dio ix. - bib.irb.hrbib.irb.hr/datoteka/817914.klinicka_kemija_i_molekularna...443 laboratorijska...

443

Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

DIO IX.

48. Anemije (Ivo Radman, Marijo Vodanović) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

49. Tumori krvotvornog limfnog tkiva (Igor Aurer) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

50. Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija (Danica Matišić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

51. Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija (Dragana Šegulja, Danica Matišić) . . . . . . . . . . . . . .

52. Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija (Sanja Davidović-Mrsić, Ivana Franić Šimić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

53. Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti (Renata Zadro) . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

54. Primarne imunodeficijencije (Jadranka Kelečić, Ana Merkler) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

55. Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma (Drago Batinić) . . . . . . . . . . . . . . . . . .

56. Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze (Désirée Coen Herak, Marija Miloš) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

57. Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja (Silva Zupančić Šalek) . . . . .

58. Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica (Branka Golubić Ćepulić, Ines Bojanić) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

dell

Highlight

krvotvornog i limfnog

444 | Laboratorijska dijagnostika hematoloških bolesti i poremećaja hemostaze

445

P o g l a v l j e 48.Anemije

Ivo Radman, Marijo Vodanović

Anemija je stanje smanjenog broja eritrocita, mase eritrocita ili sadržaja hemoglobina u eritrocitima i ozna-čava slabokrvnost ili malokrvnost. Pojam anemije obuhvaća izrazito heterogenu skupinu poremećaja koji se rijetko javljaju kao primarne bolesti krvotvornog sustava, a puno češće kao odraz drugih bolesti. U rutinskom radu stupanj anemije određujemo koristeći nalaze koncentracije hemoglobina - krvnog pigmenta za prijenos kisika i hematokrita koji predstavlja volumni udio eritrocita u krvi. Anemija se prema količini mase crvenih krvnih stanica dijeli na relativnu i apsolutnu. Kod relativne anemije nalazimo urednu masu eritrocita uz povećan volumen plazme. Apsolutna anemija je stanje smanjene mase crvenih krvnih stanica koju određu-jemo prema kinetskim, morfološkim i patofiziološkim kriterijima. Zadatak kliničara jest prepoznati anemiju i diferencijalno dijagnostički znati razlikovati sva stanja koja mogu dovesti do određenog tipa anemije.

Prevalenciju anemija je teško odrediti jer ovisi o učestalosti uzroka koji dovode do njenog nastanka i o drugim čimbenicima (populacija bolesnika, geografska lokacija, referentne vrijednosti nalaza, razvijenost medicinsko-zdravstvenog sustava koji može odrediti točan uzrok i mehanizam anemije). Epidemiološke studije u razvijenim zemljama navode prevalenciju anemija do 15 % dok se u nerazvijenom svijetu pojavnost anemija kreće i do 50 %.

Podjela anemijaDva su osnovna pristupa podjeli anemija: 1.) kinetički koji nastoji utvrditi mehanizam koji dovodi do anemije i 2.) morfološki koji dijeli anemije prema veličini srednjeg volumena eritrocita (MCV).

Kinetički pristup dijeli anemije prema jednom od tri mehanizma nastanka anemije: smanjeno stvaranje, ubrzano propadanje i gubitak eritrocita.

1. Smanjeno stvaranje eritrocita. Tijekom 24 sata propada 1 % eritrocita i zamjenjuje se novostvorenima u koštanoj srži. Smanjeno stvaranje eritrocita (hipoproliferacijska anemija) javlja se zbog primarne bolesti


koštane srži, infiltracije koštane srži tumorskim stanicama, snižene razina trofičkih hormona (eritropoetin, hormoni štitnjače i androgeni) i nedostatka vitamina B12, folne kiseline ili želje-za.

2. Povećano propadanje eritrocita javlja se ako je životni vijek eritrocita kraći od 100 dana (eri-trociti prosječno žive oko 120 dana). Do anemije dolazi ukoliko koštana srž ne može dnevno na-domjestiti 5 % eritrocitne mase. Ovakav tip ane-mije je karakterističan za hemolitičku anemiju.

3. Gubitak eritrocita je najčešći uzrok anemije. Najčešće se događa se zbog traume, krvarenja iz probavnog sustava ili ginekološkog krvarenja. Krvarenje može i biti okultno npr. kod polipa ili raka debelog crijeva ili jatrogeno zbog kod učestalih venepunkcija, hemodijalize i darivanja krvi.

Morfološki pristup dijeli anemije u tri skupine; mi-krocitnu gdje je MCV<80 fL, normocitnu (MCV 80-100 fL) te makrocitnu (> 100 fL) (Tablica 48.1.).

Klinička slikaKliničke tegobe ovise o brzini nastanka anemije. Anemije koje se brzo razvijaju pokazuju više tego-ba od kroničnih, sporoprogredirajućih anemija jer je manje vremena za prilagodbu organizma. Tek kada je hemoglobin <90 g/L javljaju se tipični simptomi anemične hipoksije: nedostatak zraka, bol u prsima, umor i slabost, gubitak mišićne snage, pospanost,

lupanje srca, glavobolja, gubitak koncentracije. Srce povećava minutni volumen na račun porasta srčane frekvencije i manjeg udarnog volumena. Kisik se ot-pušta brže i lakše iz hemoglobina radi porasta kon-centracije 2,3 bifosfoglicerata (BPG). Anamnestički je potrebno obratiti pažnju je li anemija nastala akut-no (masivno krvarenje ili hemoliza), ili postepeno (obilnije i/ili dugotrajne menstruacije, prisustvo krvi u stolici). U statusu se mogu uočiti bljedilo kože i sluznica, ubrzana srčana akcija, sistolički šum, niže vrijednosti krvnog tlaka, žutilo sklera i hepatosple-nomegalija.

Laboratorijski nalaziNakon detaljne anamneze i statusa pravi uvid u te-žinu i uzrok anemije određuje se racionalnom dija-gnostičkom i laboratorijskom obradom što uključuje: određivanje broja eritrocita, koncentracije hemoglo-bina i hematokrita te broja retikulocita, izračunavanje eritrocitnih indeksa kao i citološki pregled razmaza periferne krvi. Mnogi uređaji automatski određuju RDW kao mjeru anizocitoze tj. varijacije u veličini stanica.

Eritrocitni indeksi opisuju veličinu eritrocita (MCV), srednji sadržaj hemoglobina u eritrocitu (MCH) te prosječnu koncentraciju Hb u volumnoj je-dinici eritrocita (MCHC). MCV određuje morfološku podjelu anemija. Smanjene vrijednosti MCH i MCHC opisuju se kod mikrocitnih anemija, a povećane vri-jednosti se nalaze kod sferocitoze, teže dehidracije ili megaloblastične anemije.

Tablica 48.1. Podjela anemija

Mikrocitna anemijaMCV < 80 Fl

Normocitna anemijaMCV (80-100 fL)

Makrocitna anemijaMCV > 100 fL

• Sideropenična anemija• Talasemija• Anemija kronične bolesti • Sideroblastična anemija

• Akutni gubitak krvi• Anemija kronične bolesti• Mijeloftizična anemija • Izolirana aplazija crvene loze • Aplastična anemija• Kronično bubrežno zatajenje• Endokrinološki poremećaji

• Intoksikacija etanolom• Deficit folne kiseline i/ili vitamina B12

• Sindrom mijelodisplazije• AML• Anemija uzrokovana lijekovima • Bolesti jetreUZ POVEĆANE RETIKULOCITE:• Hemolitička anemija• Odgovor na gubitak krvi• Odgovor na liječenje (Fe, B12, folati)

Anemije | 447

Broj retikulocita (Rtc) izražava se kao postotak od ukupne eritrocitne mase ili kao apsolutni broj. Re-ferentne vrijednosti broja retikulocita kreću se od 5- 20‰. Anemija s normalnim i smanjenim brojem retikulocita upućuje na smanjeno stvaranje eritrocita u koštanoj srži. Najčešće je riječ o hipoproliferativnoj anemiji ili anemiji zbog poremećaja u sazrijevanju. Preciznije je određivanje apsolutnog broja retikulo-cita (normalne vrijednosti su 25000-75000/µL). Reti-kulocit nastaje iz eozinofilnog eritroblasta, obilježja zadržava četiri dana, od toga tri dana provodi u ko-štanoj srži, a jedan dan u perifernoj krvi, tako da se može dogoditi pomak retikulocita (do dva i pol dana može provesti u krvi) kao kompenzatorni odgovor na anemiju i potrebu ubrzanog sazrijevanja eritrocita.

Razmaz periferne krvi pruža vrijedne informaci-je o morfološkim promjenama eritrocita i leukocita. Za megaloblastičnu anemiju karakteristične su, pri-mjerice, hipersegmentacija neutrofilnih granulocita i pojava ovalocita. Eritroblasti se nađu u hemoglo-binopatija, anemije srpastih stanica, nakon splenek-tomije radi hemolitičke anemije, kod mijelofibroze i mijeloftizične anemije. Fragmentirani eritrociti (shi-stociti) nalaze se kod mikroangiopatskih hemolitič-kih anemija i hereditarne sferocitoze. Eliptocite na-lazimo kod nasljedne eliptocitoze, a mikrosferocite kod nasljedne sferocitoze. Brzi pad broja eritrocita uz nedostatak retikulocita upućuje na aplaziju košta-ne srži, dok brzi pad eritrocita uz povećane retikulo-cite upućuje na hemolitičku anemiju ili gubitak krvi. Prisutnost nezrelih stanica u razmazu periferne krvi iziskuje analizu koštane srži (citologija, imunofeno-tipizacija, imunohistokemija, citogenetika).

Ostale pretrage: U svrhu isključivanja ili dokaziva-nja sekundarnih uzroka anemije važno je učiniti na-laze bubrežne i jetrene funkcije te odrediti hormone štitnjače i nadbubrežne žlijezde. Elektroforeza pro-teina uz imunofiksaciju te kvalitativno i kvantitativno određivanje lakih lanaca mogu otkriti monoklonsku gamapatiju ili multipli mijelom. Određivanje razi-ne vitamina B12 i folata indicirano je kod sumnje na megaloblastičnu anemiju, a vrijednost feritina uz Fe, UIBC, TIBC važne su za dijagnozu sideropenič-ne anemije. U hemolitičkih anemija bitno je učiniti

imunoeritrocitno ispitivanje (Coombsov test), elek-troforezu hemoglobina, test osmotske rezistencije eritrocita i odrediti aktivnost enzima u eritrocitu. Kod anemije kronične bolesti (AKB) važan je nalaz kon-centracije feritina i eritropoetina. Uz pojedine tipove anemija biti će i detaljnije objašnjeni pojedini testovi.

ANEMIJE ZBOG POREMEĆAJA METABOLIZMA ŽELJEZAPoremećaj metabolizma željeza. Željezo se u or-ganizmu nalazi u funkcionalnom, transportnom i pri-čuvnom obliku. Ljudski organizam sadrži 3-4 grama željeza. Od toga su 2,5 grama smještena u eritrociti-ma, 500 mg je uskladišteno u feritinu i hemosiderinu, 300 mg se nalazi u mioglobinu i enzimima, a samo 4 mg željeza cirkulira i u svakom je trenutku dostupno za korištenje. Minimalna dnevna potreba za željezom iznosi 1-2 mg jer se upravo toliko svakodnevno gubi eksfolijacijom probavnog epitela. Uobičajena dnev-na prehrana sadrži 10-20 mg elementarnog željeza od čega se iskoristi oko 10 %. Fiziološkog načina ek-skrecije željeza iz tijela nema i ono se može gubiti samo krvarenjem.

Hepcidin – ključni regulator održavanja homeostate željeza u organizmu Nedavno je identificiran glavni regulator održavanja homeostaze željeza u organizmu. To je bjelančevina akutne faze hepcidin, koji se sastoji od 25 aminoki-selina. Hepcidin se sintetizira u jetri kao odgovor na (IL-6. Povećana koncentracija IL-6 i hepatocelular-nog željeza potiču sintezu hepcidina dok je hipoksija koči. Drugi upalni citokini kao što su IL-1 i TNF-α ne utječu na ekspresiju hepcidina. Ovaj zaključak je pojačan opažanjem da u eksprimentalnih miševa s nedostatkom IL-6 upalni enzimi ne izazivaju po-rast hepcidina. Pokusi na zdravim dobrovoljcima su definitivno dokazali da infuzija IL-6 brzo dovodi do porasta hepcidina i razvoje sideropenije. Pretjerana ekspresija hepcidina u miševa neovisno o podrijetlu izaziva tešku anemiju. Suprotno, upala u miševa ko-jima nedostaje hepcidin neće izazvati hipoferemiju


što je dokaz o ključnoj ulozi hepcidina u prometu željeza u organizmu. Hepcidin smanjuje duodenal-nu apsorpciju željeza i blokira oslobađanje željeza iz makrofaga što ima za posljedicu razvoj anemije kronične bolesti. Čini se da nedavno otkriveni gen hemojuvelin pomaže hepcidinu u navedenim pro-mjenama. Shodno tomu, poremećaj u prometu že-ljeza i smanjena količina raspoloživog željeza oteža-vaju biosintezu hema, a time i proliferaciju stanica eritrocitopoeze.

Svaki dan otprilike 20 mg željeza ulazi u plazmu i veže se za transferin. Više od 2/3 tog željeza se oslo-bađa iz raspalih eritrocita, a svega 20 % se oslobađa iz pričuva u jetri. Za vrijeme upale oslobađanje želje-za iz oba izvora je snažno inhibirano. Interleukin-6 koji se pojačano izlučuje u upali stimulira produkci-ju hepcidina s posljedičnim smanjenjem oslobađanja uskladištenog željeza što brzo dovodi do hipofere-mije.

Hepcidin inhibira oslobađanje željeza iz makrofa-ga vezivanjem na feroportin i dovodi do njegove internalizacije i propadanja.U normalnim uvjetima feroportin na staničnoj membrani predstavlja izlazni kanal za željezo. Mehanizmom hepcidin-feroportin zakočena je i intestinalna apsorpcija željeza u AKB. Konačno to može dovesti i do smanjenja zaliha želje-za u organizmu što je vrlo rijedak slučaj u AKB osim kod izrazito jake stimulacije IL-6. To je slučaj u djece i adolescenata koji boluju od juvenilnog reumatoid-nog artritisa.

SIDEROPENIČNA ANEMIJANajčešći oblik anemije koji nastaje zbog manjka že-ljeza u organizmu.

Sideropenična anemija nastaje zbog smanjenog unosa, poremećene apsorpcije u probavnom traktu, gubitka krvi ili zbog povećane potrebe za željezom (Tablica 48.2.).

Najčešći uzrok sideropenične anemije jest kronično krvarenje, primjerice, fiziološko krvarenje u žena s mjesečnicama. Gubitak željeza ne mora biti velik, ali s vremenom dolazi do sideropenije, a zatim i ane-

mije. Odrastao muškarac fiziološki praktički ne gubi željezo. U dobi od 15. do 44. godine učestalost ane-mije je kod žena 10 do 20 puta češća nego kod muš-karaca, a nakon 45. godine učestalost se izjednačava. Manjak željeza se prvo nadoknađuje popunjavanjem željeza iz rezervi i dolazi do razvoja latentne sidero-penije (Fe je uredno, TIBC povišen, feritin snižen). Daljnjom progresijom dolazi do manifestne sidero-penije (Fe sniženo, TIBC povišen, feritin snižen), a zatim i anemije.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaSimptomi poput umora, slabosti, teškoće koncentra-cije vezane su uz težinu anemije, može biti prisutan i Plummer-Vinsonov sindrom (trijas disfagija s ezofa-gitisom, glositis, hipokromna anemija). Usto se često

Tablica 48.2. Najčešći uzroci sidropenične anemije

Prehrana siromašna željezom• Pridonosi težini anemije, ali je rijetko samostalno uzrokuje

Poremećaj apsorpcije iz probavnog trakta • gastrektomija• kolektomija• resekcija tankog crijeva• celijakija• upalne bolesti crijeva

Kronično krvarenje• ginekološko (menometroragije) • probavni sustav • varikoziteti jednjaka • hijatalna hernija • ulkusna bolest želuca i dvanaesnika • erozivni gastritis• nesteroidni protuupalni lijekovi• tumori probavnog sustava • divertikuloza • parazitarne bolesti • angiodisplazije• Rendu-Osler-Weberova bolest

Povećane potrebe za željezom• ubrzani rast• trudnoća• dojenje

Ostalo• intravaskularna hemoliza• gubitak željeza urinom• idiopatska plućna hemosideroza• dugotrajno liječenje eritropoetinom (bubrežno zatajenje).

Anemije | 449

nađe i angularni stomatitis, koilonihija (krhki nokti), atrofični gastritis. Brojne promjene vjerojatno su po-vezane sa smanjenom aktivnošću enzima koje sadrže željezo važno u sintezi stanica epitela.

Anemija je mikrocitna i hipokromna s nalazom anu-locita u perifernoj krvi uz snižene eritrocitne indekse MCV i MCH. Bojanje koštane srži na željezo pokazuje potpuni nedostatak granula željeza u eritroblastima. Serumsko željezo je sniženo (Fe), uz povišen transfe-rin (TIBC) i nezasićen dio (UIBC), a zasićenost tran-sferina (Fe/TIBC) < 10 %. Feritin je izrazito snižen i najosjetljiviji pokazatelj količine željeza u rezervama.

Manjak željeza može se odrediti i mjerenjem tran-sferinskih receptora (TfR) u serumu. TfR potječu od eritroidnih prekursorskih stanica, dobar su kvantita-tivni pokazatelj eritrocitopoeze i obrnuto su propor-cionalni količini serumskog željeza.

LiječenjePrvo treba liječiti uzrok anemije, nakon toga kori-girati anemiju i popuniti zalihe željezom. Željezo se primjenjuje u obliku Fe-glukonata, sukcinata, sulfata, laktata i fumarata. Više je preparata na tržištu, a naj-češće se rabe tablete za žvakanje koje sadrže 100 mg željeza u obliku kompleksa željezovog (III) hidrok-sida s polimaltozom (dekstriferon) i kapsule koje sa-drže 350 mg željezo (II) fumarata što odgovara ekvi-valentu od 115 mg željeza. Željezo za parenteralnu primjenu je željezo (III) hidroksid saharat. Pripravci za sporo otpuštanje željeza nisu prikladni jer se želje-zo ne može apsorbirati u donjim dijelovima crijeva. Terapija se primjenjuje 4-6 mjeseci tj. do popune re-zervi i normalizacije feritina. Postoje različite formule za izračunavanje manjka željeza npr.

Deficit (Fe) = (150 – Hb g/L) x tjelesna masa (kg) x 0.22+600 mg (ž) ili 1000 mg (m)

ili

deficit (Fe) = (15,0 – Hb g/dL) x tjelesna masa (kg) x 3

Za nekoliko dana nastaje poboljšanje (nestaje umor, rastu retikulociti i hemoglobin), nestaju drugi zna-

kovi sideropenije (glositis, krhki nokti). Terapija pa-renteralnim željezom je opravdana kod bolesnika s teškom anemijom (Hb < 60 g/L), koji imaju malap-sorpcijski sindrom (upalne bolesti crijeva, celijakija, operativni zahvati probavne cijevi) ili koji ne podno-se peroralno željezo. Parenteralno željezo ima nus-pojave poput lokalne preosjetljivosti na mjestu ubo-da, opisana je čak i anafilaksija. U slučaju neuspjeha terapije treba razmotriti druge uzroke: manjak folne kiseline i/ili vitamina B12, AKB, otrovanje olovom, nedostatak bakra, talasemije, lijekove koji smanjuju apsorpciju (čajevi, antacidi, tetraciklini). Potrebno je liječiti uzrok koji je doveo do anemije npr. krva-reći peptički ulkus, kolorektalni karcinom ili polip. Najviše željeza od živežnih namirnica sadrži jetrica (svinjska 19 mg Fe/100 g), teleća jetra (5,4 mg/100 g), kvasac 18,0 mg/100 g, dok je važno znati da tvari u povrću poput fitata i fosfata smanjuju apsorpciju željeza.

SIDEROBLASTIČNA ANEMIJASideroblastična anemija nastaje zbog stečenog pore-mećaja ili smanjene sinteze hema u prekursorskim eritroidnim stanicama. Posljedično manjkavoj sinte-zi hemoglobina razvijaju se mikrocitni i hipokromni eritrociti. Bojanjem berlinskim modrilom te elektron-skom mikroskopijom dokazuju se depoziti željeza unutar mitohondrija. Uzroci mogu biti nasljedni i ste-čeni. U nasljedne ubrajamo X-vezano nasljeđivanje, X-vezano nasljeđivanje uz ataksiju, anemiju s pore-mećajem mitohondrija i megaloblastičnu anemiju osjetljivu na tiamin. Stečene su čista sideroblastična anemija ili RARS, te reverzibilna anemija izazvana al-koholom, izoniazidom, kloramfenikolom, manjkom bakra i hipotermijom.

ANEMIJA KRONIČNE BOLESTIAnemija kronične bolesti (AKB) je često korišten termin za hematološki sindrom koji prati kronične nehematološke bolesti. Pojavljuje se u kroničnim upalnim bolestima (endokarditis, kronične plućne i


urinarne infekcije, osteomijelitis), sistemskim bole-stima vezivnog tkiva, u bolesnika sa zloćudnim tu-morima i nakon velikih trauma tkiva. Ova se anemija naziva još i anemija posredovana citokinima.

Temeljni mehanizam razvoja anemije kronične bo-lesti je poremećaj ravnoteže sadržaja željeza u or-ganizmu koji se sastoji od povećanog ulaska i za-državanja željeza u stanicama retikuloendotelnog sustava.(RES). Time se željezo uklanja iz funkcio-nalnog odjeljka u pričuvni odjeljak odakle se teško mobilizira te nastaje manjak raspoloživog željeza za

potrebe eritrocitopoeze. U eksperimentalnih životi-nja injekcija proupalnih citokina IL-1 i TNF-α rezul-tira razvojem hipoferemije i anemije što je povezano sa sintezom feritina, glavnim proteinom koji pohra-njuje željezo u hepatocite i makrofage. U kroničnoj upali aktivira se u makrofazima mehanizam eritro-fagocitoze i transmembranskog unosa fero iona po-moću proteina nosača dvovalentnih metalnih iona (DMT1).

