imunologia clínica imunoensaios - precipitação. anticorpos monoclonais: a utilização de...
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Imunologia Clínica
Imunoensaios - Precipitação
Anticorpos Monoclonais: Anticorpos Monoclonais:
• A utilização de anticorpos como ferramentas de identificação
de estruturas tem sido cada vez mais freqüente,
principalmente no diagnóstico clínico.
• O uso de misturas de anticorpos tem aplicação limitada –
múltipla especificidade e heterogeneidade da resposta imune
humoral.
• Soro policlonal: Muitos tipos diferentes de anticorpos
produzidos por vários clones de linfócitos B, específicos para
diferentes antígenos.
Como resolver esse problema????Como resolver esse problema????
Anticorpos Monoclonais: Anticorpos Monoclonais:
• Georges Koller e Cesar Milstein (1975): Descreveram a 1ª
técnica para a obtenção de anticorpos homogêneos ou
monoclonais de especificidade definida.
• Ganharam o Prêmio Nobel em 1984.
Imunização com o antígeno
Células do baço Clone de LB + Mieloma (Tumor de LB), não
secretor de anticorpos
Hibridoma: Podem ser mantidas in vitro indefinidamente e irão continuar secretar
anticorpos com especificidade definida. Esses anticorpos são MONOCLONAIS.
IMUNOPRECIPITAÇÃO
• As técnicas manuais de precipitação atualmente em uso são
realizadas em meio gelificado, o que facilita a leitura e reduz
os volumes necessários para a interação. No entanto
requerem períodos de horas ou dias para a migração
molecular e a formação do imunocomplexo.
• A técnica pode ser automatizada (turbidimetria e
nefelometria). São técnicas muito mais sensíveis.
Técnicas baseadas na reação de precipitação: Técnicas baseadas na reação de precipitação:
1. Imunodifusão:
• Baseia-se na difusão de substâncias solúveis ao acaso em meio
gelificado como o ágar ou gel de agarose. Enquanto as moléculas
estão livres continua ocorrendo difusão, ao se formarem IC (alto PM),
ficam imobilizados no gel, permitindo a visualização.
• A máxima precipitação ocorre na zona de equivalência.
Podem ser classificadas em:
• Imunodifusão Simples: O Ac ou o Ag está fixado ao gel, enquanto o
outro migra até a formação do IC.
• Imunodifusão Dupla: Ambos os reagentes estão livres para mover em
direção ao outro e precipitar.
• O movimento pode ser linear ou radial.
1.a. Imunodifusão simples em uma dimensão (linear)
• 1946 - Oudin (França).
• Difusão simples em tubo.
Antígeno + Gel
Antígeno
O tubo é selado e deixado à temperatura constante por
aproximadamente 1 semana.
AgAc Imunocomplexo
Princípio: Relação quantitativa
entre a quantidade de Ag
presente no poço e o anel de
precipitação resultante.
Tempo de incubação: 48 a 72 h
Diâmetro do halo [ ] Ag
1.b. Imunodifusão radial simples
1.b. Imunodifusão radial simples
1.c. Imunodifusão dupla de Ouchterlony
• Nesta técnica os dois componentes, antígeno e
anticorpo difundem-se radialmente em todas as
direções, a partir de orifícios no meio gelificado, e
se encontram formando linhas ou arcos de
precipitação.
• Limitação:
• Requer 18 a 24 horas de difusão para que a
reação se processe.
• Baixa sensibilidade.
Amostra 1: negativa; Amostra 2: positiva; Poços: Padrão
1.c. Imunodifusão dupla de Ouchterlony
Técnicas baseadas na reação de precipitação: Técnicas baseadas na reação de precipitação:
2. Imunoeletroforese:
2.a. Eletroforese:
• Técnica que permite a separação das proteínas de acordo com
sua carga. O suporte de eletroforese é inerte e não influencia o
fluxo das moléculas no campo elétrico.
• Suporte: papel, agarose ou acetato de celulose (corrida de
eletroforese em tempo mais curto - 60 a 90 minutos).
• O soro ou outro material biológico é aplicado na origem e
fracionado por cerca de 90 minutos, usando um tampão alcalino.
A seguir as fitas são coradas para se detectar as proteínas e
lidas em densitômetro, que converte o padrão em picos
permitindo a quantificação.
2.a. Eletroforese:
2.a. Eletroforese:
2.b. Imunoeletroforese:
• A técnica combina a eletroforese e difusão dupla em meio
gelificado, em tempos distintos, com alto poder resolutivo.
+ +- -Amostra (Ag)
Eletroforese
a b dc
Soro
a b dc
Difusão
Aa
Bb
Dd
Cc
Técnicas baseadas na reação de precipitação: Técnicas baseadas na reação de precipitação:
3. Eletroimunodifusão:
3.a. Eletroimunodifusão Simples Linear (Laurell ou Foguete)
3.b. Eletroimunodifusão Dupla Linear ou Contra-
imunoeletroforese.
• Na eletroimunodifusão, a migração do antígeno e do anticorpo
é dirigida por um campo elétrico, aumentando a velocidade de
formação do imunocomplexo e a sensibilidade em relação à
difusão natural.
Soro - Anticorpo
Gel contendo o antígeno
-
+
3.a. Eletroimunodifusão Simples Linear (Laurell ou Foguete)
Linha de precipitação
3.b. Eletroimunodifusão Dupla Linear ou Contra-imunoeletroforese.
Automação dos ensaios de
precipitação
Nefelometria
• Uma das características das soluções coloidais é a pronunciada
dispersão de luz.
• Quando um feixe de luz incidente atravessa um meio contendo
partículas, essas interferem com a passagem da luz, fazendo com
que seja dispersa em todas as direções.
Mistura homogênea – Não há dispersão da luz.
Mistura coloidal
Nefelometria
Suspensão Ag-Ac
Fonte de luz
Lentes que captam os raios
dispersos
Lentes focalizadoras
Detector
•Os raios de uma fonte
de luz de alta intensidade
(lâmpadas de halôgenio,
laser) são dirigidos por
lentes focalizadoras e
passam através da
amostra contendo os ICs.
Os raios que emergem
em ângulo de 70º são
dirigidos por outra lente
para o detector
eletrônico.
• O sinal é
matematicamente
relacionado à
concentração do Ag ou
Ac.
Nefelometria
• A nefelometria é totalmente automatizada, de fácil realização, rápida e
precisa.
• Ideal: Nefelômetros que subtraiam ruído de fundo (background), causados
por amostras lipêmicas ou hemolisadas.
• Emprega pequenos volumes de amostra e tem alta sensibilidade.
• Pode ser aplicada nas determinações de proteínas de significado clínico em
qualquer fluído corporal.