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PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNAS SEXO-ESPECÍFICAS DE MEMBRANA DE
ESPERMATOZÓIDES DE EQÜINO
GUILHERME VALENTE DE SOUZA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ MARÇO – 2003
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNAS SEXO-ESPECÍFICAS DE MEMBRANA DE
ESPERMATOZÓIDES DE EQÜINO
GUILHERME VALENTE DE SOUZA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Orientador: Prof. José Frederico Straggiotti Silva
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
MARÇO – 2003
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA PROTEÍNAS SEXO-ESPECÍFICAS DE MEMBRANA DE
ESPERMATOZÓIDES DE EQÜINO
GUILHERME VALENTE DE SOUZA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Produção Animal.
Aprovada em 27 de março de 2003. Comissão Examinadora: _______________________________________________________ Prof. Claudio Andrés Retamal Martínez(DS. Biociência e Biotecnologia) - UENF _______________________________________________________ Prof. Clóvis José Pascarelli Souza (DS. Reprodução Animal) - FIOCRUZ _______________________________________________________ Prof. Marcos Fernando de Resende Matta (DS. Imunologia Veterinária) - UENF _______________________________________________________ Prof. José Frederico Straggiotti Silva (DS. Reprodução Animal) – UENF
(Orientador)
ii
“Wo ein Willen ist, gibt’s immer einen Weg”
“Onde existe um querer, sempre há um caminho”
Autor desconhecido
iii
Aos meus pais, pela educação desde meu primeiro dia de vida até hoje e,
também, pelo amor, carinho, dedicação e companheirismo.
Aos meus irmãos, William e Marden, pela força em todos os momentos de
nosso dia-a-dia.
À minha namorada, Rachel, pela sua imensa dedicação, compreensão, amor
e carinho em todos os momentos e a seus familiares, pela total atenção e carinho.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF) e ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA) pelo oferecimento deste curso.
À CAPES pela concessão de bolsa de estudo, pois sem ela seria impossível
permanecer nesta cidade.
A todos os meus familiares e amigos pelos incentivos e pelos momentos
compartilhados.
Ao meu super-amigo Bruno Fagundes, pela sua amizade fraterna, desde o
início de nossa difícil caminhada pela graduação e mestrado, mostrando-se presente
em todos os momentos, sem medir esforços para ajudar e pela sua grandiosa
colaboração na execução do presente estudo.
Ao Maurício Fraga van Tilburg, por sua amizade, incentivos e idéias para
serem empregadas na realização deste trabalho.
À Cláudia Gomes Fernandes Matta, por sua dedicação e amizade e aos
demais amigos da Pós-Graduação e do laboratório que colaboraram com idéias e
sugestões.
Aos técnicos do LMGA, Thiago, Bruna, Juliana, Vânia e Diogo pelos auxílios
nos trabalhos desenvolvidos, pela organização e manutenção de equipamentos do
laboratório.
Ao Setor de Reprodução do Laboratório de Biologia Celular e Tecidual
(LBCT), ao Laboratório de Tecnologia de Alimentos (LTA) Setor de Microbiologia e
v
ao Laboratório de Bioquímica e Funções de Proteínas e Peptídeos (LQFPP), por
disponibilizar equipamentos e espaço físico para execução de parte deste trabalho.
Ao professor Claudio Andrés Retamal Martínez, pela orientação na parte de
proteínas de membrana, mostrando-se incansável em ajudar.
Ao professor Marcos Fernando de Resende Matta, pela confiança depositada
em mim para desenvolver este trabalho de tão grandiosa magnitude científica.
Ao orientador e professor José Frederico Straggiotti Silva, principalmente pela
amizade e confiança, pela orientação neste trabalho de forma integral e incansável,
por me fazer um pesquisador dando estímulos, sugestões e apresentando algumas
dificuldades para desenvolver a capacidade de pensar.
Àqueles que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
A Deus, por ter me dado forças para finalizar este trabalho e por sempre estar
presente para que eu superasse os obstáculos encontrados nessa minha
caminhada.
vi
BIOGRAFIA
GUILHERME VALENTE DE SOUZA, filho de Telmo Marden de Souza e Anna
Maria Valente de Souza, nasceu em 21 de junho de 1977, na cidade de Rio Bonito –
RJ.
Em março de 1996, iniciou o curso de Medicina Veterinária na Universidade
Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ, onde se
formou em março de 2001.
Em março de 2001, deu início ao Curso de Pós-Graduação em Produção
Animal, ao nível de Mestrado, na área de Reprodução Animal, da Universidade
Estadual do Norte Fluminense (UENF), em Campos dos Goytacazes – RJ,
submetendo-se à defesa de tese, para conclusão do curso, em março de 2003.
vii
RESUMO
Souza, Guilherme Valente; Msc; Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro; março/2003; Produção de anticorpos monoclonais contra proteínas sexo-específicas de membrana de espermatozóides de eqüino; Professor orientador: José Frederico Straggiotti Silva. Professor conselheiro: Marcos Fernando de Resende Matta.
A produção de anticorpos monoclonais contra proteínas sexo-específicas de
membrana de espermatozóides de eqüino foi realizada utilizando-se proteínas
purificadas de géis de eletroforese, cujas proteínas apresentam peso molecular em
torno de 19 e 21 quilodaltons (kDa). Foram produzidos 25 clones, dos quais apenas
17 cresceram e somente 3 apresentaram-se positivos contra as proteínas utilizadas
na confecção dos anticorpos monoclonais, sendo 2 clones para a proteína de 19
kDa e 1 para a proteína de 21 kDa. Neste trabalho, verificou-se a baixa
antigenicidade das proteínas sexo-específicas de membrana de espermatozóides de
eqüino e também verificou-se a grande dificuldade da produção de monoclonais a
partir de proteínas de membrana de leucócitos contra as proteínas sexo-específicas
de membrana de espermatozóides de eqüino.
Palavras-chave: Eqüino, espermatozóides, proteína sexo-específica,
monoclonal, antígeno HY
viii
ABSTRACT
The production of monoclonal antibody against sex-specific protein of equine
sperm membrane was developed using purified proteins of one-dimensional
poliacrylamide gel electrophoresis, which proteins has a molecular weight around 19
and 21 kDa. Twenty-five clones were produced, from them only 17 had developed
and just 3 had shown positive against the proteins used to make the monoclonal
antibodies, from the 3 clones 2 were against the protein 19 kDa and 1 was against
the protein 21 kDa. In this work, it was observed low antigenicity of sex-specific
proteins of equine sperm membrane and it was also observed great difficulty to
develop monoclonal antibodies from leucocyte membrane against sex-specific
proteins of equine sperm membrane.
Keywords: Equine, sperm, sex-specific protein, monoclonal, HY antigen
ix
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 01
2 REVISÃO DE LITERATURA 05
2.1 Sêmen 05
2.2 Plasma Seminal 08
2.3 Aspectos gerais sobre a determinação do sexo e o antígeno HY 09
2.4 Produção de anticorpos monoclonais 12
3 MATERIAL E METODO 15
3.1 Obtenção do material biológico 15
3.1.1 Leucócitos 15
3.1.2 Sêmen 16
3.2 Preparação do material biológico para inoculação 16
3.2.1 Extração de proteínas dos leucócitos 16
3.2.2 Espermatozóides íntegros 16
3.2.3 Extração de proteínas dos espermatozóides 17
3.3 Determinação da concentração das proteínas 17
3.4 Eletroforese monodimensional das proteínas de membranas celulares 17
3.5 Análise do gel de eletroforese 18
3.6 Extração das proteínas dos géis de poliacrilamida 18
3.7 Imunização dos animais 19
3.8 Western Blotting 20
3.9 Produção de anticorpos policlonais 20
x
3.10 Teste de ELISA 21
3.11 Obtenção dos macrófagos peritoniais 22
3.12 Fusão 22
3.13 Testes dos clones 24
4 RESULTADOS 25
4.1 Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do gel 25
4.2 Extração, purificação e quantificação das proteínas sexo-específica 28
4.3 Produção dos anticorpos monoclonais contra as proteínas sexo-
específicas de leucócitos
28
4.4 Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do
western-blotting
29
4.5 Imunização dos camundongos 31
4.6 Fusão (Produção dos anticorpos monoclonais) 32
4.7 Teste dos anticorpos monoclonais 32
5 DISCUSSÃO 34
6 CONCLUSÕES 37
7 REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA 38
APÊNDICES 44
1
1. INTRODUÇÃO
Historicamente, a pré-determinação do sexo sempre despertou interesse. A
antigüidade desse tema é demonstrada no Talmudic ao se referir aos métodos de
coito na pré-seleção do sexo, embora a interpretação permaneça obscura
(ROSNER, 1979). A possibilidade da escolha do sexo também foi considerada pelos
gregos no século V. Apesar deles acreditarem que forças sobrenaturais
determinavam o sexo fetal, infanticídio seletivo foi usado em crianças a fim de
eliminar características indesejáveis, incluindo sexo inapropriado [Cyrus the Great
(Heredotus, Book I) and Oedipus apud WINDSOR et. al., 1993]. Como alternativa, os
pais tinham acesso a um número de seleção do sexo no pré-natal (revisado por
LEVIN, 1987).
Hipócrates, por exemplo, propôs que machos desenvolviam-se mais no lado
direito do útero e fêmeas no lado esquerdo. Acreditava-se que práticas sexuais
apropriadas asseguravam a deposição do sêmen na porção correta do trato genital
feminino, seguindo-se o desenvolvimento do feto do sexo desejado.
