UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMONFACULTAD: CIENCIAS Y TECNOLOGIACARRERA: INGENIERIA DE ALIMENTOS

MATERIA : LABORATORIO DE ANALISIS DE ALIMETOSDOCENTE : GIANNINI ZALLOCCO MARIA ESTHERESTUDIANTE: JHOANA QUINO CHOQUEGRUPO : 3FECHA : 20/ IV / 09

COCHABAMBA - BOLIVIADETERMINACIÓN DE AZUCARES TOTALES Y REDUCTORES

1. INTRODUCCION:

En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas gomas.

Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el jugo celular; los almidones son los carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural y las gomas son productos de desecho. Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por los polisacáridos estructurales.

Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica, ya que durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos preferidos para la biosíntesis y suministro de energía pues son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando lugar a la formación de CO2, H2O y ENERGÍA la cual queda disponible para la biosíntesis de otros componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos azucarados, glucósidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de azúcares aumenta casi invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos, aunque algunos azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria.

2. OBJETIVOS:

Determinar el contenido de azúcar total y azúcar reductor en una muestra de

mermelada

Realizar las curvas de calibración Realizar los cálculos pertinentes de la práctica de acuerdo al método

3. FUNDAMENTO TEORICO:

Mono- y OligosacáridosDada la importancia de estos compuestos se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio

Como ya se mencionó los oligosacáridos son polímeros de bajo peso molecular, que cuando se hidrolizan producen hasta un máximo de 10 monosacáridos. Debido a que los oligosacáridos están formados por unidades de monosacáridos unidos por enlaces glicosídicos, reaccionan de igual forma que dichos monosacáridos.

Los oligosacáridos de importancia en análisis de alimentos son aquéllos que sólo contienen combinaciones de D-glucosa, D-fructosa y D-galactosa. Dependiendo del número de unidades de monosacáridos se clasifican como di-, tri-, tetra- y pentasacáridos.

Los monosacáridos generalmente son los responsables del sabor dulce, son solubles en agua y pueden estar cristalizados. Estructuralmente hablando pueden considerarse como aldehídos alifáticos ó alcoholes cetonas, conteniendo un grupo carbonilo y uno ó mas grupos alcohol, siendo los centros químicos reactivos estos grupos alcohol y carbonilo. La propiedad más comúnmente usada, para estudiar a los monosacáridos, es su habilidad para oxidarse en soluciones alcalinas. Para la identificación y cuantificación de los oligo- y monosacáridos primero se deben extraer y clarificar.

Extracción de Carbohidratos SolublesLa función de este paso es la de separar a los mono- y oligosacáridos de polisacáridos, lípidos, algunos colorantes y proteínas. Para esto se remueve primero cualquier material extraño, después se mezcla la muestra con etanol al 80% y carbonato de calcio, se calienta en baño de agua por 30 min, se filtra y se repite la extracción sí el filtrado presenta color. La adición del carbonato de calcio es para neutralizar el extracto y así evitar la hidrólisis (inversión) de sacarosa por ácidos orgánicos a temperaturas altas. Esta adición no se recomienda si el extracto contiene cantidades altas de azúcares reductores. Por otro lado se recomienda la extracción alcohólica para evitar la hidrólisis de oligosacáridos por acción enzimática. Para determinar la cantidad de alcohol a utilizar se considera la cantidad de agua que contiene la muestra para ajustar la concentración del alcohol al 80%.

También se pueden obtener los extractos utilizando agua caliente para solubilizar azúcares como es el caso de mieles, jarabes y mermeladas.

