INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE INFRAČERVENÁ A RAMANOVA SPEKTROSKOPIE

aneb aneb

CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI CO NÁM MOHOU VIBRACE ŘÍCI

O (BIO)MOLEKULÁCHO (BIO)MOLEKULÁCH

Vladimír BaumrukVladimír Baumruk

Univerzita Karlova v PrazeUniverzita Karlova v PrazeMatematicMatematickko-fyzikální fakultao-fyzikální fakulta

Fyzikální ústav UKFyzikální ústav UK

vibrační spektroskopievibrační spektroskopie infračervená spektroskopie (IČ)infračervená spektroskopie (IČ)

Ramanova spektroskopie (RS)Ramanova spektroskopie (RS)

MetodyMetody

2

COCO22 - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie

nn = 3 = 3 33nn – 5 = 4 – 5 = 4 2 valenční vibrace2 valenční vibrace nesymetrickánesymetrická aktivní v IČaktivní v IČ symetrickásymetrická aktivní v RSaktivní v RS

2 deformační vibrace (degenerované)2 deformační vibrace (degenerované) aktivní v IČaktivní v IČ

středstřed symetr symetrieie alternativní zákazalternativní zákaz

vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramanakomplementarita IČ a Ramana))

frefrekvencekvence vibra vibracece

f f – – silová konstantasilová konstanta ( (síla vazbysíla vazby)) – – reduredukovanákovaná hmotnosthmotnost

VibrVibrační spektroskopie – principační spektroskopie – princip

3

COCO22 - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie - lineární molekula (O=C=O) se středem symetrie

nn = 3 = 3 33nn – 5 = 4 – 5 = 4 2 valenční vibrace2 valenční vibrace nesymetrickánesymetrická aktivní v IČaktivní v IČ symetrickásymetrická aktivní v RSaktivní v RS

2 deformační vibrace (degenerované)2 deformační vibrace (degenerované) aktivní v IČaktivní v IČ

středstřed symetr symetrieie alternativní zákazalternativní zákaz

vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní vibrace aktivní v IČ spektru nejsou aktivní v Ramanově spektru a vice versa (tedy v Ramanově spektru a vice versa (tedy komplementarita IČ a Ramanakomplementarita IČ a Ramana))

frefrekvencekvence vibra vibracece

f f – – silová konstantasilová konstanta ( (síla vazbysíla vazby)) – – reduredukovanákovaná hmotnosthmotnost

VibrVibrační spektroskopie – principační spektroskopie – princip

4

h h E ER 0 2 1( )

VibrVibrační spektroskopie – principační spektroskopie – princip

vibrace aktivní v IČ spektru (změna dipólového momentu)

vibrace aktivní v Ramanově spektru (změna polarizovatelnosti)

Ramanův posuv vib = 0-R

5

VibrVibrační spektroskopie – spektraační spektroskopie – spektra

Infračervené absorpční a Ramanovo spektrum kyseliny benzoové

inte

nzita

roz

ptyl

u

prop

ustn

ost

(%)

IČIČ

RamanRaman

vlnočet (cm-1)

daleká daleká IČIČ

(FIR)(FIR)

6

1 460 cm-1

plně symetrická

2 214 cm-1

2x degenerovaná

3 780 cm-1

3x degenerovaná

4 313 cm-1

3x degenerovaná

polarizované spektrum

depolarizované spektrum

Jednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CClJednoduché molekuly – symetrie a vibrace (příklad CCl44))

infračervená absorpce

-1vlnočet (cm )

7

Detailní pohled naDetailní pohled na pás v Ramanově spektru CClpás v Ramanově spektru CCl44

Izotopické štěpení díky existenci dvou stabilních izotopů 35Cl a 37Cl(jednotlivé komponenty odpovídají různému zastoupení těchto dvou izotopů v molekule CCl4)

C 35Cl337Cl

C 35Cl4C

35Cl237Cl2

C 35Cl 37Cl3

1 - symetrická valenční vibrace

vlnočet (cm-1)

8

Vyzařování oscilujícího dipóluVyzařování oscilujícího dipólu

Úhlové rozdělení amplitudy E (---) a zářivosti I ( ) oscilujícího elektrického dipólu.