Alternativamente, ligação ou, em casos extremos, remoção do testículo direito
(crendo nascer macho) ou do testículo esquerdo (crendo nascer fêmea) resultaria na
ejaculação do espermatozóide desejado. Outras técnicas baseadas em fatores como
o alinhamento geográfico da cama nupcial, remoção ou retenção de calçados antes
da atividade sexual. Mesmo Aristóteles acreditava que o sêmen era o fator
controlador do próprio desenvolvimento fetal, atribuindo a determinação do sexo à
relativa atividade dos pais durante o coito. Os métodos folclóricos foram mantidos no
2
século XX, e são encontradas na literatura, como exemplo, variedade na ingestão de
dietas, técnicas sexuais e cirúrgicas.
Os métodos sexuais para a determinação do sexo tornaram-se menos
empíricos devido à suposição de evidências de que o sexo era determinado não
pela herança, porém por efeitos combinados de condições externas (WILSON, 1896
citado por FARLEY, 1982). Esta suposição foi contraposta pela observação da
genética mendeliana, a qual mostrou a presença de um possível mecanismo de
herança do sexo no momento da fertilização, sendo a eventual determinação do
sexo realizada pelo complemento cromossomal do espermatozóide fertilizante
(revisado por FARLEY, 1982). O reconhecimento do fato de que, em mamíferos, a
fertilização por espermatozóide contendo o cromossomo “X” produzirá fêmea e
espermatozóide contendo o cromossomo “Y” produzirá macho foi resultado da
maioria dos ensaios científicos do século XX, onde a seleção do sexo pré-fertilização
envolve alterações na taxa da população de espermatozóides X/Y, in vitro, antes da
inseminação artificial ou no trato reprodutivo da fêmea.
O progresso para a sexagem de espermatozóides humanos foi alavancado
como método para reduzir a incidência de alterações genéticas ligadas ao sexo. Os
métodos empregados em tecnologias de criação artificial e a demanda por um
sistema de produção agropecuária mais eficiente têm, entretanto, evidenciado um
aumento de interesse para a determinação do sexo da prole dos animais
domésticos. A separação dos espermatozóides contendo o cromossomo “X” e “Y”,
no homem e nos animais, foi o principal assunto das revisões (CORSON et al., 1984;
GARNER, 1984; LEVIN, 1987; GLEDHILL, 1988; AMANN, 1989; JOHNSON, 1992) e
um levantamento bibliográfico paralelamente aos periódicos 1981-86 (MCKENZIE,
1987).
O estudo da sexagem dos espermatozóides para a pré-seleção do sexo está
gerando, cada vez mais, um grande interesse tanto na comunidade científica quanto
nos criadores. Este interesse continua devido ao impacto econômico que pode
apresentar sobre a produção de animais (GARNER, 1984; SHAMBACHER, 1975).
Um método imunológico para a separação dos espermatozóides está
baseado na expressão dos genes dos cromossomos “X” e “Y”, de tal forma que o
produto de um desses genes está presente sobre a membrana plasmática dos
espermatozóides (OHNO, 1982).
3
O antígeno HY é controlado pelo gene do cromossomo “Y”, que está expresso
sobre todas as células de machos normais de mamíferos, exceto em eritrócitos e
células germinativas pré-meióticas (MÜLLER, 1981; WACHTEL, 1983).
Diferentes métodos têm sido aplicados para a separação dos
espermatozóides portadores do cromossomo “X” e “Y”. Entre os métodos de
separação são citados a centrifugação, diferença de carga elétrica da superfície
celular, uso de anticorpos, quantificação do DNA por marcação fluorescente e
característica da motilidade (ALI et al., 1990).
De acordo com JOHNSON et al. (1987), o aumento de uma das duas
populações de espermatozóides portadores do cromossomo “X” ou “Y” deverá elevar
o ganho genético e aumentar a eficiência da produção animal. MOREL et al. (1988)
mostraram que produtores de gado estarão sob pressão para otimizar suas criações
e uma técnica para pré-selecionar o sexo poderia ajudar na redução do número de
macho ou fêmea, aumentando a progênie do sexo desejado.
A identificação de proteína sexo-específica na membrana plasmática para
ambos os espermatozóides “X” e “Y” pode gerar grandes oportunidades para a
escolha do sexo (HENDRIKSEN, 1999). Ela pode permitir o desenvolvimento de um
ou mais anticorpos antiproteína “X” ou antiproteína “Y”, viabilizando a separação
através de técnicas imunológicas. A citometria de fluxo consegue separar os
espermatozóides contendo o cromossomo “X” e “Y” com alta fidelidade, entretanto,
esse método requer equipamentos caros e, tanto o tempo, quanto o número de
espermatozóides separados por dia é limitado. Métodos imunológicos simples e com
equipamentos de baixo custo podem ser aplicados, possibilitando uma separação
dos espermatozóides em larga escala, evitando o uso de corantes de DNA e
excitação por raio lazer, com possível efeito negativo no espermatozóide e na
viabilidade do embrião precoce (MCNUTT et al., 1996).
MATTA (2001) desenvolveu uma tecnologia capaz de separar as duas
populações de espermatozóides utilizando anticorpos monoclonais, onde a base
científica está na diferença da expressão de proteínas na superfície de
espermatozóides contendo o cromossomo “X” e “Y”. Esta metodologia consiste na
utilização de anticorpos monoclonais contra proteína sexo-específica (HY) associada
à via clássica do sistema complemento, onde o anticorpo utilizado destrói somente
os espermatozóides do sexo indesejado, tornando-se esta metodologia rápida, não
4
invasiva e de baixo custo. Essa tecnologia promoveu a sexagem de 81% de 367
embriões analisados por PCR na INFIGEM - EUA. (Matta, 2001).
O objetivo geral deste trabalho é o de gerar condições para o
desenvolvimento de uma metodologia eficiente e simples, pela utilização de
anticorpo monoclonal, para separação de espermatozóides eqüinos com
funcionalidade para fecundação.
Os objetivos específicos deste trabalho são: 1) determinar a proteína sexo-
específica; 2) produzir anticorpos monoclonais contra a proteína sexo-específica.
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Sêmen
A fertilidade poderá estar reduzida se o espermatozóide ou outro constituinte
essencial para a sobrevivência das células espermáticas ou fertilização promover
uma resposta imunológica efetiva. O trato genital da fêmea é completamente capaz
de produzir uma resposta imune e destruir antigenicamente corpos estranhos.
Sêmen e, em particular, espermatozóides podem, por alguma razão, falhar de serem
antigênicos ou, pelo menos, serem fortes o suficiente para iniciarem uma resposta
antigênica. Entretanto, isto parece ser improvável, já que existem precedentes, isto
é, alguns tecidos no organismo não apresentam antígenos de histocompatibilidade
e, portanto, não são rejeitados após a halotransplantação. Exemplo disso são os
eritrócitos humanos. Na transfusão sanguínea, as células sanguíneas vermelhas são
aceitas pelo receptor mesmo quando outros tecidos do mesmo doador venham a ser
rejeitados. O espermatozóide, uma célula especial também noutros aspectos, pode
de maneira não convencional, falhar em expressar qualquer antígeno de
histocompatibilidade de superfície. De fato, tem sido demonstrado repetidamente
não ser o caso (HOGARTH, 1982).
Inoculações de células espermáticas de várias espécies no coelho provocam
a produção de anticorpos que podem ser verificados a partir da aglutinação de
espermatozóides in vitro ou outros efeitos que indicam a presença de
6
imunoglobulinas específicas antiespermatozóides (EDIDIN e JOHNSON, 1977;
COHEN e HENDRY, 1978).
Os antígenos que provocam estas respostas devem ser xenoantígenos
característicos das espécies das quais os espermatozóides foram obtidos. Antígenos
de espermatozóides que produzem resposta imune apenas em outras espécies,
como os xenoantígenos, são bastante irrelevantes ao sistema imunológico
reprodutivo normal. Apenas substâncias comuns dentro da espécie, mas diferentes
entre os diferentes indivíduos da mesma espécie podem provocar uma resposta
imune como resultado da cobertura, que, conseqüentemente, afetará de forma
adversa a fertilidade. A questão não é, portanto, se os espermatozóides contêm
substâncias que provam ser antigênicas, mas se eles possuem haloantígenos ou
autoantígenos.
Pesquisas adicionais revelam que a situação é consideravelmente complexa.
Os espermatozóides humanos possuem uma carga mista que inclui antígenos do
principal grupo sanguíneo e do sistema de histocompatibilidade.
A pele de camundongos machos deve ser rejeitada por fêmeas de mesma
linhagem genética, onde o transplante entre machos, entre fêmeas, ou de fêmeas
para machos são reconhecidos e aceitos. Isto é devido ao transplante de antígeno
associado com o domínio do cromossomo “Y”, conhecido com antígeno HY. O
antígeno HY tem uma função crucial na determinação primária do sexo. Somente
quando exposto dentro de uma uniformidade genética de uma linhagem altamente
congênita verificou-se a ocorrência de uma discrepância somente no lócus HY, que
vem a ser responsável pela rejeição de transplante (AUSTIN e SHORT, 1972;
HOGARTH, 1978).
O antígeno HY em camundongo é quase totalmente restrito na capa
acrossomal. Este está presente em quantidades variáveis sobre o espermatozóide
do ejaculado, e cerca de 20 a 40 % dos espermatozóides não possuem
praticamente este antígeno. Como somente metade dos espermatozóides do
ejaculado possuem o cromossomo “Y”, isso sugere a expressão pós-meiótica do
genoma, assim como também um método potencial de pré-determinação do sexo da
prole, utilizando antígenos HY do espermatozóide como a base de separação
espermática na produção de machos e fêmeas (HOGARTH, 1982).