Clarificación de Soluciones AzucaradasLos extractos acuosos y alcohólicos de tejidos vegetales y animales no son adecuados para utilizarlos en el análisis de azúcares debido a que contienen, además de los azúcares solubles, sustancias que interferirán con los análisis, como son: compuestos nitrogenados, lípidos, constituyentes fenólicos y pigmentos solubles en los solventes utilizados. Estos pueden interferir en la filtración o participar en las reacciones químicas o mediciones físicas usadas en la determinación de azúcares. Antes de la determinación de azúcares, esas sustancias y el alcohol presente deben removerse, a menos que no interfieran. El alcohol se remueve por evaporación a baja temperatura, preferiblemente bajo vacío, para evitar la descomposición de azúcares con el calentamiento. La clorofila, pigmentos carotenoides y lípidos se remueven por extracción con éter de petróleo en el cual son insolubles los azúcares. Las proteínas se separan por precipitación con ácido fosfotúngstico, nitrato mercúrico u otro precipitante adecuado. Después de la remoción de las sustancias solubles en éter, el residuo se disuelve en agua y las otras sustancias interferentes se remueven por otros tratamientos. El grado y tipo de tratamiento que se requiera dependerá de la naturaleza de las sustancias interferentes presentes, el tipo de muestra y del método que se utilizará en la determinación de azúcares, particularmente de su sensibilidad a los constituyentes no azucarados de los alimentos.

La concentración de los constituyentes no azucarados con relación a la cantidad de azúcar presente es otro factor. Cuando se analizan extractos relativamente ricos en azúcares por microprocedimientos en los cuales se usan 1-3 mg de azúcar reductor, la dilución utilizada es tan grande que no es necesaria ni la remoción del alcohol ni la de las sustancias reductoras no azucaradas. Las muestras que van a ser analizadas polarimétricamente deben estar libres de material colorante, de todas las sustancias ópticamente activas diferentes a los azúcares como taninos, glucósidos y aminoácidos así como de ácidos o sales que puedan influír en la rotación específica de los azúcares presentes. Cuando se utilizan métodos de reducción para la cuantificación de azúcares

debe eliminarse el material coloidal ya que puede quedar ocluído en el precipitado de óxido cuproso que se forma, también deben eliminarse todas aquéllas sustancias reductoras no azucaradas como son los aminoácidos y tanino

Agentes ClarificantesExisten muchos clarificantes en uso. La selección de uno de ellos depende de la muestra analizada, de la clase de sustancias interferentes y del método de ensaye propuesto. Como ya se mencionó los extractos para medidas polarimétricas deben estar libres de partículas que obstruyan el paso de la luz, deben ser claros, prácticamente incoloros y libre de sustancias ópticamente activas diferentes de los azúcares. En el caso de los métodos de reducción se debe remover el material coloidal que puede coprecipitar con el óxido cuproso así como otras sustancias reductoras que no son azúcares.Debido a lo anterior es muy importante seleccionar el agente clarificante para cada muestra en particular considerando los siguientes factores:

1. Que introduzca un mínimo de error2. Que sea de rápida filtración 3. Que sea eficiente en la clarificación

Entre los agentes clarificantes más usados se encuentran:1. Acetatos de plomo2. Acetato de (Ac)2.3H2O3. Acetato de plomo básico, 3Pb(Ac)2PbO.3H2O4. Acetato de plomo básico, Pb(Ac)2.2PbO.4H2O5. Carbonato de plomo recientemente precipitado6. Cloruro de plomo7. Nitrato de plomo8. Hipoclorito9. Nitrato básico de plomo10.Hidróxido de aluminio (crema de alúmina)11.Sulfuro de sodio12.Nitrato mercúrico13.Hidróxido de cobre14.Solución de Carrez (volúmenes iguales de soluciones que contienen por L de

solución 150g de K4Fe(CN)6.3H2O y 300g de ZnSO4.7H2O, respectivamente)

Existe una variación en eficiencia y error introducido por los diferentes acetatos de plomo. El acetato básico es más eficiente que el acetato neutro ya que no solo flocula coloides sino que además adsorbe materia colorante, sin embargo no es deseable su uso como agente clarificante para soluciones de azúcares reductores porque forma un precipitado voluminoso que puede llevar azúcares ocluidos. El acetato básico precipita además cantidades apreciables de azúcares reductores, especialmente fructosa, este precipitado plomo-fructosa es dextrorrotatorio e interfiere con la medición de rotación óptica en los métodos polarimétricos. La precipitación de azúcares se incrementa con la alcalinidad. La pérdida de azúcares reductores puede ocurrir no sólo en el proceso original de clarificación sino también en el procedimiento subsecuente cuando se usa un exceso de reactivo por lo que es conveniente siempre usar acetato de plomo seco, no en solución y siempre se debe precipitar el exceso de plomo para lo cual se utiliza con una solución de fosfato o sulfato de sodio, oxalato de sodio en cristales, ó una mezcla de fosfato disódico y oxalato. La cantidad y naturaleza de las impurezas, la cantidad de acetato de plomo usada y la concentración del azúcar en solución afectan la cantidad de azúcar arrastrada en el precipitado. El acetato de plomo básico se usa para clarificar soluciones de sacarosa (productos de caña de

azúcar) y manejado adecuadamente puede usarse para clarificar soluciones que no contengan fructosa o inulina.