Oscilující elektrický dipól

směršíření

9

RozptylRozptyl

(a) (b)

Rozptyl lineárně polarizovaného světla molekulouRozptyl lineárně polarizovaného světla molekulou

10

RozptylRozptyl

Rozptyl nepolarizovaného světla molekulouRozptyl nepolarizovaného světla molekulou

11

12

Polarizovaný Ramanův rozptylPolarizovaný Ramanův rozptyl

Měření polarizovaných Ramanových spekter v pravoúhlé geometrii experimentuMěření polarizovaných Ramanových spekter v pravoúhlé geometrii experimentu

E �

2

22

3

45 4

I

I

Depolarizační poměrDepolarizační poměr tenzor polarizovatelnosti

2

1

313

2

izotropní invariant

anizotropní invariant

vlnoèet (cm-1)

200 400 600 800 1000

inte

nzi

ta r

op

ztyl

u

polarizované kolmopolarizované rovnobì žnì

217 31

4

461

760

788

= 0,75

= 0,006

2245 7totI I I

Totální spektrum

x

y

z

excitace

rozptyl

y

x

z

excitace

rozptyl

z

x

y

excitace

rozptyl

y

x

z

excitace

rozptyl

x

z

y

excitace

rozptyl

z

y

x

excitace

rozptyl

Polarizovaná Ramanova Polarizovaná Ramanova spektra orthorombického spektra orthorombického monokrystalumonokrystalu

T=300KT=300Koblast vnitro-oblast vnitro-molekulárních molekulárních vibracívibrací

monokrystal monokrystal síranu adeninusíranu adeninu

x(yz)y

y(xz)x

z(xy)x

y(zz)x

x(yy)z

z(xx)y

Portova notacePortova notace

x(yy)z

13

x

z

y

excitace

rozptyl

x

z

y

excitace

rozptyl

z

y

x

excitace

rozptyl

z

y

x

excitace

rozptyl

x

z

y

excitace

rozptyl

Polarizovaná Ramanova Polarizovaná Ramanova spektra orthorombického spektra orthorombického monokrystalumonokrystalu

T=10KT=10Knízkofrekvenční oblastnízkofrekvenční oblast(mezimolekulární (mezimolekulární vibrace)vibrace)

x(zx)z

x(zx+zy)z

z(yx+yz)y

x(zy)z

z(zy)y

bez analyzátoru

bez analyzátoru

14

monokrystal síranu adeninumonokrystal síranu adeninu

15

16

Tsu et al. Appl. Phys. Lett. 40, 534 (1982)

1

0.88

p p aI I I

y

y

Dvoufázový systém - mikrokrystalický křemík v amorfní matrici

pás amorfní komponenty

pás polykrystalické komponenty

17

strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice)nachází využití například v proteomice)

neomezuje se pouze na statický obrázekneomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií)možnost dynamických studií)

velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně)

je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturoustrukturou aa funkcí biomolekulfunkcí biomolekul

Proč vibrační spektroskopieProč vibrační spektroskopie ? ?

18

Výhody vibračníVýhody vibrační spektroskopiespektroskopie

RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření).

Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku.

Nenáročné na objem vzorku (cca 10 ml pro konvenční RS, 20 ml pro IČ).

Rychlá časová škála absorpce i rozptylu ( 10-15 s) - využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR.

Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).

19

Specifické výhody Ramanovy spektroskopieSpecifické výhody Ramanovy spektroskopie

Voda představuje ideální rozpouštědlo pro Ramanovu spektroskopii

(na rozdíl od IČ).

Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly).

Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1, daleká IČ oblast) v jediném experimentu se základní oblastí

Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev).

Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS) (design SERS aktivního povrchu spadá do oblasti nanotechnologií)

20

Nevýhody vibrační spektroskopieNevýhody vibrační spektroskopie

Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací.

Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku ( 10-100 g/l) byť v malých objemech.

Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii

(na rozdíl od Ramanova rozptylu).

Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).

21