Interferon-γ, lipopolisaharidi i TNF-α pojačavaju ek-spresiju DMT1 s povećanim unosom željeza u ak-

Autoimuna bolest

monocit

jetra

duodenum

eritrociti

EPO

hepcidin

hepcidin

hepcidin

hepcidin

CD3+T limfocit

hepcidin

fagocitozaeritrocitoza

feroportin

feroportin

DMT-1

transferinskireceptor

feritin

transferinskoželjezo

EPO

bubreg

koštanasrž

TNF-αIFN-γ

IFN-γ

makrofag

IL-1

IL-6

Fe2+

Fe2+

Fe2+

DC

B

A

E

F

Slika 48.1. Patofiziološki mehanizmi nastanka anemije kronične bolesti. A. Imunološki mehanizam potiče monocite i T limfocite na pojačano izlučivanje citokina IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-γ. B. Interleukin-6 stimulira proizvodnju hepcidina u jetri. C. Hepcidin se veže za fero-portin na membrani enterocita i koči apsorpciju željeza. D. Hepcidin se i na površini makrofaga veže uz feroportin izazivajući njegovu internalizaciju i degradaciju. Funkciju feroportina koči i INF-γ. Tako se željezo pojačano nakuplja u makrofagu čemu doprinosi i pojačana fagocitoza eritrocita te pojačana ekspresija DMT-1. Upalni citokini pojačavaju ekspresiju transferinskih receptora na membrani makrofaga što ide u prilog nakupljanju željezovih iona u feritinu unutar makrofaga. E. TNF-α i INF-γ koče produkciju eritropoetina u bubrezima. F. IL-1, TNF-α, IFN-γ izravno inhibiraju diferencijaciju i proliferaciju prethodnih stanica crvene loze. Dodatni negativan učinak je izazvan ograničenom raspoloživošću željeza te smanjenom aktivnošću eritropoetina što u konačnici dovodi do nastanka anemije

Anemije | 451

tivirane makrofage. Isti citokini zadržavaju željezo u makrofazima smanjenjem aktivnosti feroportina koj je transmembranski izbacivač željeza iz stanice. U normalnim uvjetima feroportin obavlja prijenos apsorbiranog željeza iz stanica duodenalnog epitela u cirkulaciju. Zanimljivo je da i protuupalni citokini primjerice IL-10 mogu izazvati anemiju poticanjem transferina i feritina na zadržavanje željeza u RES-u. U većine bolesnika s AKB nalazi se povećana koncentracija bakra u krvi što je posljedica porasta plazmatskog ceruloplazmina. Ceruloplazmin je en-zim koji je potreban za izbacivanje željeza iz stanice. Zadržavanje željeza u makrofagima moglo bi značiti da je u AKB feroksidazna aktivnost ceruloplazmina inhibirana, no to nije slučaj jer se stanični transport željeza ne popravlja dodatkom egzogenog cerulo-plazmina.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaAnemija kronične bolesti je normokromna, normo-citna anemija blažeg (Hb 95 g/L) do srednje teškog stupnja (Hb 80 g/L) Bolesnici imaju snižen broj re-tikulocita što govori za smanjenu proizvodnju eri-trocita. Definitivna dijagnoza može biti otežana u stanjima kroničnih krvarenja s posljedičnom sidero-penijom ili u prisustvu drugih vrsta anemija. Stoga obrada treba uključiti i određivanje statusa željeza u organizmu da se isključi anemija zbog manjka želje-za koja je obično hipokromna i mikrocitna. Razlika između AKBi i sideropenične anemije je u tome da je posljednja izazvana isključivo manjkom željeza dok je nastanak AKB višeuzročan. U obje vrste anemije koncentracija serumskog željeza i saturacija transfe-rina su smanjene. U prvom slučaju je to posljedica apsolutnog manjka željeza, a u drugom manjak je relativan jer je velika količina željeza zarobljena u stanicama RES-a.

U sideropeničnoj anemiji saturacija transferina je niža nego a AKB zbog toga što je koncentracija tran-sferina u AKB normalna ili snižena dok je u sidero-peničnoj anemiji izrazito povećana. Treba tragati i za drugim uzrocima manjka željeza kao što su meno-metroragije, kronična krvarenja iz probavnog susta-va, crijevne upalne bolesti, angiodisplazije, adenomi

debelog crijeva, rak probavnih organa ili parazitarne infekcije.

Feritin se koristi kao pokazatelj rezervi željeza u or-ganizmu i koncentracija od 15 ng/ml se uzima kao granica koja pokazuje nedostatak željeza. Međutim koncentracija od 30 ng/ml puno sigurnije određuje anemiju zbog manjka željeza (vjerojatnost dijagnoze 92-98 %). U AKB feritin je normalan ili povišen poka-zujući povećane rezerve željeza i zadržavanje željeza unutar stanica RES-a, ali može biti povišen i zbog imune aktivacije kao reaktant akutne faze.

Topljivi transferinski receptor je dio membranskog receptora koji je povećan u nedostatku željeza. U anemiji kronične bolesti nivo topljivog transferin-skog receptora je približno normalan jer upalni cito-kini negativno utječu na njegovu ekspresiju. Odre-đivanje nivoa topljivog transferinskog receptora odličan je test razdvajanja AKB od AKB udruženog s manjom željeza. U prvom slučaju je koncentracija feritina normalna ili povišena uz nisku vrijednost so-lubilnog transferinskog receptora dok je u drugom obrnuto, niski feritin uz visoki transferinski receptor. Omjer koncenetracije topljivog transferinskog recep-tora i logaritma koncentracije feritina također može biti od pomoći. Omjer manji od 1 sugerira anemiju kronične bolesti, dok vrijednost veća od 2 snažno su-gerira apsolutni manjak željeza zajedno s anemijom kronične bolesti. Određivanje postotka hipokromnih eritrocita ili sadržaja hemoglobina u retikulocitima također mogu pomoći u otkrivanju manjka željeza u bolesnika s anemijom kronične bolesti. U tablici 48.3. prikazane su razlike između anemije kronične bolesti i sideropenične anemije te njihove kombina-cije.

LiječenjeAnemija se korigira liječenjem osnovne bolesti, stoga je terapija željezom kontraindicirana. Tran-sfuzija eritrocita neophodna je samo u bolesnika s teškim stupnjem anemije i naglašenim simptomima uz oprez kod srčanih bolesnika. Eritropoetin može biti koristan u bolesnika sa sniženom proizvodnjom EPO-a.


ANEMIJA U KRONIČNOJ BUBREŽNOJ INSUFICIJENCIJIU kroničnoj bubrežnoj insuficijenciji (KBI) redovito se pojavljuje hipoproliferacijska, normocitna, normo-kromna anemija uzrokovana poremećajem ekskre-torne i endokrine funkciji bubrega. Težina anemije obično odgovara težini bubrežne insuficijencije tako da je kod vrijednosti klirensa kreatinina manjeg 20 mL/min hematokrit niži od 30 %.

Najvažniji mehanizam nastanka anemije u KBI je smanjenje ili prestanak proizvodnje eritropoetina zbog bolesti bubrega, inhibicija koštane srži tok-sičnim metabolitima koji se ne izlučuju iz organiz-ma zbog poremećene ekskretorne funkcije bubre-ga te sekundarni hiperparatireoidizam. Uremijski toksini nepovoljno djeluju na sintezu hema, te in-hibiraju diferencijaciju eritroidnih matičnih stani-ca. Hemodijaliza može dijelom popraviti, ali ne u potpunosti korigirati anemiju, jer nedostaje eritro-poetin. U KBI postoji blaga hemoliza zbog meta-boličkih promjena u eritrocitima i veće osjetljivosti na mehaničko oštećenje. Kao odgovor na anemiju i hiperfosfatemiju povećana je koncentracija 2,3-BPG (2,3 bifosfoglicerat), sa smanjenim afinitetom Hb za kisik. Ostali činitelji koji pogoduju nastan-ku anemije su nedostatak željeza zbog gubitaka krvi iz probavnog i genitalnog sustava te gubitak željeza i folne kiseline tijekom dijalize. Jedan od činitelja je i mehanizam koji uzrokuje tzv. anemiju kronične bolesti. Hemoliza može biti izrazita kod

bolesnika s mikroangiopatskom hemolitičkom anemijom (hemolitičko-uremički sindrom, mali-gna hipertenzija). Konačno, lažno niže vrijednosti hematokrita mogu biti uzrokovane i stanjem hi-perhidracije.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaAnemija je normocitna i normokromna, ali mogu postojati blaža makrocitoza ili značajke siderope-nične anemije. U razmazu krvi se mogu naći razli-čite morfološke promjene te fragmentirani eritrociti. Broj retikulocita je normalan ili blago snižen, a oči-tih znakova hemolize nema. Vrijednosti serumskog željeza variraju. Osnovna bolest uz pridružene in-fekcije doprinosi nastanku anemije kronične bolesti. Brojne transfuzije dovode do opterećenja željezom. Najvjerodostojniji nalaz za procjenu rezervi željeza je određivanje serumskog feritina. Funkcija trombo-cita je poremećena proporcionalno stupnju uremije. Citološki pregled koštane srži pokazuje “normalan� nalaz, što je kod izražene anemije, kada se očekuje eritroidna hiperplazija, odraz relativne insuficijencije eritroidne loze.

LiječenjeNadomjesna terapija eritropoetinom (EPO) u najve-ćoj će mjeri korigirati anemiju te poboljšati kvalitetu života bolesnika, a izbjegavaju se i moguće kompli-kacije liječenja transfuzijama krvi. Uz terapiju eritro-poetinom uvijek kod sideropenije treba dodati želje-zo (najbolje intravenozno) te folnu kiselinu.

Tablica 48.3. Laboratorijske razlike između AKB i sideropenične anemije

Laboratorijski nalaz Anemija kronične bolesti Sideropenična anemija Kombinirana anemija

MCV Normalan Snižen Normalan

Željezo Sniženo Sniženo Sniženo

Transferin Snižen/normalan Povišen Snižen

Zasićenost transferina Snižena Smanjena Snižena

Topljivi transferinski receptor Normalan Povišen Normalan/povišenn

Feritin Normalan/povišen Snižen Snižen/normalan

Omjer transferinskog receptora i log feritina

Nizak (>1) Visok (>2) Visok (>2)

Anemije | 453

ANEMIJA U ENDOKRINIM BOLESTIMAUz eritropoetin i drugi hormoni sudjeluju u regula-ciji eritrocitopoeze; posredno utječu na produkciju eritropoetina, kontrolirajući potrošnju kisika u tkivi-ma. Hormoni koji najočitije utječu na eritrocitopoe-zu su hormoni hipofize, štitnjače, kore nadbubrežne žlijezde i gonada. U pravilu ove anemije su blage i korigiraju se supstitucijskom terapijom osnovne bo-lesti. Utjecaj androgena na hematopoezu očituje se već razlikom u koncentraciji hemoglobina između muškaraca i žena. Androgeni djeluju na eritrocito-poezu djelujući izravno, zajedno s eritropoetinom na koštanu srž, a također povećavajući razinu eri-tropoetina. Bolesnici s hipopituitarizmom razvijaju najčešće srednje tešku (Hb oko 100 g/L) normocitnu, normokromnu anemiju s umjerenom hipoplazijom i relativnom insuficijencijom koštane srži. Za ovo su odgovorni hormoni hipofize kao što su tireotro-pni hormon (TSH) i gonadotropini (LH i FSH) koji kontroliraju produkciju androgena. Supstitucijska terapija hormonima štitnjače, androgenima, uz ste-roide korigira anemiju. U hipotireozi eritrocitopoeza je inhibirana zbog smanjenog metabolizma i stoga smanjene potrebe tkiva za kisikom. Anemija je umje-rena, normocitna i normokromna, no može biti kom-plicirana deficitom željeza i folata, a ponekad može biti pridružena i periniciozna anemija. Relativno je česta mikrocitna, hipokromna anemija zbog gubitka željeza metroragijama što je česta pojava u žena s miksedemom. Željezo može uzmanjkati i u slučaju oslabljene apsorpcije zbog aklorhidrije ili intesti-nalne malapsorpcije. Insuficijenacija kore nadbu-brežna žlijezde, tj. prije svega nedostatak glukokor-tikoida uzrokuje blagu normocitnu, normokromnu anemiju uz pridružen smanjeni volumen plazme, što može lažno prikrivati anemiju. Nakon adrenalekto-mije anemija (najčešće blaga) dobro odgovara na glukokortikoide i EPO. Nakon orhidektomije kon-centracija hemoglobina je prosječno smanjena za 12 g/L. Androgeni se koriste i u liječenju refraktornih anemija i aplastične anemije. U hipogonadizmu se pojavljuje blaga normocitna, normokromna anemija koja se korigira primjenom testosterona.

MEGALOBLASTIČNE ANEMIJEU megaloblastične anemije ubrajaju se anemije s ka-rakterističnim poremećajem eritroidne loze i očituju se pojavom megaloblasta u koštanoj srži i makrocita (megalocita) u perifernoj krvi.

Megaloblastična anemija je najčešće posljedica manj-ka vitamina B12 ili folne kiseline, no može se pojaviti i zbog poremećaja metabolizma tih dvaju vitamina, manjka transkobalamina-bjelančevine koja prenosi vitamin B12 u serumu, te primjene dušikova oksida i lijekova antifolata. Temeljni mehanizam anemije je poremećaj u sintezi DNA, anemija prati i konge-nitalni manjak enzima važnog u sintezi DNA, npr. kod orotičke acidurije (manjak enzima koji katalizira pretvorbu orotičke kiseline u orotidin-monofosfat i potom u uridin-monofosfat). Opaža se u stečenim stanjima kod dugotrajnog konzumiranja alkohola, primjene hidroksiureje i citarabina. Tablica 48.4. pri-kazuje najčešće uzroke nastanka megaloblastične anemije.

U koštanoj srži vide se brojni megaloblasti s izrazi-to velikom nezrelom jezgrom. To su stanice veće od normoblasta istog razvojnog stupnja i obično su ovalnog oblika. Količina RNA u tim je stanicama ap-solutno povećana dok je stvaranje DNA usporen. Ci-toplazma je u nezrelijim stanicama vrlo modra zbog povećanog sadržaja RNA. U polikromatofilnom me-galoblastu jezgra je nezrela dok citoplazma odgovo-ra stadiju zrelosti polikromatofilnog eritroblasta i to stanje se naziva nukleo-citoplazmatska disocijacija.

Krajnja stanica megalocit je veća od eritrocita, oval-nog je oblika i promjera do 14 µm. Eritrocitne kon-

Tablica 48.4. Uzroci megaloblastične anemije

• Manjak Vitamina B12

• Manjak folata• Poremećaj metabolizma vitamina B12 ili folata – Manjak transkobalamina II, – Dušikov oksid – Antifolatni lijekovi• Ostali poremećaji sinteze DNA – Kongenitalni manjak enzima npr. orotička acidurija – Stečeni poremećaj enzima zbog alkohola, liječenje

hidroksiurejom ili citarabinom


stante MCV i MCH povećane su pa anemija poka-zuje značajke makrocitne i hiperkromne anemije. Zbog nukleo-citoplazmatske disocijacije pojavljuje se nedjelotvorna (inefektivna) eritrocitopoeza. Zna-čajka je te promjene izrazita hiperplazija megalo-blasta u koštanoj srži, pri čemu samo mali broj stva-ra zrele eritrocite. Na to upozorava broj retikulocita, koji je obično normalan ili snižen. Željezo se uspo-reno ugrađuje pa je njegova koncentracija u seru-mu povećana, a UIBC je normalan ili snižen. Veliki broj megaloblasta propada u koštanoj srži. Zbog intramedularne destrukcije ili „hemolize� nezrelih prethodnih eritroidnih stanica (megaloblasta) raste LDH i bilirubin. Poremećaj sinteze DNA uzrokuje morfološke promjene i drugih loza. Granulocitna loza je zastupljena tzv. gigantskim metamijelociti-ma s izduženom jezgrom. Segmentirani granuloci-ti pokazuju hipersegmentaciju jezgre sa šest i više segmenata. Megakariociti su također veliki i hi-persegmentirani, a broj im je povećan. Stvaranje trombocita je smanjeno pa se u teškim slučajevima stvara samo 10 % od količine koja bi odgovarala povećanom broju megakariocita. Hipercelularna i displastična koštana srži ponekad može upućivati lažno na akutnu leukemiju. Promjene jezgre opaže-ne su i na epitelnim stanicama probavnog sustava i spolnih žlijezda.

Jedna od najčešćih megaloblastičnih anemija zbog manjka vitamina B12 je perniciozna anemija (PA). To je autoimuna megaloblastična anemija koju karakte-rizira atrofija sluznice želuca. Smanjena je ili izostaje sekrecija unutarnjeg faktora, a nedostaje i slobod-ne solne kiseline u želučanom soku (aklorhidrija). Bolest se pojavljuje u starijoj životnoj dobi (oko 60. godine), češće u žena i pokazuje pridruženost dru-gim autoimunim bolestima (miksedem, Hashimotov tireoiditis, Addisonova bolest, vitiligo, hipoparatire-oidizam i hipogamaglobulinemija). Bolest pokazuje obiteljsku učestalost, najčešća je u osoba krvne gru-pe A, s plavim očima, koje brže sijede. Prevalencija karcinoma želuca u bolesnika s pernicioznom ane-mijom (PA) je 1-3 %, a 2 % bolesnika s karcinomom ima PA. Zahvaća sve dobne skupine, ali je vršak po-javnosti između 70 i 80 godina.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaU većine megaloblastičnih anemija simptomi umora i slabosti se postupno razvijaju, anemija može biti vrlo teškog stupnja (čak Hb<50 g/L), a da bolesnik bez drugih komorbiditeta nema većih tegoba. Bolesnik je blijedožućkaste boje poput slame. Jezik je jarko crven, uz angularni stomatitis. Mogu biti prisutni umjereni znakovi malapsorpcije, a ako je prisutna trombocitopenija može se pojaviti purpura. Pri per-nicioznoj anemiji često je zahvaćen i živčani sustav jer je vitamin B12 potreban za proces mijelinizacije. Najpoznatiji oblik tih neuroloških promjena je funi-kularna mijeloza, 70-90 % bolesnika pokazuje neu-rološke promjene sa smetnjama dubokog senzibili-teta, parestezijama, ataksijom, u težih oblika javljaju se smetnje mokrenja i defekacije.

Manjak folata ne uzrokuje neuropatiju, iako se na-kon primjene metotreksata može razviti teška ence-falopatija Glositis se opaža u oko 65 % bolesnika, naziva se Hunterovim glositisom.

Anemija je makrocitna (MCV > 100 fL, a često i >120 fL). Makrociti (megalociti) su ovalnog oblika, broj retikulocita je snižen, a broj leukocita i trombocita može biti umjereno snižen. Neki od segmentiranih granulocita pokazuju hipersegmentaciju jezgre (sa šest i više segmenata). Koštana srž pokazuje tipične znakove megaloblastične hematopoeze. U serumu je povećan nekonjugirani bilirubin i LDH, a željezo i feritin su na gornjoj granici normale ili su povišeni. Manjak vitamina B12 ili folne kiseline može se utvrditi određivanjem njihove koncentracije u serumu (Ta-blica 48.5.).

Ako manjka vitamina B12, serumski su folati normalni do povišeni, a ako manjka folne kiseline, serumski je vitamin B12 umjereno snižen. Deoksiuridinski test supresije koristi se u dijagnostici manjka folne kiseli-ne i vitamina B12. Tim se testom in vitro objektivizira stupanj supresije ugradnje radioaktivnog timidina u stanice koštane srži, dodatkom deoksiuridina. Za manjak vitamina B12, posebice pernicioznu anemiju provodi se Schillingov test, koji je zadnjih nekoli-ko godina zamijenjen novijim testovima. Testom se određuje izlučivanje radioaktivnog vitamina B12 u

Anemije | 455

mokraći. Na usta se primjeni 0,5-2,0 µg radioaktiv-nog vitamina B12 uz parenteralnu primjenu oko 1000 µg vitamina B12 kako bi se popunile rezerve tog vi-tamina. Zdrave će osobe u 24-satnom urinu izlučiti 5-40 % primijenjene peroralne doze. Bolesnici po-kazuju smanjeno izlučivanje ako je zbog bilo kojeg razloga poremećena apsorpcija vitamina B12. Izlučuju od 0-3 % radioaktivnog vitamina B12. Test se izvodi u tri akta kako bi se razlikovala perniciozna anemija od bolesti ileuma i sindroma slijepe vijuge. Dodatkom unutarnjeg faktora test se normalizira kod pernicio-zne anemije. U sindromu slijepe vijuge prethodnim liječenjem antibioticima uništavaju se bakterije koje prekomjerno troše vitamin B12 što uvjetuje normali-zaciju Schillingova testa (tablica 48.6.)

Kod određivanja koncentracije vitamina B12 javljaju se lažno pozitivne i negativne vrijednosti zbog činje-nice da se samo 20 % ukupnog vitamina B12 nalazi vezan za transkobalamin, a ostatak za haptokorin. Noviji testovi poput holotranskobalamina temelje se na mjerenju saturacije transkobalamina vitaminom B12. Mjerenje koncentracije MMA i/ili homocisteina se sve više koristi u postavljanju dijagnoze nedostat-ka vitamina B12. U preko 98 % bolesnika nalaze se značajno povišene vrijednosti MMA i homocisteina, uključujući i one bolesnike sa samo neurološkim ma-nifestacijama. Povišena MMA>1000 nmol/L isključi-

vo je povezana uz nedostatak vitamina B12, dok se umjeren porast (300-700 nmol/L) vidi u bubrežnom zatajivanju. Određivanje homocisteina je manje specifično, a povišen je i kod nedostatka folata. Za određivanje uzroka nedostatka vitamina B12 koriste se drugi testovi poput određivanja protutijela na IF-intrinzični faktor (osjetljivost 50 %, specifičnost 100 %), antiparijetalna protutijela (osjetljivost viša od 80 % uz manju specifičnost), određivanje razine gastri-na, serumskog pepsinogena tip I.

Makrocitna anemija se može pojaviti zbog kroničnog alkoholizma, bolesti jetre, miksedema, primjene ci-tostatika, tijekom trudnoće, u teških oblika aplastič-ne anemije, te u mijelodisplazija i multiplog mijelo-ma. Makrocitoza je umjerena a MCV gotovo nikad nije > 120 fL.