El acetato de plomo neutro es el agente clarificante más comúnmente usado tanto para determinaciones químicas como polarimétricas ya que remueve ácido tánico, ácidos orgánicos, pectinas y flocula material coloidal. Su principal limitación es su bajo poder decolorante, consecuentemente no se recomienda para mediciones polarimétricas de soluciones muy oscuras, además de que introduce error debido al volumen del precipitado que se forma. Sin embargo su uso tiene ciertas ventajas debido a que no precipita azúcares reductores de la solución y no forma compuestos plomo-azúcar solubles de diferente rotación óptica. Se considera que este compuesto manejado adecuadamente puede ser utilizado aún con soluciones de fructosa.

La crema de alúmina es una suspensión de hidróxido de aluminio en agua. No es un agente clarificante muy eficiente pero introduce un mínimo de error en la clarificación, por consiguiente se usa en productos de alta pureza. Se usa para productos con un contenido elevado de fructosa (miel) porque no reacciona con el azúcar. La clarificación por crema de alúmina es principalmente un efecto mecánico que resulta de la remosión de materia suspendida por las partículas floculantes del hidróxido de aluminio.

En el análisis de soluciones azucaradas incoloras o ligeramente coloridas, ricas en proteínas, el método de precipitación de con el reactivo de Carrez proporciona excelentes resultados. El precipitante no es satisfactorio para soluciones de origen vegetal que son ricas en gomas, pectinas y coloides ácidos. El uso del reactivo de Carrez involucra la adición consecutiva de volúmenes iguales de las soluciones que contienen por litro respectivamente, 150 g de K4Fe(CN)6 3H2O y 300 g de ZnSO4.7H2O. El zinc se encuentra en exceso pero generalmente no interfiere, excepto en la determinación de azúcares por métodos de fermentación, para lo cual debe removerse el exceso por precipitación con NaOH 1.0 N.

También se utiliza como agente clarificante al carbón activado el cual es el más eficiente, pero remueve azúcares de la solución, es más utilizado en pruebas cualitativas que de cuantificación.

Otros agentes clarificantes incluyen una mezcla de hidróxido de bario y sulfato de zinc; una mezcla de sulfato de cobre y álcali para la precipitación de proteínas en leche; y nitrato mercúrico junto con un álcali para extractos de tejidos animales. Las proteínas pueden removerse por los precipitantes generales de ellas, ácidos tricloroacético o fosfotúngstico.

El agente clarificante puede agregarse ya sea como solución acuosa saturada, aforando al volumen después de la clarificación, ó en polvo después que se ha aforado la solución, teniendo la precaución de remover todo exceso del agente clarificante utilizado.

En ciertos análisis se recomienda pasar la solución a través de una columna empacada con resina de intercambio iónico, con el propósito de desalar dicha solución. Los aminoácidos representan un problema especial porque interfieren con la determinación de azúcares y no se remueven por los precipitantes comunes de proteínas, pudiendo separarse de las soluciones utilizando una columna empacada con resina de intercambio iónico.

Reacciones Cualitativas de Carbohidratos

En ocasiones es necesario saber cual es el carbohidrato particular que se encuentra presente en un alimento antes de hacer el análisis cuantitativo. El tipo de alimento sugiere el carbohidrato anticipadamente, por ejemplo: en los productos de maple se espera que contengan sacarosa y azúcar invertido, los productos lácteos deberán contener lactosa y sacarosa si son azucarados.

Las pruebas cualitativas para azúcares se basan en:

1. Reacciones coloridas efectuadas por condensación de los productos de degradación de azúcares, en ácidos minerales fuertes con varios compuestos orgánicos;

2. Las propiedades reductoras del grupo carbonilo; 3. Sobre el rompimiento oxidativo de grupos hidroxilos vecinos. Algunas pruebas

cualitativas se determinan en fracciones separadas a través de técnicas cromatográficas en papel, en capa fina o en columna.

