ingenieria metabolica -agrobiotecnologia-
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Departamento de Fisiología, Biología Molecular y CelularFacultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
AgrobiotecnologíaCurso 2009
Ingeniería metabólicaAlejandro Mentaberry
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
SumarioFactores relevantes en ingeniería metabólica
Modificaciones en las rutas de síntesisde hidratos de carbono
Modificaciones en las rutas de síntesisde ácidos grasos
Referencias
Modificaciones en las rutas de síntesisde aminoácidos
Modificaciones en las rutas de síntesisde hormonas
Modificación genética del metabolismo secundario
Modificaciones en las rutas de síntesis de terpenoides
Modificaciones en las rutas de síntesis de flavonoides y antocianinas
Modificaciones en las rutas de síntesis de alcaloid es
Metabolitos secundarios
Factores relevantesen ingeniería metabólica
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Factores relevantes en ingeniería metabólica
• Conocimiento de las rutas metabólicas involucradas
• Regulación de las enzimas implicadas
• Disponibilidad de sustratos y afinidades enzimática s
• Efectos fisiológicos
• Compartimentalización subcelular de la ruta . metabólica
• Localización de la expresión en determinados . tejidos u órganos
• Regulación de la ruta metabólica durante el desarro llo . y durante el fotoperíodo
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
• Producir más cantidad del producto deseado
- Aumentar el flujo de la ruta biosintética- Inhibir el catabolismo del producto- Aumentar el número de células productoras
• Producir menor cantidad del producto deseado
- Reducir el flujo de la ruta biosintética- Aumentar el catabolismo
• Expresión de nuevos componentes
- Completar rutas metabólicas a partir de precursores de la planta por inserción de genes heterólogos
- Crear nuevas rutas metabólicas mediante inserción de genes heterólogos
Estrategias para modificar el metabolismomediante manipulación genética
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Las técnicas disponibles permiten prolongar (4,5), ramificar (6, 7)y bloquear(8) rutas metabólicas.El flujo metabólico puede también incrementarsepor expresión constitutivade enzimasclaves (1↑)o por neutralizaciónde los mecanismosde retroalimentación por acumulaciónde producto (2*).
GF
A
H B
C
D
E
1, 1↑↑↑↑
2, 2*
4
5
6 7
3
8
Modificaciónde rutasmetabólicas medianteingenieríagenética
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Modificaciones en las rutasde síntesis de hidratos de carbono
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Aplicaciones de la celulosa, el almidón y otros azúcares
Toneladas métricas (millones)
190 (2004)48,5 (2000)135 (2000)
Materias primas
CelulosaAlmidón
Sacarosa
Producción mundial de hidratos de carbono
CELULOSA PAPEL, TEXTILES, FIBRAS QUIMICAMENTE MODIFICADAS, COSMETICOS, EXPLOSIVOS.
ALMIDÓN PAPEL, CARTON, MATERIAL DE CONSTRUCCION, ADHESIVOS, PLASTICOS, LAVANDERIA, COSMETICOS, FARMACOS, BIOCOMBUSTIBLES .
AZÚCARES FARMACOS, TINTURAS, PINTURAS, ADHESIVOS, JABONES, POLVOS PARA LAVAR, PLASTIFICANTES.
PRODUCTO APLICACIÓN
• Cambios de composición
- Alto contenido de almidón
- Almidón con alto y bajo contenido de amilosa
- Almidones con distinto grado de ramificación
- Almidones libres de amilopectina
• Reorientación de las rutas biosintéticas
- Obtención de ciclodextrinas a partir de almidón
- Síntesis de fructanos a partir de sacarosa
- Obtención de azúcares-alcoholes
- Obtención de trehalosa
Posibles modificaciones al metabolismo de hidratos de carbono
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Amilosa: glucano α-1-4. Amilopectina: glucano α-1-4 glucano α-1-6AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa; GBSS: almidón sintetasa unida
al gránulo; SSS: almidón sintetasa soluble; BE: enzima ramificante
Estructura de gránulos de almidón A) maíz, B) papa y C) mandioca.
Tomado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnology, 1993.
Estructuras de los polisacáridos componentes del almidón
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica AA BB CCAA BB CC
Adaptado de: Visser and Jacobs, Trends in Biotechnol ogy, 1993.
Rutas metabólicas de algunos hidratos de carbono
sacarosa
UDP-glucosa
glucosa glucosa-6-P
fructosa
ADP-glucosaglucosa-1-P
amilosa
amilopectina
ADP
AGPasa
SSS
ATP
ADPATP
GBSSPPiATP
SSSBE
8
6
UDP PPi UTP
7
Pi
1
2,3 Pi
2, 3, 4
5
1: invertasa
2: hexoquinasa
3: hexosa-6-fosfatasa
4: glucosa-fosfato isomerasa
5: fosfoglucomutasa
6: sacarosa sintetasa
7: UDP-glucosa pirofosforilasa
8: fosforilasa del almidón
AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa
GBSS: almidón sintetasa unida al gránulo
SSS: almidón sintetasa soluble
BE: enzima ramificante
sacarosa
UDP-glucosa
glucosa glucosa-6-P
fructosa
ADP-glucosaglucosa-1-P
amilosa
amilopectina
ADP
AGPasa
SSS
ATP
ADPATP
GBSSPPiATP
SSSBE
8
6
UDP PPi UTP
7
Pi
1
2,3 Pi
2, 3, 4
5
1: invertasa
2: hexoquinasa
3: hexosa-6-fosfatasa
4: glucosa-fosfato isomerasa
5: fosfoglucomutasa
6: sacarosa sintetasa
7: UDP-glucosa pirofosforilasa
8: fosforilasa del almidón
AGPasa: ADP-glucosa pirofosforilasa
GBSS: almidón sintetasa unida al gránulo
SSS: almidón sintetasa soluble
BE: enzima ramificante
Sobreexpresiónde un gen mutadode ADP-glucosa pirofosforilasade Escherichiacoli en plantasde Solanumtuberosum
• Problema:
− La fructosa 1,6-bifosfato y el Pi actúan como efectores positivo y negativo respectivamente sobre las ADP-glucosa pirofosforilasas vegetales regulando la síntesis de almidón.
• Objetivo:
− Superproducción de almidón.
• Estrategia:
− Clonar el gen glgC16 (ADP-glucosa pirofosforilasa)de Escherichia coli mutada insensible a regulación por Pi.
• Resultados:
− La enzima transgénica se procesa correctamente y es activa en las células vegetales. Se transformó tomate, tabaco y papa vía Agrobacterium tumefaciens.
t-nosglgC16p35S CPT
Tomado de: Stark et al. Science, 1992.
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Contenido de almidón en extractos de callos de tabaco transformadoscon un gen glgC16 de Escherichia coli. Las líneas 1 a 6 expresan el
transgen; la línea 13 corresponde a una planta control no transformada.
* El porcentaje de almidón se calculó a partir de la gravedad específica.
Tomado de: Stark et al. Science, 1992.
Sobreexpresiónde un gen mutadode ADP-glucosa pirofosforilasade Escherichiacoli en plantasde Solanumtuberosum
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Tipode tubérculo
CTP-glg16
Control
% promediode almidón*
15,4
11,4
Líneavegetal
15
21
GravedadEspecífica
1,088
1,068
SD
0,012
0,010
Tipode tubérculo
CTP-glg16
Control
% promediode almidón*
15,4
11,4
Líneavegetal
15
21
GravedadEspecífica
1,088
1,068
SD
0,012
0,010
Porcentaje promedio de almidón en tubérculos de plantas transgénicas y control
Transformación de Solanum tuberosum con un gen antisentido de la enzima ramificante del almidón
• Problema:
- El almidón de alta amilosa tiene gran demanda en la industria por sus . propiedades funcionales. Existen pocos cultivos disp onibles que lo producen.
• Objetivo:
- Producción de almidón con alta amilosa.
• Estrategia:
- Se transformaron plantas de papa con secuencias an tisentido de los genes de las enzimas ramificantes del almidón (genes sbe A y sbe B ) obtenidas de papa.
• Resultados:
- El nivel de amilosa se incrementó. El Pi se increme ntó en más de 5 veces.
Tomado de: Schwall et al. Nature Biotechnology, 2000.