LiječenjeLiječenje megaloblastične anemije jednostavno je kao i liječenje sideropenične anemije. Ako uzrok nije jasan bolje je primijeniti oba vitamina, jer sama folna kiselina ne liječi neurološke promjene, nego ih pogoršava. Pripravak vitamina B12 hidroksikoba-lamin ili cijanokobalamin (češći u SAD) primjenju-je se intramuskularno u dozi od 1000 µg nekoliko puta tjedno kroz 2 tjedna (moguće i jednom kroz sedam dana) odnosno do jasnog hematološkog

Tablica 48.6. Schillingov test

Uzrok manjka vitamina B12 Schillingov test Bez IF Schillingov test s IF Schillingov test nakonantimikrobne terapije

Vegeterijanci normalan normalan normalan

Perniciozna anemija ili gastrektomija snižen normalan snižen

Bolest ileuma snižen snižen snižen

Sindrom slijepe vijuge snižen snižen normalan

Tablica 48.5. Koncentracija vitamina B12 i folne kiseline u bolesnika s megaloblastičnom anemijom

Test Manjak vitamina B12 Manjak folne kiseline

Vit. B12 u serumuFolati u serumuFolati u eritrocitu

SniženNormalan/povećanNormalan/snižen

Normalan/graničanSniženSnižen


oporavka nakon čega se prelazi na injekcije jednom mjesečno. Vitamin B12 treba profilaktički doživotno primjenjivati nakon gastrektomije, poremećene ap-sorpcije ili resekcije ileuma. Folna kiselina u obli-ku tableta primjenjuje se peroralnu u dozi od 5 mg tijekom 4 mjeseca. Dužina liječenja ovisi o uzroku manjka folne kiseline. Tijekom trudnoće, te u teških hemolitičkih anemija i bolesnika na hemodijalizi preporučuje se profilaktička primjena folne kiseli-ne. Ako je terapija ispravna bolesnik se subjektivno bolje osjeća već 24-48 sati od početka liječenja, za početak hematološkog oporavka potrebno je ne-koliko dana, a prvi objektivni pokazatelj jest izra-ziti porast retikulocita koji se opaža 6-7 dana od početka liječenja, a nakon dva tjedna hemoglobin poraste za 20-30 g/L. Periferna neuropatija samo se dijelom poboljša nakon tjedan dana. Za neurološ-ki kompletan oporavak potrebno je 6-18 tjedana. Kod bolesnika s teškom simptomatskom anemijom i kardijalnim simptomima primjenjuje se trasfuzija eritrocita.

HEMOLITIČKE ANEMIJEKoštana srž proizvede svaki dan oko 200 milijardi eritrocita koji prosječno žive 120 dana. Svako stanje koje je praćeno skraćenim životnim vijekom eritro-cita naziva se hemolitička anemija.

Eritrociti se u fiziološkom procesu starenja mije-njaju, dolazi do smanjene fleksibilnosti, povećane propustljivosti membrane, gubitka bjelančevina i enzima i smanjene sposobnosti stvaranja energije - ATP. Odstranjuju ih stanice mononuklearno-ma-krofagnog sustava u koštanoj srži te jetri i slezeni. Hemoglobin se razgrađuje na hem i globin. Hem se katabolizira put mikrosomalnog oksidacijskog sustava jetre, dok se porfirinski prsten pretvara u žučni pigment – bilirubin koji se izlučuje jetrom. Prerano raspadanje eritrocita tj. hemoliza nastaje u cirkulaciji odnosno razaranjem stanica mononukle-arno-makrofagnom sustavu. Intravaskularna hemo-liza nastaje vezanjem komplementa za membranu eritrocita ili djelovanjem vanjskog toksina. Ekstra-

vaskularna hemoliza posljedica je aktivacije makrofaga specifič-nim vezivanjem imunoglobulina vezanih za površinu eritrocita. Organizam nastoji kompenzira-ti ubrzano propadanje eritroci-ta. Koštana srž ima sposobnost povećati stvaranje eritrocita do 6 puta iznad normale. To znači da je organizam sposoban kom-penzirani anemiju sve dok se životni vijek eritrocita ne skrati ispod 20 dana. Najčešći uzroci hemolitičkih anemija prikazani su u tablici 48.7.

Laboratorijska dijagnostikaNa hemolitičku anemiju upu-ćuju povišeni nalazi testova de-strukcije eritrocita, povišenog stvaranja eritrocita te testovi koji upućuju na manje vrijedne eri-trocite. Kao prvi test potrebno je

Tablica 48.7. Najčešći uzroci hemolitičkih anemija

Nasljedne Stečene

MEMBRANOPATIJE• sferocitoza• eliptocitoza• stomatocitoza• akantocitozaENZIMOPATIJE• deficit G6PD • deficit PKHEMOGLOBINOPATIJE• hemoglobin S• hemoglobin C• nestabilni hemoglobin

IMUNOSNE• Autoimune – AIHA s toplim protutijelimaAIHA s hladnim protutijelima• Aloimune – hemolitičko-transfuzijske reakcije – hemolitička bolest novorođenčeta – alogena transplantacija koštane srži – anemija uzrokovana lijekovimaSINDROM FRAGMENTACIJE ERITROCITA• arterijski presadak• umjetni zalisciMIKROANGIOPATSKE HEMOLITIČKE ANEMIJE • trombotičko trombocitopenična purpura • hemolitičko uremijski sindrom• meningokokna sepsa• preeklamspija• diseminirana intravaskularna koagulacija • Marš hemoglobinurijaMIKROORGANIZMI (klostridij, plazmodij)PAROKSIZMALNA NOĆNA HEMOGLOBINURIJA KEMIJSKE I FIZIKALNE TVARISEKUNDARNE HEMOLITIČKE ANEMIJE • bolesti bubrega i jetre

Anemije | 457

odrediti relativni i apsolutni broj retikulocita. Uglav-nom je relativni broj retikulocita >20‰ ili apsolutni broj>100x109/L. Povišena je vrijednost nekonjugi-ranog bilirubina i urobilinogena u mokraći. Intra-vaskularna hemoliza karakterizirana je hemoglobi-nemijom, hemoglobinurijom te hemosiderinurijom i methemalbuminemijom uz snižen haptoglobin te povišen LDH. Nužno je učiniti citološki razmaz peri-ferne krvi jer različite promjene u morfologiji eritro-cita upućuju na ovaj tip anemije (shistociti, sferociti, dakriociti, ehinociti i akantociti).

Nasljedne hemolitičke anemije1. Anemije zbog poremećaja membrane eritrocita

• Hereditarna sferocitoza

• Hereditarna eliptocitoza

• Hereditarna stomatocitoza

• Akantocitoza

2. Anemije zbog poremećaja metabolizma eritrocita

• Deficit enzima G6PD

• Deficit enzima PK

3. Hemoglobinopatije

• Talasemije alfa

• Talasemija beta (minor, intermedija i major)

• Ostale hemoglobinoptije (anemija srpastih stanica, hemoglobinopatija D)

Anemije zbog poremećaja membrane eritrocitaHereditarna sferocitoza jest najčešća nasljed-na hemolitička anemija. Zbog poremećaja sinteze membranskih bjelančevina metodom elektroforeze na poliakrimidnom gelu prepoznaju se 4 podtipa nasljedne sferocitoze: izolirani poremećaj spektrina, kombinirani poremećaj spektrina i ankirina, manjak vežućeg proteina 3, manjak proteina 4.2. Za pojedi-ne podtipove zahvaćeni su geni na pojedinim kro-mosomima: kromosom 1 (alfa-spektrin), kromosom 8 (ankirin), kromosom 14 (beta spektrin), kromosom 15 (protein 4.2) kromosom 17 (vežući protein 3). Za sve je poremećaje karakteristična slabost vertikalne veze između lipidnog dvosloja od ostalog skeleta

membrane, zbog čega se područja lipidnog dvosloja oslobađaju u obliku mikrovezikula.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaBolest se očituje slikom kronične hemolitičke ane-mije i splenomegalijom. S vremenom se kod 50 % bolesnika stvaraju žučni kamenci. Hemolitičke krize su povezane s infekcijama. Aplastična kriza je po-vezana s infekcijom parvovirusom B19. Dijagnoza. Dijagnoza se postavlja na temelju kliničke slike i na-laza sferocita u razmazu periferne krvi. Osmotska rezistencija eritrocita je patološka, osjetljivost sfero-cita na osmotske promjene je povećana. Molekularni poremećaj se može otkriti na poliakrilamidu dok se u zadnje vrijeme razvijaju i genetski testovi koji se temelje na PCR metodi. Splenektomija je terapija iz-bora, a preporuča se još liječenje rekombinantnim eritropoetinom.

Nasljedna eliptocitoza nastaje radi poremećaja skeletnih bjelančevina alfa i beta – spektrina, bje-lančevine 4.1, glikoforina C i vezne bjelančevine 3. Karakterizira je nalaz eliptocita i ovalocita uz karak-teristične znakove hemolize. Homozigoti i dvostru-ki heterozigoti očituju se hemolitičkom anemijom s mikrosferocitima, poikilocitima, splenomegalijom.

Nasljedna stomatocitoza. Eritrociti imaju oblik usta, smanjena je količina stomatina, vezne bjelanče-vine 7.2, znatno je povećana količina natrija i vode. Bolest se očituje hemolizom i nalazom stomatocita oko 10-30 %.

Akantocitoza ili bizarni eritrociti s produljcima po-javljuje se kod teških jetrenih bolesti (ciroza jetre), gdje se slobodni kolesterol nakuplja na površini membrane. Akantociti su laboratorijsko obilježje abetalipoproteinemije, gdje nedostaje beta-lipopro-tein. Poremećaj je u sekreciji apoproteina u jetrernim stanicama. Eritrociti normalnog izgleda dolaze u pa-tološku plazmu gdje poprimaju izgled akantocita i ubrzano propadaju, dolazi do anemije i splenomega-lije. Karakteristični su testovi na hemolizu., Transfu-zije nemaju koristi jer se transfundirani eritrociti brzo pretvaraju u akantocite. Splenektomija može ublažiti simptome, ali je zbog postojanja jetrene bolesti vrlo rizičan zahvat.


Anemije zbog poremećaja metabolizma eritrocitaAnemija je kroničnog tipa, dok se akutna intermi-tentna hemoliza viđa kod bolesnika s poremećajem enzima koji sintetiziraju metabolizam glutationa.

Deficit enzima glukoza-6-fosfat dehidrogenaza (G6PD) najčešći je metabolički nasljedni poremećaj metabolizma eritrocita. G6PD je ključni enzim hek-soza monofosfat shunta, stoga G6PD reducira NADP u NADPH i započinje reakciju stvaranja pentoza šećera. Aktivnost G6PD smanjuje se kako eritrocit stari, a retikulociti pokazuju pet puta veću aktivnost enzima od najstarije populacije eritrocita. Nasljeđuje se spolno X-vezano, gen ima 20 kb s 13 eksona, naj-češća su 2 tipa A afrički i B divlji tip te je dosad opi-sano više od 300 inačica deficita enzima. Na temelju kliničke slike i tipa hemolize deficit enzima dijeli se na 3 skupine: akutna intermitentna hemoliza koja se pojavljuje endemski (mediteranski tip, afričko-ame-rički tip, jugoistočno azijski tip). Druga skupina je praćena kroničnom hemolitičkom anemijom. Treća skupina nije česta bez znakova hemolitičke anemije.

Klinički se bolest očituje hemolitičkom krizom na-kon akutnih infekcija, uzimanja boba i lijekova koji djeluju kao antioksidansi (antimalarici, sulfonamidi, sulfoni, nitrofurantoin, kloramfenikol, analgetici po-put aspirina u višim dozama, antihelmintici poput nitrodazola, antraciklini – doksorubicin, analozi vi-tamina K). Dolazi do denaturacije hemoglobina koji se precipitira u obliku Heinzovih tjelešaca koje fago-citira slezena. Liječenje je simptomatsko, a splenek-tomija ima kratkotrajan učinak.

Deficit piruvat kinaze PK je važan enzim u anae-robnom ciklusu glikolize u eritrocitu. Deficit tog en-zima uzrokuje kroničnu hemolitičku anemiju. Deficit se nasljeđuje autosomno recesivno. Bolest je prisut-na kod homozigota dok kod heterozigota nema bo-lesti. PK pretvara fosfoenolpiruvat u laktat, pri čemu nastaje energijom bogati ATP. Klinički težina varira od blage do teške hemolitičke anemije (žutica, žučni kamenci, aplastična bolesti, manjak folata). Splenek-tomijom se može postići dobar učinak na hemolizu jer smanjuje potrebu za transfuzijama. Splenektomiju treba napraviti nakon 3. godine života.

HEMOGLOBINOPATIJEDo sada je opisano više od 1200 mutacija globina. Većina tih mutacija je klinički nijema. U više od 350 mutacija globinskih gena dolazi do alfa i beta tala-semije. Ove mutacije mijenjaju ili zaustavljaju tran-skripciju odgovarajućih globinskih gena, odnosno translaciju mRNA. S druge strane globinske mutacije mogu uzrokovati nastanak hemoglobina s velikim afinitetom za kisik, što uzrokuje nastanak policite-mije, nastanak hemolitičke bolesti te mutacije koje pospješuju oksidaciju hemoglobina, zbog čega na-staju methemoglobin i cijanoza. Najviša je učestalost hemoglobinopatija u tropskom i subtropskom po-dručju kao jedan od zaštitnih odgovora na malariju.

Talasemije su heterogena skupina nasljednih bolesti uzrokovanih smanjenim stvaranjem α i β-globinskih lanaca. Bolest se očituje od fetalnog hidropsa, β-talasemija major, talasemija intermedija i talasemija minor.

Alfa talasemije nastaju zbog delecije α-gena. Postoje dva gena na kromosomu 15 i potrebna je delecija sva 4 alela za potpunu supresiju α-lanaca. Manjak ili delecija obaju gena dovodi do nastanka hemoglobin Bart (γ4) i takav poremećaj dovodi do intrauterine smrti fetusa. Delecija tri α-gena dovodi do kliničke slike mikrocitne hipokromne anemije i splenome-galije (bolest hemoglobina H). Poremećaj jednog ili dvaju α-gena nema kliničkih posljedica, ali MCV i MCH mogu biti niži. Opisana je mutacija koja zahva-ća krajnju fazu translacije, pri čemu nastaje produže-ni α-lanac npr. „hemoglobin constant spring�.

Beta talasemije obuhvaćaju sljedeće bolesti talasemi-ja major, intermedija i minor.

β-talasemija minor pojavljuje se u potomaka u kojih su oba roditelja prenositelji talasemije (hete-rozigotna talasemija minor). Bolest se naziva me-diteranskom anemijom. Temeljno je obilježje pot-puni manjak β-lanaca (β0) ili se stvara vrlo mala količina β-lanaca (β+). Veći višak α-lanaca uzrokuje težu anemiju. Stvaranjem γ-lanaca nastoji se suzbiti bolest. Povoljan je učinak hidroksiureje jer dovodi do pomaka sinteze adultnog hemoglobina prema fetalnom. Poznato je preko 200 različitih genetskih

Anemije | 459

poremećaja koji se fenotipski očituju ovom slikom. Glavna genetska promjena je točkasta mutacija unu-tar genetskog kompleksa ili u začetniku gena ili u području genskog pojačivača. Mutacija dovodi do delecije nukleotida, zbog čega se zaustavlja proces translacije ili dolazi do preranog završetka sinteze globinskog lanca. Mutacija može uzrokovati i na-stanak vrlo nestabilne m-RNA. Talasemija major je često posljedica nasljeđivanja dvaju mutacija od kojih svaka zahvaća β-lanac. Stvaranje δ/β fuzijskog gena zbog prebacivanja gena s jednog člana kromo-soma na drugi te nastaje talasemija nazvan Lepore sindrom. Klinički bolest se očituje slikom teške ane-mije 3-6 mjeseci nakon rođenja kada nastaje pomak od fetalnog HbF u adultni hemoglobin (HbA) kada se pojačava sinteza β-globinskog lanca. Prisutna je izrazita destrukcija i ekstramedularna hematopoeza te hepatosplenomegalija i hemosideroza. Intenziv-na hiperplazija koštane srži dovodi do ekspanzije i hipertrofije koštanog tkiva s formiranjem facies tha-lassemica (izbočene kosti kranija, posebice čeonih i tjemenih kostiju). Zbog brojnih transfuzija razvija se sekundarna hemosideroza s oštećenjem niza or-gana (hipofiza-hipopituitarizam, zaustavljanje rasta, zakašnjeli pubertet, hipotireoidizam, šećerna bolest, hipoparatireoidziam, oštećenje jetre i gonada) te srca s nastajanjem infiltrativne hipertrofične kardiomio-patije. Bolesnici imaju sivkast izgled, osjetljivi su na infekcije posebice nakon splenektomije (pneumo-kok, meningokok). Prisutna je teška hipokromna, mikrocitna anemija uz retikulocitozu, a u perifernom razmazu nađe se povećan broj eritroblasta, stanice poput cilja, bazofilne punktacije eritrocita. Elektrofo-rezom se nađe HbF, nedostaje HbA. Važno je učiniti ispitivanje svih organskih sustava kod hemosideroze.

Liječenje talasemija provodi se transfuzijama kon-centrata eritrocita uz primjenu folne kiseline (5mg/dan). Terapija hemosideroze provodi se kelatorima željeza. Parenteralni pripravak deferoksamin potreb-no je davati u produljenoj kontinuiranoj infuziji što povećava njegov učinak i eliminaciju željeza iz orga-nizma. Postoji i peroralni pripravak deferasiroks ko-jeg je potrebno dati dovoljno rano i prevenirati ošte-ćenja organa. Splenektomija može smanjiti potrebu

za transfuzijama. Prije splenektomije potrebno je dati pneumokokno cjepivo. Transplantacija alogenih kr-votvornih matičnih stanica od HLA-podudarnog da-rivatelja omogućuje povoljan terapijski učinak kod 80 % bolesnika. Talasemija intermedija: Anemija pokazuje srednje težak stupanj (Hb 70-100 g/L) bez sustavne potrebe za liječenjem transfuzijama. Tako se može prezentriati i homozigotna beta talasemija s povećanim stvaranjem HbF. Kliničku sliku uzrokuje i delecija triju gena α–lanca i HbH se razlikuje od beta talasemije. U ovog tipa nema povećane koli-čine željeza u organizmu, kao niti ekstramedularne hematopoeze.

Heterozigotna talasemija (minor) čest je oblik ta-lasemije koji se očituje hipokromnim, mikrocitnim eritrocitima s naznačenom anemijom ili normalnim nalazom crvene krvne slike. Nalaz elektroforeze po-kazuje povećan udio HbA2 (>3,5 %).

Ostale hemoglobinopatijeAnemija srpastih stanica (drepanocitoza – hemo-globinopatija S) Deoksihemoglobin S polimerizira se pa je hemoglobin izduženog oblika, a eritrocit popri-ma izgled srpastog izgleda (beta kodon 6 GAG>GTG ili zamjena valina glutaminskom kiselinom). Taj pro-ces se odigrava u mirocirkulaciji pa uzrokuje zače-pljenje malih krvnih žila i razvoja mikroinfarkta. U zapadnoj Africi je česta hemoglobinopatija C gdje je lizin zamijenjen glutaminskom kiselinom u beta-glo-binskom lancu na istome mjestu gdje je valin zamje-njen glutaminskom kiselinom.

Hemoglobinopatija D (zamjena glutamina u položaju 121 β-globinskog lanca s glicinom) u homozigotnom se stanju očituje kliničkom slikom koja podsjeća na anemiju sprastih stanica.

STEČENE HEMOLITIČKE ANEMIJESplenomegalijaSlezena je organ u kojem se razara najveći dio eri-trocita, posebice se razaraju eritrociti s bilo kojim defektom. Kod bolesnika sa splenomegalijom do-lazi do razaranja eritrocita u crvenoj pulpi. Uzroci


splenomegalije su brojni poput hematoloških bolesti (KML, KLL, leukemija vlasastih stanica, mijelofibroza, akutne leukemije, limfomi, talasemija major), bole-sti nakupljanja (Gaucherova bolest, Nieman-Pickova bolest, galaktozemija), sustavne upalne autoimune bolesti (SLE, RA), infekcije poput bruceloze, malarije, tuberkuloze, mononukleoze, lišmenije (kala-azar). Splenomegalija se javlja i u bolestima s portalnom hipertenzijom (ciroza jetre, tromboza hepatalnih vena –Budd-Chiariev sindrom, tromboza vene porte, spleničnih vena).

Imunohemolitičke anemijeImunohemnolitička anemija u odraslih može biti uzrokovana trima vrstama protutijela:

a) Stečenim aloantitijelima nakon transfuzije ili trudnoće, usmjerenim protiv transfundiranih eritrocita

b) Protutijelima koja se aktiviraju na tjelesnoj tem-peraturi, a usmjerena su protiv bolesnikovih vla-stitih eritrocita i

c) Protutijela koja se aktiviraju na hladnoći, a usmjerena su protiv bolesnikovih protutijela

Autoimune hemolitičke anemije (AIHA) bolesti su koje nastaju kao posljedica gubitka tolerancije prema vlastitim antigenima. Dijele se prema toplin-skim osobinama autoantitijela na hemolitičke ane-mije uzrokovane „toplim� i „hladnim� protutijelima, a ovisno o uzroku na primarnu (nepoznat uzrok) ili idiopatsku te sekundarnu AIHA (u podlozi druga bolest). Glavni laboratorijski test za dokaz imuno-hemolitičke anemije jest Coombsov antiglobulinski test. Test se zasniva na vezivanju životinjskih protu-tijela usmjerenih na serumske proteine koji su vezani na membrani eritrocita. Riječ je o IgG i dijelovima komplementa C3. Sposobnost seruma da se veže za eritrocitnu membranu i izazove aglutinaciju naziva se Coombsovim direktnim antiglobulinskim testom (DAT). Indirektni Coombsov test (IAT) otkriva pri-sutnost proteina u serumu bolesnika. U testu se inku-biraju normalni eritrociti s bolesnikovom plazmom i nakon toga se primjenjuje DAT.

Autoimuna hemolitička anemija uzrokovana toplim protutijelimaAutoimuna hemolitička anemija je uzrokovana pro-tutijelima koja pokazuju najveću reaktivnost s eritro-citnim antigenima pri tjelesnoj temperaturi od 37°C.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaKod primarne AIHA s toplim protutijela postoji spe-cifičan imuni odgovor na membranski antigen. Kod sekundarne AIHA autoantitijela nastanu kao pore-mećaj imunološke regulacije, eritrociti su obloženi s IgG, kompleksom IgG+komplement ili komplemen-tom. Iznimno su rijetka IgM i IgA protutijela. Eritro-citi koji nemaju ciljni antigen uredno preživljavaju. Razgrađuju se u makrofazima ukoliko su obložena s IgG, a ukoliko su obložena komplemetom razgrad-nja nije izravna, već se takvi eritrociti predočavaju antigen prezentirajućim stanicama. Eritrocite mogu razoriti i limfociti direktnom citotoksičnom aktivno-šću. Prevalencija raste sa starenjem, anemija uglav-nom nastane kao komplikacija poremećaja imuno-loškog sustava poput zloćudnih tumora limfocita, kolagenoza, solidnih tumoria te kongenitalne imu-nodeficijencije. Stvaranje protutijela mogu poticati i lijekovi.

Anemija varira od blage do teške, pa čak i one s dramatičnim tijekom. Obično se razvija postupno no moguć je i nagli nastanak. Anemiju karakterizira retikulocitoza, povišen indirektni bilirubin i LDH te snižen haptoglobin. Serološki se nađe pozitivan Co-ombsov test, najčešće DAT, a ukoliko su protutijela prisutna u velikoj količini pozitivan je i IAT. Osim anemije može se razviti i imuna tromocitopenija pa je tada riječ o Evansovom sindromu.