Reacciones Coloridas en Ácidos Fuertes

Reacción de Selivanoff. Esta reacción es específica para cetoazúcares. Se basa en la producción de un color rojo debido a la formación de un grupo quinoide al reaccionar un cetoazúcar en presencia de resorcinol y HCl diluído. Las reacciones involucradas son iguales a la prueba anterior sólo que en lugar de alfa naftol se usa resorcinol. Prueba de Molisch. Muchos carbohidratos dan reacciones coloridas con fenoles, timol, alfa naftol, resorcinol y floroglucinol. Uno de los más usados es el alfa naftol. En esta reacción el ácido sulfúrico deshidrata al carbohidrato formando furfural o hidroxi-metil-furfural que se condensa con el fenol para producir un color característico rojo violáceo.

Reacción de la Antrona. La antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) es un producto de la reducción de antraquinona y reacciona específicamente con muchos carbohidratos en soluciones de ácido sulfúrico concentrado para producir un color verde o azul verde característico.

Prueba de Dubois. Conocida también como el método fenol-ácido sulfúrico, es una prueba simple, rápida, sensible, exacta, específica y ampliamente aplicada para detectar carbohidratos en forma general. Virtualmente pueden determinarse todas las clases de azúcares, incluyendo sus derivados, oligosacáridos, y polisacáridos. Los reactivos son baratos, fácilmente disponibles y estables. Se produce un color amarillo naranja estable y los resultados son reproducibles. El método es excelente para determinar azúcares separados por cromatografía.

Reacciones de Reducción Todos los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles (reductonas) al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)6

3- y los azúcares se oxidan formando mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas.

Todos los monosacáridos y algunos oligosacáridos de cadenas cortas poseen la habilidad de reducir:

1. Soluciones alcalinas de sales metálicas incluyendo Cu, Ag, Hg y Bi.2. Soluciones ácidas de ácido selenioso y molíbdico3. Compuestos orgánicos como el ácido pícrico y el azul de metileno.

Estos azúcares conocidos como azúcares reductores, presentan esta propiedad porque tienen en su estructura molecular un grupo aldehído o cetona libre o potencialmente libre. Además también reaccionan con fenil hidracina para formar hidrazonas y osazonas. Las reacciones de reducción pueden usarse ya sea cualitativamente para distinguir entre azúcares reductores o no reductores o como medio de identificación de azúcares individuales y cuantitativamente para evaluar la cantidad de azúcar presente

Reacción de Fehling. Esta prueba está basada en la reducción de Cu de la solución de Fehling, la cual se prepara mezclando dos soluciones antes de su uso. Una solución contiene sulfato cúprico y la otra contiene tartrato de sodio y potasio e hidróxido de sodio formando una solución de tartrato cuproalcalino, que por acción de un carbohidrato, reduce al cobre en forma cúprica a óxido cuproso que es un precipitado de color rojo ladrillo.

Reacción de Benedic. El fundamento es el mismo que el de la reacción anterior con la diferencia de que la solución usada contiene ácido cítrico en lugar de tartático y la alcalinidad es producida por la presencia de carbonato de sodio en lugar de hidróxido de sodio.Reacción con arsenomolibdato. En esta reacción las sales cúpricas se reducen a óxido cuproso, el cual a su vez reduce al arsenomolibdato a azul de molibdeno que es una mezcla de óxidos de molibdeno, pudiendo medirse espectrofotométricamente el color azul desarrollado.

Prueba de Oxidación con Periodato. En esta prueba los grupos hidroxilo vecinos se oxidan y los aldehídos formados se detectan por el reactivo fuchina-ácido sulfuroso.Reacción de la Osazona. Los azúcares reductores poseen la propiedad de reaccionar con fenil hidracina bajo condiciones definidas para formar osazonas. Las osazonas derivadas de monosacáridosdifieren en solubilidad de las de disacáridos. También pueden purificarse y examinarse microscópicamente su estructura cristalina así como determinar su punto de fusión que es diferente para cada caso.