Os antígenos do grupo sanguíneo e antígenos do sistema de
histocompatibilidade, os quais os espermatozóides têm em comum com as células
7
somáticas, são também uma classe de antígenos espermatozóide-específicos,
próprios do espermatozóide ou de seus precursores imediatos, isto é, das células
germinativas. Estes auto-antígenos são potencialmente capazes de induzir uma
resposta imune no corpo do macho nos quais são produzidos, por outro lado,
componentes do testículo são estranhos para o resto do corpo. Uma resposta auto-
imune contra antígenos de espermatozóides é, normalmente, prevenida pelo
seqüestro destas células atrás da barreira hemato-testicular, representada pela zona
tight junction das células da Sertoli. Muito raramente esta barreira é quebrada,
porém pode ocorrer a transposição de forma artificial através de injeções de
espermatozóides fora da região confinada do testículo e, conseqüentemente,
provocar uma resposta imune, sendo este um dos principais critérios para
estabelecer a existência de auto-antígenos nos espermatozóides.
Fazendo um experimento com cobaios, os quais são muito susceptíveis à
indução de reação auto-imune antiespermatozóide VOISIN et al.,1974; JOHNSON,
1975 identificaram quatro auto-antígenos de espermatozóides. Eles designaram
estes antígenos como: P, S, T e Z. Dos quatro, Z foi particularmente o mais evasivo,
e tendem a desaparecer durante o processamento de extração utilizado, embora a
existência tenha sido estabelecida, pouco se sabe deste, com exceção, de poder ser
uma glicoproteína. Dos outro três antígenos, P é uma proteína de peso molecular,
provavelmente menor que 60 kDa, S uma glicoproteína rica em açúcar de alto peso
molecular e T é, possivelmente, uma lipoproteína. Os anticorpos contra T são
espermoaglutinantes, os quais indicam que T está localizado do lado externo do
espermatozóide: de outro modo, seria impossível a aglutinação de espermatozóides
vivos e intactos. Essa suposição é confirmada por imunofluorescência. O auto-
anticorpo anti-T é também capaz de fixar complemento e, assim, causar lesões na
superfície da membrana de espermatozóides, principalmente na região do
acrossoma da cabeça do espermatozóide. Esta reação é letal, progredindo muito
rápido: cerca de 20 % dos espermatozóides desenvolvem lesões dentro de 30
segundos, 40 % dentro de 1 minuto e 80 % dentro de 5 minutos da adição do
anticorpo mais complemento. Auto-anticorpos contra o antígeno P são também
fixadores de complemento, como também uma pequena proporção do auto-
anticorpo contra o antígeno S. Entretanto, ambos os antígenos (P e S) estão abaixo
da superfície do espermatozóide, dentro do acrossoma, não podendo nenhum dos
dois anticorpos aglutinar espermatozóides intactos ou iniciar um ataque sobre eles.
8
Porém, estes anticorpos podem contribuir no estágio tardio da destruição, quando o
anticorpo T já abriu a membrana externa do espermatozóide e expôs os antígenos
internos para o ataque (RUSSO e METZ, 1974; LE BOUTEILLIER et al., 1975).
2.2. Plasma Seminal
Além dos espermatozóides, o plasma seminal em que eles estão suspensos
pode também ser antigênico. O plasma seminal é uma mistura complexa, originada
de diferentes secreções dentro do trato genital do macho. O fluido inicial secretado
dentro dos túbulos seminíferos, nos quais os espermatozóides são transportados, é
uma mistura de diferentes contribuições na rete testis. Além do mais, o plasma
seminal modifica sua composição com a passagem pelo epidídimo por adição e
remoção de várias substâncias. Além dessas glândulas acessórias adicionarem
constituintes, formam, também, a maior parte do ejaculado, à medida que os
espermatozóides são lançados para fora durante o coito. Muitas das substâncias
secretadas são enzimas ou grandes moléculas, podendo ser antigênicas.
TROEDSSON et al. (1995) mostraram que os espermatozóides de garanhões
são capazes de ativar o complemento, os quais causam a quimiotaxia e migração
das células polimorfonucleares. Eles também mostraram que o plasma seminal inibiu
a ativação do complemento e suprimiu a quimiotaxia dos polimorfonucleares e a
fagocitose dos espermatozóides. Frações do plasma seminal causaram uma maior
supressão da quimiotaxia dos polimorfonucleares quando comparado com a ação do
plasma sanguíneo inativado pelo calor, sugerindo que outros mecanismos, além da
inativação do complemento, estão envolvidos no efeito supressivo do plasma
seminal (TROEDSSON et al., 1999).
Os espermatozóides alogênicos, logicamente, podem penetrar com sucesso e
repetidamente no trato reprodutivo feminino sem provocar uma resposta imune
significativa. A razão para isso é que o plasma seminal é imunossupressivo. Os
espermatozóides expostos a esse fluido não são imunogênicos, mesmo após uma
lavagem. O fluido prostático, um de seus componentes imunossupressivos do
plasma seminal, também inibe a hemólise mediada por complemento. Nos bovinos,
os componentes imunossupressivos do plasma seminal são proteínas de peso
molecular entre 50 e 150 kDa. Entretanto, ocorrem casos esporádicos de
infertilidade resultante da produção de anticorpo antiespermatozóide no útero
9
(TIZARD 1998). TROEDSSON et al. (2001) caracterizaram que o componente
imunossupressor do plasma seminal de eqüino poderia ser uma ou mais proteínas
com peso molecular entre 50 e 100 kDa, e que estas poderiam ser inativadas
parcialmente pelo uso de carvão e/ou pelo calor (95ºC/45min).
Vários métodos têm sido empregados para estudar a quantidade e a natureza
dos antígenos do plasma seminal oriundos das glândulas acessórias. Se o plasma
seminal humano é inoculado em coelhos, o anti-soro resultante é utilizado para
separar os constituintes do plasma seminal através de imunoeletroforese; com a
separação de componentes protéicos, de acordo com a sua mobilidade
eletroforética, poderão ser distinguidos doze componentes xenoantigênicos. Para
eliminar a possibilidade de inclusão de antígenos de espermatozóides, experimentos
similares foram feitos utilizando-se soro anti-coelho contra o plasma seminal de
homens, cujo sêmen estava completamente livre de espermatozóides. Nesse
plasma seminal azoospérmico foram distinguidos de 13 a 15 componentes. Alguns
desses componentes ocorrem também em outros lugares do organismo. Quando o
soro anti-plasma seminal de humano em coelho foi absorvido com soro humano e
extrato de fígado, o número de componentes do plasma seminal que permaneceram
reagindo caiu para 6. A absorção removeu da mistura de anti-soro aqueles
anticorpos contra elementos do plasma seminal os quais reagiram também contra
antígenos presentes no soro sanguíneo ou fígado. Os seis componentes restantes
do plasma seminal representam antígenos que não ocorrem em outra parte do
organismo, os quais podem, conseqüentemente, atuar como auto-antígenos
específicos do plasma seminal (ISOJIMA et al., 1974).
2.3. Aspectos gerais sobre a determinação do sexo e o antígeno HY
Segundo HAFEZ (1995), as fêmeas dos animais possuem dois cromossomos
sexuais similares (X e X), enquanto que os machos apresentam dois cromossomos
sexuais diferentes (um cromossomo “X” e outro menor, o cromossomo “Y”). Os
gametas (óvulo e espermatozóide) são células haplóides que contêm o cromossomo
“X” ou o cromossomo “Y”. Células somáticas diplóides de fêmeas (sexo
homogamético) contêm um par de cromossomos “X”, porém as células somáticas
dos machos (sexo heterogamético) possuem cromossomos sexuais XY.
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O sexo genético é estabelecido durante a ocasião da fertilização na trompa, e
o sexo dos descendentes é determinado por complemento cromossômico sexual
dentro do espermatozóide (MOORE, 1978; HAFEZ, 1995). O cromossomo “Y” tem
forte efeito determinante de testículo na gônada não diferenciada. Sob sua
influência, o cordão sexual primário diferencia-se em túbulos seminíferos. A falta do
cromossomo “Y” resulta em formação de um ovário. Portanto, o tipo do cromossomo
sexual estabelecido na fertilização determina o tipo de gônada que se desenvolve a
partir de uma gônada indiferenciada. As gônadas, então, determinam o tipo de
diferenciação que ocorre nos ductos genitais e na genitália externa (MOORE, 1978).
Vários trabalhos relatam que a proporção de espermatozóides “X” e “Y” que
chegam até a porção superior do trato genital feminino poderia ser alterada e,
conseqüentemente, poderia alterar o sexo do feto, alteração essa que poderia ser
conseqüência de vários fatores. Segundo BETTERIDGE (1984), têm sido reportadas
várias abordagens práticas com o intuito de promover a sexagem dos
espermatozóides, tanto utilizando meios científicos quanto métodos empíricos.
Como meios científicos temos, por exemplo, o tempo de inseminação (WHELAN,
1974, FRANCE et al., 1984), utilização de diferentes métodos de inseminação, como
na utilização de duchas alcalinas ou ácidas para alterar o pH vaginal (DANIELL,
1983) e o emprego de dietas específicas (PAPA et al., 1983; STOLOWSKI, 1983).
Nenhum destes métodos supracitados apresentam efeitos sobre a alteração da taxa
do sexo do feto.
Até a data de 1998, HOSSAIN et al. (1998) afirmaram que não se dispõe de
uma metodologia de rotina e segura para a separação das duas populações
espermáticas (X e Y). As metodologias utilizadas no processamento do sêmen para
a separação destas populações ainda não forneceram um resultado seguro, rápido e
economicamente viável. Como exemplo destas metodologias, podemos citar: a
motilidade, a exploração da diferença de massa de cada população, o conteúdo de
DNA e a carga elétrica da superfície celular.
