCCION

La obtención de Acmo frente antígenos de diferenciación de leucocitos han permitido

definir en el cerdo, al igual que en otras especies, distintas subpoblaciones de linfocitos T

(CD4, CD8), con características funcionales propias (Pescovitz et al, 1984, 1985, Jonjic y

Koszinowski, 1984) y analizar su distribución en los distintos órganos linfoides en

animales sanos (Jonjic et al, 1987) e infectados (Mínguez et al, 1988, Susa et al, 1992).

Estudios realizados con estos Acmo han puesto de relieve la existencia de ciertas

peculiaridades en el sistema inmune del cerdo, como son la presencia de linfocitos

CD4+CD8+ dobles positivos en sangre periférica, cuya función todavía se desconoce

(Saalmuller et al, 1989) (es la única especie estudiada en la que se ha observado esta

población en sangre periférica), o la existencia de un porcentaje elevado de linfocitos

Tγδ en sangre periférica (Hirt et al, 1990). Esto último también se ha descrito en vaca y

oveja.

Aunque en los últimos años se ha obtenido un importante número de Acmo frente

antígenos de membrana de leucocitos porcinos, especialmente frente linfocitos T

(revisado en Lunney y Pescovitz, 1987, 1988), existen muchas moléculas de membrana,

implicadas en distintos mecanismos inmunológicos, cuyas funciones han sido

caracterizadas en otras especies (ratón y hombre), para las que no se dispone de Acmo.

En este sentido, sería de gran interés disponer de Acmo frente antígenos de activación

(moléculas que se expresan selectivamente en los linfocitos después de su activación por

antígenos o mitógenos) ya que podrían utilizarse en distintas patologías como

marcadores para la detección de poblaciones activadas. También sería de gran utilidad

la obtención de Acmo frente a diferentes estadios de maduración/diferenciación de los

monocito-macrófagos, (en la fecha de comienzo de este proyecto se disponía de un

número reducido de Acmo frente estas células que además reconocían granulocitos), ya

que en estas células replican varios patógenos importantes de la especie porcina como

son el virus de la PPA (Malmquist y Hay, 1960) y el virus del síndrome respiratorio y

reproductivo porcino (SRRP) (Pol et al, 1991), y que permitirían una mejor

caracterización fenotípica de las poblaciones susceptibles a estos virus y del efecto de la

infección sobre las mismas. Además muchos de estos Acmo, por su capacidad de

estimular o bloquear la función de determinadas subpoblaciones celulares permitirán

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conocer en mayor detalle los mecanismos inmunologicos implicados en la protección o

en la patogenia de estas enfermedades.

Otra de las limitaciones en el análisis de la respuesta inmune celular en el cerdo

es el desconocimiento genético y estructural de las moléculas responsables del

reconocimiento antigénico (TCR). El análisis del uso y diversidad de TCR en las

respuestas de linfocitos T a varios virus (LCMV, MCMV, Influenza, etc) en ratón ha

mostrado en ciertos casos la utilización preferente de determinados segmentos variables

(Yanagi, Y.,1991).Esto abre la posibilidad de actuar sobre la respuesta mediante la

activación, o el bloqueo, de células con cierto tipo de receptor que están implicadas en la

protección o patología asociada a ciertas infecciones virales. Dado el interés en analizar

la respuesta inmune celular a varios virus que infectan al cerdo (VPPA, VFA, VSRRP,

etc) que existe en nuestro Centro, nos hemos planteado el análisis genético y molecular

de los TCR porcinos.

Los complejos CD3-TCR están compuestos por al menos 7 cadenas

polipeptídicas, cinco de las cuales son invariantes en su estructura y se denominan

complejo CD3 (cadenas CD3γ,δ,ε,ζ y η). Las dos cadenas restantes, que son el TCR

propiamente dicho, son variables, pueden ser de dos tipos, αβ o γδ, y los genes que las

codifican contienen varios segmentos variables (V, J y en las cadenas β y δ D) que se

reordenan para dar lugar al gen funcional (Allison et al., 1987; Wilson et al.,1988;

Raulet et al.,1989; Clevers et al., 1988).