Reacciones para Azúcares Especiales

Reacción del Furfural. Las pentosas reaccionan con ácido clorhídrico o sulfúrico para producir furfural (2-furaldehído) y 3 moléculas de agua por deshidratación. El furfural con acetato de anilina forma una coloración rosa la cual se usa como una prueba cualitativa y que bajo determinadas condiciones puede usarse para determinaciones cuantitativas.

Reacción del Ácido Múcico. Es una prueba para galactosa que depende de la oxidación de ese azúcar a ácido múcico a través de la acción del ácido nítrico. Di, tri y polisacáridos como lactosa, rafinosa y gomas que producen galactosa por hidrólisis también dan positiva la reacción. El ácido múcico aparece como un precipitado fino blanco insoluble en agua pero fácilmente soluble en álcali o solución de carbonato de amonio.

Reacción de Raybin. Es una prueba para sacarosa y se basa en la formación de un producto de condensación del diazouracilo y sacarosa produciendo un color verde.

Prueba para pentosas. Esta prueba se ha desarrollado para detectar arabinosa. La presencia de ésta se pone en evidencia por la formación de un color verde con orcinol, ácido clorhídrico y cloruro férrico.

Cuantificación de Mono- y OligosacáridosLos métodos disponibles para la cuantificación de mono- y oligosacáridos incluyen:

1. Métodos refractométricos2. Métodos de reducción3. Métodos polarimétricos o sacarimétricos4. Métodos cromatográficos5. Métodos bioquímico

Métodos refractométricosLos refractómetros son ampliamente utilizados en la industria azucarera y de la industria de alimentos en general para medir el contenido de sólidos disueltos en soluciones azucaradas. Generalmente, una industria de alimentos debe poseer varios refractómetros, localizados en varios lugares de la planta y en el laboratorio de control de calidad, para proveer información rápidamente del proceso así como del control del producto. Una de los métodos que involucra el uso de refractómetros es la determinación de sólidos solubles e insolubles.

Sólidos Solubles e InsolublesEste método se utiliza para establecer la concentración de azúcares presentes en jaleas, jarabes, mermeladas y frutas frescas. Uno de los objetivos es, en complemento de la determinación de CENIZAS SOLUBLES, determinar el contenido de frutas en jaleas, jarabes y mermeladas.

Para llevar a cabo la determinación si se parte de jaleas y mermeladas, éstas deben de calentarse a baño María, con la finalidad de separar sólidos solubles de insolubles; posteriormente se filtra, obteniéndose por un lado los sólidos insolubles, los cuales se secan a vacío y por el otro los solubles, los cuales pueden establecerse a través de un refractómetro (°Brix). Cuando la estimación se va a realizar en frutas, estas son homogenizadas en agua, se filtra y del jugo se toman unas gotas y se miden los °Brix en un refractómetro de Abbe, estos grados van a representar los sólidos solubles ó el grado de dulzor de un fruto y ésto se correlaciona con su estado de madurez, a mayor concentración, mayor madurez.

Métodos espectrofotométricosUna de las técnicas analíticas más potentes consiste en determinar la cantidad de una substancia disuelta midiendo la cantidad de radiación absorbida por la misma. Esta técnica se llama Espectrofotometría. Se puede utilizar el espectrofotómetro para determinar la longitud de onda de la radiación necesaria para las determinaciones de la cantidad de azúcar en las muestras bajo estudio, comparándola después con la radiación absorbida por un blanco. La regla específica que relaciona la cantidad de radiación absorbida por una substancia con la concentración de esa misma substancia se llama Ley de Beer

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Para la pesada de la muestra agarramos una espátula y tomamos una porción de mermelada y la introducimos en un vaso de precipitado pequeño y lo vamos a pesar en la balanza analítica aproximadamente 1 gCalentamos agua destilada en la hornilla para disolver la muestra de de mermelada con 40ml del agua tibiaagitamos con la varilla vigorosamente y la trasvasamos al matraz aforado (100ml), posteriormente con una pipeta (2ml) agregamos 2ml de carrez I y agitamos, mas 2ml de carrez II, mas 1ml de la solución de NaHPO4, enrasamos con agua destilada tapamos con teflón y homogeneizamos preparamos el

equipo de destilación rápida para la separación del precipitado gelatinoso que se ha clarificado