Línea Actividad SBE a Contenido de amilosa a Fósforo(U.g – 1 de peso fresco) (% de almi dón total) ( µµµµg g – 1 de almidón)
Tubérculo Hoja Colorimét rico Potenciométrico
260077,0464,58 ± 1,40,01 ± 0,020,13 ± 0,04208
300080,8462,01 ± 1,40,00 ± 0,030,05 ± 0,02202
260077,4559,37 ± 5,3 0,07 ± 0,070,32 ± 0,18 201
49825,5927,75 ± 1,910,05 ± 0,03 36,38 ± 1,07 Planta control
Línea Actividad SBE a Contenido de amilosa a Fósforo(U.g – 1 de peso fresco) (% de almi dón total) ( µµµµg g – 1 de almidón)
Tubérculo Hoja Colorimét rico Potenciométrico
260077,0464,58 ± 1,40,01 ± 0,020,13 ± 0,04208
300080,8462,01 ± 1,40,00 ± 0,030,05 ± 0,02202
260077,4559,37 ± 5,3 0,07 ± 0,070,32 ± 0,18 201
49825,5927,75 ± 1,910,05 ± 0,03 36,38 ± 1,07 Planta control
Tubérculo Hoja Colorimét rico Potenciométrico
260077,0464,58 ± 1,40,01 ± 0,020,13 ± 0,04208
300080,8462,01 ± 1,40,00 ± 0,030,05 ± 0,02202
260077,4559,37 ± 5,3 0,07 ± 0,070,32 ± 0,18 201
49825,5927,75 ± 1,910,05 ± 0,03 36,38 ± 1,07 Planta control
a La media y el desvío estándar fueron calculados a partir de cuatro muestras.
A Vista de gránulos de una planta control con luz polarizada.B Vista de gránulos de la línea transgénica 208 con luz polarizada.C Tratamiento a 95oC durante 5 minutos y tinción con iodo de almidón
de una planta control.D Tratamiento a 95oC durante 5 minutos y tinción con iodo de almidón
de la línea transgénica 208.
Microscopía de luz de gránulos de almidón
AA
DDCC
BB
Transformaciónde Solanumtuberosumcon un gen antisentido de la enzima ramificantedel almidón
Tomdado de: Schwall G., et al. Nature Biotechnology, 2000.Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Modificaciones en las rutas de síntesis de hidratos de carbono para obtener moléculas de utilidad económica
Tomado de: Goddijn and Pen, Trends in Biotechnology, 1995.
CITOSOLVACUOLA
almidón libre de amilosa
sacarosa
fructanos
ADP-glucosaglucosa-6-fosfato
glucosa-1-fosfato
UDP-glucosa
triosa-fosfato
fructosa-6-fosfato
sacarosa
manitol
pinitol
mio-inositol
GLUCOLISIS
amilosaamilopectina
almidón
ciclodextrinas
hexosa-fosfato
triosa-fosfato
PLASTIDOPi
Pi
CO2
trehalosaCITOSOL
VACUOLA
almidón libre de amilosa
sacarosa
fructanos
ADP-glucosaglucosa-6-fosfato
glucosa-1-fosfato
UDP-glucosa
triosa-fosfato
fructosa-6-fosfato
sacarosa
manitol
pinitol
mio-inositol
GLUCOLISIS
amilosaamilopectina
almidón
ciclodextrinas
hexosa-fosfato
triosa-fosfato
PLASTIDOPi
Pi
CO2
trehalosa
1
2
3
4
5
6
1. Levano sacarasas y fructosil transferasas2. Manitol-1P-deshidrogenasa 3. Mioinositol-O-metil transferasa 4. Trehalosa sintetasa 5. Antisentido de almidon sintetasas6. Ciclodextrin-glicosil transferasas
• Ciclodextrinas
- Oligosacáridos cíclicos α-1,4 compuestos por seis (ciclodextrina α), siete (ciclosdextrina β)u ocho (ciclodextrina γ) unidades piranósicas.
- De estructura cilíndrica. Se usan como portadores de moléculas de interés o para removercompuestos indeseables.
- La expresión de ciclodextrin glicosil transferasa de Klebsiella pneumoniae en amiloplastosde papa permitió obtener ciclodextrinas α y β.
- El nivel de expresión alcanzado es de 0,001-0,01% del contenido total de almidón.
• Fructanos
- La expresión de levano sacarasa de Bacillus subtilis permitió acumular fructanoen tabaco y papa.
- El nivel de expresión alcanzado en tubérculos de papa es de 1-7% del peso secode los microtubérculos y de 1-30% en hojas.
• Alcoholes azúcares
- La expresión del gen de manitol-1-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli en tabaco permitió la síntesis de manitol en hojas y raíces.
- La expresión del gen de myo-inositol O-metil transferasa de Mesembryanthemun crystallinumpermitió la síntesis de pinitol en tabaco.
Otros hidratos de carbono expresados en plantas
Transformación de plantas de Solanum tuberosumcon genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas
• Problema:
- Los fructanos y los levanos se producen en algunos órganos de las plantas y en microrganismos en pequeñas cantidades.
• Objetivo:
- Producción de fructanos y levanos en tubérculos y raíces.
• Estrategia:
- Introducción de genes bacterianos o de hongos en plantas de papa yremolacha.
AIMV cpy sac B o ftf nosAIMV cpy sac B o ftf t-nos35S 35S
35Sl35S: Promotor doble del transcripto de 35S del CaMV; AIMV: enhancer traduccional del virus AlMV;cpy: señal de transporte a vacuola de carboxipeptidasa Y de levadura; sacB: levano sacarasa de Bacillus subtilis;
ftf: fructosiltrasferasa de Streptococcus mutans; nos: terminador de nopalina sintetasa de A. tumefaciens
Tomado de: van der Meer et al. The plant cell, 1994.
Comparación de los niveles de almidón y fructano en microtubérculos de plantas transgénicasy controles
WT1 a WT4: Plantas controles; TP26, TP15, TP25 y TP11: Plantas transformadas con el gen ftf (Streptococcus mutans); KP24, KP1, KP18, KP25, KP29 y KP15: Plantas transformadas con el gen sacB (Bacillus subtilis)
Tomado de :van der Meer et al. The plant cell, 1994.
Transformación de plantas de Solanum tuberosumcon genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas
Contenido de carbohidratos en hojas en diferentes e stadíos de plantas transgénicas y control
El nivel de carbohidratos totales se determinó en hojas jóvenes (y), de edad intermedia (m) y viejas (o; casi senescentes) obtenidas de plantas control (WT) y de la línea KP29 que expresa el gen sacB de Bacillus subtilis
Comparación de los contenidosde almidón y de fructano en hojas.
Comparación de carbohidratos neutrosno estructurales totales (almidón,
glucosa, sacarosa, fructosa y fructano).
Transformación de plantas de Solanum tuberosumcon genes de fructosiltransferasas y levanosacarasas
Tomado de: van der Meer et al., The Plant Cell, 1994.
Transformaciónde Beta vulgariscon el gen 1-sstde la fructosil-transferasa de Helianthustuberosus
Planta joven de remolachano transformada
• El gen de la fructosiltransferasa1-sst de Helianthus tuberosus(Topinambo o Papa de Jerusalem) fue introducido en plantas de Beta vulgaris .
• Esta enzima convierte la sacarosa en una mezcla de fructanos de bajo peso molecular (GF2, GF3 y GF4).
Planta de remolachatransformada con el gen 1-sst
Tomado de: Sevenier et al., Nature Biotechnology, 1998.
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Transformaciónde remolachacon el gen 1-sstde la fructosil-transferasa de Helianthustuberosus
Agrobiotecnología
IngenieríaMetabólica
a) Remolacha no transformada; b) Línea transformadacon el gen 1-sst ; c) Mezcla de 20 mg/mL de glucosa
(G), fructosa (F), sacarosa (S), rafinosa (R), 1-kesto sa (GF2), nistosa (GF3) y fructofuranosil nistosa (GF4)
Cromatografía de intercambio aniónico de altapresión para detectar carbohidratos solubles
Tiempo (min)
Res
pues
ta P
AD
(un
idad
es a
rbitr
aria
s
Extractos de bulbo de raíz
Extractos de hojas
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
Modificaciones en las rutas de síntesisde ácidos grasos
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Tomado de: FAO Cálculos Observatorio Agrocadenas
Producción mundial de los principales aceites y grasas(en miles de toneladas)
Puesto
1
23
4
56
7
89
1011
12
1314
15
1617
18
1920
21
22
Tipo de aceite
Aceite de soja
Aceite de palma Aceite de colza
Aceite de girasol
Manteca y gheeAceite de maní
Aceite de semilla de algodón
Aceite de cocoAceite de almendra de palma
Aceite de oliva virgenAceite y grasas hidrogenadas
Aceite de maíz
Aceite de sésamoAceite de pescado
Aceite de linaza
Aceite de ricinoOtros aceites vegetales
Aceite de oliva residual (orujo)
Manteca de karitéSebo de origen vegetal
Aceite de nueces de tung
Aceite de mostaza
Total
1990
15.386
11.4458.178
5.659
7.7953.838
3.796
3.3591.674
1.5121.940
1.323
6671.289
667
461420
138
145116
76
54
69.936
1994
17.819
14.7239.818
7.525
6.6274.783
3.690
3.0161.996
1.8062.417
1.625
6091.502
686
384454
173
166119
81
51
80.072
1998
23.123
18.30411.538
9.013
6.9315.400
3.620
3.4742.324
2.4002.262
1.911
737878
694
448442
217
176120
80
55
94.147
2002
25.790
25.08412.445
8.178
7.9255.348
4.003
3.5602.890
2.4462.503
2.017
7540
679
525454
217
184125
88
61
105.274
Part (%)
24,13
21,8912,48
8,75
7,325,00
3,78
3,382,70
2,482,37
1,95
0,750,71
0,69
0,500,45
0,21
0,180,12
0,08
0,06
100 %
Puesto
1
23
4
56
7
89
1011
12
1314
15
1617
18
1920
21
22
Tipo de aceite
Aceite de soja
Aceite de palma Aceite de colza
Aceite de girasol
Manteca y gheeAceite de maní
Aceite de semilla de algodón
Aceite de cocoAceite de almendra de palma
Aceite de oliva virgenAceite y grasas hidrogenadas
Aceite de maíz
Aceite de sésamoAceite de pescado
Aceite de linaza
Aceite de ricinoOtros aceites vegetales
Aceite de oliva residual (orujo)
Manteca de karitéSebo de origen vegetal
Aceite de nueces de tung
Aceite de mostaza
Total
1990
15.386
11.4458.178
5.659
7.7953.838
3.796
3.3591.674
1.5121.940
1.323
6671.289
667
461420
138
145116
76
54
69.936
1994
17.819
14.7239.818
7.525
6.6274.783
3.690
3.0161.996
1.8062.417
1.625
6091.502
686
384454
173
166119
81
51
80.072
1998
23.123
18.30411.538
9.013
6.9315.400
3.620
3.4742.324
2.4002.262
1.911
737878
694
448442
217
176120
80
55
94.147
2002
25.790
25.08412.445
8.178
7.9255.348
4.003
3.5602.890
2.4462.503
2.017
7540
679
525454
217
184125
88
61
105.274
Part (%)
24,13
21,8912,48
8,75
7,325,00
3,78
3,382,70
2,482,37
1,95
0,750,71
0,69
0,500,45
0,21
0,180,12
0,08
0,06
100 %
Los símbolos sólidos indican dobles enlaces ( ) y grupos funcionales ( ; hidroxilo). Los círculos indican el largo de la cadena carbonada.