O antígeno HY é um epitopo antigênico macho-específico, o qual foi
observado pela primeira vez em 1955 por EICHWALD e SILMSER (citado por
HENDRIKSEN, 1999). Esse antígeno foi denominado “antígeno HY”, inicialmente por
BILLINGHAN e SILVERS (1960), onde o “H” se refere à histocompatibilidade, o “Y”
ao cromossomo “Y”. GOLDBERG et al. (1971) verificaram a presença do antígeno
HY por meio do teste de citotoxidade ou pela detecção de anticorpos macho-
11
específicos. EICHWALD e SILMSER (1955) descobriram que camundongos fêmeas
rejeitaram transplante de pele de camundongo macho isogênico, enquanto
transplante entre machos e entre fêmeas não resultou numa rejeição. De 1971 em
diante, muitos trabalhos sobre anticorpos direcionados contra antígeno HY têm sido
publicados ( WIBERG, 1987).
MÜLLER (1996) definiu também o antígeno HY como um antígeno de
histocompatibilidade de macho, o qual causa rejeição no transplante de pele de
macho para fêmea da mesma linhagem de roedores, onde o antígeno HY mostra ser
uma parte essencial da membrana da maior parte das células dos machos.
KOPPE e KOO (1984) mostraram que a porcentagem de espermatozóides
HY positivos difere das regiões do trato reprodutivo do macho, isto é, parece diminuir
durante seu transporte a partir do testículo para o epidídimo e vasos deferentes. Eles
sugerem que o antígeno HY aparece sobre a superfície dos espermatozóides
durante a associação com os constituintes testiculares e são removidos durante o
transporte epididimário e capacitação. Neste trabalho, eles também afirmam que o
uso do anticorpo monoclonal HY não influencia na taxa de fertilidade, obtendo
sucesso na fertilização de ovócitos de ratos com subseqüente nascimento da prole.
BRADLEY (1989) mostrou, em estudos imunohistoquímicos com alto título
sorológico detectado, que o antígeno macho-específico está aproximadamente em
50 % dos espermatozóides e está localizado sobre a região pós-acrossomal da
cabeça e na peça intermediária do flagelo. Relata, também, que o antígeno macho-
específico sobre os espermatozóides é um resultado da expressão do gene do
cromossomo haplóide Y. IYER et al. (1989) mostraram, também por testes
imunohistoquímicos, a localização do antígeno nas secções testiculares, onde este
estando presente no citoplasma das células de Leydig, sobre a membrana das
células de Sertoli e na cabeça do espermatozóide.
Inicialmente, acreditava-se que o antígeno HY era responsável pela
determinação do sexo, representando o fator determinante testicular (TDF) em
mamíferos, porém esta hipótese não tem sido aceita pelo fato da diferenciação
gonadal em camundongo poder ocorrer também na ausência do antígeno HY
(WOLF, 1998). Esta hipótese de Ohno’s também foi negada por SIMPSON (2001).
12
2.4. Produção de anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais vem-se tornando uma valiosa ferramenta
para as pesquisas científicas, pois através dos conhecimentos dos mecanismos de
ação das células responsáveis pela defesa do organismo é que os imunologistas,
médicos veterinários, químicos, biólogos e médicos vêm desenvolvendo vários
produtos, como: imunoterápicos, kits de diagnóstico e kits de imunossexagem.
Os anticorpos monoclonais apresentam duas características muito próprias. A
primeira é que estes anticorpos são extremamente específicos, e cada anticorpo liga
e ataca um antígeno em particular. A segunda, alguns anticorpos, uma vez ativados
pela ocorrência de doença, continuam conferindo resistência a esta doença (Access
Excellence).
Várias metodologias vêm sendo testadas com a finalidade de intensificar a
produção de hibridomas. Estas metodologias propõem modificações nos protocolos
de imunização e fusão, utilização de meios para cultivos de mieloma e hibridomas e
aproveitamento de diferentes linhagens de mieloma.
A tecnologia da produção de anticorpos monoclonais foi revolucionada em
1975, quando KOHLER e MILSTEIN descreveram a fusão de células esplênicas com
células de mieloma para a produção de linhagem de células imortais, hibridomas,
produzindo anticorpo para um epitopo em particular. Desde então, essa tecnologia tem
sido padronizada em muitos laboratórios para a geração de anticorpos monclonais
(HARRIS et al., 2002).
Anticorpos ou imunoglobulinas são um grupo de glicoproteínas presentes no
soro sangüíneo e no fluido tecidual de mamíferos. As glicoproteínas séricas podem ser
separadas de acordo com as suas cargas através do uso de eletroforese, HPLC e
anticorpos policlonais. Para eliminar substâncias estranhas, o reconhecimento e a
ligação entre o anticorpo e a superfície do antígeno são muito importantes. O local de
ligação no antígeno é conhecido como epitopo. STRYER (1992) define anticorpos
monoclonais como proteínas homogêneas específicas que são formadas em resposta
a um antígeno e que reagem especificamente contra esse antígeno.
Antes de 1975, só era possível produzir anticorpos policlonais. KOHLER e
MILSTEIN (1975) desenvolveram um método para produzir anticorpos monoclonais de
células hibridomas. Células hibridomas são formadas pela fusão do linfócito B, a partir
do baço do animal imunizado, com a célula mieloma, que tem a capacidade para
13
proliferação ilimitada. Este método permitiu que cientistas produzissem um clone de
células a partir de uma única fusão celular. Esta única célula fusionada pode ser
mantida em cultura celular para sempre, e irá continuar a secretar um único tipo de
anticorpo. Este anticorpo monoclonal pode ser usado para testar a presença de
antígenos específicos, para estudar reação cruzada entre antígeno, e a purificar
antígenos. O anticorpo monoclonal é específico para um determinado epitopo,
ocorrendo somente em determinadas proteínas. Logo, o anticorpo monoclonal permite
que cientistas isolem ou purifiquem proteínas específicas contendo um epitopo
específico.
Para produzir o hibridoma, como descoberto por KOHLER e MILSTEIN (1975),
uma célula tumoral maligna (mieloma) e um linfócito B são colocados juntos e
submetidos a tratamento químico com polietilenoglicol (PEG). Esta substância
desestrutura parcialmente as membranas celulares destas células e permite que estes
dois tipos celulares se fusionem. A célula híbrida retém a capacidade de crescimento
num meio específico no qual nenhuma célula esplênica e/ou células tumorais puras
não podem crescer. A célula híbrida vai possuir a imortalidade característica da célula
tumoral e a produção específica do anticorpo.
Em estudos feitos por OI e HERZENBERG (1980), foi verificado que as células
fusionadas linfócito-linfócito morriam após duas semanas da fusão quando cultivadas
em meio de cultura apropriado. Estes pesquisadores relatam que a especificidade dos
clones pode ser verificada através do teste de reatividade ao antígeno utilizado para a
produção dos anticorpos monoclonais e que estes hibridomas e os seus clones podem
ser injetados em animais isogênicos para induzir a produção em grande quantidade de
anticorpos específicos.
Foi observado que, após a fusão dos linfócitos e das células de mieloma, o
resultado apresentava três tipos celulares, sendo estes híbridos linfócito-linfócito,
mieloma-mieloma e linfócito-mieloma. Com o intuito de obter somente células híbridas
formadas por linfócito-mieloma, foi verificado que era necessário um meio seletivo
onde os híbridos celulares linfócito-linfócito e mieloma-mieloma não pudessem crescer
e, assim, foi verificado que após a fusão das células, estas deveriam ser transferidas
para o meio seletivo contendo hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), onde
vai ocorrer o bloqueio da via normal da síntese de nucleotídeos através da
aminopterina (antimetabólico), fazendo com que a célula utilize uma via alternativa e,
14
para isso, é necessária a utilização da hipoxantina e da timidina, para que as células
híbridas linfócito-mieloma não morram (KELLEY e LEWIN, 1986).
KOO (1981) relata que, antes da descoberta da metodologia da produção de
anticorpos monoclonais, os anticorpos anti-HY eram produzidos fazendo-se
hiperimunizações em fêmeas de camundongos ou de ratos utilizando-se como
antígeno células de baço de camundongos machos e verificou que das fêmeas
hiperimunizadas, somente 30 % apresentaram um boa resposta imunológica para o
antígeno HY, ou seja, somente 30 % apresentaram um alto título de anticorpos para o
antígeno.
15
3. MATERIAL E MÉTODO
3.1. Obtenção do material biológico
3.1.1. Leucócitos
Os leucócitos foram obtidos de eqüinos sem raça definida (SRD), machos e
fêmeas em bom estado de saúde, da instituição (UENF) e de produtores rurais. Para
a obtenção dos leucócitos utilizou-se um Ehrlenmeyer de 250 mL contendo 0,4 mL
de heparina sódica (5000 U.I./mL) e uma agulha 40x12. Foi feita punção na veia
jugular e o sangue retido no frasco. À medida que o sangue ia descendo, era
realizada sua homogeneização no frasco com suaves movimentos circulares. O
sangue foi vertido em tubos de 50 mL e colocado na geladeira para a sedimentação
das hemácias e dos leucócitos durante 1 hora. Após este tempo, os leucócitos foram
retirados com auxílio de uma pipeta Pasteur e depositados em tubos de 50 mL. Para
a purificação dos leucócitos foi realizada uma centrifugação em gradiente de
percoll®, onde se utilizaram duas concentrações, 90% e 50%, sendo vertida,
inicialmente, a solução de 50% e, depois, com o auxílio de uma seringa com agulha
longa, a solução de 90% foi depositada lentamente no fundo do tubo e, em seguida,
os leucócitos mais plasma foram depositados lentamente sobre a solução de 50%. A
centrifugação utilizada foi de 750 g por 10 minutos numa velocidade de aceleração e
de desaceleração lenta, a fim de não homogeneizar o gradiente de percoll® com
uma aceleração e parada brusca. Feita a centrifugação, os leucócitos ficaram retidos
16
entre o gradiente de 50 e 90% e as poucas hemácias que se apresentavam no
plasma passaram do gradiente de 90% e depositaram-se no fundo do tubo. Com o
auxílio da pipeta Pasteur, os leucócitos foram aspirados e depositados em tubos de
15 mL e, em seguida, foram lavados com o auxílio de uma centrífuga numa
velocidade de 1600 g por 10 minutos em tampão PBS por duas vezes para retirar o
percoll®.