Determinación azucares reductoresTomamos una alícuota de la solución clarificada de la mermelada para el análisis de azucares reductoresPara realizar las diluciones realizamos una prueba tomando una alícuota de 10 ml de la solución de la mermelada y la enrasamos a 100ml en un matraz aforado, volvemos hacer la dilución tomando 2 ml de la solución diluida en un tubo de ensayo y le añadimos 6ml del reactivo de color y la calentamos a baño María de la misma forma tomamos 0.06g de glucosa y le añadimos el reactivo de color y la calentamos y luego comparamos Si la comparación está bien procedemos hacer la curva de calibración de acuerdo a la siguiente tabla:Conc. Glucosa (mg/ml)

Volumen del patrón (ml)

Volumen de agua dest. (ml)

Volumen total

Volumen de reactivo de color (ml)

0 0 2 2 60.2 0.4 1.6 2 60.3 0.6 1.4 2 60.4 0.8 1.2 2 60.5 1 1 2 60.6 1.2 0.8 2 6muestras 2 0 2 6

Tomamos los volúmenes señalados en la tabla con una microbureta en un tubo de ensayo marcamos de acuerdo a la concentración y muestraDepues de realizar ello calentamos todos los tubos a baño María durante 6min., dejamos enfriar y procedemos hacer la lectura de la absorvancia a 560nm

Determinación de azucares totalesTomamos una alícuota de 25ml de la solución clarificada de mermelada por duplicado, una para realizar la prueba de dilución Y la otra para el análisis realizamos hidrólisis acida con 2ml de HCl concentrado (esto bajo campana) a 70 °C durante 10min.en un baño termostáticoDe la solución diluida tomamos 10ml y volvemos a enrasar y de ahí tomamos una alícuota de por2 ml para el analisisParalelamente tomamos 0.2g de sacarosa la enrasamos a 100ml en un matraz aforado con agua destilada, extraemos una alícuota de 25ml e hidrolizamosLuego neutralizamos con NaOH conc. Al 25% para corroborar que nuestra solución esta neutralizada tomamos una muestra paralela y le añadimos fenoftaleina y calculamos el volumen que se gasta de NaOH para neutralizar la solución, aumentando 0.5ml a lo calculado después enrasamos la solución en un matraz aforado de 50ml tapamos con teflón y agitamosPreparamos la curva de calibración con un patrón de sacarosa que coincidentemente los volúmenes de enrace para la curva son iguales a la de azucares reductoresHecho todo ello procedemos a la lectura de la absorvancia

DATOS:N° Peso muestra de mermelada en

g

1 1.35202 1.23423 1.3049

Determinación de azucares reductores

Determinación azucares totales

Conc. (mg/ml)

T %

0 1000.2 64.80.3 45.80.4 39.80.5 30.10.6 27.4M1 38.4M2 37.8M3 41.3

5. CALCULOS

Determinación de azucares reductores

Las diluciones que se realizaron son:

Peso de muestra de mermelada 100ml 25ml 50ml

10ml 100ml

2ml lectura

Las diluciones que se realizaron son:

Peso muestra de mermelada 100ml

10ml 100ml

2ml lectura

Calculamos el valor de la absorvancia:

A%= 2 - logT

Por el método de regresión lineal introducimos los datos de la concentración y absorvancia a la calculadora de donde se obtiene los siguientes datos

r=0.9987A=-2.16e-4B=0.8085

Por interpolación encontramos las concentraciones de nuestras muestras

CM1=0.3253 mg/mlCM2=0.3779 mg/mlCM3=0.2883 mg/ml

Conc. (mg/ml)

T %

0 1000.2 70.60.3 56.60.4 46.00.5 39.70.6 33.2M1 54.6M2 49.5M3 58.5

Determinación azucares totales

6. RESULTADOS:

CUVA DE CALIBRACION PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES

Calculamos el valor de la absorvancia:

A%= 2 - logT

Por el método de regresión lineal introducimos los datos de la concentración y absorvancia a la calculadora de donde se obtiene los siguientes datos

r=0.9925A=0.0108B=0.9732

Por interpolación encontramos las concentraciones de nuestras muestras

CM1=0.4159 mg/mlCM2=0.4230 mg/mlCM3=0.3835 mg/ml

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

conc. (mg/ml)

A%

Conc. (mg/ml)

A %

0 00.2 0.15120.3 0.24720.4 0.33720.5 0.40120.6 0.4789M1 0.2628M2 0.3054M3 0.2328

CURVA DE CALIBRACION PARA LA DETERMINACION DE AZUCAR TOTAL

7.