Tipos deácidos grasospresentesen aceites vegetales
Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
22
18
16
14
12
10
erúcico
linolénico
linoleico
ricinoleico
oleico
petroselínico
esteárico
palmítico
mirístico
laurico
cáprico caprílico
8
COOH
1: ∆∆∆∆4-palmitoil-ACP desaturasa
2 y 2’: ββββ-cetoacil-ACP sintetasas
3: acil-ACP tioesterasa
4: ∆∆∆∆9-estearoil-ACP desaturasa
5: oleoil CoA elongasa
6: ∆∆∆∆12-oleoato desaturasa
7: ∆∆∆∆12-oleoato hidrolasa
8: ∆∆∆∆15-linolato desaturasa
9: ∆∆∆∆6-linolato desaturasa
Rutas biosintéticas de ácidos grasos
Adaptado de: Töpfer and Martini W. Agricultural Biotechnology, 1998.
plástidoacetil-CoA + malonil-CoA
C8:0
C12:0
C14:0
C16:0
C10:0
C18:0
∆∆∆∆9C18:1
∆∆∆∆4C18:1∆∆∆∆4C16:1
caprilato
caprato
laurato
miristato
palmitato
ricinoleatolinolatoerucato
petroselinato
oleato
estearato
3
3
3
3
3
3
33
1
2
4
α-linolenato γ-linolenato
CITOPLASMA
5 7
6
98
plástidoacetil-CoA + malonil-CoA
C8:0
C12:0
C14:0
C16:0
C10:0
C18:0
∆∆∆∆9C18:1
∆∆∆∆4C18:1∆∆∆∆4C16:1
caprilato
caprato
laurato
miristato
palmitato
ricinoleatolinolatoerucato
petroselinato
oleato
estearato
3
3
3
3
3
3
33
1
2
4
α-linolenato γ-linolenato
CITOPLASMA
5 7
6
98
2’
Composición de ácidos grasos de los aceites comestibles más comunes
Tomado de: Broun et al., Annu. Rev. Nutr., 1999.
4-110-1,5<2,00~0,318:3
<1,00<1,0<0,10,7-1,420:0
<1,00-0,500020:1
<0,50<0,50~0,222:0
00041-56012:0
0003,2-15010:0
0003,4-1508:0
000<1,206:0
00-0,1000,1-0,217:0
<0,50<0,500,1-0,416:1
7,0-147-17,88,0-194,2-1223,6-30,516:0
<0,10>0,113-230,2-0,1614:0
19-3043,7-78,219-503,4-1233,2-38,618:1
1,4-5,52,2-40,5-4,01,0-4,730,2-36,518:0
0
5-32,3
Oliva
0<0,500 24:0
44-6234-620,9-3,72,2-4,818:2
Soja Maíz Nuez Manteca de cacaoÁcido graso
Composición porcentual
4-110-1,5<2,00~0,318:3
<1,00<1,0<0,10,7-1,420:0
<1,00-0,500020:1
<0,50<0,50~0,222:0
00041-56012:0
0003,2-15010:0
0003,4-1508:0
000<1,206:0
00-0,1000,1-0,217:0
<0,50<0,500,1-0,416:1
7,0-147-17,88,0-194,2-1223,6-30,516:0
<0,10>0,113-230,2-0,1614:0
19-3043,7-78,219-503,4-1233,2-38,618:1
1,4-5,52,2-40,5-4,01,0-4,730,2-36,518:0
0
5-32,3
Oliva
0<0,500 24:0
44-6234-620,9-3,72,2-4,818:2
Soja Maíz Nuez Manteca de cacaoAcido graso
Composición porcentual
C 6:0 caproico; C 8:0 caprílico; C 10:0 cáprico; C 12:0 láurico; C 14:0 mirístico; C 16:0 palmítico; C 16:1 palmitoleico; C17:0 margárico; C 18:0 esteárico; C 18:1 oleico; C 18:2 linoleico;C 18:3 linolénico; C 20:0 araquídico; 20:1 gadoleico; C 22:0 behénico; C24:0 lignocérico
Acidos grasos no comestibles de semillas oleaginosas
Acido graso tipo
Saturado de cadena corta
Monosaturado cadena larga
ω-hidroxilado
Poliinsaturado
Conjugado
Dicarboxílico
Ésteres de ceras
Epoxi
Ejemplo
C12-láurico
C22:1-erúcico
C18:1-OH-ricinoleico
C18:3-α-linolénico
C18:3 conjugado
C6-adípico
C20, C22 éster
C18, C20 epoxi
Fuente real o potencial
cocotero, palma, Cuphea,Umbelliferae
Cruciferae, Meadowfoam,Lunaria
poroto de ricino
semilla de lino, Salvia hispanica
tung, caléndula
Umbelliferae
Jojoba
Vernonia, Crepis palaestina
• Obtención de ácidos grasos saturados
• Obtención de ácidos grasos monosaturados
• Obtención de ácidos grasos de cadena media
• Obtención de ácidos grasos con distintas sustituciones
Modificación del metabolismo lipídico
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
• Problema:
- Los aceites con alto contenido de ácidos grasos saturados como palmítico y esteárico tienen gran demanda industrial. La mayoría de las plantas producen aceites con bajo contenido de ácidos grasos saturados.
• Objetivo:
- Producción de semillas de Brassica napus y Brassica rapa con altos niveles de ácidos grasos saturados.
• Estrategia:
- Introducción de genes antisentido de la estearoil-ACP desaturasa de Brassicarapa.
napin 3´35S npt II tml 3´ napin 5´ anti-desat anti-desatACP 5´ ACP 3´BI BD
Construcción con dos copias en antisentido del gen de la estearoil-ACP desaturasa. napin 5’ y napin 3’: promotor y terminador de napina; ACP 5’ y ACP 3’: promotor y terminador de la proteína transportadora de ácidos grasos.
Tomado de: Knutzon. et al., PNAS, 1992.
Transformación de Brassica con un genantisentido de la estearoil-ACP desaturasa
Composición de ácidos grasos de dos clases de semil las obtenidas de plantas de la línea transgénica 3242-T-1 de Brassica rapa.
Transformación de Brassicacon un gen antisentidode estearoil-ACP desaturasa
Tomado de: Knutzon et al., PNAS, 1992.
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Por
cent
aje
Transformación de Brassica con un gen antisentidode estearoil-ACP desaturasa
Contenido de estearatoy de estearoil-ACP desaturasaen semillas derivadas de la línea transgénica 3242-T-1y de plantas controlde Brassica rapa
Las barras representan el porcentaje de estearato de cada semilla individual. Debajo de los graficos de barras se observan los Western blotscorrespondientes revelados con un anticuerpo contra estearoil-ACP desaturasa.
Tomado de: Knutzon et al., PNAS, 1992.
21161913
3242609031080
4,44,66,76,4
10,612,116,423,5
Transformaciónde Arabidopsis thaliana conel gen de 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellulariacalifornica
• Problema:- Los ácidos grasos saturados de cadena media son utilizados
en la industria cosmética. No se los encuentran en grandes cantidades en semillas de cultivos extensivos.