En la actualidad se conoce la estructura de genes del complejo CD3-TCR de

varias especies animales (que incluyen al hombre, ratón, rata, oveja, vaca, perro, conejo,

macaco, aunque sólo en los casos del hombre y el ratón se conoce la estructura de todos

y cada uno de los genes. Todas las secuencias de estos genes se encuentran en las bases

de datos del European Molecular Biology Laboratory (EMBL), o Gen Bank USA).La

comparación de las secuencias de genes homólogos de distintas especies ha mostrado

que todos tienen regiones muy conservadas en las distintas especies. Este hecho hace

factible el empleo de técnicas de amplificación in vitro de ácidos nucleicos (PCR) para el

aislamiento y análisis de estos genes.

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Las células del sistema inmune producen diversos factores hormonales,

denominados interleuquinas o más genéricamente citoquinas, que regulan la respuesta

inmune, controlando los procesos de activación, crecimiento y diferenciación celular.

El análisis de las citoquinas producidas por clones de linfocitos T en ratón y otras

especies animales ha puesto de manifiesto la existencia de al menos 2 subpoblaciones de

linfocitos CD4+, denominadas Th1 y Th2, que sintetizan distintos tipos de citoquinas

(Mosmann y Coffman, 1989). Estas 2 subpoblaciones se estimulan de forma diferente

por distintos tipos de patógenos o en diferentes estadios de la infección y parecen actuar

de forma antagónica en varios modelos de infecciones experimentales analizados

(revisado en Scott y Kaufman, 1991). En diversos modelos infecciosos, resistencia y

susceptibilidad se correlacionan con distintos perfiles de producción de citoquinas (Pond

et al, 1989; King et al, 1990; Yakamura et al, 1991). Estos estudios han revelado la

existencia de un complejo cuadro de interacciones entre distintas citoquinas y los

diversos tipos celulares del sistema inmune. (Ken-Ichi et al, 1990; Hamblin, 1988).

Los interferones están considerados como importantes defensas inespecíficas frente a las

infecciones víricas. El papel protector del IFNγ ha sido claramente demostrado en

infecciones por virus de la coriomeningitis linfocitaria (Leist et al. 1989; Klavinskis et al.

1989), por virus vaccinia (Karupiah et al. 1990) y virus influenza A (Taylor et al. 1989).

Este efecto antivírico puede ser mediado por su acción directa sobre la célula infectada o

de forma indirecta, a través de la inducción de mecanismos inmunológicos como la

actividad citotóxica (Willie et al. 1989). En la especie porcina, se ha demostrado una

inhibición de la replicación in vitro del virus de la estomatitis vesicular, VGT y VPPA en

varias líneas celulares y en cultivos de macrófagos por IFNγ recombinante porcino

(Charley et al, 1988; Esparza, 1988) y por IFNα recombinante bovino y humano

(Esparza, 1988; Páez et al, 1990). También se ha descrito la producción de IFNγ por

linfocitos T específicos del virus de la Peste porcina africana (Revilla et al, 1992). Sin

embargo, no existen estudios sobre el papel de estas citoquinas "in vivo" en animales

que sobreviven la infección experimental. El TNFα también posee actividad antivírica

(Wong y Godel,1986), y puede potenciar el efecto del IFN (Feduchi et al, 1989; Paez et

al, 1990). Estas citoquinas también pueden estar implicadas en la patogenia de muchas

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de las lesiones que ocurren durante las infecciones. Así, el TNF parece ser el principal

mediador del choque endotóxico causado por bacterias Gram negativas, en el que

también se ha implicado a la IL-6 (Starnes et al, 1990). La presencia de niveles altos de

TNF en líquido cefalorraquídeo se ha correlacionado con el desenlace fatal en las formas

cerebrales de la malaria (Kwiatkowski et al, 1990).