7. CONCLUSION:

Se logro determinar el contenido de azúcar reductor y azúcar total en la mermelada usando como patrón para la curva de calibración la glucosa y la sacarosa sacando los resultados con un promedio de 25.59 y 62.94 respectivamente

8. CUESTIONARIO:

1) Indicar otros métodos para cuantificar azucares en alimentos?Los métodos utilizados en azucares varian según el tipo de muestra y citaremos algunas

Determinación cuantitativa de azúcares reductores y totales (método de Lane y Eynon).

Existen diversos métodos de cuantificación de carbohidratos basados en la capacidad reductora de los azúcares que tienen libre el grupo carbonilo. Estos carbohidratos son

capaces de reducir elementos como el cobre (Cu+2

), el hierro (Fe+3

) o el yodo (I0

).

En el caso específico del cobre, este es reducido desde Cu+2

a Cu+1

. En este sentido, en el método de Lane y Eynon (1923) se hace reaccionar sulfato cúprico con azúcar

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.70

0.10.20.30.40.50.6

conc. (mg/ml)

A%

Conc. (mg/ml)

A %

0 00.2 0.18840.3 0.33910.4 0.40010.5 0.52140.6 0.5622M1 0.4157M2 0.4225M3 0.3840

reductor en medio alcalino, formándose oxido cuproso, el cual forma un precipitado rojo ladrillo. Este método utiliza azul de metileno como indicador, el cual es decolorado una vez que todo el cobre ha sido reducido, lo que indica el fin de la titulación

Análisis de disacáridosAntes de aplicar un procedimiento analítico específico es necesario tener una buena idea de cuales carbohidratos están presentes y los rangos de concentración de las soluciones estudiadas.Si el sistema es completamente desconocido, una evaluación cualitativa por TLC y un análisis de los azúcares totales presentes deben ser obtenidos primero.La elección de la metodología cuantitativa específica va a depender de muchos factores:

a. El objetivo del análisis. b. El rango de concentración del disacárido. c. La presencia de otros carbohidratos u otros compuestos que puedan interferir

con el método particular para el disacárido de interés. d. El grado de precisión requerido. e. El disacárido no debe ser degradado antes ni durante el análisis dado que se

podrían obtener datos erróneos. f. La disponibilidad del reactivo analítico específico, su costo y eficacia. g. La accesibilidad a la instrumentación específica necesaria.

Cabe notar que para muchos fines, una técnica simple y barata para el análisis de carbohidratos puede lograr excelentes resultados- casi tan buenos como los obtenidos con técnicas e instrumentos sofisticados y caros.Recordar que la caracterización de un disacárido por una técnica dada, debe ser siempre verificada por un segundo método independiente.

Métodos espectrofotométricos

El término espectrofotometría se refiere al uso de la luz para medir las concentraciones de sustancias químicas.Cuando una molécula absorbe un fotón, su energía se incrementa. Se dice que pasa a un estado excitado. Si por el contrario emite un fotón, su energía disminuye. El estado de menor energía de una molécula se denomina estado basal o fundamental.En la siguiente figura se describe un esquema básico de un espectrofotómetro:Monocromador - Celda con el analito - Detector de luz Fuente de luz - (Selección de longitud de onda)Una fuente de luz se hace pasar por un monocromador. Éste permite seleccionar un haz de luz con una única longitud de onda. Este haz de luz monocromática incide sobre una celda de ancho b que contiene la solución con el analito. Si la solución absorbe la luz, la potencia radiante incidente (Po) (1) del haz de luz disminuye al emerger de la celda. Los valores de la potencia radiante emergente (P) tienen que cumplir necesariamente la siguiente relación:P Po

(1) La potencia radiante se define como energía por unidad de tiempo y por unidad de área o sección.