• Objetivo:- Producción de semillas de Arabidopsis thaliana con altos
niveles de ácidos grasos saturados de cadena media.
• Estrategia:- Se transformó Arabidopsis thaliana con un gen de la 12:0
acil-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica, que interrumpe la elongación para producir ácido láurico .
Planta
21
1619
13
Act. TE /semilla (mU)
324
260903
1080
12:0 /semilla(nmol)
4,4
4,66,7
6,4
12:0 (% molde AG totales)
10,6
12,116,4
23,5
Acumulación de ácido láurico en líneas individuales d e Arabidopsis thaliana transformadas con el gen de la 12:0 acil-ACP-tioeste rasa
Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
- Se observó un alto contenido de ácido láurico con descenso concomitante de algunos ácidos grasos de cadena larga.
Se determinó la composición de ácidos grasos por cromatografía gas-líquido en 100 semillas maduras de cada planta. Barras verdes:
Plantas controles. Barras violetas: Línea transgénica 3828-13.
• Resultados:
Tomado de: Voelker et al., Science, 1992.
Transformaciónde Arabidopsis thaliana conel gen de 12:0 acil-ACP-tioesterasa de Umbellularia californica
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
8:0 C10:0 C12:0 C14:0 C16:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C22:1
Colza [+ a. erúcico] 3 1 17 14 9 50Colza [–a. erúcico] [Canola] 4 2 62 22 10 0ClTEg100 1 3ClTEg200 7 15ChTE 11 27UcTE 50CtTE 25Bc∆∆∆∆9DES 0.7Bc∆∆∆∆9DESas 40Bn∆∆∆∆12DES(fad2)as 83Bn∆∆∆∆12DES(fad2)as X IMC 129 88ScKAS elong X Canola 20
• El aceite producido por Brassica napus posee en un alto contenido de ácido erúcico que no resulta adecuado para uso alimentario.
• Con la inhibición de la expresión de la oleoil-CoA -elongasa se redujo a 0 la cantidad de ácido erúcico, con el consecuente aumento de ácido oleico. El aceite obtenido resulta comestible y fue denominado aceite de canola ( canadian oil ).
Alteraciones porcentuales en el perfil de ácidos grasos de Brassica napus
ClTEg100 y ClTEg200: genes de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea lanceolata; ChTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Cuphea hookeriana; UcTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Umbellularia californica; CtTE: gen de acil-[ACP] tioesterasa de Carthamus tinctorius; Bc∆9DES: gende ∆9 desaturasa de Brassica rapa (campestris); Bc∆9DESas: gen antisentido de ∆9 desaturasa de Brassica rapa; Bn∆12DES(fad2)as: genantisentido de ∆12 desaturasa de Brassica napus; Bn∆12DES(fad2)as x IMC129: planta Bn∆12DES(fad2)as cruzada con el mutante IMC129
de colza; ScKAS elong x Canola: gen de la β-cetoacil-[ACP] sintetasa de la elongasa de Somodnsia chinensis cruzada con Canola
Adaptado de: Töpfer and Martini. Agricultural Biotechnology, 1998.
Modificaciones en las rutasde síntesis de aminoácidos
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
1. Alteración de la regulación de la ruta de síntes is de aminoácidos esenciales.
2. Expresión tejido específica de proteínas con mejor composición aminoacídica.
3. Modificación de la secuencia de proteínasde reserva.
Muchas semillas, frutas o turbérculos que se utilizan para alimentación animal o humana son deficientes en aminoácidos esenciales. En particular, se busca incrementar el contenido de lisina en los cereales y el de metionina en las leguminosas.
Existen diversas estrategias para cambiar la composición aminoacídica :
Posibles estrategiaspara modificar el contenido de aminoácidos esenciales
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Modificación de la biosíntesis de aminoácidos esenciales para eliminar la retroalimentación por acumulación de producto
Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.
aspartatoaspartatokinasa
inhibición por feedback inhibición por
feedback
DHDPS
múltiples pasos enzimáticos
treonina
isoleucina metioninalisina
DHDPS: dihidrodipicolinato sintetasa
aspartatoaspartatokinasa
inhibición por feedback inhibición por
feedback
DHDPS
múltiples pasos enzimáticos
treonina
isoleucina metioninalisina
DHDPS: dihidrodipicolinato sintetasa
aspartatoaspartatokinasa
inhibición por feedback inhibición por
feedback
DHDPS
múltiples pasos enzimáticos
treonina
isoleucina metioninalisina
DHDPS: dihidrodipicolinato sintetasa
La síntesis de lisina, treonina, isoleucina y metio nina ocurre a nivel del cloroplasto
Transformación de soja con los genes DHDPS de Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)
• Problema:
- En soja y en colza el contenido de lisina es del 7,2% y 12%, respectivamente
• Objetivo:
- Incrementar el contenido de lisina en semillas de soja y colza por la introducción de genes de enzimas insensibles a la regulación por lisina.
• Estrategia:
- Utilizar los genes DHDPS de Corynebacterium glutamicum (dapA) y AK mutado de Escherichia coli (lysC) insensibles a regulación.
• Resultados:
- La expresión del gen dapA produce un incremento de lisina libre unas 100 veces mayor en canola y de hasta 25% más en soja. La expresión de ambos genes, aumentó varios cientos de veces los niveles de lisina libre y hasta 5 veces el total de lisina en semillas de soja.
Pv 3´35S gus tnos Pv 5´ Pv 5´ Pv 3´dapActs cts lysC
Tomado de: Falco et al., Biotechnology, 1995.Pv 5’ y Pv 3’: promotor y terminador de faseolinacts: péptido señal de transporte al cloroplasto
Se extrajeron los aminoácidos libres de 10 semillas segregantes R1 para cada línea transgénicay se determinó su composición. Se compara la línea A2396 (barras sólidas) con la línea A2396 (barras vacías). Ambas líneas expresan los dos transgenes. Se indica la determinación de GUS, DHDPS y AK.
Contenido de lisina libre en semillas individuales de soja
Transformación de soja con los genes DHDPS de Corynebacterium (dapA) y AK de Escherichia coli (lysC)
Tomado de: Falco et al., Biotechnology, 1995.
Los nivelesde aminoácidos sulfurados en todas las semillas mencionadas varían entre diferentes variedades;sólo se mencionan las más relevantes en el contextode modificar la composición de proteínas vegetales.
Contenido de metionina de distintas especies y modificación de la composición proteica en cultivos de interés
Tomado de: Tabe and Higgins, Trends in Plant Science, 1998.
No determinada
18
Proteína tipo Proteína Contenido de Conte nido de metionina metionina
( g 100 . g-1 proteína)a (% de residuos )
Proteínas de Proteína de arveja 0,8 semilla Proteína de lupino 0,6 No determinada
Proteína de soja 1,2 No determinada
Proteínas Zeína de maíz de 21 kDa 37 28 ricas en Albumina 2S B. excelsa 23 metionina Albúmina de girasol 20 16
Cultivo Gen introducidoIncrementode proteína
Incrementode metionina
Maíz Zeína rica en medionina de 10 kDa 0,9 % 30 %
Tabaco Albúmina 2S de B. excelsa 8 % 30 %
Canola Albúmina 2S de B. excelsa 4 % 33 %
Soja Albumina 2S de B. excelsa 10 % 50 %
Haba Albumina 2S de B. excelsa 4,8 % 100 %
Lupino Albúmina 2S de H. annus 5 % 100 %
Arveja Albúmina 2S de H. annus 2-5 % -----
Garbanzo Albumina 2S de H. annus 2-5 % -----
Niveles de albúmina 2S acumulados en semillas de canoladeterminados por ELISA a distintos tiempos luego de la floración.
• La albúmina 2S de B. excelsa contiene 18,8 % de metionina
- El gen 2S se expresó bajo un promotor específico de semilla(promotor de faseolina) y se introdujo en plantas de canola vía Agrobacterium.
- Se muestra la acumulación de albúmina 2S durante el desarrollo de las semillas.
- Se extrajeron las proteínas solubles totales a los 19, 22, 26, 29, 32, 36 y 40 días luego de la antésis y se las analizó por PAGE y ELISA.
Transformación de Brassica napus con el gen de la albúmina 2S de Bertholletia excelsa (nuez del Brasil)
% d
e al
bum
ina
2S
de n
uez
del B
rasi
l
Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. La columna pARC12 muestra los datos para una planta control transformada con el vector vacío. Las columnas B10-6 y B13-1 muestran datos de líneas transgénicas que expresan el gen de la albúmina 2S de B. excelsa.