3.1.2. Sêmen
O sêmen foi obtido de animais em idade reprodutiva, em perfeito estado
sanitário, de propriedade de produtores rurais do município de Campos dos
Goytacazes/RJ e da instituição (UENF). As coletas foram efetuadas por meio de
vagina artificial modelo “Hannover”, utilizando-se como parceira para o salto um
manequim artificial ou uma égua contida. Imediatamente após a coleta, o sêmen era
mantido a ± 37ºC em banho-maria e transportado para o laboratório para os exames
de concentração, motilidade e subseqüentes tratamentos.
3.2. Preparação do material biológico para inoculação
3.2.1. Extração de proteínas dos leucócitos
Após a obtenção (purificação) dos leucócitos, foi adicionado detergente
(NONIDET-NP 40® – 0,1% V/V) em tampão PBS para extrair as proteínas de
membrana, deixando as amostras a uma temperatura de 5ºC ± 0,5º por 12 horas;
transcorrido este tempo, foi realizada uma ultracentrifugação (18000 g / 30 minutos),
onde se coletou o sobrenadante e fez-se o descarte do sedimento.
3.2.2. Espermatozóides íntegros
Após a coleta do ejaculado, como descrito na obtenção do sêmen, este foi
filtrado em gaze estéril onde as impurezas e fração gelatinosa ficaram retidas na
gaze. O conteúdo remanescente foi vertido em tubos de 15 mL até o volume de 10
mL. O ejaculado foi centrifugado numa velocidade de 1600 g por 10 minutos. Após
transcorrido este tempo, o sobrenadante foi descartado e o sedimento
17
ressuspendido em tampão PBS, sendo esta etapa de lavagem repetida por várias
vezes.
3.2.3. Extração de proteínas dos espermatozóides
Seguindo a técnica de obtenção de espermatozóides íntegros conforme o
item 3.2.2, descartou-se o sobrenadante da última lavagem e adicionou-se às
células, contidas no sedimento, detergente (NONIDET-NP 40® – 0,1% V/V) em
tampão PBS para extrair as proteínas de membrana, sempre deixando as amostras
a uma temperatura de 5ºC ± 0,5º por 12 horas. Transcorrido este tempo, realizou-se
a ultracentrifugação (18000 g / 30 minutos), onde se coletou o sobrenadante que
continha as proteínas e fez-se o descarte do sedimento.
3.3. Determinação da concentração das proteínas
A concentração protéica foi determinada pelo método de Bradford
(BRADFORD, 1976).
3.4. Eletroforese monodimensional das proteínas de membranas celulares
As separações das proteínas foram efetuadas em géis de poliacrilamida SDS-
PAGE a 12% (tabela 1A e 2A) confeccionados em placas de 20 X 20 cm (BIO-RAD
System). Após a polimerização do gel, as proteínas de membrana já processadas e
diluídas no tampão de amostra (tabela 3A) foram depositadas nos poços (gel
concentrador) dos géis entre as placas de eletroforese. A eletroforese se efetuou a
uma corrente de 60 Volts no início da migração (gel de concentração), após o qual,
quando as proteínas penetraram no gel de separação, a corrente foi elevada para 80
Volts. Para a migração eletroforética foi utilizado uma tampão com SDS pH 8,3
(tabela 3A).
18
3.5. Análise do gel de eletroforese
Após a migração eletroforética das proteínas, o gel foi corado e descorado de acordo com RETAMAL et al. (1999) e depois foi digitalizado, com o auxílio de um scanner comercial de 400 dpi
transformando a imagem adquirida em tons de cinza e salvando como imagem tif. As análises das proteínas foram realizadas
utilizando-se o programa densitográfico GEL-PERFECT (BOZZO E RETAMAL 1991,).
Através deste programa, foi determinada a massa molecular das proteínas,
comparando-as com a migração proteica de uma amostra padrão, no mesmo gel.
3.6. Extração das proteínas dos géis de poliacrilamida
A extração das proteínas dos géis, ou seja, a purificação dos antígenos foi
realizada de acordo com a teoria de RETAMAL et al. (1999) e modificado de acordo
com o descrito abaixo, onde as proteínas de espermatozóides foram depositadas em
um poço único sobre toda a extensão do gel e, após a eletroforese, as fitas laterais
dos géis contendo as bandas proteicas foram cortadas, que consistem em uma fita
contendo as bandas dos padrões e uma pequena parte da migração do material em
questão e outra fita do lado oposto contendo somente a migração do material. Estas
fitas foram, então, colocadas por cerca de 1 a 2 horas em cubas contendo a solução
de coloração (tabela 4A). Transcorrido este tempo, fez-se a descoloração das fitas,
que foi efetuada por meio de um microondas a uma potência máxima por 5 minutos,
utilizando-se água como solução, e repetindo este processo até que as bandas
estivessem bem contrastadas em relação ao fundo incolor do gel. As fitas, uma vez
descoradas, foram recolocadas nos seus devidos lugares em relação ao padrão e,
assim, observando-se a banda de interesse. Elas foram, então, cortadas em tiras
utilizando-se uma régua e um papel com uma reta traçada, a qual serve de
alinhamento para o corte preciso das bandas das proteínas de interesse. Após o
corte destas, as tiras foram trituradas com o auxílio de um bastão e, depois,
sonicadas, utilizando-se 20 ciclos de 30 segundos. A extração foi feita por meio de
um sonicador (20 ciclos de 30 segundos), onde as amostras eram mantidas em um
tubo envolto por gelo picado para não deixar aquecer as proteínas. Após este
processo, as amostras foram centrifugadas a ± 18000 g por 20 minutos, de onde o
sobrenadante foi retirado e armazenado no freezer a uma temperatura de ± – 70ºC.
19
3.7. Imunização dos animais
Na primeira parte deste projeto, foram utilizadas as proteínas purificadas de
membrana de leucócitos, extraídas do gel de eletroforese monodimensional (Gel
poliacrilamida SDS-PAGE 12%), que se apresentaram diferentes nas concentrações
perante a análise do gel para as proteínas de leucócitos de macho e fêmea. Para a
imunização dos animais (camundongas da linhagem Balb/c) seguiu-se um protocolo
conforme a tabela 5A.
Na segunda parte que se divide em primeira e segunda etapa, as
imunizações se deram da seguinte maneira: para a determinação da proteína sexo-
específica utilizando-se células espermáticas na primeira etapa, os animais
(camundongos e coelhos - macho e fêmea e égua) foram imunizados com
espermatozóides íntegros. Os camundongos (macho e fêmea) foram imunizados
com espermatozóides de eqüino íntegros numa concentração de 200 x 106
espermatozóides/mL, sendo o volume total da dose imunizante de 0,5 mL, composta
de 250µL da solução de espermatozóides mais 250µL de adjuvante. Os coelhos
(macho e fêmea) foram imunizados com 1mL de um composto de 750µL da solução
de espermatozóides mais 250µL de adjuvante. A égua foi imunizada com 2mL,
composto de 1500µL da solução de espermatozóides de eqüino íntegros mais 500µL
de adjuvante. A primeira inoculação foi feita com adjuvante completo de Freund’s e
as posteriores inoculações foram feitas com adjuvante incompleto (hidróxido de
alumínio).
Após a identificação das proteínas sexo-específicas pelo teste Western-
blotting (item 3.8), seguiu-se para a segunda etapa da pesquisa, quando os animais
(camundongas da linhagem Balb/c com idade em torno de três meses) foram
inoculados com as proteínas sexo-específicas purificadas da membrana de
espermatozóides numa quantidade em torno de 150 µg de antígeno, seguindo-se o
protocolo de imunização para camundongos na tabela 5A, cujas proteínas foram
extraídas do gel de eletroforese monodimensional (Gel poliacrilamida SDS-PAGE
12%).
20
3.8. Western Blotting
Depois da corrida eletroforética, os géis, contendo as proteínas de membrana
de espermatozóides de eqüino macho e fêmea, foram colocados em contato com
papel de nitrocelulose e este conjunto, protegido com papel-filtro Whatman®, foi
mantido na cuba com tampão de transferência (tabela 6A) durante duas horas a
10Volts.
Terminada a transferência, o papel de nitrocelulose (0,45µ de porosidade) foi
submetido ao corante Ponseau® para verificar se houve a transferência e para
auxiliar no corte das tiras. As tiras foram bloqueadas com leite a 2% por 12 horas,
sendo secas com papel-filtro e armazenadas no freezer –70ºC para posterior
revelação imunoenzimática.
Na revelação imunoenzimática, cada fita de papel de nitrocelulose contendo o
perfil das proteínas seguiu um protocolo abaixo descrito de incubação com soros no
objetivo de se evidenciarem as proteínas sexo-específicas.
Protocolo de incubação para revelação imunoenzimática:
1- Bloqueio das fitas com leite-em-pó a 2%, durante 120 minutos;
2- Incubação com soro de macho ou fêmea hiperimunizado com espermatozóides,
durante 60 minutos;
3- Incubação com imunoglobulina conjugada com peroxidase, especifica contra IgG
da espécie em estudo, diluído na proporção de 1:2000 em tampão PBST, durante 90
minutos;
4- Lavagem abundante com tampão PBST, contendo 0,05% de Tween 20;
5- Revelação imunoenzimática (substrato - DAB)
A coloração foi realizada por 10 minutos, após a qual ela foi parada pela
lavagem com tampão PBST.