- Magnitudes en Espectrofotometría

La transmitancia se define de la siguiente forma:En tanto, la absorbancia se define como:

Cuando no se absorbe luz, P = Po y por lo tanto A = 0. Cuando se absorbe 90 % del haz de luz, 10 % de éste se transmite, por lo que P = Po / 10 y A = 1.

- Ley de Beer

Donde:

A es la absorbancia (magnitud adimensional) es un coeficiente de proporcionalidad denominado absortividad molar. Indica

la absorbancia de una determinada sustancia a una longitud de onda dada y se expresa en M-1. cm-1.

b es el ancho o espesor de la celda donde se deposita la muestra y se expresa en cm.

c es la concentración expresada en moles / Litro (M)

La ley de Beer establece que la absorbancia es proporcional a la concentración de las especies absorbentes. Dicha ley se verifica muy bien en un rango definido de concentraciones ( 0.01 M). Las fallas aparentes de la ley de Beer en soluciones más concentradas pueden atribuirse a cambios en las propiedades de las especies absorbentes de la solución. Conforme una solución se vuelve más concentrada, las moléculas de soluto interactúan entre sí debido a su proximidad, modificando sus propiedades de absorber la luz. De ello resulta que la gráfica de Absorbancia en función de la concentración pierde su linealidad.

Métodos no enzimáticos

1. Fenol – H2SO4

Este es probablemente el procedimiento más común para la estimación del contenido total de azúcares reductores y glucósidos. Una muestra de 0.01 – 0.25 mol de azúcar en 0.3 mL se mezcla con 0.01mL de fenol 10%. Se agrega 1.0mL de H2SO4 concentrado de grado analítico a la mezcla azúcar – fenol. Después de mezclar, se incuba por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se mide la absorbancia a 490nm.Algunas sustancias tales como cationes de metales pesados, compuestos azo- y tio- podrían interferir.

2. Antrona - H2SO4

El medio ácido hidroliza el enlace glicosídico de la sacarosa y los monosacáridos resultantes reaccionan con la antrona produciendo un color verde – azulado.Para el análisis de sacarosa, una muestra de 100 L (0.05-0.4 mol de sacarosa) se mezcla con 100 L de NaOH 30%, y se calienta por 10 minutos a 100°C. Se deja enfriar a temperatura ambiente y se agregan 3.0mL del reactivo de antrona (0.15% en 80% H2SO4).Después de 15 minutos a 40°C, se mide la absorbancia a 620nm.

Antrona

Métodos enzimáticos

Desde un punto de vista analítico, la capacidad de los enzimas para catalizar reacciones específicas con un alto grado de eficacia, ha dado lugar a diferentes aplicaciones en diversos campos del análisis como análisis clínicos, análisis de productos alimentarios, análisis de preparados farmacéuticos etc.El análisis enzimático o análisis mediante el empleo de enzimas puede ser utilizado en:1. La determinación de los sustratos de la reacción enzimática, siendo posible determinar específicamente cada una de las sustancias de una mezcla sin necesidad de separar. Para la cuantificación de sustratos se pueden utilizar dos métodos generales:a. Métodos de cambio total, de equilibrio o de punto final. En este tipo de métodos (los más utilizados en la práctica) se permite que la reacción enzimática se complete o llegue al equilibrio y se mide la variación producida en la concentración de un producto de reacción o de un reactivo presente inicialmente en exceso.b. Métodos cinéticos, en los que se utilizan medidas de la velocidad inicial de la reacción enzimática para deducir la concentración inicial de sustrato. Los procedimientos de medida son idénticos a los utilizados para reacciones catalíticas en general.2. Determinación de los mismos enzimas mediante el empleo de métodos cinéticos en los que se mide la velocidad de desaparición del sustrato o de generación del producto, relacionada con la concentración de enzima en disolución.

Determinación de otras sustancias mediante el empleo de reactivos marcados con enzimas: enzimoinmunoanálisis.

Hay otros métodos cualitativos que se explican en el marco teorico Métodos cromatográficos (generalmente HPLC de fase reversa con detección por índice de refracción).Métodos polarimétricos (medida de la capacidad rotatoria óptica).Métodos químicos (oxidación del grupo aldehido/ceto en medio alcalino).

2) Porque se realiza la hidrólisis acida para determinar azucares totales con 2,4 nitrofenol?