• Las semillas de canola transgénica acumulan 1,7- 4,0 % de albumina 2S de B. excelsa y pueden contener hasta 33 % más metionina que los controles
• Las semillas de tabaco contienen aproximadamente 16 ,5 % más de metionina que los controles
3,52(0,39)
2,94(0,12)
2,64(0,14)
metionina
B13-1B10-6pARC12
3,60(0,23)
Tob
3,54(0,13)
pARC12
4,47(0,31)
3
4,31(0,31)
3,95(0,14)
4,74(0,16)
metionina
673432
Los números entre paréntesis corresponden a las desviaciones estándar. Tob y PARC12 representan proteínas de plantas control (tabaco no transformado o transformado con el vector vacío). Las columnas 3, 32, 34 y 67 corresponden a líneas transgénicas de tabaco que expresan la albúmina 2S de B. excelsa.
Transformación de Brassica napus con el gen de la albúmina 2S de Bertholletia excelsa (Nuez del Brasil)
Transformación de Solanum tuberosum con el gen de laalbúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus
• Problema:
- El valor nutritivo de Solanum tuberosum está limitado por el contenido de aminoácidos sulfurados, lisina y tirosina.
• Objetivo:
- Introducir una proteína con una composición balanceada en términos de aminoácidos esenciales.
• Estrategia:
- Introducir el gen AmA1 de la albúmina de Amaranthus hypocondriacus enSolanum tuberosum. Se expresó el gen en forma constitutiva o tubérculo específica (pSB8 y pSB8G respectivamente).
• Resultados:
- Se observaron incrementos en prácticamente todos los aminoácidos. Las plantas transgénicas contienen más proteína en los tubérculos en comparación con los de las plantas control.
nptII tnospnos AmA135S tnosBD BI
nptII tnospnos AmA1pGBSS tnosBD BI
pSB8
pSB8G
Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.
Composición de aminoácidosde tubérculos de las plantas
transgénicas de papa pSB8G-5 y pSB8-3en comparación con la de las plantas
controles no transformadas.
Transformación de plantas de papaCon el gen AmA1 de Amaranthus hypocondriacus. Características
de los tubérculos de plantas transgénicas (derecha) y controles (izquierda).
El histograma muestra la cantidad de veces en que se incrementó el contenido de cada aminoácido en las plantas transgénicas respecto de los controles.
Transformación de Solanum tuberosum con el gen de laalbúmina AmA1 de semillas de Amaranthus hypocondriacus
Tomado de: Chakraborty et al., PNAS, 2000.
Modificaciones en las rutasde síntesis de hormonas
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.
Modificacionesgenéticaspara controlarla síntesisdel etileno
metionina
S-adenosil metionina
ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico(ACC)
etileno
ACC sintasa
ACC oxidasaACC deaminasa(Pseudomonas spp )
αααα-cetobutirato + NH3
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
Transformación de especies de interés para controlar la síntesis de etileno
• Problema:
- El tiempo requerido para la comercialización de flores y frutos se reduce debido a la producción de etileno que acelera su maduración y/o senescencia.
• Objetivo:
- Inhibir la producción de etileno para retardar la maduración y la senescencia.
• Estrategia:
- Introducir el gen antisentido de la ACC-sintetasa o de la ACC-oxidasa, o el gen de la ACC-deaminasa de Pseudomonas para reducir la síntesis de etileno. Se transformaron melón, tomate, clavel, brócoli y tabaco con dichas construcciones.
• Resultados:
- En melones se obtuvo una inhibición en la producción de etileno. Las plantas controles produjeron hasta un 340% más de etileno que las plantas transgénicas.
tnos35S npt II tnos 35s´ ACC-oxidasa
Tomado de: Stearns and Glick, Biotechnology Advances, 2003.Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
AA
BBBB
Melones obtenidos a partir de plantas transformadas con el gen antisentido de la ACC-oxidasa de manzana (AS1)y control a los15 d postcosecha
A: cortes de melones control y transgénico AS1B: Aspecto externo de melones
control y transgénico AS1
Plantas de claveltransformadas con un gen antisentido de la ACC oxidasa
Planta transgénica (izquierda) Planta control (derecha).
Transformación de especies de interés para controlar la síntesis de etileno
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
A: fruto de planta control mantenida en aire por 60 días. B: fruto de planta transgénica mantenida en aire por 78 días. C: fruto de planta transgénica mantenida en atmósferade 10 ppm de etileno por 78 días. D: frutos de planta no transformada mantenidos en aire. E: frutos de planta transgénica mantenidos en aire. F: frutos de planta transgénica mantenidos en atmósfera de 10 ppm de etileno. G y H: fruto de planta no transformaday de planta transgénica respectivamente mantenidos a 20oC en aire por 138 días.
Genes antisentido de ACC sintetasa
Genes antisentidoACC oxidasa
Expresión de un gen de ACC deaminasa
Distintas vías utilizadas para lograr la inhibición reversible de la maduración de tomate
Tomado de: Theologis, Current Opinion in Biotechnology, 1994.
Transformación de especies de interés para controlar la síntesis de etileno
Agrobiotecnología
Ingenieríametabólica
A CB
FED
HG
• Problema:
- Las flores comienzan su senescencia una vez polinizadas.
• Objetivo:
- Evitar la senescencia por la inducción de síntesis de citoquininas.
• Estrategia:
- La isopentenil transferasa es la enzima limitante en la síntesis decitoquininas. Su sobreexpresión durante la senescencia incrementael nivel de citoquinina y retrasa este proceso.
Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil transferasa bajo un promotor específico de senescencia
tnosiptpSAG12
Tomado de: Chang et al., Plant Physiology, 2003.
Transformación de Petunia hybrida con el gen de isopentenil transferasa bajo un promotor específico de senescencia
• Resultados:- Las líneas transformadas retrasaron su senescencia de las flores
de 6 a 10 días luego de la polización respecto a las controles.
Tomado de: Chang et al., Plant Physiol., 2003.
Flores controles sin transformar
0 24 48 72 96 120Flores psag12-ipt
0 24 48 72 96 120
144 168 192 216 240 264
Flores controles sin transformar
0 24 48 72 96 120Flores psag12-ipt
0 24 48 72 96 120
144 168 192 216 240 264
Metabolitos secundarios
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
La producción de metabolitos secundarios:
- No es necesaria para el crecimiento y desarrollo de la planta per se y no forma parte de las principales estructuras celulares.
- Distribuidos en forma especie-específica.
- Depende de condiciones determinadas .de control hormonal.
- Es paralela al desarrollo de tejidos especializado s .y órganos (raíces, tallos, hojas y glándulas).
- La biosíntesis y acumulación suele estar .. fuertemente compartimentalizada a nivel . intracelular, celular, de tejidos y de órganos.
- La biosí ntesis puede ser inducida por estreses . abióticos ( radiación UV, presión osmó tica, metales . pesados, etc.) bióticos (elicitores microbianos: . oligosacáridos, proteínas, metiljasmonato, etc).
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Los metabolitossecundariosno son esencialesper se paralas funciones vitalesde las plantas
Propiedades biológicas de importancia ecológica
- Protección contra herbívoros y microorganismos:fitoalexinas y fitoanticipinas
- Atracción de polinizadores y animales que dispersan semillas: pigmentos y esencias volátiles
- Agentes alelopáticos: aleloquímicos que influyen en la competencia entre diferentes especiesde plantas
- Estreses abióticos: pigmentos y osmolitos que protegen de la radiación UV, presión osmótica, toxicidad de metales pesados, etc.
Los metabolitossecundariosson necesariospara la supervivenciaen el ecosistema
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
El metabolismo secundario regulamuchas de las relacionesde la planta con el medio circundante
Concepto general
Las plantascomo fuentede metabolitos secundarios de interés comercial
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
• Potencial:
- 75% de las nuevas estructuras químicas descubiertas provienen de las . plantas.
- Sólo se tiene buen conocimiento de 5.000 de las 250.000-300.000 . especies vegetales que se creen existentes en el planeta.
- 25% de los medicamentos de las industrias farmacéuticas son de origen . vegetal.
- 75% de la población mundial utiliza la medicina tradicional que consiste
. principalmente en el uso de extractos provenientes de plantas.
• Metabolitos secundarios de importancia económica:
- Compuestos que determinan la calidad de los alimentos (color, sabor y . aroma).
- Compuestos que determinan la calidad de las plantas ornamentales . (color y aroma).
- Compuestos utilizado en la producción comercial de colorantes, . fragancias e insecticidas.
- Compuestos de uso medicinal con actividad antioxidante y antitumoral.
