IMUNOFENOTIPIZACIJA HEMATOLOŠKIH

NEOPLAZMI:

ATRAKTIVNA ALTERNATIVA KLASIČNOJ

DIFERENCIJALNOJ KRVNOJ SLICI

Barbara Vuković, mag.med.biochem.

Blaženka Dobrošević, mag.med.biochem.

Klinički zavod za laboratorijsku dijagnostiku

KBC Osijek

HEMATOLOŠKE NEOPLAZME KROZ POVIJEST

4.-5.st.pr.Kr. 19.st. 20.st. 21.st.

„bolest krvi” Hodgkin – HL NHL SZO

Virchow – limfa, slezena FAB

Friedreich – akutne/kronične REAL

Ehrlich – košt.srţ; myelo/lym

• FAB (engl. French-American-British) – akutne leukemije

• REAL (engl. Revised European American Lymphoma Classification) – NHL

• SZO 2001./2008./2016.g. :

1. The 2016 revision to the World Health Organization classification of

myeloid neoplasms and acute leukemia

2. The 2016 revision of the World Health Organization classification of

lymphoid neoplasms

DIJAGNOSTIKA HEMATOLOŠKIH NEOPLAZMI

SZO revizija klasifikacija akutnih leukemija i mijeloidnih te limfoidnih neoplazmi:

- važnost dijagnostiĉkog i prognostiĉkog multidisciplinarnog pristupa koji obuhvaća:

1. kliniĉke znaĉajke

2. morfologiju stanica

3. specifiĉni imunofenotip stanica

4. kromosomske abnormalnosti

5. genetske abnormalnosti

- nova saznanja objavljena tokom zadnjih godina na ovim poljima

- nekoliko novih kliniĉkih entiteta !

- FCI (engl. flow cytometry immunophenotyping) – važna uloga !

ULOGA IMUNOFENOTIPIZACIJE

- SZO – mijelo/akutne - najvažnija uloga:

1. Mijeloidne neoplazme – PK i KS – sastavni dio dg – odreĊivanje staniĉne linije i procjene sazrijevanja stanica

2. Akutne leukemije – multiparametrijska FCI – metoda izbora za odreĊivanje staniĉne linije blasta; detekcija aberantnih profila antigena – korisna za praćenje ! * FCI – odreĊivanje % CD34+ stanica nije preporuĉljivo kao zamjena za vizualnu procjenu udjela blasta!

3. MPAL (mixed-phenotype acute leukemia) – koekspresija antigena razliĉitih staniĉnih linija na istim blastima ili više vrsta blasta – B/M, T/M – FCI – metoda izbora !

4. AUL (acute undifferentiated leukemia) – samo CD34+, HLA-DR+, CD38+, TdT+

5. MDS - ≥3 fenotip.aberacije + citomorfološka + citogenetska potvrda; bez potvrde – samo sumnja na MDS

6. B/T-ALL (B/T-lymphoblastic leukemia/lymphoma) – samo pomoć

7. ETP ALL (early T-precursor ALL) – uz genotip.najvažnija uloga !

8. BPDCN – novi entitet – nekad zvan NK-leukem./limfom – CD4+CD56+ hematoderm.neoplazma; prava NK AL – dg izazov !

ULOGA IMUNOFENOTIPIZACIJE

SZO – limfoidne - najvažnija uloga:

1. Diff dg KLL / MBL - ↑ osjetljivost FCI – aberantni izražaj +

monoklonalnost B-limfocita u PK– razlikovanje ova 2 entiteta prema

aps.broju monoklon. B-limfocita, a ne aps. broju svih limfocita

(arbitrarno 5x109/L)!

2. Dg KLL / SLL – limfadenopatija i/ili splenomegalija

*SLL – aps.br.monoklon.B-lym<5x109 /L u PK

3. Dg PCM (plasma cell myeloma) – odreĊivanje klonalnosti plazma

stanica jedan od kljuĉnih kriterija !