3.9. Produção de anticorpos policlonais
Os camundongos utilizados na produção de anticorpos policlonais foram os
da linhagem BALB/c, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro - UENF.
21
Para a produção destes anticorpos foram utilizados como antígenos, na
primeira parte, no que se refere aos leucócitos, proteína de membrana de leucócito
de eqüino macho e fêmea; já na segunda parte, no que se refere aos
espermatozóides, foram utilizados para a primeira etapa os espermatozóides
íntegros eqüinos e para a segunda etapa as proteínas purificadas de
espermatozóides eqüinos.
3.10. Teste de ELISA
O teste de ELISA foi usado para verificar se os animais imunizados estavam
produzindo resposta contra os antígenos inoculados.
Para testar os animais imunizados com as proteínas dos leucócitos e
espermatozóides íntegros, a sensibilização da placa se deu utilizando-se um
conjunto protéico o qual foi diluído para uma concentração final de 5 µg/mL em
tampão carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6 (0,80 g 0,015 M Na2CO3, 1,47 g 0,035
M NaHCO3 e 500 mL H2O destilada), sendo colocados 100 µL em cada um dos 96
poços. A placa foi, então, colocada na geladeira a ± 8ºC por 12 horas. Após
sensibilização, a placa foi lavada quatro vezes com PBS pH 7.4 com um volume de
250 µL e bloqueada com 100 µL de gelatina 2% durante duas horas na estufa a ±
37°C. Lavou-se, novamente, a placa e o primeiro anticorpo utilizado foi o soro de
cada animal inoculado (screening), adicionando-se 100 µL em cada poço, sendo
este soro diluído na proporção de 1:100. A placa foi, então, levada à estufa por uma
hora a ± 37°C. Foi utilizado como controle negativo o soro de um camundongo não
imunizado.
A placa foi então novamente lavada quatro vezes com PBS pH 7.4 e, logo
após, foi adicionado anticorpos anti-IgG, das espécies utilizadas como primeiro
anticorpo, conjugado com peroxidase (Sigma Co.,USA) na diluição de 1:2000 em
todos os poços. A placa foi, então, posta na estufa por uma hora a ± 37°C. Em
seguida, a placa foi lavada novamente e foi adicionado 50 µL do substrato para
peroxidase (6,5 mL 0,1N de Ácido Cítrico, 7,0 mL 0,2N de Fosfato de Sódio, 11,5 mL
de água destilada, 10 µL de água oxigenada volume 30 e 10 mg de
Ortofenildiamina). A placa foi protegida da luz e deixada reagir durante 15 minutos.
Transcorrido este tempo, a reação foi interrompida com 50 µL de Ácido Sulfúrico 3N.
22
3.11. Obtenção dos macrófagos peritoniais
Para a obtenção dos macrófagos peritoniais foi, primeiramente, realizado o
sacrifício dos camundongos por deslocamento cervical e, em seguida, os
camundongos foram lavados com álcool 70%, secos com papel-toalha e fixados
numa plataforma. Os camundongos já fixados eram levados ao fluxo laminar (para
realizar-se a retirada asséptica dos macrófagos), sendo feito um pequeno corte na
pele, na porção ventral e, a seguir, a pele foi divulsionada e rebatida em todo a
extensão do abdômen, em seguida eram injetados 5 mL de meio DEMEN-F12 sem
soro fetal a uma temperatura de 4 a 8ºC, o qual era mantido na cavidade abdominal
por 2 minutos. Após esse tempo, foi feita a aspiração do meio da cavidade e, após
colocado em tubos tipo Falcon® de 15 mL, foram adicionandos mais 5 mL de meio à
temperatura de 4 a 8ºC. Finalmente, esta solução contendo os macrófagos foi
centrifugada a ± 720 g/10 minutos/5ºC.
3.12. Fusão
Os camundongos utilizados na produção de anticorpos monoclonais foram os
da linhagem BALB/c utilizados na produção dos anticorpos policlonais, provenientes
do Biotério Central da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro –
UENF, empregados na primeira parte (utilizando-se como material biológico
proteínas sexo-específicas de membrana de leucócitos) e, na segunda etapa da
segunda parte os que utilizou-se como material biológico proteínas sexo-específicas
de membrana de espermatozóides.
Para a realização da técnica de fusão, foram utilizadas as células de mieloma
(NS0) da linhagem BALB/c, as quais eram mantidas armazenadas em nitrogênio
líquido e descongeladas cerca de uma semana antes da fusão, e esplenócitos de
camundongos, isogênicos da linhagem BALB/c, hiperimunizados. Os camundongos
foram sacrificados por deslocamento cervical e os baços retirados de maneira estéril,
sendo colocados em duas placas de Petri contendo meio de cultivo DMEM-F12 sem
soro fetal bovino. Os baços foram tratados separadamente e todas as manipulações
foram feitas em ambiente estéril.
Com o auxílio de duas seringas agulhadas, e estas agulhas previamente
dobradas, as células do baço foram dissociadas manualmente em meio DMEM-F12
sem soro fetal bovino. O sobrenadante, contendo células dissociadas do baço foi
23
recuperado e submetido à centrifugação de oito minutos a 400 G, em temperatura
ambiente. Estas células foram lavadas três vezes com meio DMEM-F12 com soro
fetal bovino, suspendidas novamente e contadas na câmara hematimétrica de
Newbauer. As grandes células brilhantes representam os blastos em fase de
diferenciação.
As células de mieloma foram lavadas em meio DMEM-F12 com soro fetal
bovino, e as células vivas contadas. As células de mieloma foram misturadas com
esplenócitos numa proporção de 1:4 e o conjunto foi centrifugado a 155 G durante
10 minutos à temperatura ambiente. Para induzir a fusão, 1 mL de Polietilenoglicol
(PEG-1000) foi depositado no tubo contendo as células de mieloma e esplenócitos,
delicadamente durante ± 1 minuto e, imediatamente após este procedimento, 2 mL
do meio DMEM-F12 com 10% de soro fetal foram adicionados lentamente durante 2
minutos, em seguida, mais 10 mL do meio DMEM-F12 com 10% de soro fetal foram
adicionados. As células foram homogeneizadas e distribuídas em placas de cultura
de 96 poços, sendo estas preparadas com 2 dias de antecedência, isto é, foram
depositados nos poços macrófagos peritoniais de camundongos para que os fatores
de crescimento pudessem ser concentrados no meio de cultura. Feita a distribuição,
as placas foram levadas à estufa sob uma condição de temperatura de ± 37ºC e
uma concentração de 5% de CO2.
As culturas de células foram colocadas na estufa durante 10 dias, sem que
houvesse nenhuma intervenção, a fim de deixar os híbridos se multiplicarem e
começarem a formação dos clones celulares. Após este período, o crescimento dos
clones foi observado diariamente ao microscópio e quando estes clones ocuparam
1/4 do orifício ou mais, foram coletadas pequenas alíquotas de sobrenadante das
culturas e testadas pelo teste de ELISA para verificação da produção de anticorpos
específicos para o antígeno em estudo. Os clones positivos foram ampliados e
posteriormente sub-clonados com o objetivo de se obter um anticorpo que fosse
realmente monoclonal.
24
3.13. Testes dos clones
Para identificar quais clones estavam produzindo anticorpos para as proteínas
sexo-específicas purificadas, utilizou-se também o teste de ELISA como descrito no
item 3.9. As proteínas extraídas dos géis foram diluídas também numa concentração
de 5 µg/mL em tampão carbonato/bicarbonato e o primeiro anticorpo utilizado foi
sobrenadante da cultura de células, onde se adicionaram 100 µL em cada poço.
Para identificar os clones que estavam produzindo anticorpos utilizou-se como
controle positivo o soro do camundongo imunizado com as proteínas extraídas dos
géis e como controle negativo foi utilizado o soro de um camundongo não
imunizado.
25
4. RESULTADOS
4.1. Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do gel
Na figura 1, pode-se observar a migração proteica contendo o material de
macho à direita e de fêmea à esquerda e ao centro a amostra padrão e as áreas
selecionadas para posterior análise.
Figura 1: Migração eletroforética no gel de poliacrilamida 12 % SDS-PAGE das proteínas dos leucócitos de macho e fêmea. O retângulo amarelo representa o perfil protéico dos leucócitos de fêmea; o retângulo laranja representa o perfil protéico dos leucócitos de macho e o retângulo azul representa as amostras padrão de massa molecular 66 kDa, 45 kDa, 29 kDa, 24 kDa, 20,1 kDa e 14,2 kDa.
26
Após a análise densitográfica do gel contendo as proteínas de leucócitos de
macho e de fêmea, obtivemos como resultado a diferença de concentração de três
proteínas, sendo de duas para macho de peso molecular 68 e 46 kDa e uma para
fêmea de 35 kDa. Observando a tabela 7A, podemos verificar essas diferenças
encontradas na análise.
Tabela 7A: Resultado da análise do gel onde se verifica a diferença na concentração
das proteínas de leucócitos de macho e fêmea.
Para obtermos os dados da tabela acima foi feita a determinação de cada fita
densitométrica a ser analisada e de cada uma das fitas foi feito um gráfico. Tendo
assim os seguintes gráficos obtidos através da análise conforme a figura 2.
27
Figura 2: Resultado da análise do gel onde se verificam as diferenças na concentração das proteínas de leucócitos de macho e fêmea observando as curvas dos gráficos.
O resultado da análise do gel se resume na figura 3, onde se evidenciam as
proteínas de peso molecular 68 e 46 kDa para o macho e 35 kDa para fêmea, cujas
diferenças nas concentrações são expressadas pelos picos das curvas.
Figura 3: Resultado da análise do gel onde se verifica a diferença na concentração das proteínas de leucócitos de macho (68 e 46 kDa) e fêmea (35 kDa). Estas diferenças significativas entre machos e fêmeas são observadas através de um traço.