LiječenjeBlaga anemija ne zahtjeva nikakvu terapiju, dok lije-čenje sekundarnih oblika mora biti usmjereno pre-ma osnovnoj bolesti. U bolesnika s težim oblikom lijek izbora su kortikosteroidi (prednizolon 1-2 mg/kg/dan) i terapija se koristi do normalizacije vrijed-nosti Hb, te se doza nakon toga postupno smanjuje i nakon nekoliko mjeseci prekida. Na kortikostero-

Anemije | 461

ide najbolji odgovor imaju primarna AIHA i sekun-darna AIHA uz SLE. U oko 50 % bolesnika nakon postignute remisije moguća je ponovna pojava bo-lesti. Druga linija kod neadekvatnog odgovora na kortikosteroide jest splenektomija. Ako se tada ne uspije kontrolirati bolest primjenjuju se drugi imu-nosupresivni lijekovi (azatioprin, ciklofosfamid). Plazmafereze nisu učinkovite jer je više od polovice IgG protutijela ekstravaskularno. Imunoglobulini u visokim dozama ne pokazuju povoljan učinak kao kod trombocitopenija. Transfuzija se primjenjuje u iznimnim situacijama s anemičnom hipoksijom, tako da krv davatelja ne smije sadržavati specifič-ne antigene. Rituksimab (anti-CD20) monoklonsko protutijelo također pokazuje povoljan odgovor u oko 50-60 % bolesnika. Primarne (idiopatske) AIHA imaju nepredvidljiv tijek karakteriziran remisijama i relapsima. Desetogodišnje preživljenje je oko 70 %. Prognoza sekundarne AIHA ovisi o osnovnoj bo-lesti.

Autoimuna hemolitička anemija uzrokovana hladnim protutijelimaAko protutijela pokazuju najjaču reaktivnost na tem-peraturi <37°C (obično nižoj od 31°C) i uzrokuju anemiju tada govorimo o AIHA uzrokovanoj hlad-nim protutijelima.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaOsnovni uzrok nije do kraja objašnjen, posredovana je hladnim aglutininima, a važna je i uloga komple-menta u destrukciji. Hladni aglutinini su IgM protuti-jela koja aglutiniraju eritrocite na temperaturi između 0 i 5°C, vežu se na „I� antigen eritrocitne membrane ili na njegov fetalni ekvivalent „i� antigen. Stupanj hemolize ovisi o titru protutijela u serumu, njihovom afinitetu za eritrocit, afinitetu za vezanje komple-menta, te temperaturi pri kojoj protutijela uzrokuju aglutinaciju. Oštećenje eritrocita nastaje izravnom li-zom posredovanom komplementom ili fagocitozom makrofaga. Dijeli se na primarnu (idiopatsku) kro-ničnu bolest hladnih aglutinina, te sekundarnu koja nastaje kao komplikacija virusnih bolesti (infektivna

mononukleoza), infekcije mikoplazmom pneumoni-je i u sklopu limfoproliferativnih bolesti.

Primarna se bolest hladnih aglutinina razvija nakon 50. godine života. U nekih bolesnika se razvije B-stanična limfoproliferativna bolest (Waldenströmova makroglobulinemija).

Sekundarna bolest hladnih aglutinina pojava je kod sifilisa, infekcije mikoplazmom pneumonije, Epstein-Barrovim virusom i kod drugih virusnih infekcija jer nastaje prolazna hiperprodukcija hladnih aglutinina. Aglutinini su prisutni nekoliko dana nakon oporavka od infekcije. Sekundarna bolest može nastati u bo-lesnika s preegzistirajućim limfoproliferativnim bo-lestima, a hladni algutinini se mogu naći i u sklopu drugih malignih bolesti.

Vaskularni poremećaji nastaju pri hlađenju krvi u perifernoj cirkulaciji kad se hladni aglutinini vežu za eritrocite. Nastaje intravaskularna hemoliza koja se očituje cijanotičnim ekstremitetima, ušima i nosu (akrocijanoza). Anemija je blaga do umjerena, češće u hladnim razdobljima.

LiječenjeNajbolji način liječenja bolesnika s akrocijanozom jest utopljavanje i zaštita od hladnoće. Splenek-tomija nema učinka dok je učinak kortikosteroida znatno manji nego kod anemije s toplim protutije-lima i ostvaruje se u oko 1/6 slučajeva. Klorambu-cil i ciklofosfamid rabe se kod izraženije bolesti s naglašenim anemijskim simptomima. Plazmafereze mogu biti korisne obzirom na prisutna intravasku-larna protutijela u akutnom napadaju i kod kritičnih bolesnika. Opisuje se odgovor na liječenje interfero-nom alfa, dok primjena rituksimaba dovodi u 50-60 % slučajeva do parcijalne remisije. Prognoza bolesti je dobra, osim kod onih u kojih je bolest nastala u sklopu neke od limfoproliferativnih bolesti.

Paroksizmalna hemoglobinurija na hladnoću je ri-jetka, ranije se opisivala u područjima endemskog tercijarnog sifilisa, javlja se kod djece (zaušnjaci, os-pice), a postoji i primarni oblik. Bolest počinje stva-ranjem snažnih hemolizina (Donath-Landsteinerova protutijela) IgG klase usmjerene na „P� kompleks.


Bolest nastaje nakon izlaganja hladnoći. Potrebno je bolesnike utopljavati te liječiti akutnu infekciju kod djece uz zabrana izlaganja hladnoći.

Imunohemolitička anemija uzrokovana lijekovimaPostoje tri tipa AIHA uzrokovane lijekovima:

Penicilinski (haptenski) tip AIHA. Bolest nasta-je 7-14 dana od početka antibiotske terapije, nakon prekida penicilina dolazi do oporavka. Penicilin obloži eritrocite koji vežu protutijela IgG, a ne vežu komplement te se razgrađuju u slezeni. Sličan tip mogu uzrokovati cefalosporini i tetraciklini.

AIHA uzrokovana primjenom alfa-metildope. Mnogi lijekovi uzrokuju stvaranje autoantitijela na eritrocite. Primjer je antihipertenziv alfa-metildopa. Test je pozitivan u oko 10-35 % bolesnika koji uzima-ju alfa-metildopu, a kod 1 % dolazi do hemolitičke anemije. Hemoliza prestaje nakon prekida uzimanja lijeka. Kod bolesnika koji se liječe analozima purina (fludarabin) razvije se AIHA.

AIHA zbog odlaganja kompleksom lijek-protein plazme (antigen-protutijelo-komplement). Molekule lijeka ili metabolita (kinidin, probenicid, rifampicin, cefalosporini, diklofenak, amfotericin B) ulaze u in-terakciju s makromolekulom plazme nakon čega do-lazi do indukcije stvaranja IgG, IgM i formiranja kom-pleksa koji se veže na eritrocite i posljedično aktivira komplement. Potrebno je prekinuti uzimanje lijeka.

Anemija uzrokovana fizikalnim čimbenicima Mehanička trauma u krvnom otpoku može uzroko-vati hemolizu na tri načina:

1. Oštećenjem eritrocita prilikom prolaska kroz vrlo uske krvne žile na površini tijela ispod kojih je tvrda podloga-kost; što se događa kod trkača, sportaša, vojnika koji obavljaju marševe.

2. Oštećenjem eritrocita prolaskom kroz umjetne valvule, arterijske presatke, umjetne graftove, valvule s velikim gradijentom tlakom (stenoza aortne valvule). U oko 10 % bolesnika s umjet-nim zaliscima događa se hemolitička anemija. Hemoliza se očituje smanjenjem vrijednosti hemoglobina i haptoglobina, porastom LDH

i retikulocita, hemoglobinurijom te hemoglo-binemijom uz fragmentirane eritrocite u cito-loškom razmazu periferne krvi. U težim slu-čajevima potrebno je učiniti ponovni kirurški zahvat, a može se razmotriti liječenje eritropo-etinom.

3. Intravaskularna koagulopatija s taloženjem fibri-na unutar stijenki krvnih žila oštećuje eritrocite što se vidi kod arterijske hipertenzije, eklampsi-je, odbacivanja transplantiranog bubrega, meta-staskog karcinoma i hemangioma. Ovaj tip ane-mije je prisutan kod TTP i HUS-a te bolesnika s DIK-om. Terapija je usmjerena prema liječenju osnovne bolesti.

Hemolitička anemija uzrokovana biološkim činiteljimaBrojne infekcije mogu uzrokovati intravaskularnu hemolizu na nekoliko načina: 1. Izravna invazija in-fektivnog mikroorganizma (malarija, bartoneloza); 2. Otpuštanje hemolitičkih toksina (Clostridium perfrin-gens); lecitinaza razara lecitin membrane eritrocita i uzrokuje akutno bubrežno i jetreno zatajenje; 3. Na-stanak autoantitijela protiv antigena eritrocita (miko-plazma pneumonije). Virusi također mogu biti pove-zani s nastankom autoimune hemolize kao i brojne bakterijske infekcije (Shigella, Campylobacter, As-pergillus) te ubodi ose, stršljena, škorpiona i pauka.

Hemolitička anemija uzrokovana kemijskim činiteljimaOtrovanja olovom, arsenom, solima bakra (Wilsono-va bolest, hemodijaliza) mogu uzrokovati hemolitič-ku anemiju.

APLASTIČNA ANEMIJAAplastična anemija (AA) određena je pancitopenijom i hipocelularnom koštanom srži koja nastaje zbog smanjenog broja ili nedostatka krvotvornih matičnih stanica.

Aplastične anemije mogu biti nasljedne i stečene (idiopatska i sekundarna). Među nasljedne ubraja-

Anemije | 463

mo Fanconijevu anemiju, kongenitalnu diskeratozu i Schwachman–Diamondov sindrom. Sekundarne mogu biti uzrokovane citostaticima, zračenjem, benzenom i drugim organskim otapalima te nekim lijekovima (kloramfenikol, soli zlata, nesteroidni an-tireumatici, antiepileptici, sulfonamidi, arsen). Na-dalje virusne infekcije (parvovirus B19, HIV, EBV, virusi hepatitisa) kao i autoimune sistemske bole-sti (eozinofilni fascitis, SLE, GvHD), paroksizmalna noćna hemoglobinurija, tumori timusa mogu biti uzrok aplastične anemije. U više od polovice sluča-jeva uzrok je nepoznat pa govorimo o idiopatskoj aplastičnoj anemiji. Smanjen je broj matičnih stani-ca s ekspresijom CD34 biljega dok stroma koštane srži nije poremećena. Smatra se da matične stanice bolesnika inkubirane zdravim stromalnim stanica-ma ne oporavljaju svoju proliferativnu sposobnost, dok s druge strane toksične tvari (lijekovi, virusi i antigeni) aktiviraju imunološki sustav limfocita T i izazivaju ubrzanu apoptozu matičnih stanica. Lu-čenje IFN-γ dovodi do ekspresije Fas receptora na matičnim stanicama i apoptoze. Opisan je i manjak NK T-limfocita koji se vidi i kod drugih autoimunih poremećaja.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaKlinički znakovi odraz su smanjenog broja krvnih stanica pa se zbog trombocitopenije javljaju znako-vi hemoragijske dijateze poput petehija, ekhimoza i manjih ili većih krvarenja, a zbog nedostatka eri-trocita izraženi su simptomi i znakovi anemijskog sindroma.

U krvnoj slici se nalazi normocitna, normokromna anemija ili makrocitoza uz manjak ili nedostatak re-tikulocita. Granulociti su sniženi uz urednu morfo-logiju i povišenu leukocitnu alkalnu fosfatazu (APL) dok je broj limfocita najčešće uredan.

Histološki nalaz koštane srži pokazuje izrazitu hipo-plaziju sa zamjenom hematopoetskog tkiva masnim tkivom. Glavne su stanice limfociti i plazma stanice, a megakariociti su izrazito smanjeni ili ih se ne nala-zi. Dijagnostičke kriteriji teške i izrazito teške apla-stične anemije prikazuje tablica 48.8.

LiječenjeCilj liječenja je restitucija funkcije koštane srži imuno-supresivnom terapijom ili alogenom transplantacijom koštane srži. Ako je uzrok anemije poznat treba ga ukloniti i provoditi potporno liječenje transfuzijama eritrocita i trombocita uz liječenje infekcija. Strategija liječenja idiopatske AA ovisi o dobi i stupnju anemi-je. U osoba mlađih od 30 godina s TAA prva linija terapije je transplantacija alogene koštane srži ko-jom se postiže izlječenje u više od 60 % bolesnika. U ostalih liječenje se provodi kombinacijom kortikoste-roida i ciklosporina, a u slučaju neadekvatnog odgo-vora primjenjuje se antitimocitni globulin. Povoljan terapijski učinak se očekuje kod 50-70 % bolesnika, uz rizik od relapsa bolesti 30-40 % unutar 5 godina. Komplikacije liječenja su razvoj drugih klonalnih po-remećaja poput mijelodisplazije, AML ili PNH.

PAROKSIZMALNA NOĆNA HEMOGLOBINURIJA (PNH)PNH je klonalna bolest matičnih hematopoetskih sta-nica zbog stečenog poremećaja membrane i poveća-ne osjetljivosti eritrocita na hemolizu posredovanu komplementom.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaPoremećaj se očituje na svim krvnim stanicama i može se očitovati hemolizom, sklonošću tromboza-ma i aplastičnom anemijom.

Tablica 48.8. Kriteriji za dijagnozu teške i izrazito teške aplastične anemije

Teška aplastična anemija• <25 % stanica krvotvornog sustava u biopsiji koštane srži• <50 % stanica krvotvornog tkiva u koštanoj srži • s <30 % hematopoetskih stanica) te prisutnost najmanje

od navedenih kriterija:• apsolutni broj retikulocita <40 x 109/L• apsolutni broj granulocita <0,5 x 109/L• apsolutni broj tromboita <20 x 109/L

Izrazito teška aplastična anemija• kriteriji za tešku aplastičnu anemiju• apsolutni broj granulocita < 0,2 x 109/L


Poremećaj nastaje zbog somatske mutacije gena pig-A važnog za sintezu GPI koji je smješten na X kromo-somu. Zbog nedostatka GPI na PNH stanicama nasta-je manjak enzima acetilkolinesteraze, 5-nukleotidaze, alkalne fosfataze i adhezijskih molekula CD48 i LFA 3 ili CD58, CD66 i CD67. Nedostaju regulatori kom-plementa CD 55 ili DAF, CD59 ili MIRL. Nedostatak CD 55 dovodi do nakupljanja i odlaganja aktiviranog komplementa (C3b) i hemolize. Nedostatak CD59 molekule prati sklonost izrazitoj hemolizi zbog nedo-statka inhibitora stvaranja C9 (kompleks komplemen-ta). Manje vrijedan PNH klon ima prednost u rastu u usporedbi s normalnim hematopoetskim klonom. Temeljna značajka klasične PNH jest kronična intra-vaskularna hemoliza s epizodama akutnih egzacerba-cija i hemoglobinurijom kojoj prethodi napadaj boli u trbuhu (privremene okluzije vena probavnog trakta).

U postavljanju dijagnoze važno je osim rutinske krv-ne slike učiniti testove intravaskularne hemolize: broj retikulocita, LDH, haptoglobin, hemoglobin i hemosiderin u mokraći, methemalbumin u serumu. Obično se nađe pancitopenija uz aplaziju koštane srži, manjak željeza, folne kiseline te snižena kon-centracija APL. Današnja dijagnostika temelji se na određivanju stanica s manjkom GPI protočnom cito-metrijom pomoću anti-DAF protutijela (CD55), anti-MIRL protutijela (CD59).

LiječenjeOsim potpornog liječenja transfuzijama eritrocita i trombocita daju se glukokortikoidi koji pokazuju povoljan učinak na hemolitičku anemiju, a mogu se primjeniti i androgeni. Najnovije u liječenju jest primjena monoklonskog protutijela ekulizumab (So-liris) koji je usmjeren na CD5 komponentu komple-menta i tako inhibira završnu aktivaciju komplemen-ta. Jedini način izlječenja je transplantacija alogenih krvotvornih matičnih stanica. Također se primjenjuje imunosupresivna terapija (ciklospirin i antitimocitni globulin).

Izolirana aplazija crvene lozeRijetki poremećaj s izrazitom anemijom bez prekur-sora crvene krvne loze i retikulocita, dok su ostale

loze uredne. U citološkom nalazu koštane srži ne nalaze se proeritroblasti, prve nezrele morfološki prepoznatljive stanice.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaUzroci su najčešće infekcije (parvovirus B19, HIV, vi-rusni hepatitis), imunološki poremećaji (autoimuna hemolitička anemija, SLE, RA, alogena transplantaci-ja AB0 nepodudarnog darivatelja), mijeloidni tumori (KML, mijelofibroza, mijelodisplazija), limfoidni tu-mori (KLL, LGL leukemija, Hodgkinov limfomNHL, multipli mijelom), lijekovi (sulfametoksazol/trime-toprim, zidovudin, fenitoin, rekombinantni humani eritropoetin, mikofenolat mofetil).

Dijagnoza se postavlja na temelju nalaza anemije, smanjenog broja retikulocita uz urednu mijelopoezu i limfocitopoezu. U aplaziji crvene loze uzrokovane parvo B19 virusom prisutni su divovski proeritroblasti.

LiječenjeTerapijski pristup se temelji na prekidu primjene lije-ka koji je doveo do aplazije i liječenju transfuzijama eritrocita. Infuzije imunoglobulina daju se bolesni-cima kod sumnje na aplaziju uzrokovanu virusom parvo B19 i najčešće je dostatna jedna infuzija 0,4 g/kg tjelesne mase. Ako je u podlozi mogući imunološ-ki uzrok primjenjuju se kortikosteroidi, ciklosporin i ciklofosfamid. U zadnje vrijeme sve je više radova koji daju pozitivne rezultate na primjenu anti-CD20 monoklonskim protutijelom (rituksimab).

Anemija zbog infiltracije koštane srži stranim tkivomAnemija zbog infiltracije koštane srži stranim tkivom ili mijeloftizična anemija nastaje zbog infiltracije ko-štane srži malignim stanicama, rjeđe granulomato-znim tkivom, fibrozom ili produktima metaboličkih poremećaja koji se odlažu u koštanoj srži.

Metastatski karcinomi su najčešći uzrok infiltracije i oštećenja mikrookoliša koštane srži jer je koštana srž nakon pluća i jetre najčešće sijelo metastaza. Zloćud-ne hematopoetske bolesti rijetko izazivaju mijeloftizič-nu anemiju. Sekundarna mijelofibroza može se vidjeti kod kroničnih infekcija i otrovanja. Granulomatozne

Anemije | 465

upale, neke gljivične i bakterijske infekcije te naku-pljanje metabolita u Gaucherovoj bolesti, Nieman-Pic-kovoj bolesti i drugim tezaurizmozama uzrokuju sliku mijeloftizične anemije. Dolazi do mehaničkog poti-skivanja zdravog hematopoetskog tkiva uz inhibiciju rasta normalnih stanica humoralnim mehanizmima te mlađi oblici krvnih stanica ulaze u krvotok.

Klinička slika i laboratorijska dijagnostikaAnemija je normocitna, normokromna uz morfološke promjene eritrocita (poikilocitoza, anizocitoza, prisut-nost dakriocita, fragmentocita, leukoeritroblastoza) i prisutnost eritroblasta i nezrelih granulocita. Katkad se nalazi pancitopenija, smanjen broj trombocita, ili čak povećan broj neutrofila. Klinička slika ovisi o težini anemije te uzroku koji dovodi do ovog tipa anemije.

Infiltracija koštane srži stranim tkivom dokazujemo biopsijom koštane srži jer je citološki nalaz nedosta-tan. Scintigrafija i radiološke metode otkrivaju mjesta patološke pregradnje kostiju. Biopsijom je nužno ra-zlikovati idiopatsku mijelofibrozu od ovog entiteta. Leukoeritroblastoza se viđa i kod težih infekcija te u hemolitičkim krizama. Za razliku od KML-e APL je povišena i nema Ph kromosoma.

LiječenjePotrebno je liječiti osnovnu bolest, npr tuberkuloza tuberkulostaticima, Gaucherovu ili Fabryjevu bolest enzimskom terapijom. Transfuzija se daje kod teške anemije sa znakovima hipoksije. Terapija eritropoe-tinom može biti korisna, dok se splenektomija radi kod bolesnika sa hipersplenizmom.

LITERATURAAgarwal AM, Prchal JT. Anemia associated with marrow infil-tration. Williams Hematology pp 613-616, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Baker KR, Moake J. Hemolytic anemia resulting from physi-cal injury to red cells. Williams Hematology pp 755-760, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Banka S. et al. Identification and Characterisation of an Inborn Error of metabolism caused by Dihidrofolate Reductase Defi-ciecy. Am J Hum Genet. 2011;88:216-225.

Beutler E. Disorders of Iron metabolism. Williams Hemato-logy pp 565-606, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Brodsky RA. How I treat paroxysmal nocturnal hemoglobinu-ria. Blood 2009;113:6522-6527.

Carmel R. How I treat cobalamin (vitamin B12) defiiency. Blo-od 2008;112(6):2214-2221.

Cattan D. Pernicious anemia: What are the actual diagnostic criteria? World J Gastroenterol 2011;17(4)543-544.

Clarke V, Weston-Smith S. Severe folate-deficiency pancyto-penia. BMJ Case Rep. 2010;doi:10.1136.

Coelho D et al. Gene Identification for the cblD Defect of Vi-tamin B12 Metabolism. N Engl J Med 2008;358(14):1454-1464.

Drüeke TB. Anemia Treament in Patients with Chronic Kid-ney Disease. N Engl J Med 2013;368:387-389.

Francetić I i sur. Farmakoterapijski priručnik. Medicinska na-klada, Zagreb, 6. Izdanje 2010.

Gallagher PG. The red blood cell membrane and its disorders: Hereditary spherocytosis, eliptocytosis and related diseases. Williams Hematology pp 617-646, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Green R. Folate, Cobalamin and megaloblastic anemias. Williams Hematology pp 533-563. McGraw-Hill, New York, 8th edition 2010.

Gregg XT, Prchal JT. Anemia of endocrine disorders. Williams Hematology pp 509-5013, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Gonzalez-Casas R, Jones EA, Moreno-Otero R. Spectrum of anemia associated with chronic liver disease. World J Gastro-enterol. 2009;15(37):4653-4658.

Inrig JK, Barnhart HX, Reddan D, et al. Effect of hemoglobin target on progression of kidney disease: a secondary analysis of the CHOIR (Correction of Hemoglobin and Outcomes in Renal Insufficiency) trial. Am J Kidney Dis 2012;60:390.