*1°amiloidoza - < 10 % klon.plazma st. u KS

4. B-NHL – pomoć pri dg zbog monoklonalnosti + karakteristiĉni IF

5. T/NK-NHL – slabiji znaĉaj FCI, nema jasan biljeg monoklonalnosti

(TCR-heterodimer ?), ali mogućnost postavljanja sumnje:

a) promjena izražaja CD45 (LCA)

b) nedostatak izražaja ≥1 pan-T-biljega

c) promjena intenziteta izražaja pan-T-biljega

d) promjena izražaja CD4 i CD8 biljega (CD4+CD8+, CD4+CD8-,

CD4-CD8+, CD4-CD8-); obavezna potvrda metodom molek.dg !

FENOTIP STANICA

sklop površinskih i unutarstaniĉnih (citoplazmatskih ili

jezgrinih) molekula (antigena) karakteristiĉan za svaki tip

stanice

Plava kosa

Zelene oĉi

Puna usta

T i B-limfocitni fenotip

(preuzeto s: https://www.classimed.de/eurocel2.html )

IMUNOLOŠKA FENOTIPIZACIJA STANICA

(IMUNOFENOTIPIZACIJA)

Metoda protoĉne citometrije

FCI (engl. flow cytometry immunophenotyping)

Direktna imunofluorescencija

Priprema uzorka (predanalitiĉka faza)

Antigen

Primarno protutijelo

Sekundarno protutijelo – NE

Fluorokrom

Akvizicija (skupljanje) stanica – analitiĉka faza

FCI – ŠTO SA SKUPLJENIM PODACIMA ?

Analiza skupljenih podataka – (post) analitička faza

FSC, SSC, FL1, FL2, FL3, FL4……

Količina podataka – konfiguracija citometra !

1. Određivanje % stanica pozitivnih (negativnih) na neki biljeg

2. Određivanje intenziteta izraţaja pozitivnog biljega (MFI, mean fluorescence

intensity) – ovisi o broju Ag – niski (dim) / umjereni (moderate) / visoki

(bright) izraţaj biljega

PRIMJENA FCI U KLINIĈKOJ PRAKSI

1. hematologija tj. imunofenotipizaciji leukemija i limfoma -

najĉešće

2. imunologija (dijagnostika imunodeficijencija i alergija)

3. pulmologija (diff dg intersticijskih plućnih bolesti

- sarkoidoza / fibroza)

4. reumatologija (analiza HLA-B27 antigena u

seronegativnim spondiloartropatijama)

5. onkologija (analiza DNA i proliferacijskog kapaciteta

tumorskih stanica)

Primjena u hematologiji – ovisi o osjetljivosti metode:

1. Dijagnostika

2. Praćenje nakon terapije

3. Praćenje minimalne ostatne bolesti – zahtjeva iznimno visoku

osjetljivost tj.citometre najnovije generacije (10-6 – 10-8 )

KBCO

KBCO

FCI U HEMATOPATOLOGIJI

Identifikacija antigena koji imaju razliĉite, ali specifiĉne funkcije u/na

stanicama, a zajedniĉkim imenom ih nazivamo CD-biljezi (eng. Cluster of

Differentiation)

danas poznato više od 300 CD-biljega !

Vrste najĉešćih biljega u FCI:

1. pan-biljezi loze:

a) mijeloidni: CD13, CD33, cit.MPO

b) B-staniĉni: CD19, cit.CD22, cit. CD79a

c) T-staniĉni: CD2, CD3, CD5, CD7, cit. CD3

2. Biljezi nezrelosti ili aktivacije

a) CD34, nTdT, HLA-DR

3. Biljezi izražaja specifičnog za liniju i razinu sazrijevanja

a) mijeloidni – CD14, CD15, Gly A, CD41, CD61

b) B-staniĉni – CD20, CD23, FMC7, sIg, cyIg

c) T-staniĉni – CD1a, CD4, CD8

d) NK – CD16, CD56, CD57

TEMELJ HEMATOLOŠKE IMUNOFENOTIPIZACIJE

razlika „normalnog“ od „nenormalnog“, tj. zdravog od patološkog

imunofenotipa

Patološki imunofenotip:

1. pojava biljega jedne staniĉne loze na drugoj (aberacija)

2. odsustvo ili promjena intenziteta fluorescencije oĉekivanog (tipiĉnog)

biljega loze

3. dokaz klonalnosti patološke staniĉne populacije - FCI:

a) periferne (zrele) B-limfoidne neoplazme – omjer površinskih Κ/Λ lakih

lanaca (restrikcija)

b) periferne (zrele) T/NK-limfoidne neoplazme – TCR - heterodimer

(TCRαβ/Γδ) ??

c) klonalnost malignih plazma-stanica - omjer citoplazmatskih Κ/Λ lakih

lanaca (restrikcija)

LABORATORIJSKA FCI - PROBLEMI

FCI – problem standardizacije cjelokupnog analitiĉkog

procesa

Raznolikost opreme, antitijela, fluorokroma…

EuroFlow konzorcij 2009.g. – pokušaj standardizacije

SOP – priprema uzoraka i paneli biljega – probirni i

prošireni, no za citometre novije generacije

RH – planira se implementacija kroz 2 godine

Za sada – in house paneli u većini centara

EUROFLOW PANELI

(preuzeto s www.euroflow.org )

UZORCI ZA IMUNOFENOTIPIZACIJU PROTOĈNOM

CITOMETRIJOM

Generalno - bilo koji uzorak koji sadrţi stanice !

Hematologija - 2 kategorije uzoraka:

1. Tekući: periferna krv, koštana srţ, tjelesne

tekućine (likvor, serozne efuzije…)

2. Solidna (kruta) tkiva: limfni čvorovi, tonzile,

slezena, bioptati koštane srţi i ekstranodalni

infiltrati

Svjeţi uzorci - veličina uzork (celularnost) i

vijabilnost ključni !

UZORCI U HEMATOPATOLOGIJI

Koštana srž – dijagnostički uzorak izbora za postavljenje

dijagnoze hematoloških entiteta s medularnom lokalizacijom

Limfni čvorovi i tjelesne tekućine - za ekstramedularno

lokalizirane neoplazme

Periferna krv - prisutnost neoplastičnih stanica u

cirkulaciji, ali najčešće prvi uzorak koji postavlja sumnju na

hematološki malignitet !

KBC Osijek – KZLD – Odjel za hematološku dijagnostiku i

koagulaciju:

1800-2000 analiza godišnje (ukupno)

Hematološka dg:

1. ~ 50 % KS

2. ~ 30 % PK

3. ~ 15 % LĈ

4. ~ 5 % OSTALO

DANAŠNJA TEMA – SVAKODNEVNA PRAKSA

Sumnja na hematološku neoplazmu – sluĉajan nalaz !

PZZ ili COHP - pojava nespecifiĉnih simptoma: slabost, umor,

glavobolja, vrtoglavica, nespecificirana vrućica, modrice

nepoznatog porijekla, oteĉeni limfni ĉvorovi, itd.

PK – KKS – nalaz sumnjivih hematopoetskih stanica u DKS-u

Specijalistiĉka hematološka obrada: detaljna anamneza,

procjena kliniĉke slike, prošireni panel općih i specijalistiĉkih

laboratorijskih pretraga, te mikrobiološka, citološka,

imunofenotipska, radiološka i patohistološka analiza

dijagnostiĉkih uzoraka

Danas – prikaz FCI analize PK, likvor, serozne efuzije –

uzorci koji svakodnevno dolaze u MBL (redovni / hitni)

KS, LĈ – neće biti prikazani – dio šire spec. obrade

PRIMJER 1: PRISUTNOST LEUKOCITOZE PERIFERNE KRVI UZ

NALAZ LIMFOCITOZE U DIFERENCIJALNOJ KRVNOJ SLICI

Slika 1. Analiza KKS na automatskom brojaču Sysmex XN2000 (Sysmex,

Kobe, Japan) - umjerenua leukocitoza s limfocitozom, uz oznaku sumnjive

morfologije limfocita; nalaz eritrocita i trombocita je uredan

SLUČAJ 1: PREGLED MORFOLOGIJE LIMFOCITA

Slika 2. Automatizirana analiza razmaza periferne krvi na sustavu za

digitalnu morfologiju CellaVision DM1200 (Sysmex, Kobe, Japan) koja

prikazuje prisutnost brojnih zrelih limfocita

SLUČAJ 1: B-KRONIĈNA LIMFATIĈNA LEUKEMIJA (B-KLL) –

FCI ANALIZA

IF: CD5+, CD19+, CD20+,

CD22+, CD23+, monoklonskih

kappa+(dim)