Ejemplos de terpenoidesproducidosen plantas Se conocen
unos 25.000 terpenoidespresentesen plantas
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
AzadiractinaA ( antinutriente de insectos) αααα-Ecdisona
(disruptor de la muda de insectos)
Ecogenina( aglicona de una saponina;
detergente)
Digitoxigenina( aglicona de digitoxina; tratamiento
de congestiones cardíacas)
Taxol( droga anticancerígena)
Forbol( irritante y co-carcinogénico)
AzadiractinaA ( antinutriente de insectos)
Costunólido( repelente de insectos ;
antinutriente de mamíferos)
Ejemplos de fenólicos derivados de fenilpropanoides
Unos 8.000 fenólicosse forman en las plantas por las rutas del ácido shikímico o del malonato/acetato
Granos de café
Corteza de canela
cinnamaldehido
ácido clorogénico
gingeroles
Rizoma de ginger
Pimiento rojo y negro
piperina
norhidrocapsaicina
capsaicina
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Ejemplos de alcaloides producidos en vegetales
Se han caracterizado unos 12.000 alcaloides en plantas
Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocaína
CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca
Cinchona officinalis
Quinina
Hyoscyamus niger Atropina Rauwolfia serpentina Ajmalina
Cocaína
CafeínaCoffea arabicaErythroxylon coca
Cinchona officinalis
Quinina
Algunas de las medicinas más importantes o sus precursores derivados de plantas y sus ventas en el 2002
Nombre Tipo Origen Uso terapéutico Alcaloides: ventas proyectadas para el 2002: 4045 m illones US$ Hiosciamina, escopolamina
Alcaloides del tropano Solanaceas Anticolinérgicos
Camptotecina Alcaloide indólico Camptotheca acuminata
Antineoplásico
Capsaicina Alcaloide fenilalquilamino Capsicum spp. Analgésico local Codeína, morfina Alcaloide opiáceo Papaver somniferum Analgésico Colchicina Alcaloide isoquinolinico Colchicum autumnale Antigota Galantamina Alcaloide isoquinolinico Leucojum aestivum Inhibidor coliesterasa Pilocarpina Alcaloide imidazólico Pilocarpus jaborandi Colinérgico Nicotina Alcaloide pirrolidínico Nicotiana spp. Terapia antitabaco Quinina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Antimalárico Quinidina Alcaloide quinolínico Cinchona spp. Cardiotónico Reserpina Alcaloide indólico Rauwfolia serpentina Antihipertensivo, psicotrópico Vinblastina, vincristina
Alcaloide indólico Catharanthus roseus Antineoplásico
Yohimbina Alcaloide indólico Apocynaceae, Rubiaceae
Afrodisíaco
Terpenos y esteroides: ventas proyectadas para el 2 002: 12400 millones US$ Artemisinina Lactona sesquiterpénica Artemisia annua Antimalárico Diosgenina, Esteroides Dioscorea spp. Hormonas esteroidales Taxol Diterpenos Taxus brevifolia Glicósidos: ventas proyectadas para el 2002: 9230 m illones US$ Digoxina, digitoxina Glicósidos esteroidales Digitalis spp. Cardiotónico Sennósidos A y B Antracenos Cassia angustifolia Laxante Otros: ventas proyectadas para el 2002: 5014 millon es US$ Ipecac Mezcla de alcaloides de
ipecacuana Cephaelis ipecacuanha
Emético
Podophyllotoxina Lignanos Podophyllum peltatum Antineoplásico
Antitumoral
Manipulación genética del metabolismo secundario
Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
• Se ha estudiado bien el metabolismo secundario de unas pocas plantas; los metabolitos secundarios son especie-específicos.
• Existe un conocimiento limitado de las vías debiosíntesis, tanto a nivel de sus componentes como a nivel regulatorio.
• Se han aislado pocos genes y en muchos casosse desconocen las funciones de las proteínascodificadas por los mismos.
• Existe un riesgo potencial de toxicidad en alimento sasociado con el aumento o producción de nuevosmetabolitos.
• Se requiere conocer el perfil exacto de losmetabolitos (metaboloma) que produce una planta modificada genéticamente. Los métodosde análisis están actualmente en desarrollo.
Limitaciones para la manipulación genética delmetabolismo secundario
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Ingeniería
metabólica
Se requieren conocimientos sobre:
• Intermediarios y productos finales de las rutasbiosintéticas
• Enzimas que regulan las rutas biosintéticas
• Pasos limitantes, enzimas alostéricas, vías competitivas de la ruta biosintética principal
• Compartimentalización subcelular de las rutasbiosintéticas
• Células o tejidos productores específicos
• Rol que cumple el metabolito secundario enla planta
Requerimientos para la manipulación genética delmetabolismo secundario
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metabólica
Factores de transcripción
• Permiten la modificación del metabolismoinduciendo o reprimiendo un subconjuntode genes estructurales dentro de una vía metabólica específica.
Los factoresde transcripción pueden utilizarse como herramientas para la modificacióndel metabolismo secundario
Ejemplos:
• Familias de factores de transcripción R. . y C1 (regulación positiva de la síntesis de . antocianinas en maíz)
• Factores de transcripción de tipo C1 . (regulación negativa de la síntesis de . flavonoides por Myb4 en frutilla)
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metabólica
Ventajas y limitaciones del uso de factores de transcripción:
• Permite la activación o inhibición simultáneade los genes involucrados en una vía metabólica.
• Evita efectos no deseados producidospor la existencia de pasos limitantesen la vía metabólica.
• Permite la modulación del flujo de una ruta metabólica sin un conocimiento profundode los componentes que la conforman.
• Se limita a modificar vías metabólicaspreexistentes sin originar nuevas rutas.
Los factoresde transcripción pueden utilizarse como herramientas para la modificacióndel metabolismo secundario
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metabólica
• Modificación de la síntesis de terpenoides
- Alteración de las fragancias y sabores de los alimentos
- Producción y sobrexpresión de vitaminas- Producción de compuestos farmacológicos
• Modificación de la síntesis de flavonoides
- Producción de compuestos nutracéuticos- Modificación de la coloración floral
• Modificación de la síntesis de alcaloides
- Aumento y producción de compuestosfarmacológicos
- Modificación de la calidad de los alimentos
Blancos de la manipulación genética del metabolismo secundario
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metabólica
Terpenoides
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Terpenoides• Monoterpenos
- Esencias volátiles de flores y frutos- Aceites esenciales de hierbas y especias- Compuestos defensivos
• Sesquiterpenos
- Aceites esenciales de hierbas y especias- Compuestos defensivos- Repelentes de herbívoros
• Diterpenos
- Acidos de resinas coníferas y legumbres- Drogas farmacológicas
• Triterpenos
- Compuestos defensivos- Repelentes de herbívoros- Drogas farmacológicas
• Tetraterpenos
- Carotenoides
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• Problema:Los tomates sin aroma son percibidos por el público como productos de baja calidad. El aroma está determinado por la relación azúcares/ácido cítrico y por unos 400 compuestos volátiles.
• Solución:Aumento del nivel de s-linalol, un alcohol monoterpeno preponderante en el aroma y sabor del tomate.
• Estrategia:Transformación con el gen heterólogo de la s-linalol sintetasa (LIS) de Clarkia breweri bajo la dirección del promotor E8, específico del estadío tardío de maduración del tomate.
Aumentode los nivelesde s-linalolpor modificación de la vía de los monoterpenos
Se transformaron 2 variedades de tomate con poco aroma:UC82B: variedad de tomate para procesadoCB3: variedad de tomate fresco
t-tmlLinalol sintetasa pE8
Se transformaron 2 variedades de tomate con poco aroma:UC82B: variedad de tomate para procesadoCB3: variedad de tomate fresco
t-tmlLinalol sintetasa pE8 t-tmlLinalol sintetasa pE8Agrobiotecnología
Ingeniería
metabólica
Linalol: alcohol monoterpeno acíclico presente en l os tomates frescos que le otorga un aroma dulce y flor al.
Se desvió la vía de los terpenoides que lleva a la formación de carotenoides por sobrexpresión de la linalol sintetasa en
plástidos, lo que lleva a la producción de s-linalol.
Aumentode los nivelesde s-linalolpor modificación de la vía de los monoterpenos
gAgrobiotecnología
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metabólica
La modificación de la vía de los monoterpenos en tomate produce un aumento de los niveles de s-linalol pero no de su enantiómero r-linalol
Presencia de s-linalol y 8-hidroxilinalol en tomates transgénicos maduros
Composición enantiomérica del linalol acumulado en los tomates transgénicos
Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.
• Se observa la producción de s-linalol en las dos variedades de tomates transgénicos; las plantas control no producen este compuesto.
• El nivel de carotenoides y otros terpenoides no se ha modificado sustancialmente.
Líneas
CB3 Transgénica LIS
CB3 Control
UC82B Transgénica LIS
UC82B Control
γγγγ-tocoferol
10,45 (0,31)
11,07 (0,09)
11,83 (0,34)
10,40 (0,98)
αααα-tocoferol
8,49 (0,82)
7,02 (0,09)
7,45 (0,75)
6,40 (1,82)
ββββ-caroteno
5,53 (0,56)
3,00 (0,48)
3,35 (0,60)
4,80 (0,14)
S-linalol
0,31 (0,01)
0,00 (0,00)
0,25 (0,05)
0,00 (0,00)
µµµµg g -1 peso fresco ( ±±±± DE)
Niveles de s-linalol y otros terpenoides en tomates maduros de plantas control y transgénicas para linalol sintetasa
Tomado de: Lewinsohn et al., Plant Physiol., 2001.