Muchos virus que infectan células del sistema inmune evaden la respuesta inmune

alterando el patrón de citoquinas producidas por estas células. Como ejemplo podemos

citar el incremento de la producción de TGF-β por linfocitos de enfermos de SIDA. Esta

citoquina posee actividad inmunosupresora y puede contribuir a la deficiente función

inmune observada en las primeras fases de la enfermedad (Kekow et al, 1990).

Recientemente se ha identificado una proteína en el virus del Epstein-Barr que presenta

una alta homología con la IL-10 humana. Esta proteína , al igual que la IL-10 inhibe la

producción de IFNγ por los linfocitos activados (Hsu et al, 1990). En la PPA se ha

descrito también la inhibición por el virus de ciertas funciones inmunológicas, como la

respuesta proliferativa a mitógenos o la actividad NK (Wardley, 1982; Ara-Chaves et al,

1988; González et al, 1990; Mendoza et al, 1991). Algunas de estas inhibiciones están

mediadas por factores solubles producidos durante la infección.

Estos estudios sobre la implicación de estas citoquinas en la resistencia o en el desarrollo

de lesiones han sido posibles gracias al clonaje y expresión de los genes que codifican

estas moléculas, lo que ha permitido su obtención en grandes cantidades y con gran

pureza, y ha facilitado el desarrollo de reactivos (Acmo, sondas cDNA) y técnicas (RIAs,

ELISAs, hibridación "in situ", inmuohistoquímica) para su detección y/o cuantificación

en sueros y secreciones corporales, y la identificación de las células que las producen en

suspensiones celulares y cortes de tejido (Mosmann y Fong, 1989; Moller, 1991). En el

cerdo se han clonado y secuenciado los genes del IFNα (Lefevre y La Bonnardiere,

1986), IFNß (Artursson et al, 1992), IFNγ (Dijkmans et al, 1990), TNFα (Pauli et al,

1989; Drews et al, 1990), TNFß (Kuhnert et al, 1991), IL-1α (Maliszewski et al, 1990),

IL-2 (Goodall et al, 1991) e IL-6 (Richards y Saklatva, 1991).

18

2.- PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES2.- PLANTEAMIENTO Y DESARROLLO DE LAS ACTIVIDADES

REALIZADASREALIZADAS

El cerdo representa uno de los sectores ganaderos económicamente más importantes de

nuestro país. Varias de las líneas de trabajo del Centro de Investigación en Sanidad

Animal (CISA)tienen por objetivo la obtención o mejora de vacunas frente virus que

afectan al cerdo (Virus de la Peste porcina africana (VPPA), de la fiebre aftosa (VFA),

de la gastroenteritis transmisible (VGT), etc). La consecución de estos objetivos

requiere un mejor conocimiento del sistema inmune del cerdo y de los mecanismos

inmunológicos que confieren protección en las distintas infecciones. Para ello es

necesario el desarrollo de técnicas y reactivos que ya están siendo utilizados en modelos

experimentales de ratón y humano y que han permitido un gran avance en la

comprensión de la inmunología de las enfermedades infecciosas en estas especies.

En el presente proyecto se pretenden desarrollar reactivos y técnicas que permitan un

análisis más profundo del sistema inmune, particularmente de los mecanismos de

inmunidad celular, en el cerdo. Estos reactivos y técnicas serán utilizados en el estudio

de la respuesta inmune frente virus que son objeto de estudio de otros grupos del

Centro. Los objetivos concretos que se pretenden alcanzar son los siguientes:

1) Obtención de una colección de anticuerpos monoclonales (Acmo) frente a

antigenos de diferenciación de leucocitos porcinos, con especial interés en antígenos

específicos de monocitos-macrófagos porcinos y antígenos de activación de linfocitos T.