SLUČAJ 2: REAKTIVNA LIMFOCITOZA – FCI ANALIZA

IF:

poliklonski B-limfociti

SLUČAJ 3: PREGLED MORFOLOGIJE LIMFOCITA

Slika 3. Automatizirana analiza razmaza PK na sustavu za digitalnu

morfologiju CellaVision DM1200 - prisutnost brojnih velikih,

granuliranih limfocita

SLUČAJ 3: T-LIMFOCITNA NEOPLAZMA (ZRELA) - FCI ANALIZA

IF: R2: CD2+, CD3+, CD5+niski izraţaj, CD7±, CD8, CD56±, HLA-DR±; CD4-, CD11c-, CD25-, CD57-, CD69-

susp. kronična neoplazma velikih granuliranih limfocita (NK-like-T-LGL)

SLUČAJ 4: VARIJANTA LEUKEMIJE VLASASTIH STANICA (HCL-V,

OD ENGL. HAIRY-CELL LEUKEMIA-VARIANT) – FCI ANALIZA

IF: B-NHL – HCL-

varijanta

PRIMJER 2: LEUKOPENIJA UZ LIMFOCITOZU U DKS-U

Slika 4. Analiza KKS na automatskom brojaču Sysmex XN2000

(Sysmex, Kobe, Japan) - leukopenija s limfocitozom, uz naznaku

sumnjive morfologije stanica u DKS-u

SLUČAJ 5: PREGLED MORFOLOGIJE LIMFOCITA

Slika 5. Automatizirana analiza razmaza PK na sustavu za digitalnu

morfologiju CellaVision DM1200 koja prikazuje zrele, vlasaste limfocite

(trihocite)

SLUČAJ 5: LEUKEMIJA VLASASTIH STANICA (TRIHOLEUKEMIJA) –

KLASIĈNI OBLIK

IF: CD19+CD20+CD22+

CD25 (dim)

FMC7+CD103+

CD11c+; sLambda+

(bright)

PRIMJER 3: UREDAN NALAZ KOMPLETNE KRVNE SLIKE, ALI

POREMEĆEN IMUNOLOŠKI STATUS

Teška klinička slika (višemjesečna febrilnost,

neodgovaranje na antibiotsku th, gubitak na teţini, opća

slabost)

normalan broj leukocita bez limfocitoze u DKS-u

Imunološki status: obrnut omjer pomagačkih i cito-

toksičnih T-limfocita

HIV neg.

Proliferacija T-limfocita - sumnja na limfom ?

SLUČAJ 6: KRONIĈNA AKTIVNA INFEKCIJA EPSTEIN-BARR

VIRUSOM – FCI ANALIZA

-omjer CD4 / CD8 = 0,1

(RI: 0,9-3,4)

PRIMJER 4: LEUKOCITOZA UZ „MONOCITOZU“ U DKS-U

Slika 6. Analiza KKS na automatskom brojaču Sysmex XN2000 koja

prikazuje leukocitozu s monocitozom, uz naznaku sumnjive morfologije

stanica u DKS-u

SLUČAJ 7: PREGLED MORFOLOGIJE STANICA

Slika 7. Automatizirana analiza razmaza PK na sustavu za digitalnu

morfologiju CellaVision DM1200 - prisutnost brojnih stanica monocitne

diferencijacije različitog stupnja sazrijevanja

SLUČAJ 7: AKUTNA MONOCITNA LEUKEMIJA – FCI ANALIZA

IF: CD4+niski izraţaj, CD11c+, CD13+, CD14+, CD15+, CD56+, CD33+, CD38+, CD64+, HLA-DR+,

citoplazmatski MPO+/-; CD34-, CD117-, nTdT-.- monocitna komponenta (dominantno zreliji oblici –

promonociti i monociti, uz manji udio monoblasta)