KDIGO clinical practice guidelines for anemia in chronic kid-ney disease. Kidney Int Suppl 2012;2:288.

Labar B, Hauptman E. i sur. Anemije. Hematologija, 11: 102-157 Školska knjiga Zagreb, 4. izdanje 2007.

Lechner K, Jäger U. How I treat autoimmune hemolytic ane-mias in adults. Blood 2010;116:1831-1838.

Lim CH et al. Anaemia after gastrectomy for early gastric can-cer: Long-term follow-up observational study. World J Gastro-enterol 2012;18(42):6114-6119.


Pitanja i odgovori

1. Koji je najbolji test za procjenu rezervi željeza u organizmu?

Koncentracija feritina u serumu.

2. Što je glavni regulator metabolizma željeza u organizmu?

Hepcidin.

3. Na kojem je kromosomu smještena mutacija gena odgovorna za nastanak PNH?

Na X kromosomu.

4. Koja je najčešća nasljedna hemolitička anemija?

Hereditarna sferocitoza.

5. Koliki je udio HbA2 u heterozigotnoj talasemiji?

Veći od 3,5 %.

Macdougall IC et al. Peginesatide for Anemia in Patients with Chronic Kidney Disease not receiving Dialysis. N Engl J Med 2013;368(4):320-332.

Namour F et al. Luminal expression of cubilin is impaired in Imerslund-Gräsbeck syndrome with compound AMN mutati-ons in intron 3 and exon 7. Haematologica 2011;96(11):1715-1719.

Packman CH. Hemolytic anemia resulting from immune injury. Williams Hematology pp777-793, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Palmer SC, Navaneethan SD, Craig JC, et al. Meta-analysis: erythropoiesis-stimulating agents in patients with chronic kid-ney disease. Ann Intern Med 2010;153:23.

Pfeffer MA, Burdmann EA, Chen CY, et al. A trial of darbe-poetin alfa in type 2 diabetes and chronic kidney disease. N Engl J Med 2009;361:2019.

Prchal JT. The Erythrocyte. Williams Hematology pp 409-455, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Scheinberg P, Young NS. How I treat acquired aplastic ane-mia. Blood 2012;120:1185-1196.

Segel GN, Lichtman MA. Aplastic anemia: Aquired and inhe-rited. Williams Hematology pp 463-480, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

Sertić J i sur. Katalog dijagnostičkih laboratorijskih pretraga s primjerima iz kliničke prakse, Medicinska naklada, Zagreb 2011

Stabler SP. Vitamin B12 Deficiency. N Engl J Med 2013;368(2):149-159.

Weatherall DJ. The Thalassemias: Disorders of globin synthe-sis. Williams Hematology pp 675-703, McGraw-Hill, New York, 8 Edition 2010.

467

Tumori krvnog i limfnog tkiva čine veliku skupinu zloćudnih bolesti porijeklom iz krvotvorne matične stanice i njenih potomaka. Potpuna klasifikacija je složena (tablica 49.1.) i podložna čestim promjenama. Trenutno se koristi klasifikacija Svjetske zdravstvene organizacije iz 2008. godine. Ovako velik broj različitih vrsta raka je vjerojatno posljedica činjenice da normalne hematopoetske i limfne stanice imaju neke od značajki zloćudnih pa maligna transformacija može nastati u stanicama različitog stupnja sazrijevanja, a ne samo u matičnim stanicama kao u većini ostalih tkiva. Tako skoro sve krvne stanice imaju sposobnosti širenja po organizmu (tj. metastaziranja), dok velik broj zrelih limfocita živi dugo i može se, uz odgovarajući podražaj, početi dijeliti i stvoriti klon potomaka.

U ovom poglavlju ćemo se osvrnuti na najčešće mijeloproliferativne bolesti (MPB, akutne mijeloične i lim-foblastične leukemije (AML i ALL), tumore zrelih B odnosno T i NK stanica, koji se zajedno ubrajaju u non-Hodgkin limfome (NHL), Hodgkinov limfom (HL) i multipli mijelom (MM).

MIJELOPROLIFERATIVNE BOLESTIMijeloproliferacije su tumori koji nastaju iz matične krvotvorne stanice, a karakterizirani su prekomjernim stva-ranjem zrelih granulocita, eritrocita, trombocita ili srodnih mijeloičnih stanica. To su bolesti starije životne dobi. Klinička slika je obično blaga, bolesti se nerijetko nađu slučajno ili se bolesnik javlja liječniku zbog smetnji uzro-kovanih povećanom slezenom (bolovi i nelagoda pod lijevim rebrenim lukom), začepljenja krvnih žila (venska tromboza, moždani ili srčani udar) ili znakova hipermetabolizma (subfebrilitet, noćno znojenje, svrbež kože).

Najčešća MPB je policitemija rubra vera (PRV), bolest kod koje dominira prekomjerno stvaranje eritrocita. Učestalost bolesti je oko 2 na 100000 stanovnika. Zbog povećane mase eritrocita u krvi, krv je gušća pa

P o g l a v l j e 49.Tumori krvotvornog i limfnog tkiva

Igor Aurer

dell

Sticky Note

(MPB)


je povećana sklonost venskim trombozama i mož-danom udaru, a bolesnici nerijetko imaju i povišen krvni tlak. Sumnja na dijagnozu se postavlja na teme-lju povećane koncentracije hemoglobina ili hemato-krita. Broj eritrocita nije toliko značajan jer njihova veličina može jako varirati pa bolesnik s povećanim brojem malih eritrocita (mikrocitoza) može biti ane-mičan, a onaj sa smanjenim brojem velikih (makroci-toza) policitemičan. Dijagnostička obrada bolesnika sa sumnjom na PRV je danas znatno jednostavnija nego ranije. Za postavljanje dijagnoze je nekada bilo nužno dokazati da je povećanje koncentracije hemoglobina uistinu posljedica povećanja ukupnog volumena mase eritrocita, a ne smanjene količine plazme u tijelu. To se može učiniti scintigrafskom pretragom: volumen mase eritrocita i plazme. Nakon toga je bilo potrebno isključiti bolesti koje dovode do prekomjernog lučenja eritropoetina, najčešće su to bolesti pluća. Prije desetak godina je otkriveno da preko 90 % bolesnika s PRV ima mutiran i stoga traj-no aktivan JAK2 gen čiji se protein fiziološki aktivira nakon vezivanje eritropoetina na receptor i stimuli-ra stvaranje eritrocita. Mutacije ovog gena mogu se dokazati u kliničkim molekulskim laboratorijima, a

određivanje koncentracije eritropoetina je postala ru-tinska laboratorijska pretraga tako da se danas s ove dvije pretrage može dijagnosticirati ili isključiti PRV u velike većine bolesnika s eritrocitozom. Cilj liječenja je smanjiti rizik od tromboembolizama. To se može postići smanjenjem mase eritrocita u cirkulaciji i da-vanjem lijekova koji ometaju agregaciju trombocita. Citoredukcija se najčešće provodi venepunkcijama (puštanjem krvi) ili citostatikom hidroksiureom, a od antiagregacijskih lijekova se obično koristi acetilsali-cilna kiselina. Prognoza bolesti je razmjerno dobra, očekivano preživljavanje je preko 10 godina, smrt-nost je oko 30 % veća nego u općoj populaciji.

Druga češća MPB je esencijalna trombocitemija (ET). Učestalost joj je slična ili nešto manja nego PRV. Iako se i u 50 % ovih bolesnika nađe mutirani JAK2 gen, u druge polovice je potrebno isključiti sekundarne uzroke trombocitoze. To su između ostaloga kro-nična upala (npr. autoimune bolesti), rak i manjak željeza. Bolesnici s ET imaju blago povećan rizik pre-težno arterijskih tromboembolizama, prvenstveno infarkta miokarda i mozga. Bolesnici s vrlo visokim brojem trombocita (preko 100-150 x 109/L) mogu imati paradoksalnu sklonost krvarenju. Cilj liječena je spriječiti tromboembolije (što se postiže acetilsa-licilnom kiselinom i eventualno smanjenjem broja trombocita) i krvarenje (za što je nužno smanjiti broj trombocita). Od citoreduktivnih lijekova najčešće se koriste hidroksiurea i interferon alfa. Prognoza bo-lesti je dobra, očekivani životni vijek je sličan općoj populaciji.

Kronična mijeloična leukemija (KML) je prva bolest kod koje je dokazano da rak nastaje zbog pojave određene genetske promjene u osjetljivim stanicama, u ovom slučaju BCR-ABL gena, posljedice translo-kacije t(9;22) u matičnoj krvotvornoj stanici. Godiš-nje se dijagnosticira oko 1 novi bolesnik na 100000 stanovnika. Bolest se obično prezentira povećanim brojem leukocita na račun zrelih i nezrelih oblika granulocitne loze bez prekida u sazrijevanju (tj. bez hiatus leukemicusa). Tako se u krvi nalaze segmen-tirani i nesegmentirani neutrofilni granulociti, eozi-nofili i bazofili, metamijelociti, mijelociti, promijelo-citi i blasti. Bolesnici nerijetko imaju trombocitozu.

Tablica 49.1. Osnovna podjela tumora krvotvornog i limfnog sustava

Mijeloproliferativne neoplazme

Mijeloične i limfoidne neoplazme s eozinofilijom i pore-mećajima PDGFRA, PDGFRB ili FGFR1

Mijelodisplastično-mijeloproliferativne neoplazme

Mijelodisplastični sindromi

Akutne mijeloične leukemije i srodne prekursorske neo-plazme

Akutne leukemije dvojbenog porijekla

Prekursorske limfoidne neoplazme

Neoplazme zrelih B limfocita

Neoplazme zrelih T i NK stanica

Hodgkinov limfom

Limfoproliferativni poremećaji povezani s imunodefici-jencijom

Neoplazme histiocita i dendritičkih stanica

dell

Highlight

1000-1500

Tumori krvotvornog i limfnog tkiva | 469

Dijagnoza se postavlja tako da se dokaže postajanje t(9;22) ondosno hibridnog BCR-ABL gena, citogenet-skim ili molekulskim metodama. Obzirom da KML nekada može imitirati ET pa čak i PRV, potrebno je kod svih MPB isključiti postojanje BCR-ABL gena. S druge strane, svaka MPB u kojoj postoji BCR-ABL je po današnjoj definiciji KML i treba je liječiti na taj način. Razlog za to leži u izrazito visokoj sklonosti transformaciji KML u akutnu leukemiju. I u PRV, a u manjoj mjeri u ET se u manjeg broja bolesnika nakon dosta godina može javiti akutna leukemija, no u ne-odgovarajuće liječenoj KML se to događa u praktički svih. Cilj liječenja KML je supresija malignog klona što se danas postiže lijekovima koji inhibiraju ABL ki-nazu: imatinibom, nilotinibom i dasatinibom. Uspjeh liječenja se prati molekulski, kvantitativnim PCR-om na BCR-ABL. U većine bolesnika se ovakvom tera-pijom uspijeva postići trajno ili dugogodišnje povla-čenje bolesti. U većine se, nakon prekida terapija, bolest vraća. U slučaju neuspjeha inhibitora tirozin kinaza, može se KML pokušati izliječiti transplantaci-jom alogeničnih matičnih krvotvornih stanica (što je malo složeniji i točniji naziv od transplantacije aloge-nične koštane srži), no uz rizik smrti od komplikacija liječenja od 20 do 30 %.

AKUTNE LEUKEMIJE (AL)Akutne leukemije su vrlo zloćudni tumori krvotvor-nog sustava karakterizirani zastojem sazrijevanja krvnih stanica na razini nezrelih stanica: blasta i po-sljedičnim izostankom stvaranja zrelih krvnih stanica. Bolesti se javljaju u svim dobnim skupinama, a uče-stalost im raste s dobi. ALL su najčešće zloćudne bo-lesti djece. Čimbenici rizika za nastanak AL su izlaga-nje genotoksinima, npr. citostaticima, ionizirajućem zračenju, organskim otapalima itd. Visoka je učesta-lost AL u bolesnika s prirođenim poremećajima po-pravka DNA (teleangiektatična ataksija, Fanconijeva anemija itd) i u osoba s Downovim sindromom.

Većina bolesnika se javlja liječniku zbog komplika-cija supresije normalne hematopoeze, tj. infekcije uslijed manjka granulocita, krvarenja uslijed manjka

trombocita ili slabosti uslijed anemije. Prvi korak u dijagnostici je krvna slika. Redovito se nalaze anemi-ja i trombocitopenija, broj leukocita može biti visok, normalan ili čak snižen. Ako je normalan ili visok, obično se u diferencijalnoj krvnoj slici nalaze samo zreli oblici granulocitne loze i blasti, dok se prijelazni oblici ne nalaze. To se zove hiatus leukaemicus. Za dijagnozu AL je nužna punkcija i citološka analiza koštane srži kojom se nađe povećan udio blasta (>20 % stanica s jezgrom). Iako se suvremena klasifikacija AL temelji na citogenetskim i molekulskim značajka-ma zloćudnih stanica (za sada je poznato preko 20 različitih vrsta), u kliničkoj dijagnostičkoj obradi su od velike važnosti i citokemija i imunotipizacija le-ukemija na protočnom citometru, metode kojima se brzo može odrediti radi li se o AML, B-ALL ili T-ALL što je važno za izbor terapije. Liječenje se provodi kombinacijom citostatika, u AML najčešće citarabi-nom i nekim od antraciklina (daunorubicin, idaru-bicin) ili mitoksantronom, a u ALL vinkristinom i glukokortikoidima uz dodatak antraciklina, ciklofos-famida, metotreksata, merkaptopurina, asparaginaze itd. AL s RARα-PML i BCR-ABL se liječi kombinaci-jom citostatika i lijekova koji inhibiraju odgovarajuće proteine: transretinoičnom kiselinom i inhibitorima ABL kinaze, istim koji se koriste za KML. Terapija AL je dugotrajna i naporna, bolesnici prolaze kroz duga razdoblja pancitopenije s teškim infektivnim kompli-kacijama. Većini odraslih treba i alotransplantacija. Naposljetku se izliječi oko 1/3 bolesnika, dok 2/3 umru od svoje bolesti ili komplikacija liječenja. Pro-gnostički faktori su genetske promjene, dob (mlađi imaju bolju prognozu) i broj leukocita (oni s vrlo ve-likim brojem leukocita imaju lošiju prognozu).

LIMFOMINajjednostavnija definicija limfoma u skladu s klasifi-kacijom SZO bila bi da su to tumori koji nastaju iz tzv. zrelih limfatičkih stanica. Pri tom je nebitno prezenti-raju li se oni kao solidne nakupine tumorskog tkiva (što je klasična definicija limfoma) ili su tumorske stanice smještene u koštanoj srži i cirkuliraju krvlju (što je klasična definicija leukemije). Tumori nezre-

dell

Highlight

BCR-ABL

dell

Highlight

BCR-ABL prijepis


lih limfatičkih stanica su ALL, odnosno limfoblastični limfomi za koje danas smatramo da su samo druga manifestacija ALL i liječimo ih na isti način kao i nji-hove leukemijske inačice. Podjela limfoma je vjero-jatno najkompliciraniji dio hematopatologije. Temelji se na morfologiji (mikroskopskom izgledu tumora), imunološkim i genetskim značajkama tumorskih sta-nica te kliničkoj slici. Za pravilnu dijagnozu je ve-ćinom nužna biopsija zahvaćenog čvora ili organa

osim u nekih leukemijskih oblika bolesti za koje je dovoljna citologija, imunofenotipizacija i citogene-tika. Danas postoji preko 50 općepriznatih tipova limfoma i još dvadesetak podtipova, u budućnosti ih možemo očekivati i više (tablica 49.2.). Limfomi većinom nastaju uslijed genetskih grešaka koje se događaju tijekom prestrojavanja imunoglobulinskih, odnosno gena za T stanični receptor, procesa pro-mjene građe DNA svojstvene isključivo limfocitima

Tablica 49.2. Osnovna podjela limfoma

Tumori zrelih B stanica• Kronična limfocitna leukemija / limfom malih limfocita• B prolimfocitna leukemija• Splenički limfom marginalne zone• Leukemija vlasastih stanica• Neklasificirani splenički B stanični limfom/leukemija• Limfoplazmocitoidni limfom• Ekstranodalni limfom marginalne zone limfnog tkiva vezanog uz sluznice (MALTom)

Nodalni limfom marginalne zone• Folikularni limfom (1.-3. stupnja)• Primarni kožni limfom centra folikla• Limfom plaštenih stanica• Difuzni B velikostanični limfom (DLBCL)• Burkittov limfom

B stanični limfom, neklasificiran, sa značajkama između DLBCL i Burkittovog limfoma

B stanični limfom, neklasificiran, sa značajkama između DLBCL i klasičnog Hodgkinovog limfoma

Tumori zrelih T/NK stanica• T prolimfocitna leukemija• T stanična leukemija velikih granuliranih limfocita• Kronična NK stanična limfoproliferativna bolest• Agresivna NK stanična leukemija• Sustavna EBV pozitivna dječja T stanična limfoproliferativna bolest• T stanična leukemija/limfom odraslih

Limfom sličan Hydroi vacciniforme• Mycosis fungoides• Sezaryjev sindrom• Primarna kožna CD30 pozitivna T stanična limfoproliferativna bolest• Primarni kožni gama-delta T stanični limfom

Ekstranodalni NK/T stanični limfom nosnog tipa• Enteropatski T stanični limfom• Hepatosplenički T stanični limfom• T stanični limfom sličan subkutanom panikulitisu• Nespecificirani periferni T stanični limfom• Angioimunoblastični T stanični limfom• Anaplastični velikostanični limfom

Hodgkinov limfom• Nodularna limfocitna predominacija• Klasični Hodgkinov limfom

dell

Highlight

sve ovo su tumori zrelih B stanica, ništa ne smije biti boldano!

dell

Highlight

Sve ovo su tumori zrelih T/NK stanica. Ništa ne smije biti boldano!


koji omogućuju stvaranje velikog broja različitih mo-lekula potrebnih za uspješnu borbu protiv velikog broja uzročnika infekcija. Zbog toga većina kromo-somskih translokacija koje se javljaju u B limfomima uključuju imunoglobulinske gene.

Godišnje se dijagnosticira oko 9 novih bolesnika s B limfomima, 1 s T limfomom (tj. 10 s NHL) i 2,5 s Hodgkinovim limfomom na 100000 stanovnika. Čimbenici rizika su slični kao za AL. Učestalost lim-foma je nešto veća u osoba višeg socijalnog statusa i jedinaca, dok je značajno veća u bolesnika inficira-nih HIVom i onih na dugotrajnoj imunosupresivnoj terapiji, npr. nakon transplantacije organa.

Klinički se NHL mogu podijeliti na indolentne i agre-sivne. Indolentni limfomi mogu rasti godinama ne stvarajući bolesniku smetnje. Iako dobro odgovara-ju na liječenje, redovito se ponovno vraćaju (ulaze u relaps). Liječenje se bez štete po bolesnika može odgoditi do pojave smetnji. Agresivne NHL treba dijagnostički obraditi i započeti s liječenjem u roku od nekoliko tjedana, dok kod Burkittovog limfoma, zbog vrlo kratkog vremena podvostručenja tumorske mase, to razdoblje valja što više skratiti.

Za uspješno liječenje je osim točne dijagnoze potreb-no odrediti proširenost bolesti, prognostičke značaj-ke te procijeniti podobnost bolesnika za eventualno agresivno liječenje. Proširenost bolesti procjenjuje se kliničkim pregledom, CT-om prsnog koša, trbuha i zdjelice te biopsijom koštane srži iz stražnje gornje ilijačne spine. Danas se CT često nadopunjuje i po-zitronskom emisijskom tomografijom, scintigrafskom metodom kojom se procjenjuje intenzitet metaboliz-ma u limfnim čvorovima i drugim organima. Poja-čano nakupljanje radionuklida fluorodeoksiglukoze može ukazivati na prisustvo limfomskih stanica. LDH je jedan od najvažnijih prognostičkih biljega u NHL, bolesnici s povišenom razinom ovog enzima imaju lošiju prognozu.

Najindolentniji limfomi su ekstranodalni limfomi marginalne zone (eMZL). To su tumori koji se javljaju u organima izloženim dugotrajnoj antigenoj stimula-ciji, obično u sklopu kronične infekcije. U nas su to najčešće želudac uslijed infekcije Helicobacter pylori i očna adneksa uslijed infekcije klamidijom. Većina

ovih limfoma regredira na odgovarajuću antibiotsku terapiju, rijetko koji bolesnik umre od svoj bolesti.

Folikularni limfom je najčešći indolentni nodal-ni limfom. Vrlo je rijedak u djece. Karakterizira ga translokacija t(14;18) kojom se inhibitor apoptoze bcl2 dovodi pod kontrolu promotora za teški lanac imunoglobulina. Kod nas na folikularni limfom ot-pada oko 20 % svih NHL, nešto je rjeđi nego u SAD i zapadnoj Europi, a češći nego u istočnoj Europi i Dalekom istoku. Bolest je u pravilu neizlječiva, ali in-dolentnog tijeka. Liječenje se provodi kombinacijom citostatika, glukokortikoida i monoklonskog protuti-jela rituksimaba koji se veže na CD20 antigen, prisu-tan na stanicama većine B limfoma. Mlađim bolesnici se u drugoj ili trećoj liniji mogu liječiti i transplan-tacijom vlastitih (autolognih) matičnih krvotvornih stanica. Prosječno preživljavanje je 11 godina, 15 % bolesnika nikada ne treba terapiju.

B-velikostanični limfom je najčešća vrsta limfoma di-ljem svijeta. Javlja se u svih dobnih skupina. Na njega otpada oko 1/3 svih NHL. Biološki i genetski je hete-rogen, nema tipičnih genetskih promjena, a obično se nalazi poremećen izražaj bcl2 ili bcl6 gena. Liječi se kombinacijom rituksimaba i citostatika, povreme-no i zračenjem. Najčešće se koristi CHOP kombina-cija (ciklofosfamid, doksorubicin, vinkristin, predni-zon). Izliječi se oko 60 % bolesnika. Mlađi bolesnici, koji ne odgovore na prvu liniju, se liječe intenzivnom kemoterapijom i autotransplantacijom.