2) Puesta a punto de técnicas para la detección de citoquinas porcinas. Nos

proponemos obtener antisueros policlonales, anticuerpos monoclonales (Acmo) y/o

sondas de cDNA frente a diversas citoquinas porcinas (IFNα, IFNγ, TNFα, IL1,etc), de

las que se dispone de material purificado (IFNα, IFNγ) o se conoce su secuencia (TNFα,

IL1, IL10, IFNα, IFNγ). Con estos reactivos se desarrollarán inmunoensayos (ELISA) o

técnicas de RT-PCR para la cuantificación de estas citoquinas en sueros y/o secreciones

corporales y en órganos de animales sanos e infectados. Estos reactivos serán también

19

utilizados en técnicas inmunohistológicas y de hibridación "in situ" para la detección de

células productoras de citoquinas en cortes de tejidos de animales sanos y en lesiones e

infiltrados inflamatorios en animales infectados. Estas técnicas nos servirán para

analizar (en próximos proyectos y en colaboración con otros grupos) el papel que juegan

las distintas citoquinas en las infecciones por VPPA, VFA, virus del síndrome

respiratorio y reproductivo porcino (VSRRP)etc.

3) Clonaje y caracterización del complejo CD3-TCR (receptor de antígeno de los

linfocitos T). Este objetivo es un paso previo al análisis de la diversidad y del repertorio

de linfocitos T en respuesta a distintos virus de interés. La disponibilidad de sondas

derivadas de los genes del TCR permitirá analizar la distribución y diversidad de los

linfocitos Tαß y Tγδ en tejidos y lesiones o infiltrados inflamatorios, por hibridación in

situ.

20

3.- GRADO DE CONSECUCION DE LOS OBJETIVOS3.- GRADO DE CONSECUCION DE LOS OBJETIVOS

Los objetivos propuestos se han alcanzado en su mayor parte. Se ha obtenido

una amplia colección de Acmo frente antígenos de diferenciación de leucocitos porcinos.

Muchos de estos Acmo han sido caracterizados en cuanto a peso molecular, distribución

celular y tisular, y propiedades funcionales de los antigenos reconocidos se refiere. Sin

embargo, en algunos casos, no hemos identificar ningún CD humano o de ratón

homólogo, por lo que continuamos con su caracterización. Es interesante resaltar la

obtención de Acmo frente CD11b, SWC7, CD45RA y antígenos específicos de

macrófagos, de los que no se disponía en la especie porcina. En cuanto al receptor de

células T se ha puesto a punto una técnica por RT-PCR que permite detectar la

expresión de los genes de las cadenas α,β y δ de dicho receptor en el cerdo. Esta técnica

ha permitido caracterizar en mayor profundidad un clon T específico del virus de la

Fiebre aftosa (VFA), desarrollado por el grupo del Dr. Francisco Sobrino en nuestro

Centro. La aproximación propuesta en el proyecto para el análisis de la diversidad de

los genes del TCR porcino (RACE), aún no ha dado resultados por problemas técnicos

todavía no superados. Sin embargo, el análisis de la diversidad se ha abordado por

clonaje y secuenciación de los segmentos variables. Por último, en relación con ensayos

para citoquinas, disponemos de ELISAs para la detección y cuantifiación de IFN α e

IFN γ porcinos, de un ensayo biológico para la cuantificación de TNF α porcino, y de

una técnica RT-PCR para analizar la expresión de los genes de IFN γ, TNFα, IL-1β e

IL-10 porcinos. Asimismo disponemos de sondas para algunas de estas citoquinas (IFN

α, IFN γ, TNFα) para su uso en técnicas de hibridación "in situ", aunque todavía no se

han ensayado.

21

4.- CONCLUSIONES Y RESULTADOS ALCANZADOS4.- CONCLUSIONES Y RESULTADOS ALCANZADOS

Se han realizado una fusión inmunizando con leucocitos de sangre periférica (PBL), 5

fusiones frente a linfocitos activados con Con A y PMA, y dos fusiones inmunizando con

macrófagos alveolares porcinos. De los híbridos obtenidos se han seleccionado 40 AcMo

para su posterior caracterización.