SLUČAJ 8: PREGLED MORFOLOGIJE STANICA

Slika 8. Automatizirana analiza razmaza periferne krvi na sustavu za digitalnu

morfologiju CellaVision DM1200 koja prikazuje prisutnost brojnih tzv. APL (od eng.

acute promyelocyte leukemia) blasta s bilobuliranom jezgrom (lijeva strelica) koji sliče

na monocite (tzv. monocyte-like stanice) i s morfologijom ogledalca s ručkom (tzv. hand-

mirror morfologija) (desna strelica)

SLUČAJ 8: *APL-V – FCI ANALIZA

• acute promyelocyte leukemia- variant (FAB – AML-M3v-hipogranularni oblik)

• Diff dg – slična AML-M5 ili M2

• Th – ciljana – ATRA !

• IF: razlika SSC, HLA-DR+/-, CD34+/-, CD11c-

SLUČAJ 9: PREGLED MORFOLOGIJE STANICA

Slika 9. Automatizirana analiza razmaza PK na sustavu za digitalnu

morfologiju CellaVision DM1200 - prisutnost brojnih atipičnih limfocita tj.

plazma-stanica.

SLUČAJ 9: LEUKEMIJA PLAZMA-STANICA – FCI ANALIZA

IF: CD45-, CD38++,

CD138++, CD56+,

CD117+, CD200+,

citoplazmatski kappa laki

lanci +

MONOKLONSKE VS. POLIKLONSKE PLAZMA-STANICE

Slika 10. Primjer imunofenotipske analize periferne krvi koja sadrţi 1 %

normalnih, poliklonskih (reaktivnih) plazma-stanica (crveno obojene stanice)

PRIMJER 5: LEUKOCITOZA U TJELESNIM TEKUĆINAMA KOD

HEMATOLOŠKIH BOLESNIKA – PITANJE INFILTRACIJE OSNOVNE

BOLESTI U SŢS-U ILI DRUGE ORGANSKE SUSTAVE

Slika 11. Automatizirano brojanje stanica u modu za tjelesne tekućine na

automatskom hematološkom brojaču Sysmex XN2000.

- Uz visok broj leukocita, vidljiva je i prisutnost limfocitoze

SLUČAJ 10: FCI ANALIZA LIKVORA - INFILTRACIJA STANICA FOLIKULARNOG

LIMFOMA U SŢS NAKON TH RITUXIMAB-OM ?

IF: CD19+, CD20-, CD22+,

CD23-, FMC7-, sLambda+

SLUČAJ 11: FCI ANALIZA LIKVORA - INFILTRACIJA KLL-A U SŢS ?

IF: CD3+CD5+ - T-lym

- Dg WNV

SLUČAJ 12: FCI ANALIZA - LIMFOCITNI TIP IZLJEVA ILI INFILTRACIJA KLL-A

U PLEURALNI IZLJEV ?

IF: 29 % T-limfocita i 68 %

monoklonskih lambda+B-

limfocitima – B-KLL

ZAKLJUČAK – FCI ALTERNATIVA DKS-U ?

Sadašnjost:

DKS → vizualizacija krvnih stanica → sumnja na patologiju

→ proširivanje dijagnostike: citomorfologija, citokemija,

imunofenotipizacija → diff dg (postavljanje dijagnoze ili

sumnja na odreĊenu dijagnozu) → citogenetika,

molekularna dijagnostika → potvrda dijagnoze

→ DUGOTRAJAN PROCES

Budućnost: Flow Cytometry Imaging

- vizualizacija i po potrebi imunofenotipizacija iz istog

uzorka

- → SKRAĆIVANJE DIJAGNOSTIĈKOG PROCESA

Pitanje: RH – daleka ili bliska budućnost ?

(...danas…)

HVALA NA PAŽNJI !

(...sutra…)