28
4.2. Extração, purificação e quantificação das proteínas sexo-específica
Para a extração das proteínas sexo-específicas foram utilizadas membranas
citoplasmáticas de leucócitos macho e fêmea conforme o item 3.2.1. A purificação e
a quantificação dessas proteínas foram realizadas conforme os itens 3.6 e 3.3,
respectivamente, onde as proteínas extraídas dos géis apresentam o peso molecular
de 68, 46 e 35 kDa.
4.3. Produção dos anticorpos monoclonais contra as proteínas sexo-
específicas de leucócitos
As proteínas oriundas da extração e purificação foram inoculadas em
camundongos para a produção dos monoclonais. As inoculações seguiram o
esquema descrito no item 3.7. Feita a fusão e transcorridos dez dias, foi observado o
crescimento de 44 clones apresentados a seguir:
Placa 1: B3, B4, B7, C2, C5, C7, C10, D5, D6, D8, G9 e G10
Placa 2: C10, D2, D4, G6, G8, G9 e G10
Placa 3: C6, D3, D6, D7, E2, E3, E10 e F10
Placa 4: C2, C8, B9, D4, D10, F2, F5, F6 e F10
Placa 5: C6, F3 e G6
Placa 6: D8, D6, E4, E7 e G10
Os clones produzidos foram testados pela técnica de ELISA, onde não se
obtiveram resultados satisfatórios (não houve a produção de clones positivos contra
as proteínas de membrana de leucócitos), o que nos fez seguir para a segunda parte
do projeto.
29
4.4. Identificação das proteínas sexo-específicas através da análise do
western-blotting
Para se chegar às proteínas macho-específicas foram feitas inoculações em
camundongos machos e fêmeas, coelhos machos e fêmeas e égua, daí pôde-se
observar a presença de três proteínas (conforme a figura 4) pelo teste Western-
Blotting. O material utilizado como antígeno para este teste foi um conjunto de
proteína de espermatozóides de diferentes garanhões e foram utilizados dois soros,
que têm a finalidade de bloquear as proteínas com o primeiro anticorpo e depois o
segundo anticorpo para se ligar somente à proteína sexo-específica, já que estas
proteínas não foram reconhecidas pelo primeiro anticorpo.
Figura 4: Western-Blotting para a localização das proteínas sexo-específicas utilizando soro de camundongos machos e fêmeas, coelhos machos e fêmeas e égua e como antígeno foi utilizado um pool de proteínas de espermatozóides de diferentes garanhões.
Nesta figura 4, podemos observar 3 proteínas de interesse, que são,
aproximadamente: 19, 21 e 35 kDa. Com este resultado, foi dado início à segunda
etapa do projeto de pesquisa, que foi a purificação das proteínas (figura 5) e a
inoculação em camundongos fêmeas com as proteínas de interesse.
0- Padrão
1º Anticorpo 2º Anticorpo
1- Soro coelho ♂; soro camund. ♂
2- Soro coelho ♀; soro camund. ♀
3- Soro coelho ♂; soro camund. ♀
4- Soro coelho ♀; soro camund. ♂
5- Soro camund. ♂; soro coelho ♂
6- Soro camund. ♀; soro coelho ♀
1º Anticorpo 2º Anticorpo
7- Soro camund. ♂; soro coelho ♀
8- Soro camund. ♀; soro coelho ♂
9- Soro égua
10- Soro coelho ♀; soro égua
11- Soro coelho ♂; soro égua
Diluição do conjugado → 1:1000
Diluição do anticorpo → 1:50
0
66 kDa 45 kDa 29 kDa 24 kDa 20 kDa 14 kDa
30
A purificação das proteínas foi feita através da técnica descrita anteriormente
no item 3.6.
Figura 5: Eletroforese mostrando o resultado da extração e purificação das proteínas sexo-específicas de peso molecular de 19, 21 e 35 kDa de espermatozóides de eqüinos.
Para confirmar que as proteínas purificadas estavam com
peso de 19, 21 e 35 kDa, o gel de eletroforese foi digitalizado (figura 5) e submetido à análise no programa GEL-PERFECT (BOZZO E
RETAMAL 1991), e o resultado da extração pode ser verificado na figura 6.
Figura 6: Resultado da análise do gel onde se verificam as diferenças na
concentração das proteínas extraídas do gel, observando os picos das proteínas com seus respectivos pesos moleculares na diferença entre as curvas.
31
4.5. Imunização dos camundongos
Feitas as inoculações em comundongos fêmeas da linhagem Balb/c,
realizamos o teste de ELISA em soro destes animais para verificar se o soro estava
apresentando resposta para as proteínas de interesse e um bom título de anticorpos
a fim de se fazer a fusão. Na tabela 8A, podemos observar os resultados do último
teste de ELISA antes da fusão. A leitura do teste de ELISA foi feita com um
comprimento de onda de 493 nanômetros no aparelho AWARENESS® –
(THECHNOLOGY INC) STAT FAX - 2100.
Tabela 8A: Resultado do último teste de ELISA para as proteínas de 19, 21 e 35 kDa
antes da fusão.
1 2 3 4 5 6 A 1,739 0,700 0,710 1,120 0,366 2,936 B 1,336 0,729 0,557 1,064 0,365 2,936 C 1,070 0,563 0,400 1,771 0,360 2,933 D 0,831 0,458 0,346 1,805 0,365 2,933 E 0,595 0,375 0,333 0,496 0,414 F 0,486 0,350 0,329 0,430 0,367 G 0,389 0,299 0,323 0,273 0,339 H 0,360 0,292 0,338 0,280 0,330
Colunas 1, 2 e 3 – proteína de espermatozóides + Bloqueio + Soro (1:50) + Conjugado + Substrato => soro diluído em log 2 Colunas 4 – proteína de espermatozóides + Soro + Bloqueio + Conjugado + Substrato Colunas 5 – Bloqueio + Soro + Conjugado + Substrato Colunas 6, linhas A-D – Conjugado + Substrato Coluna: 1- Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa 2- Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa 3- Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa 4- linhas A e B - Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa (1:200) 4- linhas C e D - Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa (1:200) 4- linhas E e F - Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa (1:200) 4- linhas G e H - proteína de espermatozóide + Bloqueio + Conjugado +
Substrato 5- linhas A - Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa (1:100) 5- linhas B - Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa (1:100)
5- linhas C - Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa (1:100) 5- linhas D - Soro de camundongo inoculado → proteína 19 KDa (1:200) 5- linhas E - Soro de camundongo inoculado → proteína 21 KDa (1:200)
5- linhas F - Soro de camundongo inoculado → proteína 35 KDa (1:200) 5- linhas G e H - Bloqueio + Conjugado + Substrato
Obs: Conjugado (Biotina/Estreptavidina) => 1:4000
Proteínas => [10µg/ml]
32
4.6. Fusão (Produção dos anticorpos monoclonais)
Partindo da idéia de que a proteína de 35 kDa poderia ser um dímero da
proteína de 19 kDa, foi decidido, então, trabalhar com as proteínas de 19 e 21 kDa,
mas não descartando totalmente a proteína de 35 kDa. Sendo assim, os
camundongos que foram inoculados com as proteínas de 19 e 21 kDa foram
sacrificados e seu baço retirado, conforme descrito no material e método no item
3.12. Foram feitas várias fusões que apresentaram somente o crescimento de 11
clones para a proteína de 19 kDa e 14 para a de 21 kDa.
4.7. Teste dos anticorpos monoclonais
As proteínas originárias da extração e purificação foram inoculadas em
camundongos para a produção dos monoclonais. As inoculações seguiram o
esquema descrito no item 3.7. Feita a fusão e transcorridos dez dias, foi observado o
crescimento de 25 clones e somente 17 continuaram crescendo. Estes são
apresentados a seguir:
Placa dos clones contra a proteína de 19 kDa
C3, D4, F4, E5, F5 e E5
Placa dos clones contra a proteína de 21 kDa
B7, B2, F2, C3, D4, D7, E9, E10, D11, E11 e G11
Feitas 10 repetições do teste de ELISA, obteveram-se somente 3 clones que
se apresentaram fracamente positivos que, são: C3 e E5 de 19 kDa e E10 de 21
kDa. Logo, este resultado pode ser observado na tabela 9A, onde foi utilizado
sobrenadante de cultura de células, onde cada clone foi testado separadamente, e o
controle positivo utilizado era o próprio soro, diluído numa proporção de 1:200, dos
animais inoculados com a proteína sexo-específica de 19 e 21 kDa. O conjugado foi
utilizado numa diluição de 1:2000 e o controle negativo numa diluição de 1:200,
onde se utilizou soro de animais não inoculados.
33
Tabela 9A: Resultado do teste de ELISA para a determinação dos clones positivos.
Clones Resultado do teste de ELISA 19 kDa 21 kDa
E5 B7 D11 0,155 0,111 0,126 C3 B2 E11 0,162 0,136 0,110 D4 F2 G11 0,103 0,076 0,102 F4 C3 + 0,093 0,117 0,257 F5 D4 - 0,085 0,108 0,072 C6 D7 branco 0,122 0,101 0,071 + E9 branco 0,648 0,113 0,073 - E10 conjugado 0,071 0,162 3,588
34
5. DISCUSSÃO
A sexagem como um todo sempre despertou o interesse na comunidade
científica desde a antiguidade até os dias de hoje e, dentro da Medicina Veterinária,
há um grande interesse voltado para os animais de produção (bovino, ovinos e
caprinos), esporte e lazer, como os eqüinos, e também quanto ao aspecto
conservacionista de animais em extinção.