Se ha analizado por citometría de flujo la distribución en las distintas poblaciones

celulares de los antígenos, estudiando la reactividad de los AcMo con PBLs, linfocitos

activados, monocitos, macrófagos alveolares, granulocitos, plaquetas, eritrocitos y con

diferentes líneas celulares porcinas (PK-15, 38A1D). La distribución tisular de estos

antígenos se ha analizado mediante tecnicas de inmunoperoxidasa indirecta sobre cortes

de congelación de timo, bazo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, amígdalas, hígado,

riñón y piel. El peso molecular de los antígenos reconocidos por estos AcMo se ha

determinado por inmunoprecipitación y/o Western blotting. También hemos estudiado

la posible reactividad cruzada con PBLs humanos, equinos,bovinos, ovinos y caninos.

En la tabla 1tabla 1 se refleja la reactividad de los AcMo con linfocitos, en reposo o activados

con ConA+PMA, granulocitos, plaquetas, eritrocitos y macrófagos alveolares. Estos

datos se han obtenido por citometría de flujo, y corresponden al porcentaje de células

positivas.

Cinco AcMo tienen alta reactividad con linfocitos activados, y no reaccionan o

reaccionan débilmente con linfocitos circulantes. Se han realizado estudios de la

expresión de los antígenos a distintos tiempos y con distintos mitógenos. De este grupo,

un Acmo (6E2/12) reconoce la cadena α del receptor de IL-2 (CD25) y dos Acmo (2F6/8

y 2A10/8) reconocen un antígeno expresado en células B de centros germinales (SWC7).

Siete Acmo,obtenidos frente macrófagos alveolares, reconocen antígenos específicos de

la serie mielomonocítica. Tres de estos Acmo (2A10/11, 3B11/11 y 3F7/11) parecen

reconocer antígenos presentes en macrófagos alveolares, cuya expresión es más débil en

monocitos y negativa en granulocitos, y que podrían servir como marcadores de

maduración. De los cuatro restantes, dos (1E12/11 y 4E9/11) muestran una reacción

22

muy débil con monocitos y granulocitos, y otros dos (2C12/10 y 2F4/11) reconocen por

igual monocitos, macrófagos alveolares y granulocitos. Uno de estos (2F4/11) reconoce la

cadena a del receptor de complemento tipo 3 porcino o CD11b. Este anticuerpo es capaz

de bloquear la fagocitosis de partículas de zymosan opsonizado por macrófagos

alveolares y granulocitos PMN, así como la adhesión al plástico de estos últimos cuando

se activan con PMA. En cuanto a la distribución tisular, todos marcan macrófagos en

los órganos linfoides, pero con distintos patrones de tinción. En hígado, las células de

Kupffer se tiñen fuertemente con los AcMo 1E12, 3B11, 4E9 y 2A10, mientras que el

AcMo 2C12 reacciona con las células endoteliales de los sinusoides hepáticos. Los AcMo

3B11 y 1E12 muestran un patrón de tinción similar, y en gánglios linfáticos parecen

reconocer células foliculares dendríticas en los centros germinales.

Entre las moléculas reconocidas por los restantes Acmo se han podido identificar CD5

(1H6/8), CD45 (2A5), CD45RA (6E3/7 y 3C3/9), CD46 (1C5, 6D8/8, 2C11), SLA I

(4B7/8) y SLA II-DR ( (2F4, 1F12 y 2E9) y SLA II-DQ (2H5/13, 4H2/13).