Los monoterpenos son los principales componentes del aceite esencial de la familia de la menta (Lamiaceae),
siendo el mentol y la mentona los principales monoterpenos (50 y 10-30%, respectivamente) presentes
en el aceite esencial de Mentha piperita.
Mentha piperita (menta)
Tomado de: Katzer, http://www-ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/generic_frame.html?Ment_pip.html
Modificaciónde la composición del aceite esencial deMentha piperita
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metabólica
• Problemas:La falta de luz, sequedad y altas temperaturas favorecen laproducción y acumulación de los monoterpenos mentofuranoy pulegona en el aceite esencial de menta. Estos componentes disminuyen el aroma y gusto de la menta.
• Solución:Disminuir la acumulación de metabolitos indeseables comomentofurano, y maximizar la producción de mentol.
• Estrategia:- Sobrexpresión de la enzima 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR).
- Supresión de la expresión de la enzima mentofurano sintetasa (MFS) por expresión transcriptos antisentido del del gen de MFS.
Tomado de: Katzer, http://www-ang.kfunigraz.ac.at/~katzer/engl/generic_frame.html?Ment_pip.html
Modificaciónde la composición del aceite esencial deMentha piperita
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metabólica
Desregulación de la síntesis de monoterpenos para modificar la composición de aceites esenciales de Menta piperita
DXR: 1-deoxi-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasaMFS: mentofurano sintetasa
Niveles de ARNm de 1-deoxixilulosa-5-fosfato reductoisomerasa en plantas transgénicas y control
Hojas inmaduras Hojas maduras
De las plantas transgénicas, la mayoría presentó un fenotipo normal, y algunas presentaron una pigmentación anormal (sugiriendo inhibición de la síntesis de clorofila) y en mosaico. La utilización de un promotor constitutivo permitió la expresión del gen dxr en hojas jóvenes y maduras de plantas transgénicas. Por el contrario, en las
hojas maduras de plantas no transformadas la expresión de este gen se encuentra normalmente reprimida.
Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2001.
• En las plantas DXR, la producción total del aceite esencial se incrementó en un 50% y se observó un aumento en los niveles de mentol.
• En las plantas MFS, la producción total del aceite esencial fue similar a la de las plantas control. Los niveles de mentofurano y pulegona disminuyeron y los de mentol aumentaron.
Modificado de: Mahmoud et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 98: 8915-8920, 2001.
Composición de aceites esenciales en plantas transgénicas y control de Menta piperita
DXRSENTIDO
MFSANTISENTIDO
Porcentaje
Planta
Salvaje
DXR6
DXR32
DXR46
MFS1
MFS3
MFS7
Mentona
45,9
45,0
46,1
45,3
35,0
63,7
53,5
Pulegona
8,0
6,1
5,7
1,7
0,2
0,7
0,8
Mentofurano
16,8
15,7
12,5
5,1
2,5
2,5
2,5
Mentol
6,9
12,7
13,9
27,0
23,1
12,7
19,5
Porcentaje
Planta
Salvaje
DXR6
DXR32
DXR46
MFS1
MFS3
MFS7
Mentona
45,9
45,0
46,1
45,3
35,0
63,7
53,5
Pulegona
8,0
6,1
5,7
1,7
0,2
0,7
0,8
Mentofurano
16,8
15,7
12,5
5,1
2,5
2,5
2,5
Mentol
6,9
12,7
13,9
27,0
23,1
12,7
19,5
Planta
Salvaje
DXR6
DXR32
DXR46
MFS1
MFS3
MFS7
PlantaPlanta
SalvajeSalvaje
DXR6DXR6
DXR32DXR32
DXR46DXR46
MFS1MFS1
MFS3MFS3
MFS7MFS7
Mentona
45,9
45,0
46,1
45,3
35,0
63,7
53,5
MentonaMentona
45,945,9
45,045,0
46,146,1
45,345,3
35,035,0
63,763,7
53,553,5
Pulegona
8,0
6,1
5,7
1,7
0,2
0,7
0,8
PulegonaPulegona
8,08,0
6,16,1
5,75,7
1,71,7
0,20,2
0,70,7
0,80,8
Mentofurano
16,8
15,7
12,5
5,1
2,5
2,5
2,5
MentofuranoMentofurano
16,816,8
15,715,7
12,512,5
5,15,1
2,52,5
2,52,5
2,52,5
Mentol
6,9
12,7
13,9
27,0
23,1
12,7
19,5
MentolMentol
6,96,9
12,712,7
13,913,9
27,027,0
23,123,1
12,712,7
19,519,5
• Hierba aromática utilizada en la medicina tradicional china para el tratamiento de la fiebre.
• Unica fuente de artemisina, sesquiterpenocon actividad contra Plasmodium falciparum, parásito que es el agente causal de la malaria.
Artemisia annua L.Expresióndel gende la farnesil difosfato sintetasaen Artemisia annua L.
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metabólica
Problema:
Aparición de cepas de Plasmodium falciparumresistentes a las tradicionales drogas antimaláricas
Objetivo:
Desarrollo de fuentes alternativas de drogasantimaláricas
Solución:
Obtención de plantas transgénicas de Artemisia annua L. que expresen altos niveles de artemisina.
Estrategia:
Sobrexpresión de la enzima farnesil difosfato sintetasa (FDS) de Gossipium arboreum en plantas de Artemisia annua L.
Expresióndel gende la farnesil difosfato sintetasaen Artemisia annua L.
t-nosFarnesil difosfato sintetasa35S CaMV
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Tomado de: Chen et al., Plant Science, 2000.
Transgénica Control
Se observa un aumento de 2-3 veces de artemisina en plantas transgénicas.
Expresióndel gende la farnesil difosfato sintetasaen Artemisia annua L.
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Problema:
• Las deficiencias en distintas vitaminas afectan a muchos millones de personas que se alimentancon dietas restringidas.
• Particularmente, la carencia de vitamina A,cuyo precursor es el β-caroteno, causa ceguera, xeroftalmia y muerte prematura.
• Se estima que 124 millones de niños padecen estadeficiencia a escala mundial y sólo en el sudeste asiático 250.000 niños quedan ciegos cada año por esta causa.
Expresión y sobreproducción de provitamina Aen plantas de Oryza sativa
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Solución:
• En términos generales, muchos cultivos alimentarios podrían ser suplementados con vitaminas, lo quepermitiría cubrir fácilmente los requerimientosalimentarios mínimos.
• Una posible solución es sobrexpresar pro-vitamina Aen alimentos básicos de las poblaciones carenciadas,tales como el arroz.
• En el caso de la vitamina A, la administración de su precursor, el β-caroteno (pro-vitamina A) tieneventajas sobre el producto final porque puede acumularse en el organismo sin efectos nocivos.
• Las rutas de síntesis de vitaminas pueden ser introducidas en las especies que no las poseenen la medida en que se conozcan bien las enzimas participantes.
Expresión y sobreproducción de provitamina Aen plantas de Oryza sativa
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Estrategia:
• El arroz produce geranil-geranil difosfato, precursor de los β-carotenos, pero carecede las enzimas correspondientesa esta ruta biosintética.
• Se sobrexpresaron enzimas que completan la vía biosintética del β-caroteno que no están presentes en arroz.
• Para producir la pro-vitamina A en arroz,la planta fue transformada con los genes de fitoeno desaturasa de Erwinia uredovora y de fitoeno sintetasa y licopeno ciclasa de Narcissus pseudonarcissus
La ruta de síntesis de β-caroteno fue introducida en arroz por transformación con genes heterólogos
t-nosFitoeno desaturasaCaMV35S t-nosFitoeno desaturasaCaMV35S
t-nosFitoeno sintetasaglutelina t-nosFitoeno sintetasaglutelina
t-nosLicopeno ciclasaCaMV35S t-nosLicopeno ciclasaCaMV35S
Desarrollo de líneas de “Golden Rice” que cumplan con las regulaciones para consumo humano
Análisis de carotenoides en semillas T1 control y transgénicas
pmi: fosfomanosa isomerasapsy: fitoeno sintetasa, crtl: fitoeno desaturasa bacterianaSSU-ps: péptido señal de la subunidad menor de la RUBISCO
-1: promotor de glutelina
35Spmi psy crtlGt-1 35S ps
pmi: fosfomanosa isomerasapsySSU-ps: péptido señal de la subunidad menor de la RUBISCO35S: promotor de 35S del CaMV; Gt-
35Spmi psy crtlGt-1 35S psps
Tomado de: Hoa et al., Plant Physiology, 2003.
IR 64 control (A) y transgénicas (B a F)
Taipei 309 control (G) y transgénicas (H)Taipei 309 control (G) y transgénicas (H)
BA
C D
FE
G H
Flavonoides
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metabólica
Flavonoides• Los flavonoides son un grupo diverso formado
por compuestos polifenólicos de bajo peso molecular .
• Se producen principalmente en la epidermis de las hojas, frutos, semillas y flores.