Neste trabalho, objetivando-se identificar antígenos sexo-específicos,
purificaram-se membranas de leucócitos de animais de ambos os sexos. A escolha
de leucócitos foi devido ao fato de ter sido anteriormente detectada a presença de
antígenos sexo-específicos em leucócitos, visto que estas células foram
responsáveis pela rejeição de enxertos de camundongos isogênicos, que se
diferenciavam apenas pelo sexo (MÜLLER,1996).
A primeira parte do trabalho teve como base científica a pesquisa do antígeno
H-Y presente nas células de machos e ausente nas de fêmeas, o que foi descrito por
BRADLEY (1989), que mostrou em estudos imunohistoquímicos, utilizando soro com
alto título de anticorpos, que o antígeno macho-específico estava presente em
aproximadamente 50% dos espermatozóides, demonstrando que, num ejaculado,
50% dos espermatozóides são possuidores do cromossomo Y portando o antígeno
HY, enquanto que os outros 50% são possuidores do cromossomo X e, portanto,
não possuem o antígeno HY.
Foi feita uma migração eletroforética (gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12%),
onde, ao final, este gel foi corado e descorado de acordo com o descrito em material
35
e método no item 3.6 e, após esta etapa, o gel foi digitalizado, sendo depois a figura
submetida ao programa GEL-PERFECT (BOZZO E RETAMAL 1991) de acordo com
o descrito em material e método no item 3.5, onde o resultado desta análise teve
como diferença 3 proteínas, sendo estas de 68 e 46 kDa para o material de macho e
35 kDa para fêmea. Este achado corrobora o que foi descrito por BRADLEY (1989);
que existe diferença na constituição protéica do tecido de macho para fêmea, o que
também vem corroborar com o que disse MÜLLER (1996); que o antígeno H-Y,
como um antígeno de histocompatibilidade de macho, causa rejeição no transplante
de pele de macho para fêmea da mesma linhagem de roedores, e o antígeno H-Y
estar presente na membrana da maior parte das células dos machos.
Para a primeira parte do trabalho, não obtivemos resultados satisfatórios, pois
os monoclonais produzidos a partir das proteínas de membrana de leucócitos não
apresentaram resposta contra as proteínas de membrana de células espermáticas.
Provavelmente, os antígenos sexo-específicos encontrados nas células leucocitárias
apresentavam-se de forma ou composição diferentes daqueles encontrados nos
espermatozóides. A composição das proteínas de membrana espermática variam
entre células de acordo com o grau de maturidade, como demonstrado por
RETAMAL et al. (2000).
Estes fatos talvez sejam os responsáveis pelo insucesso da produção do
monoclonal a partir de proteínas de membrana de leucócitos. Partimos, então, para
a segunda parte do trabalho, que foi a pesquisa do antígeno HY na membrana de
espermatozóides. Embora sabendo da pouca antigenicidade do antígeno HY, e que
muitos pesquisadores não obtiveram resultados satisfatórios na busca da sexagem
dos espermatozóides, como já descrito por KOO (1981), que somente 30% das
fêmeas de camundongos imunizadas produziam um soro com alto título de anticorpos
anti HY, mesmo assim, achamos válida a pesquisa do antígeno HY em membrana de
espermatozóides de eqüino.
Partindo do fato, relatado por EDIDIN e JOHNSON (1977), e COHEN e
HENDRY (1978), de que inoculações de células espermáticas de várias espécies no
coelho provocam a produção de anticorpos que puderam ser verificados in vitro a
partir da aglutinação de espermatozóides, foi dado início, então, à segunda parte do
trabalho.
36
Esta etapa foi a de determinar as proteínas sexo-específicas utilizando-se
soro de camundongos e coelhos (macho e fêmea) e soro de égua através do teste
de Western-blotting, verificando-se as bandas marcadas no papel de nitrocelulose.
Após as inoculações com as células espermáticas íntegras, soros de
camundongos e coelhos (machos e fêmeas) e soro de égua foram testados por
western-blotting, quando foi verificada a presença de 3 proteínas, 19, 21 e 35 kDa,
sendo que esta apresentação variava de acordo com o segundo anticorpo utilizado.
Quando o imunobloqueio era realizado utilizando-se anticorpos de macho ou de
fêmea, os resultados não variavam. Entretanto, quando o segundo anticorpo
utilizado era proveniente de macho ou de fêmea, houve diferenças acentuadas. Se o
segundo anticorpo utilizado era proveniente de animais de sexo masculino,
observavam-se as três proteínas supracitadas, e quando o segundo anticorpo era
proveniente de animais do sexo feminino, apenas a proteína de 21 kDa era
evidenciada.
O fato da proteína de 21 kDa estar evidente de forma exclusiva quando o
segundo anticorpo era proveniente de fêmeas, nos faz imaginar que esta proteína
seja o antígeno HY ou macho específico. Em relação às proteínas de 35 kDa e de
19 kDa, estas provavelmente são evidenciadas pelo mau bloqueio produzido pelo
anticorpo primário ou pelo não-reconhecimento do segundo anticorpo quando este
era proveniente de fêmea, por se tratar de um antígeno fêmea específico.
Comparando-se os resultados obtidos neste trabalho com proteínas de
membrana de leucócitos e de membrana de espermatozóides, podemos supor que a
proteína de 35 kDa encontrada no material de membrana de leucócito de fêmea foi
semelhante à proteína de 19 e 35 kDa encontrada na membrana de
espermatozóides. Podemos, também, supor que a proteína de 19 kDa encontrada
seria um monômero, enquanto que as proteínas de 35 kDa seriam um dímero desta.
Já a proteína de 21 kDa, encontrada na membrana de espermatozóides,
apresentava-se como monômero das proteínas de 46 e 68 kDa encontradas na
membrana de leucócitos de machos.
Estas proteínas que foram determinadas como sexo-específicas para eqüino,
são de fundamental importância para posteriores estudos da sexagem de
espermatozóides, sendo necessário fazer subclonagens destes clones para uma
melhor especificidade do anticorpo para com o antígeno.
37
6. CONCLUSÕES
1- Verificou-se a grande dificuldade da produção de monoclonais a partir de
proteínas de membrana de leucócitos contra as proteínas sexo-específicas de
membrana de espermatozóides de eqüino.
2- Verificou-se a baixa antigenicidade das proteínas sexo-específicas de eqüino.
3- Obteve-se a produção de três monoclonais contra a proteína de membrana de
células espermáticas de eqüinos, sendo estes dois monoclonais para a proteína de
19 kDa e um monoclonal para a proteína de 21 kDa.
38
7. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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APÊNDICES
Tabela 1A: Preparação dos géis utilizados na separação das proteínas purificadas de membrana de leucócitos e espermatozóides eqüinos.
Gel �
Soluções ↓↓↓↓
Migração (12%) Concentrador (4%)
Água destilada 16,4 ml 6,8 ml
Tris base/Hcl → pH 8,8
12,5 ml ----
Acrilamida/Bis. 30% 20,0 ml 1,7 ml
PSA 10% 400 µl 50 µl
TEMED 200 µl 40 µl
Tris base/Hcl → pH 6,3
---- 1,25 ml
Tabela 2A: Reagentes (soluções estoque) utilizados para a preparação dos géis em gradiente para a separação das proteínas purificadas de membranas de leucócitos e espermatozóides de eqüino.
Solução 1,5 M Tris base/HCl, pH 8,8
1,5 M Tris base/HCl, pH 8,8 181,65 g / L
SDS a 0,4 % p / v 4 g / L
Solução 0,5 M Tris base/HCl, pH 6,3
0,5 M Tris base/HCl, pH 6,3 60,55 g / L
SDS a 0,4 % p / v 4 g / L
Solução PSA – Estoque
Persulfato de amônio a 10 % 100 g / L
Acrilamida/Bis. estoque (30%)
Acrilamida 29,2 g
Bis-acrilamida 0,8 g
Água destilada q.s.p. 100 mL
Tabela 3A: Tampões utilizados para a preparação dos géis em gradiente para a separação das proteínas purificadas de membranas de leucócitos e espermatozóides de eqüino.
Tampão c/ SDS, pH 8,3
Tris base 30,28 g
Glicina 142,0 g
SDS 10,0 g
Água destilada q.s.p. 1000 mL
Tampão de amostra
Água destilada 3,0 mL
Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8 1,0 mL
Glicerol 1,6 mL
SDS a 10 % (p / v) 1,6 mL
Beta-mercaptoetanol 0,4 mL
Azul de bromofenol 0,4 mL
Tabela 4A: Coloração do gel com azul brilhante de Coomassie, (REISNER et. al.,
1984), contendo o perfil eletroforético das proteínas purificadas de membranas de leucócitos e espermatozóides de eqüino.
Solução de coloração
Azul brilhante de coomassie R-250 0,5 g
Metanol 250,0 mL
Ácido acético 50,0 mL
Água destilada q.s.p. 500,0 mL
Tabela 5A: Protocolo de imunização para a produção de anticorpos monoclonais.
Imunização Dias antes da fusão Via de Inoculação Inoculo
1 -15 IP* 50µg de Ag/0,1 mL
de PBS + 0,1 ml de Adj.
Compl. de Freund
2 -8 IP* 50µg de Ag/0,1 mL
de PBS + 0,1 ml de Adj.
Compl. de Freund
3 -5 IP* 50µg de Ag/0,1 mL
de PBS + 0,1 ml de Adj.
Compl. de Freund
4 -2 IP*
IV**
2,5µg de Ag/0,1 mL
de PBS, 2,5µg de Ag/0,1
ml soro fisiológico
IP* Intraperitoneal
IV** Intravenosa
Tabela 6A: Tampão de eletro-transferência utilizado na técnica de Western-blotting para se evidenciar as proteínas sexo-específicas.
Tampão de transferência
Tris 3,03 g
Glicina 15,50 g
Metanol 100,0 mL
Água destilada q.s.p 1000 mL