TCRTCR





productos obtenidos, que correspondían efectivamente a los genes del TCR. Mediante



En el proceso de análisis de la expresión de los genes β del TCR se observo un fenómeno

que consiste en la acumulación de mensajeros inmaduros, es decir aquellos que aún

conservan secuencias intrónicas. Se clonaron y secuenciaron los productos amplificados

de estos mensajeros y se comprobó que esta acumulación no era debida a la existencia

de genes defectuosos, ya que las secuencias de "splicing" podían ser identificadas en los

extremos de los exones.

23

También se ha abordado el análisis de la variabilidad en la región hipervariable de los

genes α y β del TCR que se denomina CDR3, es decir la región hipervariable que

resulta de la unión del segmento variable y el segmento J en los genes α, y en el caso de

la cadena β de la unión de los segmentos V, D y J. Para este análisis se diseñaron

oligonucleótidos específicos de un segmento Vα, y de un segmento Vβ, y se clonaron los

productos amplificados. Se han secuenciado 46 clones pertenecientes a genes TCRα, 38

de los cuales mostraron secuencias diferentes, identificándose 27 segmentos J. De los

clones correspondientes a genes TCR β se han secuenciado 9, todos ellos con secuencias

diferentes, identificándose 3 segmentos J y un segmento D.


Se han producido antisueros policlonales en conejo frente IFNγ e IFNα recombinantes

porcinos y frente TNFα recombinante bovino (la homología con TNFα porcino es

superior al 85%)y anticuerpos monoclonales frente IFNγ e IFNα recombinantes

porcinos. Los Acmo obtenidos frente IFNγ recombinante aunque reconocen el IFNγ

presente en trofoblasto, no reaccionan o lo hacen muy débilmente con el IFNγ producido

en sobrenadantes de linfocitos T estimulados con ConA, posiblemente debido a

diferencias postraduccionales entre el IFNγ recombinante y el linfocitario. Por ello

hemos utilizado los antisueros policlonales para el desarrollo de ensayos ELISA para la

detección de IFNγ. Este ensayo permite detectar 50 ng/ml de IFNγ recombinante

porcino, y la presencia de IFNγ en sobrenadantes de cultivo de linfocitos circulantes

obtenidos de cerdos infectados con aislados atenuados del virus de la peste porcina

africana y reestimulados in vitro. Para la detección de IFNα se dispone de un ELISA

que utiliza 2 Acmo cedidos por Dr. B. Charley (INRA, Jouy-en-Josas) que permite

detectar hasta 1ng/ml de IFNα. Para la detección de TNFα porcino se ha puesto a punto

un ensayo biológico utilizando la línea PK-15,que permite detectar concentraciones de

1-10 ng/ml en sobrenadantes de cultivo.

Además se ha puesto a punto una técnica de RT-PCR, tras diseño asistido por

ordenador de los "primers" correspondientes, para la detección (y semi-cuantificación)

de la expresión de los genes de IFNγ, IL-1β, IL-10, TNF-α . Con estas técnicas se está

analizando la cinética de expresión de estas citoquinas en diversos tipos celulares y

24

organos tras infecciones experimentales con aislados virulentos de VPPA. (Mientras en

los cerdo contol no se detecta expresión de IFNγ, en los cerdos infectados con VPPA éste

se puede detectar a los 3 días postinoculación en ganglios linfáticos y bazo, alcanzando

un máximo a los 5 días postinoculación y desapareciendo a los 7 días postinoculación,

cuando el animal ha entrado ya en fase terminal. La cinetica de IFNα parece más

temprana, con niveles detectables en bazo e higado desde los primeros días).

25

5.- APLICACION AL SECTOR Y POSIBLE DIFUSION DE RESULTADOS5.- APLICACION AL SECTOR Y POSIBLE DIFUSION DE RESULTADOS

Los reactivos y ensayos desarrollados a lo largo de este proyecto son de gran interés

para estudios de inmmunología porcina, existiendo una importante demanda de los

mismos por laboratorios que trabajan en patología infecciosa del cerdo y en

xenotransplante (utilizando al cerdo como donante de órganos). Varios de los Acmo

frente leucocitos porcinos obtenidos en este proyecto han sido enviados al Second

International swine CD workshop (desarrollado entre 1994-1995, y en el que nuestro

grupo ha participado activamente) para su análisis y validación. Parte de los resultados

obtenidos han sido publicados en revistas cientificas internacionales. Por último, se está

tramitando a través de la OTRI-INIA un convenio con BIOVET-UCO para la

distribución y comercialización de varios de los Acmo frente leucocitos porcinos.