T limfomi su većinom agresivni i imaju lošu progno-zu. Liječe se CHOPom ili još agresivnije, nerijetko i autotransplantacijom. Usprkos tome su rezultati loši, petogodišnje preživljavanje je oko 30 %. NK-stanični limfomi sadrže PGP, pumpu koja iz stanice izbacuje velik broj toksina, između ostalih i citostatike koje sadrži CHOP. Zbog toga je prognoza ovih bolesti do sada bilo loša. Zadnjih godina su se pojavili radovi, većinom iz istočne Azije gdje su ovi limfomi češći, koji ukazuju da su NK-stanični limfomi osjetljivi na asparaginazu, enzimski citostatik koji cijepa amino-kiselinu asparagin, a nije supstrat za PGP. Moguće je da će ovakvo liječenje poboljšati prognozu ovih bolesti.

dell

Highlight

Mlađi


Burkittov limfom je rijetka, ali vrlo agresivna vrsta limfoma koja se obično javlja u djece i mlađih odra-slih. Karakteriziran je translokacijom t(8;14) kojom se myc gen dovodi pod kontrolu promotora za teški lanac imunoglobulina. Uslijed toga su praktički sve stanice limfoma u staničnom ciklusu pa je vrijeme podvostručenja tumorske mase vrlo kratko. Ako se dijagnoza postavi na vrijeme, kombinacijom inten-zivne kemoterapije temeljene na visokim dozama metotreksata i rituksimabom može se izliječiti oko 80 % bolesnika. Na početku terapije se nerijetko javlja sindrom lize tumora. Ovaj poremećaj nastaje uslijed jako povećane razgradnje tumorskih stanica. U krvi raste koncentracija završnih produkata razgradnje DNA i intracelularnih iona: mokraćne kiseline, kalija i fosfora u krvi. Sindrom lize tumora može dovesti do akutnog zatajenja bubrega i drugih teških metabolič-kih komplikacija. Prevenira se davanjem alopurino-la, lijeka koji inhibira ksantin oksidazu, zadnji enzim u procesu sinteze mokraćne kiseline iz nukleinskih baza, stimuliranjem stvaranja mokraće lijekovima i obilnim infuzijama te davanjem natrijevog bikarbo-nata koji zalužuje urin što olakšavaju izlučivanje ka-lija i urata mokraćom.

Kronična limfocitna leukemija (KLL) je najčešća le-ukemija osoba bijele rase i najčešći uzrok kronične limfocitoze (broj limfocita > 5x109/L) u nas. Limfom-ski oblik bolesti se zove i limfom malih limfocita. Tumorske stanice izražavaju imunološke biljege B loze i CD5. Citogenetskim tehnikama se nalaze pro-mjene 11, 12. 13. ili 17. kromosoma s mutacijama ATM, Rb i p53 gena. Godišnje se dijagnosticiraju oko 4 nova bolesnika na 100000 stanovnika, uglavnom u starijim dobnim skupinama. Bolest je indolentnog tijeka, oko 1/3 bolesnika treba liječiti odmah pri po-stavljanju dijagnoze, 1/3 nakon nekog vremena, dok 1/3 bolesnika nikada ne zatreba liječenje leukemi-je. KLL može dovesti do povećanja limfnih čvorova i slezene, smanjenja broja granulocita, eritrocita ili trombocita, sklonosti infekcijama zbog hipogama-globulinemije i autoimunih poremećaja. Povećan broj limfocita je klinički beznačajan, limfociti ni kada ih ima vrlo mnogo ne ometaju normalan protok krvi kroz kapilare. KLL se liječi kombinacijom citostatika

i rituksimaba. U mlađih je najučinkovitija kombina-cija fludarabina i ciklofosfamida dok se stariji liječe klorambucilom. Autoimuni poremećaji se liječe glu-kokortikoidima, a česte infekcije u hipogamaglobu-linemičnih se mogu prevenirati infuzijama intraven-skih imunoglobulina. Od prognostičkog značenja su citogenetika, proširenost bolesti, supresija normalne hematopoeze, neke imunološke značajke i razina beta 2 mikroglobulina u krvi. Prosječno preživljava-nje je 7-9 godina.

Hodgkinov limfom je agresivni limfom koji nastaje iz B-limfocita. Javlja se u svim dobnim skupinama, a najveća mu je učestalost u mlađih odraslih. Postoji nekoliko histoloških podtipova od kojih je nodular-na limfocitna predominacija, zbog razlika u biologiji i odgovoru na liječenje, izdvojena, dok su ostale vr-ste grupirane u tzv. klasični Hodgkinov limfom. Bo-lest je ime dobila po engleskom liječniku Thomasu Hodgkinu koji je u prvoj polovici 19. stoljeća opisao veći broj bolesnika s, kako se smatralo, ovom bo-lešću. Nedavno se, pažljivim pretraživanjem arhive patologije bolnice u kojoj je radio, ustanovilo da je samo nekoliko zaista imalo HL, dok su ostali imali NHL ili tuberkulozni limfadenitis. Bolest je karakte-rizirana tumorskim stanicama tipičnog izgleda, tzv. Reed-Sternbergovim stanicama s dvije velike jezgre i izraženim nukleolusom, tako da izgledaju kao so-vino oko. Slične mononuklearne stanice zovu se Hodgkinove stanice. Tumorske stanice izražavaju CD30, dok su biljezi B loze uglavnom negativni. Zato je porijeklo tumorskih stanica dokazano mo-lekulskim metodama tek nakon desetljeća istraživa-nja. Liječenje se provodi kombinacijom citostatika i zračenjem. Najčešće se koriste ABVD (doksorubi-cin, vinblastin, bleomicin, dakarbazin) ili BEACOPP (bleomicin, etopozid, doksorubicin, ciklofosfamid, vinkristin, prokarbazin, prednizon). Bolesnici koji ne odgovore na prvu liniju se liječe intenzivnom ke-moterapijom i autotransplantacijom. Dob, spol (biti muškarac je nepovoljno) i proširenost bolesti utječu na prognozu. Od laboratorijskih nalaza mogu biti važni brzina sedimentacije eritrocita (SE), krvna slika (leukocitoza, limfopenija i anemija su nepovoljni) i razina albumina u krvi. SE, razina bakra i haptoglo-

dell

Highlight

fosfora. Izbrisati "u krvi"


bina u krvi se mogu koristiti kao tumorski biljezi jer im razina u krvi prati aktivnost bolesti. Izlječenje se postiže u oko 80 % bolesnika.

MULTIPLI MIJELOMMultipli mijelom (MM) je najčešći zloćudni tumor plazma stanica. Bolest je češća u muškaraca, crnaca i starijih, ne javlja se u djece. Tumor je građen od atipičnih plazma stanica koje najčešće luče komple-tan imunoglobulin (paraprotein), rjeđe samo lake lance, dok su nesekretorni mijelomi rijetki. Tumor-ske stanice se obično nalaze difuzno u koštanoj srži, rjeđe u fokalnim nakupinama. Naziv plazmocitom se u anglosaksonskoj literaturi koristi isključivo za tumorski oblik bolesti, dok se u srednjeeuropskoj upotrebljava kao sinonim za MM. Zbog velike količi-ne tzv. paraproteina smanjena je sinteza ostalih imu-noglobulina. Laki lanci prolaze kroz glomerularni fil-tar u primarni urin, odakle ih reapsorbiraju bubrežni tubuli. Kada im koncentracija dovoljno naraste, talo-že se u tubulima i dovode do bubrežnog zatajenja. Plazma stanice luče i različite faktore od kojih neki aktiviraju osteoklaste, a drugi suprimiraju stvaranje eritrocita. Zato je multipli mijelom karakteriziran po-javom monoklonskog imunoglobulina ili slobodnih lakih lanaca u serumu ili urinu, osteolizama i poslje-dičnim frakturama patološki promijenjenih kostiju, povećanom sklonošću infekcijama, anemijom kro-nične upalne bolesti i bubrežnim zatajenjem. Za po-stavljanje dijagnozu je potrebno dokazati postojanje dva od tri uvjeta:

1. tumor građen od plazma stanica ili infiltracija srži plazma stanicama

2. M komponenta: monoklonski imunoglobulin ili povećana koncentracija slobodnog lakog lanca u krvi ili urinu

3. osteolize.

Bolest kod koje postoji M komponenta, ali ne i ostali faktori zove se monoklonska gamapatija. Otprilike 5 % bolesnika s monoklonskom gamapatijom godišnje razvije MM.

Monoklonski imunoglobulin se dokazuje imunofik-sacijom. Prema vrsti imunoglobulina koji luče, dijele se MM na κ ili λ te IgG, IgA ili lakih lanaca. IgD i IgE su rijetki. Ova podjela nije od kliničkog značenja. M komponenta se u IgG MM obično nalazi u frakciji gama globulina, a kod IgA u frakciji beta globulina. Laki lanci se ne vide u elektoforezi serumskih pro-teina, zbog smanjene sinteze normalnih Ig nalazi se hipogamaglobulinemija. Slobodni laki lanci se mogu kvantificirati u serumu ili 24 h urinu ili se njihovo postojanje može dokazati u slučajnom uzorku urina. Potonja pretraga je nekada bila poznata kao određi-vanje Bence-Jones proteina.

MM se liječi ako postoji oštećenje ciljnih organa: ko-stiju (osteolize ili hiperkalcemija), bubrega ili nor-malne hematopoeze (najčešće anemija). U terapiji se koriste deksametazon i drugi glukokortikoidi, ci-tostatici melfalan, ciklofosfamid, vinkristin i doksoru-bicin, inhibitor proteasoma (stanične strukture koja izlučuje razgrađene proteine iz stanice) bortezomib te imunomodulatori talidomid i lenalidomid. Mlađe bolesnike je nakon postizanja remisije korisno au-totransplantirati. Bolesnicima se, osim ovih lijekova koji djeluju protutumorski, daju i lijekovi koji inhibi-raju funkciju osteoklasta i tako sprečavaju razgradnju kosti, tzv. bifosfonati. Najčešće se koriste pamidro-nat, zoledronat i ibandronat.

Bolest je praktički neizlječiva, karakterizirana re-misijama i relapsima. Najvažniji prognostički faktor je razina beta 2 mikroglobulina u krvi. Bolesnici s vrlo visokom koncentracijom imaju lošu prognozu. Osim toga na prognozu utječu koncentracija albumi-na, citogenetske i molekulske promjene. Prosječno preživljavanje transplantiranih bolesnika je oko 8, a netransplantiranih oko 6 godina.


LITERATURAAurer I, Gašparov S, Kralik M, Balenović A, Huić D, Šantek F, Duletić-Načinović A, Pejša V, Ostojić-Kolonić S, Grah JJ. Dijagnostika i liječenje limfoma – drugi hrvatski konsenzus. Liječ Vjesn 135:63-76, 2013.

Hoffbrand AV, Moss PAH, Pettit JE, ur. Essential haematology, 5. izd. Wiley-Blackwell, Malden, 2008.

Labar B, Hauptmann E, ur. Hematologija, Školska knjiga, Za-greb 2007.

Swedlow SH, Campo E, Harris NL, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H, Thiele J, Vardiman JW, ur. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, Lyon 2008.

Tefferi A, Rajkumar SV, Kantarjian HM, Adjei AA, ur. Neopla-stic hematology and medical oncology. Mayo Foundation for Medical Education and Research, Rochester, 2008.

Vrhovac B, Jakšić B, Reiner Ž, Vucelić B, ur. Interna medicina, Naklada Ljevak, Zagreb, 2008.

Pitanja i odgovori

1. Porast kojih parametara crvene krvne je tipičan za policitemiju rubru veru?

Koncentracije hemoglobina i hematokrita.

2. Što je to hiatus leukemicus i za koju skupinu bolesti je karakterističan?

Nalaz diferencijalne krvne slike u kojoj se nalaze blasti i zreli granulociti bez prijelaznih oblika. Karakterističan je za akutne leukemije.

3. Koji biokemijski parametar je jedan od najvažnijih prognostičkih faktora u NHL-u?

LDH.

4. Koncentracija kojih tvari raste u krvi u sindromu lize tumora?

Urata (ili mokraćne kiseline), kalija i fosfora.

5. Kada se u bolesnika s multiplim mijelomom neće naći monoklonski šiljak u elektroforezi serumskih proteina?

Ako mijelomske stanice luče samo lake lance ili se radi o nesekretornom mijelomu.

dell

Highlight

Swerdlow

475

Monoklonske gamapatije (MG) spadaju u veliku skupinu imunoproliferativnih bolesti koje karakterizira prisutnost monoklonskog proteina (M-proteina) u serumu i/ili urinu koje stvara klon B-stanica podvrgnut genetičkoj transformaciji. Takvo stanje može biti posljedica benigne ili maligne bolesti koja se onda manife-stira kliničkim simptomima od asimptomatskog neprogresivnog stadija do malignog agresivnog multiplog mijeloma ili limfoma. Najčešći M-protein (M-P) je IgG, rjeđe IgA i IgM, a vrlo rijetko IgD i IgE.

Benigna monoklonska gamapatija podrazumijeva koncentraciju M-proteina manju od 10 g/L, normalnu sintezu neuključenih imunoglobulina, negativan nalaz monoklonskih slobodnih lakih lanaca kapa (SLL κ) ili lambda (SLL λ) tipa u serumu i/ili urinu i odsutnost porasta koncentracije M-proteina nakon nekoliko na-rednih godina. Monoklonski sintetizirane SLL-e imunoglobulina prije 150 godina prvi puta je opisao doktor Bence Jones pa su po njemu i dobili eponim Bence Jonesovi proteini – BJP.

Malignu monoklonsku gamapatiju (multipli mijelom) prati koncentracija M-proteina veća od 10 g/L, odsut-nost sinteze ostalih neuključenih imunoglobulina, te pozitivan nalaz monoklonskih SLL κ ili λ tipa u serumu i/ili urinu kod 80-96 % bolesnika s multiplim mijelomom sa intaktnim M-Ig.

Najvažniji kriterij je svakako kliničko napredovanje bolesti i M-proteina, jer kod većine bolesnika s multiplim mijelomom postoji eksponencijalni porast koncentracije M-proteina u serumu. Stoga je od iznimne važnosti praćenje koncentracije M-proteina u serumu kao i redovito preispitivanje prisutnosti monoklonskih SLL κ ili λ tipa.

Poseban problem su monoklonski teški lanci gama, alfa i mi (bolest teških lanaca), koji se ne mogu uočiti elektroforezom proteina u serumu. Njihova imunološka identifikacija provodi se s pomoću posebne imuno-kemijske metode, imunoselekcije.

Treba uzeti u obzir i teškoće pri otkrivanju M-IgD i M-IgE koji se u serumu nalaze u vrlo malim koncentra-cijama. Osim toga M-IgD se razgrađuje in vivo i in vitro pa na elferogramu nalazimo samo difuznu vrpcu

P o g l a v l j e 50.Laboratorijska dijagnostika

monoklonskih gamapatijaDanica Matišić


proteina, dok M-IgM stvara komplekse ili polimere koji su netopljivi i ostaju na startu.

Dijagnoza monoklonskih gamapatija osniva se na nalazu klasičnog triasa:

• nalazu monoklonskog proteina u serumu i/ili urinu

• infiltraciji koštane srži plazma stanicama (>10 %) te

• nalazu osteolitičkih žarišta.

Laboratorijska dijagnostika MG obuhvaća nalaz M-proteina. Da bi klinička i laboratorijska evaluacija bolesnika s monoklonskim gamapatijama bila ujed-načena u svim centrima koji se bave tom dijagnosti-kom, Američko društvo patologa kao i Međunarodna radna grupa za multipli mijelom još su 2000. godine dali detaljne smjernice:

• dogovoren je termin monoklonskog proteina. Naime, u literaturi i svakodnevnoj upotrebi po-stoji mnogo termina koje treba izbaciti poput paraprotein, mijelom protein, monoklonska komponenta. Predložen je termin M-protein, jer takav termin ne implicira ništa što se odnosi na strukturu molekule a niti nameće postojanje po-sebnih patoloških simptoma kod bolesnika. M-pik koristimo kod denzitometrijskog očitavanja ili opisa elferograma

• zatim su dane upute koje bolesnike treba testirati

• određen je slijed testiranja te

• preporučene metode koje treba koristiti pri de-finiranju M-proteina.

Smjernice za kliničku i laboratorijsku evaluaciju bo-lesnika s monoklonskim gamapatijama mogu se sa-žeti u osam točaka:

1. Potrebno je učiniti elektroforezu proteina u se-rumu i/ili urinu za svakog bolesnika kod kojeg postoji sumnja na poremećaj plazma stanica.

2. Za definiranje abnormalnog razreda i tipa pro-teina indicirana je imunofiksacija (IF). Iako je nalaz elektroforeze negativan kod suspektnih bolesnika treba napraviti imunofiksaciju. Imu-

nofiksacija nije indicirana ako se ustvrdi poli-klonska hipergamaglobulinemija.

3. M-protein je potrebno pratiti denzitometrijski. Budući se radi o molekuli koja je monoklonski sintetizirana, te se zbog tog razlikuje od normal-nog proteina, nefelometrijski ili turbidimetrijski nećemo moći odrediti ukupnu vrijednost M-proteina. To posebno vrijedi kod vrlo visokih vrijednosti M-proteina posebno kod M-IgM i M-IgA. Imunofiksaciju nije potrebno ponavljati ako se nisu dogodile promjene u migraciji M-prote-ina te ako se nije pojavila nova monoklonska vrpca.

4. Za sve bolesnike s poremećajem plazma stanica potrebno je nefelometrijsko ili turbidimetrijsko određivanje imunoglobulina da bi se ustvrdila koncentracija i ostalih neuključenih imunoglo-bulina.

5. Svim bolesnicima s MM-om, Waldenström ma-kroglobulinemijom, amiloidozom i srodnim bo-lestima potrebno je odrediti prisutnost i dnevno izlučivanje BJP.

6. Kod bolesnika s MM-om, Waldenström ma-kroglobulinemijom te amiloidozom potrebno je pratiti promjene u koncentraciji M-proteina svakih 1-2 mjeseca, dok se takvo praćenje kod MGUS preporučuje jednom na godinu.

7. Hiperviskozni sindrom traži zamjenu plazme s indikacijama utemeljenima na kliničkim značaj-kama (viskozitet i elektroforezu seruma treba napraviti prije nego se plazma zamijeni radi us-poredbe koncentracija M-proteina).

8. Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika s M-proteinom koji pokazuju osjetljivost na hlad-noću, posebno kod onih sa M-IgM (vidi poglav-lje 51).

Isti autori dali su preporuke i za metode koje treba koristiti u evaluaciji M-proteina:

1. Za elektroforetsko razdvajanje proteina u se-rumu preporučuje se koristiti elektroforetske tehnike visoke djelotvornosti na agarozi ili ka-

Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija | 477

pilarnu zonsku elektrofore-zu što omogućuje vrlo rano otkrivanje M-proteina.

2. Imunoglobuline treba kvan-titativno odrediti nefelome-trijski kad god je to moguće. Određivanje imunoglobuli-na turbidimetrijski je također dovoljno osjetljivo za rutin-ske potrebe.

3. Razred i tip M-proteina odrediti imunofiksacijom odnosno imunoselekcijom. Metoda imunosubtrakcije je moguća samo uz kapilarnu zonsku elektroforezu.

4. Kvantifikaciju M-proteina izvoditi denzitometrijski.

5. Kontrola kvalitete evalu-acije M-proteina: ključna komponenta interne kon-trole je izravan kontakt la-boratorijskog stručnjaka s kliničarem o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo kakav nesklad u nalazu.

Zbog potrebe da se svim bole-snicima s MM-om, Waldenström makroglobulinemijom, amiloido-zom i srodnim bolestima odredi prisutnost i dnevno izlučivanje monoklonskih SLL, cijeli postu-pak laboratorijskog evaluiranja bolesnika s MG je bio znatno produžen (slika 50.1.). Naime, potvrdi li IF nalaz M-proteina potrebno je provjeriti da li njegovu sintezu prati i sinteza monoklonskih SLL imunoglobulina. U tu svrhu potrebno je učiniti elektroforezu i IF 24-sat-nog uzorka urina koji mora biti ukoncentriran naj-manje 100 x.

Osim navedene elektroforeze i IF od ostalih testova u serumu još se određuju beta-2-mikroglobulin, kre-

atinin i kalcij. Isto tako od hematoloških pokazatelja potrebno je odrediti sedimentaciju eritrocita, hemo-globin i diferencijalnu krvnu sliku.

Opisani dijagnostički postupnik za definiranje M-proteina doživio je promjene posljednih godina ra-zvojem reagensa koji omogućuje rutinsko kvantita-tivno određivanje SLL κ i λ tipa te njihovog omjera u serumu kao i u nativnom uzorku 24 satnog urina (slika 50.2.).

elektroforeza proteina u serumu

vizualni pregled

bez promjenaklinička sumnja ili

prisutnost monoklonske vrpce

BJP ? imunofiksacija MP

elektroforeza proteina u urinu(100x ukonc. urin)

negativannalaz

prisutanBJP

imunofiksacija 100xukoncentriranog urina

opisni nalaz + kliničkainformacija daju

tumačenje nalaza

definicija M-P(određ. razreda i tipa)

denzitometrijskakvantifikacija M-P

Slika 50.1. Laboratorijski dijagnostički postupnik za definiranje M-proteina: nakon vizu-alnog pregleda elferograma te nalaza monoklonske vrpce ili ako postoji klinička sumnja na postojanje MG-e, potrebno je učiniti imunofiksaciju te definirati razred i tip monoklon-skog proteina. Kod prve obrade pacijenta potrebno je također provjeriti postojanje sin-teze monoklonskih SLL imunoglobulina.


Monoklonski SLL su važan tumorski biljeg za identi-fikaciju i praćenje bolesnika s multiplim mijelomom lakih lanaca i amiloidoze lakih lanaca. Međutim, treba naglasiti da istovremeni porast koncentra-cije SLL κ i λ tipa u normalnom omjeru, ne znači monoklonsku sintezu lakih lanaca iako su njhove pojedinačne vrijednosti patološke odnosno izvan referentnog intervala. Poliklonski porast lakih lana-ca može biti znak nekog drugog upalnog procesa. Kod raznih nemalignih bolesti, kao što su reuma-toidni artritis, SLE i kronično bubrežno zatajenje, mogu se naći pozitivni SLL u povišenim vrijedno-stima. Visoke doze penicilina ili aspirina prije sku-pljanja 24 satnog urina mogu dati lažno pozitivan rezultat.

Biljeg monoklonske sinteze la-kih lanaca je poremećen omjer SLL κ/λ tipa i to povišen kod monoklonske sinteze SLL κ tipa odnosno snižen kod monoklon-ske sinteze SLL λ tipa.

Uvođenje određivanja κ/λ omje-ra SLL u rutinu povećalo je klinič-ku važnost BJP-a i znatno skratilo cijeli postupak laboratorijske di-jagnostike monoklonskih gama-patija.

Referentne vrijednosti i referen-tni intervali za κ/λ omjer u seru-mu i 24 satnom urinu određeni su na velikom broju ispitanika s različitim imunoproliferativnim bolestima. Istraživanje je provela grupa kliničkih kemičara na čelu s profesorom Robertom Kyle iz klinike Mayo. Test je tako uve-den u rutinu prije 10-tak godina. Prvi komercijalni test priredili su profesor Bradwell i njegov tim stručnjaka. Test je od Free Light Chain dobio skraćeno ime FLC koje ćemo često naći u literaturi.