• En las plantas cumplen diversas funciones:
- Protección contra luz UV (pigmentos UV-B)- Atracción de polinizadores- Defensa contra patógenos (fitoalexinas) o plagas
(compuestos antinutricionales)- Activadores de los genes de nodulación- Fertilidad y germinación del polen
• Son importantes componentes de la dieta debidoa sus efectos benéficos en la salud humana y animal :
- Antioxidantes (quercetina y epicatequina)- Antitumorales (genisteína)- Antiarterioescleróticos- Antiinflamatorios
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Biosíntesis de flavonoides
Los flavonoides se clasifican en cinco grupos según su estructura central (aglicona)
Estructuras de las antocianinas
Pelargonidina
Delphinium
DelfinidinaCianidina
Pelargonium Rosa
• La producción de flores de corte se ha convertido en una industria en el siglo XX y la floricultura continúa en expansión.
• Se han obtenido variedades con características deseables, tales como color, forma, arquitectura floral, vida en el vaso y resistencia a patógenos por mejoramiento clásico. Un obstáculo de este proceso es el reservorio genético limitado existente para cada especie individual.
• Se pueden alterar los caracteres agronómicosy ornamentales si se conocen los genes apropiados y si existen métodos de transformación para estas especies.
• Una vez obtenidas las variedades transgénicas,su viabilidad comercial depende de la estabilidady mantenimiento en el tiempo del fenotipo modificad o.
Modificación genética del color en flores
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metabólica
Modificaciónde la coloraciónfloral en petuniapor expresióndel gen de la dihidroflavonol-4-reductasa (dfr)
Cultivar transgénico queexpresa el gen dfr de maíz
Tomado de: Mol et al., Tredns in Biotechnology,1995.
La expresión del gen de dihidroflavonol-4-
reductasa ( dfr) de maíz en una línea de petunia
que acumula dihidrokemferol debido a dos mutaciones en los
genes de flavonol3’ hidroxilasa ( f3’h) y
flavonol 3’-5’ hidroxilasa(f3’5’) induce la síntesis
del pigmento pelargonidina,
de color ladrillo.
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• En los 90, los investigadores de la compañía austra liana Florigene clonaron los genes de dos enzimas de petu nia que producen el pigmento azul delfidinidina: la fla vonoide 3’5’ hidroxilasa (F3’5’H) y la dihidroflavonol reduc tasa (DRF).
pH vacuolar alcalino Delfinidina = azul
pH vacuolar ácido Delfinidina = rosa
• Obtuvieron rosas transgénicas estables pero las flo res no eran azules debido al pH vacuolar ácido de la rosa.
• Finalmente, la compañía logró transformar claveles ( Dianthuscarophyllus ) obteniendo seis variedades comerciales de claveles transgénicos que van desde el lila hasta e l violeta.
La rosa azul: una promesapendiente de la biotecnología de plantas ornamentales
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metabólica
Los flavonoides se clasifican en cinco grupos según su estructura central (aglicona)
Biosíntesis de flavonoles y antocianinas
Claveles transgénicos con diferentes coloraciones d e azul comercializados por Florigene
Transformación de Dianthus carophyllus con los genes flavonoide3’5’ hidroxilasa y dihidroflavonol reductasa de Petunia hybrida
• Objetivo:
Mejorar la capacidad nutritiva del fruto del tomateaumentando los niveles de flavonoles en su pulpa
• Estrategia:
Activación de la vía de síntesis de los flavonoides por expresión de los factores de transcripción C1 (familia
. MYB) y L1 (familia MYC) de maíz en fruto de tomate.
Incremento del nivel de flavonoles en tomate porsobrexpresión de factores de transcripción
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Ingeniería
metabólica
Pe8: promotor E8 de tomatePds35S: promotor 35S CaMV dobleTrbc: terminador transcripción subunidad menor de rubiscoTnos: terminador transcripción de nopalina sintetasa de Agrobacterium
Pe8: promotor E8 de tomatePds35S: promotor 35S CaMV dobleTrbc: terminador transcripción subunidad menor de rubiscoTnos: terminador transcripción de nopalina sintetasa de Agrobacterium
L1
L1
L1
El uso de dos factores de transcripción permite la activación simultánea de la vía de síntesis de flavonoles en tomate
Líneas transgénicas(No de serie)
100200
25003000500
Transgén
35SC1E8LC35SC1/E8LCE8C1/E8LC
Producción de flavonoidesen pulpa de tomate
--++
• Ambos factores de transcripción son requeridos para activar la vía de síntesis de flavonoides en la pulpa de tomate.
• Se observa un aumento de la actividad antioxidante de los tomates transgénicos 35SC1/E8LC debido a la acumulación de los flavonoles kemferoly naringenina. Se obtuvieron resultados
similares con la construcción E8SC1/E8LC
Tomado de: Bovy et al., Plant Cell, 2002.
35SC1/E8LC
cont
rol
Alcaloides
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• Existe un gran interés comercial en incrementarel contenido de ciertos metabolitos secundariosde uso medicinal en las plantas que los producen.
• El alcaloide del tropano escopolamina es un important e anticolinérgico presente en varias plantas Solanácea s.
• Atropa belladona produce altos niveles hiosciaminay muy poca escopolamina.
• La enzima que realiza la conversión entre estos dos compuestos (hiosciamina 6 ββββ-hidroxilasa) fue aislada de Hioscyamus niger.
Modificaciónde la síntesis de alcaloidesen Atropa belladona
Hiosciamina 6 β-Hidroxihiosciamina Escopolamina
Hiosciamina6 β-hidroxilasa
H6H
Hiosciamina6 β-hidroxilasa
H6H
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• Estrategia:
Transformación de Atropa belladona con el genque codifica la enzima hiosciamina hidroxilasa (H6H)de Hyosciamus niger bajo la regulación del promotor constituvo 35S de CaMV.
t-nosH6H Hyosciamus niger 35S CaMV
Modificaciónde la síntesis de alcaloidesen Atropabelladona
• Objetivo:
Aumentar la expresión de escopolamina, importante droga anticolinérgica, en Atropa belladona.
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Modificación de la síntesis de alcaloides en Atropa belladona
• Más del 92% del total de los alcaloides presentes en hojas, tallos y raíces principalesde las plantas control es hiosciamina.
• Las plantas transgénicas T0 y T1 expresaron casi exclusivamente escopolaminaen las partes aéreas. En las raíces la conversión a escopolamina no fue tan eficiente.
Tomado de: Yun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992.
• Problema:
- Existe una creciente demanda de café descafeinado debido a los efectos adversos que la cafeína produce en personas sensibles.
- La obtención de café descafeinadopor métodos industriales es caray el café pierde sabor.
Desarrollode plantasde café con bajo nivelde cafeína
• Objetivo:
- Obtención de plantas de café (Coffea canephora)que produzcan menos cafeína
• Estrategia:
- Disminución de la expresión de la enzima teobromina sintetasa por ARN de interferencia. La secuencia 3´ no codificante del gen CaMXMT1 se utilizó para diseñar fragmentos cortos y largos de ARNi.
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En la biosíntesis de la cafeína están involucradas tres N-metiltransferasas:
- CaXMT1 teobromina sintetasa- CaMXMT1 teobromina sintetasa- CaDXMT1 cafeína sintetasa
• Se obtuvo una reducción de hastaun 70% en los niveles de cafeína.
Salvaje ARN-S
Desarrollo de plantas de café con bajo nivel de cafeína
Tomado de: Ogita et al., Nature, 2003.
reducción de teobromina del 30-80%
reducción de cafeína del
50-70%
Conclusionesy perspectivas • La sobrexpresión de uno o mas genes de una vía metabólica
puede resultar en un aumento en la producciónde un determinado metabolito.
• En otros casos, dicha sobrexpresión resulta en la acumulaciónde compuestos no deseados o inhibe la acumulación delcompuesto que se desea sobrexpresar.
• Se requiere una mejor caracterización de las enzimas que intervienen en las rutas del metabolismo secundario:especificidad, cofactores requeridos, regulación, control porretroalimentación de producto.
• La inducción de toda una ruta metabólica por sobrexpresiónde factores de transcripción ha demostrado ser eficientey marca una tendencia en el futuro de la ingeniería metabólica.
• Los conocimientos adquiridos en el futuro permitirán establecermodelos de flujo metabólico en plantas superiores similares a los desarrollados en el caso de los microorganismos.
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Ingeniería
metabólica
Referencias 1. Stearns, J.C. and Glick, B.R. Transgenic plants with altered ethylene biosynthesis or perception. Biotechnology Advances, 21:193-210, 2003.
2. Drexler, H., Spiekermann, P., Meyer, A., Domergue, F., Zank, T., Sperling, P., Abbadi, A., and Heinz, E. Metabolic engineering of fatty acids for breeding of newoilseed crops: strategies, problems and first results. Journal of Plant Physiology, 160:779-802, 2003.
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10. Mol, J., Cornish, E., Mason, J. and Koes, R. Novel coloured flowers. Current Opinion in Biotechnology, 10:198-201, 1999.Agrobiotecnología
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