26

6.- COLABORACIONES Y AYUDAS RECIBIDAS O PRESTADAS6.- COLABORACIONES Y AYUDAS RECIBIDAS O PRESTADAS

Ver apartado 7

7.- VINCULACION DEL PROYECTO A PROGRAMAS DE COOPERACION7.- VINCULACION DEL PROYECTO A PROGRAMAS DE COOPERACION

CIENTIFICA Y TECNICA INTERNACIONALCIENTIFICA Y TECNICA INTERNACIONAL

Varios de los Acmo frente leucocitos porcinos obtenidos en este proyecto han sido

enviados al Second International swine CD workshop (desarrollado entre 1994-1995, y

en el que nuestro grupo ha participado activamente) para su análisis y validación.La

organización del Second International swine CD workshop ha sido financiada por el

Comité de Inmunología Veterinaria de la Unión Internacional de Sociedades de

Immunología. Los análisis o estudios realizados han corrido a cargo de los laboratorios

participantes.

Se ha firmado un convenio de cooperación INIA-INRA (PA02,1995-1996) con el

laboratorio del Dr. Bernard Charley (Jouy-en Josas) para el análisis de citoquinas

porcinas en patologías infecciosas (VPPA, TGE) en el que se contempla el intercambio

de técnicas y reactivos. Uno de los becarios adcritos a este proyecto (Manuel Gómez del

Moral) ha realizado una estancia de 2 meses en el mencionado laboratorio y hemos

recibido del mismo muestras de Acmo frente IFNα e IFNγ porcinos para su uso en

ELISA.

27

LEYENDA DE LAS FIGURASLEYENDA DE LAS FIGURAS

Fig. 1 Análisis por citometría de flujo de la reactividad del Acmo 2F4/11 con células

mononucleares de sangre periférica (PBMC), granulocitos polimorfonucleares (PMN),

macrófagos alveolares (MO), eritrocitos (E) y plaquetas. La línea gris corresponde al

control negativo, incubando las células con un Acmo irrelevante.

B) Distribución de las células mononucleares de sangre periférica de acuerdo a los

parámetros de tamaño (FSC) y complejidad (SSC). La región R1 corresponde a

linfocitos y la R2 a monocitos.

Fig. 2 Inmunomarcaje mediante una técnica de immunoperoxidasa indirecta de cortes

de timo (A), ganglio linfático mesentérico (B) e higado (C) con los Acmo 2A10 (A), 4E9

(B) y 1E12 (c). Se puede observar elmacaje de macrófagos en la corteza tímica,

macrófagos de cuerpo tingible en los folículos del ganglio y de las células de Kuppfer en

el higado.

Fig. 3. Análisis por inmunoprecipitación de los antígenos reconocidos por los Acmo

1F12, 2E9, 2F4 y 4B7.

Fig.4. Detección de la expresión de los genes del receptor de células T (TCR) en un clon

de linfocitos T porcino.

Fig.5. Curva patrón de la valoración de la expresión de TNFα por PCR, realizada con

un plásmido que contiene la secuencia de cDNA de dicha citoquina. Sobre la figura se

indican las cantidades de plásmido utilizadas en cada reacción.

Fig. 6. Detección de la expresión de IFNγ por RT-PCR en un ganglio mediastínico de un

cerdo infectado con virus de la Peste porcina africana.

inmunologia porcina:desarrollo de … · el cerdo representa uno de los sectores ganaderos...

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