Serumska koncentracija mo-noklonskih SLL tj. BJP korelira

samo s aktivnošću koštane srži, što znači da njihov nalaz može biti neovisan biljeg MG. Jedan posebno važan aspekt BJP je njihov kratak poluživot: 2-3 sata za kapu i 5-6 sati za lambdu, što je 150 puta kraće vrijeme od 21 dana koliko je, primjerice, poluživot IgG. Tako koncentracija BJP omogućuje vrlo brzu procjenu učinka kemoterapije: 92-128 dana brže nego koncentracija M-Ig ali isto tako i raniju procje-nu relapsa bolesti.

Koncentracija BJP ovisi o sintezi plazma-stanica, ali isto tako i o bubrežnom klirensu. Uz poliklonsku sintezu imunoglobulina i/ili bubrežnog oštećenja, naći ćemo 10-20 puta povećanu koncentraciju BJP u serumu. Bubrežno izlučivanje BJP raste s koncentra-

elektroforeza proteina u serumu

vizualni pregled

bez promjenaklinička sumnja ili

prisutnost monoklonske vrpce

BJP ? imunofiksacija MP

opisni nalaz + kliničkainformacija daju

tumačenje nalaza

definicija M-P(određ. razreda i tipa)

kvantitativno određivanjeSLL κ i λ u serumu/urinute njihovog omjera κ/λ

denzitometrijskakvantifikacija M-P

Slika 50.2. Preporučeni laboratorijski dijagnostički postupnik za definiranje M-proteina koji je danas u upotrebi: nakon definiranja razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina imunofiksacijom izmjere se kvantitativno SLL te odredi κ/λ omjer


cijom u serumu, ali značajno opada kada je visoka koncentracija kombinirana s bubrežnim oštećenjem.

Odlaganje BJP je izravno odgovorno za patološke procese tubulointersticijskog oštećenja. Nakon fil-tracije, BJP se vežu na heteromerične receptore koji se sastoje od kubilina i megalina i time injiciraju reapsorpciju u proksimalne tubule. Poslije endoci-toze i hidrolize BJP se vraćaju kao aminokiseline u cirkulaciju. BJP su otrovni zbog potencijalnih in-terakcija sa svim dijelovima nefrona. Nefrotoksični potencijal BJP ovisan je o njihovom fizikalno-ke-mijskom sastavu kao i utjecaju okoliša u kojem se nalaze.

Sakupljanje 24-satnog urina nije standardizirani po-stupak, mukotrpno je za bolesnike i uglavnom ne-točno. Laboratorijski postupak evaluacije monoklon-skog proteina znatno se produljuje zbog obrade urina. Stoga mnogi kliničari predlažu da se obrada 24-satnog urina ukloni iz primarnog postupnika za definiranje M-proteina.

Katzmann J. A. i Hill P. G. pokazali su na velikom broju bolesnika, u dvije odvojene studije, da zbog

oštećenja bubrega u približno 25 % bolesnika s MG možemo naći lažno pozitivne nalaze BJP u serumu, odnosno lažno negativne u urinu.

Može se zaključiti da primjenjujući program odre-đivanja ukupnih proteina u serumu, elektroforeze proteina u serumu, kvantitativnog određivanja SLL κ i λ tipa u serumu kao i njihovog omjera eliminira-mo potrebu sakupljanja 24-satnog urina, što znatno skraćuje proces definiranja M-proteina. Mokraća će se obrađivati diskontinuirano, tj. kod raznih dispro-teinemija kao i za praćenje bolesti jednom kad je M-protein već identificiran.

Kao što je već navedeno, prvi korak za definiranje M-proteina je elektroforeza proteina u serumu. Da-nas najraširenija elektroforetska tehnika je kapilar-na zonska elektroforeza (CZE), elektroforeza viso-ke djelotvornosti, koja je razvijena u ranim ‘90.-im godinama. Odvajanje analita bazirano je na veliči-ni i naboju samog analita u unutrašnjosti kapilara koje su napravljene iz posebnih silaniziranih vrsta stakla negativno nabijenih, promjera 15 – 20 µm. Kapilare su napunjene puferom u kojem proteini

Ukupni proteini:

Voditelj laboratorija:

A/G: 0,66

Komentar:

93 (60 - 78)

(0,80 - 2,00)

Frakcija

AlbuminAlpha 1Alpha 2BetaGamma

Ref. int. %

55,8 - 66,12,9 - 4,97,1 - 11,88,4 - 13,1

11,1 - 18,8

40,2 - 47,62,1 - 3,55,1 - 8,56,0 - 9,48,0 - 13,5

Ref. int. g/L

36,92,67,26,0

40,3

Rez. g/LRez %

39,72,87,76,5

43,3

Elektroforeza proteina u serumu

Slika 50.3. Elektroforeza proteina u serumu - nađen monoklonski protein


putuju od katode prema anodi pomoću elektro-foretskog toka. Međutim, zbog posebno visokog negativnog naboja na stijenkama kapilara javlja se elektroendoosmotski tok kao otpor pozitivnom naboju pufera, koji je znatno veći od elektroforet-skog toka, i razdvaja proteine u smjeru od anode prema katodi. Proteini se razdvajaju pri naponu od 7600 V.

Primjeri elektroforeza proteina u serumu dobiveni KZE-om nalaze se na slikama 50.3. i 50.4.

Metoda izbora za određivanje razreda i tipa M-pro-teina je imunofiksacija koja se može učiniti unutar jednog sata. Uzorak seruma nanosi se razrijeđen na katodni kraj prema preporučenim razrjeđenjima za svaki imunoglobulin. U slučaju izrazito povećane koncentracije imunoglobulina unatoč razrjeđenju može doći do učinka suviška antigena. Optimalna precipitacija s komercijalnim antiserumima događa se kod koncentracije imunoglobulina oko 10 g/L. Zato se preporuča napraviti kontrolnu elektroforezu prije izvođenja same imunofiksacije kako bi se uoči-lo kolika je vrpca samog M-proteina.

Imunofiksacija je dvostupanjski postupak koji se sa-stoji od elektroforeze na agarozi i imunoprecipitaci-je. Proteini se razdvoje elektroforetski na oštre vrpce u gelu. Na svaku vrpcu doda se specifični antiserum za molekulu pojedinačnih razreda i tipa imunoglo-bulina. Ako je prisuan monoklonski sintetizirani ra-zred teškog lanca imunoglobulina, nastat će netopivi kompleks s antiserumom koji se tada može obojiti i detektirati (slika 50.5.).

Određivanje razreda i tipa M-proteina moguće je ta-kođer odrediti na sustavu za KZE, tj. metodom imu-nosubtrakcije. Metoda se osniva također na principu imunoprecipitacije antigena: IgG, IgA ili IgM kao i vezanih κ i λ lakih lanaca sa specifičnim antiseru-mom.

Katzman J. A. i ostali stručnjaci iz Mayo klinike, koji su intenzivno pratili i ispitivali mogućnosti testa za kvantitativno određivanje SLL u serumu i/ili urinu kod MG od samih početaka, smatraju da je vrijeme za promijene laboratorijske evaluacije bolesnika s MG. Pa tako naglašavaju da dosadašnji opsežan postupnik u laboratorijskoj dijagnostici MG treba

Ukupni proteini:

A/G: 0,77

Komentar:

90 (60 - 78)

(0,80 - 2,00)

Frakcija

AlbuminAlpha 1Alpha 2BetaGamma

Ref. int. %

55,8 - 66,12,9 - 4,97,1 - 11,88,4 - 13,1

11,1 - 18,8

40,2 - 47,62,1 - 3,55,1 - 8,56,0 - 9,48,0 - 13,5

Ref. int. g/L

39,23,79,49,7

28,0

Rez. g/LRez %

43,64,1

10,410,831,1

Elektroforeza proteina u serumu

Voditelj laboratorija:

Slika 50.4. Elektroforeza proteina u serumu – hipergamaglobulinemija, (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).


selektivno koristiti. U većini slučajeva kao početni postupnik još uvijek se koristi elektroforeza prote-ina u serumu, IF seruma, određivanje κ/λ omjera

seruma i/ili urina u kombinaciji s IF i elektrofore-zom urina.

Međutim dosadašnji rezultati korištenja testa za kvantitativno određivanje SLL u serumu i/ili urinu pokazuju da bi se inicijalni probir laboratorijske di-jagnostike MG trebao sastojati od elektroforeze pro-teina u serumu i κ/λ omjera slobodnih lakih lanaca imunoglobulina u serumu (slika 50.6.). IF seruma i obradu urina treba uključivati u dijagnostički postu-pnik mnogo selektivnije.

Primjeri mogućih nalaza, koje možemo definirati već u prvom koraku dijagnostičkog postupnika, prikaza-ni su na slikama 50.7., 50.8., 50.9. i slici 50.10.

Ako ne postoji klinička sumnja na MG, nalaz na slici 50.10. pokazuje da ne postoji potreba za IF ni seru-ma ni urina. Može se zaključiti da nalaz elektroforeze proteina u serumu uz kvantitativno određivanje SLL omogućuje jednostavni i učinkoviti inicijalni dijagno-stički probir za MG poput multiplog mijeloma i Wal-denström makroglobulinemije. Stoga se kod takvih bolesnika elektroeforeza i IF urina kao i IF seruma preporuča koristiti selektivno.

sebiaHYDRAGEL IF 2/4

ELP G A M K L ELP G A M K L

ELP G A M K L ELP G A M K L10

056/

0037

14

2

3

1

Slika 50.5. Imunofiksacija četiri različita uzorka seruma u kojima su nađeni monoklonski proteini: uzorak br. 1.: nađen monoklonski IgA κ tipa; uzorak br. 2.: nađen monoklonski IgG λ tipa; uzorak br. 3.: nađen slabo izražen monoklonski IgM λ tipa; uzorak br. 4.: nađen monoklon-ski IgG λ tipa (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

elektroforezaproteina u serumu

kvantitativno određivanjeSLL: κ i λ i κ/λ omjer

prisutanBJP

1. SLL: κ/λ omjerizvan ref. intervalaSPE: nalaz uredan

prisutan intaktniM-Ig i BJP

2. SLL: κ/λ omjerizvan ref. intervala

SPE: nalaz M-Ig

prisutanintaktni M-Ig

3. SLL: κ/λ omjerunutar ref. intervala

SPE: nalaz M-Ig

M-Ig i BJPnisu prisutni

4. SLL: κ/λ omjerunutar ref. intervalaSPE: nalaz uredan

+

Slika 50.6. Primarni postupnik laboratorijske dijagnostike monoklonskih gamapatija prema kojem možemo već u prvom koraku procije-niti barem četiri slučaja: ako u prvom koraku uz uredan nalaz elektroforeze proteina u serumu imamo povišen ili snižen κ/λ omjer, nalaz ukazuje na sintezu BJP; ako elektroforezom proteina u serumu nađemo monoklonsku vrpcu M-proteina i povišen ili snižen κ/λ omjer, nalazi ukazuju na sintezu i monoklonskog intaktnog Ig i sintezu BJP; ako elektroforezom proteina u serumu nađemo monoklonsku vrpcu M-proteina a κ/λ omjer unutar referentnog intervala može se zaključiti da postoji sinteza monoklonskog intaktnog imunoglobulina bez popratne sinteze BJP; uredan nalaz elektroforeze proteina u serumu i κ/λ omjer unutar referentnog intervala ukazuje da ne postoji sinteza ni M-Ig ni BJP


ProteiniRezultat

655,870,600,62

3500,00

10,90 mg/L

vidi pod LAKI LANCI Ig (BJP) IMUNOFIKSACIJA

NAĐENI MONOKLONSKI SLOBODNI LAGANI LANCI IMUNOGLOBULINA KAPA TIPA

NAĐENI MONOKLONSKI SLOBODNI LAGANI LANCI IMUNOGLOBULINA KAPA TIPA

mg/Lg/Lg/Lg/Lg/L 66 - 81

7,0 - 160,7 - 40,4 - 2,3

3,30 - 19,40

5,71 - 26,30

0,26 - 1,65319,00

Jedinica OpaskaReferentni

interval

Rezultat Jedinica%47,4 55,8 - 66,1

40,2 - 47,62,9 - 4,92,1 - 3,57,1 - 11,85,1 - 8,58,4 - 13,1

6 - 9,411,1 - 18,8

8 - 13,50,8 - 2

30,89,56,2

17,911,616,911,0

8,35,4

0,90

%

%

%

%g/L

g/L

g/L

g/L

g/L

Referentniinterval

IgGIgAIgMSlobodni laki lanci Ig KAPAtipa – serum

Sl. laki lanci Ig KAPA / IgLAMBDA – omjer (serum)

Slobodni laki lanci IgLAMBDA tipa – serum

Imunofiksacija (serum)Laki lanci Ig (BJP)– imunofiksacija serumaLaki lanciIg (BJP) – imunofiksacija urina

Albumin %Albumin

Beta globulini %

Omjer A/GGama globuliniGama globulini %Beta globulini

Alfa 2 globuliniAlfa 2 globulini %Alfa 1 globuliniAlfa 1 globulini %

ELEKTROFOREZA PROTEINA U SERUMU

SLL: κ/λ omjerizvan ref. intervalaSPE: nalaz uredan

Slika 50.7. Uredan nalaz elektroforeze proteina u se-rumu uz povišen κ/λ omjer: pregledom elferograma moglo bi se zaključiti da osim hipogamaglobuline-mije nema nekih dodatnih osobitosti. Međutim, para-lelno određeni κ/λ omjer pokazao je da postoji sin-teza BJP κ tipa što je očito i uzrok izostanka sinteze ostalih neuključenih imu-noglobulina. Prema primar-nom nalazu napravljena je naknadno i IF seruma i urina na BJP koja je do-datno potvrdila postojanje monoklonske sinteze BJP κ tipa, (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

(S) ProteiniRezultat

6825,82

0,110,09

5420,00

2,18 mg/L

mg/Lg/Lg/Lg/Lg/L 66 - 81

7,0 - 160,7 - 40,4 - 2,3

3,30 - 19,40

5,71 - 26,30

0,26 - 1,652480,00


interval


40,2 - 47,62,9 - 4,92,1 - 3,57,1 - 11,85,1 - 8,58,4 - 13,1

6 - 9,411,1 - 22,1

8,0 - 15,90,8 - 2

25,27,24,9

15,610,6

8,55,8

31,621,50,59

%

%

%

%g/L

g/L

g/L

g/L

g/L

Referentniinterval

(S) IgG(S) IgA(S) IgM(S) Slobodni laki lanci IgKAPA tipa

(S) Sl. laki lanci Ig KAPA /Ig LAMBDA – omjer

(S) Slobodni laki lanci IgLAMBDA tipa

Imunofiksacija (serum)

Vrijeme validacije nalaza: 09.01.2012 12:13

Laki lanci Ig (BJP)– imunofiksacija serumaLaki lanciIg (BJP) – imunofiksacija urina

(S) Albumin(S) Albumin

(S) Beta globulini

(S) Omjer A/G(S) Imunofiksacija NAĐEN MONOKLONSKI IMUNOGLOBULIN G KAPA TIPA

(S) Gama globulini(S) Gama globulini(S) Beta globulini

(S) Alfa 2 globulini(S) Alfa 2 globulini(S) Alfa 1 globulini(S) Alfa 1 globulini


SLL: κ/λ omjer izvanref. intervala

SPE nalaz M proteina

Slika 50.8. Nalaz mo-noklonske vrpce na elfero-gramu kao i izrazito povi-šen κ/λ omjer: primjer na slici br. 50. 8. je vrlo jasan. Već samim pregledom elfe-rograma uočena je vrlo oš-tro odvojena monoklonska vrpca, odnosno monoklon-ski – pik (M-pik) a izrazito povišen κ/λ omjer pokazuje da sintezu intaktnog M-IgG prati i sinteza monoklonskih SLL κ tipa. Iz kvantitativno određenih imunoglobuli-na može se zaključiti da je došlo do supresije sinteze ostalih neuključenih imu-noglobulina kao i potpuno izgubljene kontrole sinteze slobodnih lakih lanaca imu-noglobulina, (Klinička jedi-nica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).


ProteiniRezultat

9444,0611,04

8,92

34,90 mg/L

NAĐEN MONOKLONSKI IMUNOGLOBULIN G LAMBDA TIPA

mg/Lmg/Lg/Lg/L 66 - 81

7,0 - 160,6 - 2,0

3,30 - 19,40

5,71 - 26,30

0,26 - 1,650,26


interval


40,2 - 47,62,9 - 4,92,1 - 3,57,1 - 11,85,1 - 8,58,4 - 13,1

6 - 9,411,1 - 18,8

8 - 13,50,8 - 2

34,94,34,09,69,06,96,5

42,139,60,59

%

%

%

%g/L

g/L

g/L

g/L

g/L

Referentniinterval

IgGBeta-e-mikroglobulinSlobodni laki lanci Ig KAPAtipa – serum

Sl. laki lanci Ig KAPA / IgLAMBDA – omjer (serum)

Slobodni laki lanci IgLAMBDA tipa – serum

Imunofiksacija (serum)

Albumin %Albumin

Beta globulini %

Omjer A/GGama globuliniGama globulini %Beta globulini

Alfa 2 globuliniAlfa 2 globulini %Alfa 1 globuliniAlfa 1 globulini %


SLL: κ/λ omjer unutarref. intervala

SPE: nalaz M-proteina

Slika 50.9. Nalaz oštro izdvojene monoklonske vrpce i κ/λ omjer unutar referentnog intervala: kvan-titativno određeni imuno-globulini pokazuju da pik monoklonskog imunoglo-bulina, koji se jasno uočava na elferogramu, pripada M-IgG. Međutim κ/λ omjer je unutar referentnog inter-vala što znači da još uvijek postoji kontrola sinteze SLL, (Klinička jedinica za specijal-nu biokemiju, KBC Zagreb).

(S) ProteiniRezultat

74

8,542,830,49

13,40g/L

mg/Lmg/L

g/Lg/L

g/L 66 - 78ležei bolesniciambulantni bol. 66 - 81

7,00 - 16,000,70 - 4,000,40 - 2,303,30 - 19,405,71 - 26,30

0,26 - 1,65

21,90

0,61


interval


40,2 - 47,62,9 - 4,92,1 - 3,57,1 - 11,85,1 - 8,58,4 - 13,16,0 - 9,4

11,1 - 18,88,0 - 15,90,8 - 2,0

46,63,22,4

10,47,7

10,77,9

12,79,4

1,701,00

%

%

%

%g/L

g/L

g/L

g/L

g/L

Referentniinterval

(S) IgG(S) IgA(S) IgM

(S) Slobodni laki lanci Ig LAMBDAtipa (S)(S) Sl. laki lanci Ig KAPA / Ig LAMBDA– omjer

(S) Slobodni laki lanci Ig KAPA tipa

(S) Albumin(S) Albumin

(S) Beta globulini

(S) Omjer A/G(S) OMJER 2

NORMALNA(S) Imunofiksacija

(S) Gama globulini(S) Gama globulini(S) Beta globulini

(S) Alfa 2 globulini(S) Alfa 2 globulini(S) Alfa 1 globulini(S) Alfa 1 globulini


FLC normalanSPE normalna

SLL: κ/λ omjer jeunutar ref. intervalaSPE: nalaz uredan

Slika 50.10. Uredan nalaz elektroforeze proteina u serumu kao i κ/λ omjera: nalazi ukazuju da ne postoji sinteza ni M-Ig ni BJP, (Kli-nička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).


LITERATURABradwell A. R. Serum Free Light Chain Analysis (plus Hevyli-te). The Binding Site Group Ltd. Birmingham 2013.

Cockwell P, Hutchison CA. European trial of free light chain removal by extended haemodiylysis in cast nephropathy. He-matology Meeting Reports 2008;2:17-18.

Goeken JA, Keren DF. Introduction to the report of the con-sensuc conference on monoclonal gammopathies. Arch Pat-hol Lab Med 1999;123:104-105

Holding S, Spradbery D, Hoole R et al. Use of serum free light chain analysis and urine protein electrophoresis for de-tection of monoclonal gammopathies. Clin Chem Lab Med 2011;49:83-88.

Hutchison CA, Basnayake K, Cockwell P. Serum free light chain assessment in monoclonal gammopathy and kidney disease. Nature Reviews 2009;5:621-627.

Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Evaluation of Crioglobulins. Arch Pathol Lab Med 1999;123:119-125

Katzmann JA. Screening Panels for Monoclonal Gammopathi-es: Time to Change. Clin Biochem Rev 2009;30:105-111.

Keren DF, Alexanian R, Goeken JA, Gorevic PD, Kyle R, To-mar RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of patiens with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999;123:106-107

Lakshminarayanan R, Li Y, Jantpour K, Beckett L, Jialal I. De-tection by Immunofixation of M Proteins in Hypogammaglo-bulinemic Patients With Normal Serum Protein Electrophore-sis Results. Am J Clin Pathol 2007;127:746-751.

Matišić D. Nova strategija u dijagnostici monoklonskih gama-patija. Biochemia Medica 2009;19(Suppl1):S22-S23.

Tatsas AD, Jagasia MH, Chen H, McCurley TL. High-Re-solution Serum/Urine Electrophoresis or Marrow Biop-sy With Immunohistochemical Analysis? Am J Clin Pathol 2010;134:139-145.

Pitanja i odgovori

1. Koji su osnovni kriteriji dijagnostike monoklonskih gamapatija?

Nalaz monoklonskog proteina u serumu i/ili urinu, infiltracija koštane srži plazma stanicama (>10 %), te nalaz osteolitičkih žarišta.

2. Koji je prvi korak u dijagnostici MG?

Elektroforeza proteina u serumu.

3. Po čemu razlikujemo benigne od malignih MG?

Benigna MG podrazumijeva koncentraciju M-proteina manju od 10 g/L, normalnu sintezu neuključenih imuno-globulina, negativan nalaz BJP u serumu i/ili urinu i odsutnost porasta koncentracije M-proteina nakon neko-liko narednih godina. Malignu MG-u prati koncentracija M-proteina veća od 10 g/L, odsutnost sinteze ostalih neuključenih imunoglobulina, te pozitivan nalaz BJP u serumu i/ili urinu kod 80-96 % bolesnika s multiplim mijelomom s intaktnim M-Ig.

4. Kojom metodom se može napraviti tipiziranje BJP?

Za određivanje tipa BJP potrebno je napraviti imunofiksaciju najmanje 100x ukoncentriranog uzorka 24 satnog urina.

5. Što pokazuju rezultati desetgodišnjeg korištenja određivanja κ/λ omjera u serumu?

Pokazuju da bi se inicijalni probir laboratorijske dijagnostike MG trebao sastojati od elektroforeze proteina u serumu i κ/λ omjera u serumu.

485

Krioglobulini su imunoglobulini ili imunoglobulinski kompleksi koji precipitiraju na temperaturi 4-37oC i ne nalaze se u serumu zdravih osoba. Nužno ih je razlikovati od ostalih fenomena u hladnom kao npr. hladnih aglutinina i kriofibrinogena.

Krioglobulini se nalaze u brojnim infektivnim, bubrežnim, jetrenim, autoimunim, hematološkim i neoplastič-nim bolestima i tada govorimo o sekundarnoj krioglobulinemiji. Međutim, moguće ih je naći i u odsutnosti navedenih bolesti. Kada ne postoje dokazi o prisutnosti bolesti s kojima se krioglobulinemija najčešće pove-zuje, prisutnost krioglobulina u krvi definira se kao esencijalna miješana krioglobulinemija (EMK). Proteini koji spontano reverzibilno precipitiraju pri temperaturi nižoj od 37oC spominju se još 1933. godine kad su Wintrobe i Buell opisali neobičan slučaj precipitacije proteina na niskoj temperaturi u serumu bolesnice s multiplim mijelomom. 1947. godine su Lerner i Watson pokazali da hladno precipitirajući proteini po svojoj elektroforetskoj pokretljivosti spadaju u gamaglobuline i nazvali ih krioglobulinima, a njihovu prisutnost u krvi krioglobulinemijom. Kako simptomi (purpura, atralgija, slabost) nisu bili tipični za određenu bolest uve-den je terminEMK. Naziv miješana krioglobulinemija obuhvaća nalaz više od jednog razreda imunoglobulina sa krioprecipitacijskim svojstvom.

Prisutnost krioglobulina u serumu uzrokuje sistemsku upalu koja se najčešće manifestira kao bubrežna bolest i kožne lezije. Kliničke manifestacije miješane krioglobulinemije (Tablica 51.1.) posljedica su nakupljanja imunokompleksa na stijenci krvnih žila pri niskoj temperaturi (sistemski vaskulitis, glomerulonefritis) te aktivacije komplementa koja dovodi do lokalnog oštećenja tkiva odnosno kožnih lezija.

Iako patofiziologija krioglobulinemija nije još potpuno jasna, uz intravaskularne depozite krioglobulina u bolesnika se često nalazi sniženi hemolitički komplement (CH50) i komponente komplementa (C3, C4) kao kemotaktičnih čimbenika upale. Cirkulirajući visokomolekularni kompleksi krioglobulina mogu izazvati i hiperviskozni sindrom.

P o g l a v l j e 51.Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija

Dragana Šegulja, Danica Matišić


KRIOPRECIPITACIJASvojstvo krioglobulina da se talože u hladnom koristi se u laboratorijskom radu za njihovu detekciju. Pre-cipitaciju krioglobulina na temperaturi od +4oC u in vitro uvjetima nazivamo krioprecipitacija. Količina i brzina stvaranja precipitata ovisi o tipu krioglobuli-nemije, njihovoj koncentraciji te temperaturi na kojoj dolazi do precipitacije. Iako točan mehanizam krio-precipitacije nije poznat, dokazane su konformacijske promijene u Fab području nekih krioglobulina pri ni-skim temperaturama. Pretpostavlja se da do stvaranja krioprecipitata dolazi u dva koraka. U prvom, neovi-snom o temperaturi, nastaju imunokompleksi između imunoglobulina M koji posjeduje reumatoidnu aktiv-nost (IgM-RF, IgM-antiglobin) i imunoglobulina G, a u drugom, ovisnom o temperaturi, dolazi do među-sobnog nekovalentnog povezivanja imunoglobulina M i time do agregacije imunokompleksa.

Kompleksi heparina i fibronektina te fibrina i fibrino-gena (kriofibrinogenemija) kod bolesnika na antiko-agulantnoj terapiji mogu precipitirati na hladnom te stoga biti čest uzrok lažno pozitivnih rezultata.

PODJELA KRIOGLOBULINEMIJAKrioglobulini (Mr oko 200 kDa) mogu biti posljedica monoklonske ili poliklonske sinteze imunoglobulina. Najčešće su IgG i IgM razreda koji posjeduje reuma-toidnu aktivnost te se veže na C-terminalni kraj Fc do-mene IgG kao antigena. Prema sastavu krioprecipita-ta krioglobulinemije dijelimo po Brouetu na tri tipa:

• Tip I - karakterizira prisutnost monoklonski sintetiziranog krioglobulina, rjeđe monoklonski

sintetiziranih lakih lanaca imunoglobulina. Kon-centracija krioglobulina u serumu često prelazi 5g/L. Ovaj tip krioglobulinemije čini 10-15 % svih krioglobulinemija, a nalazi se kod multi-plog mijeloma, Waldenström makroglobuline-mije i drugih limfoproliferativnih poremećaja.

• Tip II – čini 50-60 % svih krioglobulinemija, a predstavlja miješanu krioglobulinemiju karakteri-ziranu prisutnošću imunokompleksa koji uz mo-noklonsku sadrže i poliklonsku komponentu. Naj-češće se nalazi monoklonski IgM-RF u kompleksu sa poliklonskim IgG. Koncentracija krioglobulina u serumu je uglavnom između 1 i 5 g/L.

• Tip III – predstavlja miješanu krioglobulinemi-ju s koncentracijom krioglobulina manjom od 1 g/L. Ovaj tip krioglobulinemija karakterizira prisutnost isključivo poliklonski sintetiziranih krioglobulina. Udio krioglobulinemija tipa III u ukupnom broju krioglobulinemija je 25-30 %.

Sekundarne miješane krioglobulinemije se javljaju u infektivnim bolestima (HCV, HBV, HIV, CMV), au-toimunim bolestima (SLE, RA, SS), kroničnoj bolesti jetre. Većina miješanih krioglobulinemija (tip II i III) povezuje se s HCV infekcijom. Povezanost između kronične HCV infekcije i miješane krioglobulinemije bolje je uočena uvođenjem molekularne dijagnostike u laboratorijsku dijagnostiku hepatitisa C. Pozitivan nalaz HCV-RNA nađen je u 80 % bolesnika s miješa-

Tablica 51.1. Kliničke manifestacije miješane krioglobu-linemije

PurpuraRaynaudov sindromAtralgijaPeriferni neuritisGlomerulonefritisSistemski vaskulitisHiperviskoznost

MIJEŠANA KRIOGLOBULINEMIJA

HCV

1 2 3 4 5

HBV, HIV,CMV i dr.

?

EMK I AIP MK MK

Slika 51.1. Shematski prikaz kliničke i etiološke podijele miješane krioglobulinemije: (1) EMK – esencijalna miješana krioglobuline-mija; (2) i (3) EMK i MK pridružena hepatitisu C kod bolesnika sa autoimunim poremećajem (AIP); (4) miješana krioglobulinemija pridružena hepatitisu C; (5) miješana krioglobulinemija povezana sa drugim virusima

Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija | 487

nom krioglobulinemijom, a HCV-RNA se nalazi i u sastavu krioprecipitata.

Prevalencija miješane krioglobulinemije u općoj je populaciji 1:100000. Češće se nalazi na području juž-ne Europe nego sjeverne Europe i Amerike i to tri puta češće kod žena nego kod muškaraca. Pozitivni nalaz krioglobulina nalazi se kod 15-20 % HIV-pozi-tivnih te kod 15-25 % bolesnika sa vaskulitisom (slika 51.1.).

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA KRIOGLOBULINEMIJALaboratorijska dijagnostika krioglobulinemija sastoji se od dva dijela:

• kvalitativnog - prepoznavanja prisutnosti krio-precipitata

• kvantitativnog - određivanja koncentracije i sa-stava krioprecipitata

Budući proteini koje analiziramo imaju tendenciju precipitacije na niskoj temperaturi, postupak uzor-kovanja i pripreme seruma nužno je provesti na tem-peraturi od 37oC. Krv se vadi u unaprijed zagrijane epruvete, koje se slijedeća dva sata zadržavaju u ter-mostatu na temperaturi od 37oC i tek tada centrifu-giraju. Proces zgrušavanja krvi mora se provoditi na temperaturi od 37oC kako ne bi došlo do taloženja krioglobulina i njihovog „zarobljavanja� u ugrušku. Najčešći uzrok lažno negativnih rezultata je neod-govarajuća separacija seruma od ostalih krvnih ele-menata.

Da bi detektirali i najmanje krioprecipitate (koncen-tracije krioglobulina < 1g/L) potrebno je imati do-voljnu količinu seruma za nastanak okom vidljivog krioprecipitata. Stoga je preporuka vaditi najmanje 10-20mL krvi za pretraživanje krioglobulina.

Kvalitativna analiza precipitata sastoji se od in vitro izazvane krioprecipitacije. Uzorci seruma se pohra-njuju na +4oC tijekom 7 dana. Dnevnom vizualnom provjerom uzoraka već nakon 72 sata u uzorku s prisutnim krioglobulinima može se naći krioprecipi-tat. Krioprecipitat je bijele boje, a po strukturi može

biti želatinozan, u obliku kristala ili pahuljičast (slika 51.2.).

Za očitavanje prisutnosti krioprecipitata, pogotovo kod malih koncentracija krioglobulina, neophod-no je iskusno i educirano tehničko osoblje. U lite-raturi se preporuča alikvot uzorka čuvati na 37oC radi usporedbe sa uzorkom pohranjenim na +4oC i lakše detekcije precipitata, ali u praksi to najčešće nije moguće provesti. Zbog nemogućnosti procjene prisutnosti precipitata u lipemičnim uzorcima, takvi se uzorci smatraju neprihvatljivima za pretraživanje krioglobulina.

Veličinu krioprecipitata moguće je izraziti kao krio-krit, tj. postotni volumni udio precipitata u odnosu na ukupni volumen seruma. No, budući se kriokrit očitava prije ispiranja nespecifično adheriranih pro-teina i nije standardiziran prema volumenu, veličini epruvete, uvjetima centrifugiranja nije dobra mjera aktivnosti bolesti prilikom uspoređivanja rezultata.

Svi pozitivni uzorci idu u daljnju obradu tijekom koje se određuje količina i sastav krioprecipitata. Detaljan opis krioglobulina zahtjeva rigorozan postupak ispi-ranja precipitata, testiranje na reverzibilnost kriopre-cipitata zagrijavanjem, kvantifikaciju krioglobulina, evaluaciju monoklonskog krioglobulina metodom imunofiksacije. Precipitat se odjeljuje, a nespecifično

Slika 51.2. Serum nakon krioprecipitacije na +4 °C.


adherirani proteini se ispiru s hladnom fiziološkom otopinom. Kako bi bili sigurni da u odjeljenom pre-cipitatu doista postoje krioglobulini (gamaglobulini) moguće je provesti elektroforezu zagrijanog i ispra-nog precipitata (slika 51.3.). Odijeljeni precipitat se potom otapa s PBS-om na 37oC, i nanosi na ploče za radioimunodifuziju (RID) (slika 51.4.). Na RID plo-čama određuje se koncentracija imunoglobulina A, G i M u precipitatu, a zbrajanjem koncentracija po-jedinih imunoglobulina dolazi do količine ukupnog krioprecipitata.

Iako je do nedavno bilo opće prihvaćeno da do kon-centracije krioglobulina od 60 mg/L nije potrebno određivati tip krioglobulinemije, danas se preporuča tipizirati krioprecipitat već kod koncentracije od 20

mg/L. Za tipizaciju krioglobulina prema Brouetu po-trebno je utvrditi radi li se o monoklonskoj ili o poli-klonskoj sintezi krioglobulina. Imunofiksacija je me-toda izbora za ispitivanje klonalnosti imunoglobulina i tipiziranje krioglobulina. Oštra vrpca na agaroznom gelu nakon imunofiksacije ukazuje na monoklonsku sintezu krioglobulina (slika 51.5.).

Slika 51.4. Ploča za kvantitativno određivanje krioglobulina radi-oimunodifuzijom

Slika 51.5. Imunofiksacija uzorka s pozitivnim krioglobulinima: re-akcija s antiserumima na gama(γ) i alfa(α) teški lanac te lambda(λ) laki lanac ukazuje na poliklonsku sintezu krioglobulina G i A ra-zreda. U reakciji s antiserumima na mi(μ) teški lanac i kapa(κ) laki lanac u istom položaju se uočava oštra vrpca što ukazuje na monoklonsku sintezu krioglobulina IgM kapa tipa. Prisutan monoklonski krioglobulin IgM kapa tipa i poliklonski sintetiziran krioglobulin IgG upućuje na krioglobulinemiju tipa II, (Klinička je-dinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

A B C

Alb α1 α2 γ gloguliniβ Alb α1 α2 γ gloguliniβ Alb γ glogulini

Slika 51.3. Usporedbom nalaza elektroforeze proteina seruma zagrijanog na 37 °C i nakon krioprecipitacije moguće je procjeniti uspješ-nost odvajanja krioprecipitata. Slika A prikazuje elferogram proteina seruma s pozitivnim krioglobulinima otopljenim zagrijavanjem na 37 °C. Krioglobulini u električnom polju putuju najčešće u području beta i gama globulina. Slika B prikazuje elferogram proteina u supernatantu nakon krioprecipitacije na +4 °C. Uočava se nestanak frakcije u području gama globulina tj. krioglobulina. Slika C prikazuje elferogram otopljenog i zagrijanog krioprecipitata koji sadrži krioglobuline i primjese albumina, (Klinička jedinica za specijalnu biokemiju, KBC Zagreb).

Laboratorijska dijagnostika krioglobulinemija | 489

Testiranje na prisutnost krioglobulina treba se provo-diti samo onda kada postoje jasni klinički simptomi, manifestacije bolesti uzrokovane hladnoćom te prisut-nost bolesti koju prati krioglobulinemija. Prema smjer-nicama za kliničku i laboratorijsku evaluaciju bolesni-ka s monoklonskim gamapatijama Američkog društva kliničkih kemičara pretraživanje na krioglobuline treba

napraviti kod svih bolesnika sa monoklonskim prote-inom koji pokazuju osjetljivost na hladnoću, posebice kod onih sa monoklonskim proteinom IgM razreda. Na krioglobulinemiju treba posumnjati i kada koncen-tracija RF ne odgovara kliničkoj slici (lažno niski RF) jer ako je većina IgM antiglobina osjetljiva na tempera-turu gubi se u ugrušku tijekom obrade uzorka.

LITERATURAAttaelmannan M, Levison SS. Understanding and iden-tifying monoclonal gammopathies, Clinical Chemistry 2000;46(8):1230-1238

Ferri C. Mixed cryoglobulinemia, Orphanet Journal of rare diseases 2008;3:25

Franco Dammacco: HCV Infection and Cryoglobulinemia, Springer-Verlag, Italia, 2012.

Kallemuchikkal U, Gorevic PD. Evaluation of cryoglobulins, Arch Pathol Lab Med 1999;123:119-125

Keren DF, Alexanian R, Goeken J, Gorevic P, Kyle RA, Tomar RH. Guidelines for clinical and laboratory evaluation of pati-

ents with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab Med 1999;123:106-7

Lothar Thomas: Clinical Laboratory Diagnostic, Th-Books Verlagsgesellshaft mbH, Frankfurt/Main, Germany, 1998

Morie A Gertz, Philip R. Greipp. Hematologic Malignancies: Multiple Myeloma and related plasma cell disorders (Ange-la Dispenzieri: Cryoglobulinemia 228-252), Springer-Verlag Germany 2004

Ramos-Casals M, Stone JH, Cicl MC, Bosch X. The cryoglobu-linaemias. Lancet 2012;379(9813):348-60

Stjepan Gamulin, Matko Marušić i sur: Patofiziologija, Medi-cinska naklada, Zagreb, 1998.

Pitanja i odgovori

1. Što su krioglobulini?

Imunoglobulini ili imunoglobulinski kompleksi koji precipitiraju na temperaturi 4-37 °C.

2. Koje su najčešće kliničke manifestacije miješane krioglobulinemije?

Purpura, Raynaudov sindrom, periferni neuritis, glomerulonefritis i sistemski vaskulitis.

3. Koji je najčešći uzrok lažno negativnih rezultata u laboratorijskoj dijagnostici krioglobulinemija?

Neadekvatan predanalitički postupak. Naime, proteini koje analiziramo imaju tendenciju precipitacije na niskoj temperaturi te je nužno postupak uzorkovanja i pripreme seruma provesti na temperaturi od 37 °C.

4. Što obuhvaća kvalitativnu analizu krioglobulina?

Prepoznavanje prisutnosti krioprecipitata nakon pohrane uzorka seruma na +4 °C tijekom najmanje 72 sata, a po potrebi i do 7 dana.

5. Koja je metoda izbora za tipizaciju krioglobulina prema Brouetu?

Imunofiksacija.

490

Citogenetika je znanost koja u sebi sjedinjuje znanost o stanici (citologija) i znanost o nasljeđivanju (geneti-ka). Ona proučava morfologiju i dinamiku kromosoma tijekom mitoze i mejoze te nastoji povezati kromo-somske nalaze s principima opće genetike.

Znatniji napredak u otkrivanju hematoloških bolesti povezuje se s otkrićem Philadelphia kromosoma godine 1960. u KML-i).

Stečene klonalne kromosomske promjene nalaze se u zloćudnim stanicama bolesnika s leukemijom, limfo-mom, ali i drugim hematološkim neoplazmama. Broj specifičnih kromosomskih promjena svakim se danom povećava, a njihovo dokazivanje i razumijevanje molekularne osnove postaje bitno i nezaobilazno u dija-gnostici, klasifikaciji, terapiji, praćenju i prognozi bolesti.

METODE U CITOGENETICIKromosomske promjene (promjene genoma) u leukemijskim stanicama mogu se objektivizirati primjenom različitih citogenetskih metoda. Od metoda koje se danas primjenjuju u objektivizaciji (istraživanju i dijagno-stici) promjena genoma zloćudnih stanica su metode konvencionalne ili klasične citogenetike (metode pruga-nja) i sve više metode molekularne biologije kao što je FISH, ali i druge danas dostupne molekularne metode.

Uspjeh citogenetske analize ovisi o kvaliteti uzorka, ali i o primijenjenoj metodi.

U dijagnostici hematoloških bolesti citogenetske metode se međusobno kombiniraju i dopunjuju kako bi informacija o genomu bila što potpunija.

Ovisno o metodi koja se primjenjuje u citogenetskoj analizi promjene genoma mogu se objektivizirati izravno iz dobivenog materijala, iz stanične kulture ili iz arhiviranih uzoraka.

P o g l a v l j e 52.Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemijaSanja Davidović-Mrsić, Ivana Franić Šimić

Citogenetske metode u dijagnostici akutnih leukemija | 491

Dobivene informacije o promjenama genoma opisu-ju se kvantitativno i kvalitativno prema definiranoj međunarodnoj nomenklaturi, ISCN. Analizu prepa-rata omogućuju svjetlosno-fluorescentni mikroskopi i specifični programi za obradu slike i signala.

Konvencionalne citogenetske metode – klasična citogenetikaUzorci koji se koriste za konvencionalnu citogenet-sku analizu u bolesnika s malignim hematološkim bolestima mogu biti: koštana srž, periferna krv, uzo-rak tkiva tj. bioptat limfnoga čvora kada se radi o lim-fomu. Rjeđe se za analizu mogu upotrijebiti likvor, pleuralni izljev, ascites ili aspirat (kada se sumnja na proširenost bolesti ili ima podatak o prisutnosti malignih stanica). Svi uzorci koji se iskorištavaju za dokazivanje promjena genoma nekom od konvenci-onalnih citogenetskih metoda moraju zadovoljavati zadane kriterije kao što su: broj i viabilnost stanica, sterilno uzimanje uzorka, adekvatni transport te čitav niz drugih parametara koji su zadani protokolima i standardima koji se koriste u radu. Najčešći uzorak koji se koristi u dijagnostici hemoblastoza, akutnih leukemija je uzorak koštane srži (KS), a dobije se punkcijom sternuma i/ili kriste ilijake posterijor.

Preporučene kulture stanica koštane srži (KS) bez stanične su stimulacije i kratkotrajne su, tj. direktne,

24-satne ili nešto duže 48–72-satne kulture stanica. De-finiranim uzgojem stanica KS što ovisi o tipu leukemije (AML ili (ALL) dolazi se do metafaza i/ili interfaza koje se iskorištavaju različitim citogenetskim metodama. U kliničkoj dijagnostici hematoloških bolesti najčešće se primjenjuje konvencionalna metoda pruganja, metoda u kojoj se koristi boja Gimza i enzim tripsin (GTG). Pri-mjenom ove metode pruganja moguće je istražiti klo-nalne kromosomske promjene kako strukturne tako i numeričke. Metode konvencionalne – klasične cito-genetike iskorištavaju isključivo metafaze. Za metodu GTG- pruganja potrebne su metafaze zadovoljavajuće kvalitete i mitotskog indeksa, tj. broja metafaza. Pruga-njem kromosoma dobije se uvid u kompleksnost pro-mjena genoma, drugim riječima, konvencionalno pru-ganje kromosoma je morfološko-deskriptivna metoda i početak je svake citogenetske analize (slika 52.1.).

Molekularne citogenetske metode – Fluorescentna in situ hibridizacija Za razliku od konvencionalnalnih citogenetskih me-toda, molelularna metoda kao što je fluorescentna hibridizacija in situ osim metafaza može iskorištavati i interfezne stanice/ jezgre. Jedan od osnovni predu-vjeta za primjenu molekularne metode je sačuvani genom. Kada je genom sačuvan metode fluorescen-tne in situ hibridizacije mogu se primijeniti na arhi-

1

6

13

19 20 21 22 X Y

14 15 16 17 18

7 8 9 10 11 12

2 3 4 5

Slika 52.1. Metafaza i kariotip opisan metodom GTG-pruganja.


virane uzorke npr. parafinske rezove (slika 52.2.) ili citološke razmaze (slika 52.3.). Metodom FISH iden-tificiraju se strukturne, numeričke ali i kompleksne promjene genoma u bolesnika s AL-om.

Molekularne metode imaju veliku specifičnost i ve-liku osjetljivost i zato nam omogućuju identifikaciju gena, tj. dijelova gena koji su involvirani u onkoge-nezu. Osjetljivost FISH metode određena je uzorkom koji iskorištavamo ali i probom (sondom) koju ko-ristimo. Upravo radi toga raspon osjetljivosti se kre-će od 10-1 (metafazni, M- FISH) do 10-4 (interfazni,

I- FISH), a broj pogledanih stanica i/ili interfaznih jezgara može biti velik (200-300 i.j. ili veći).

Zahvaljujući upravo molekularnim metodama kao što je I-FISH mogu se pretraživati i dokazivati po-znate, specifične promjene genoma koje se nalaze u određenog morfološkog tipa/podtipa akutne le-ukemije.

AKUTNA LEUKEMIJALeukemije su neoplazme koje nastaju iz hematopoe-znih stanica i u početku proliferiraju u koštanoj srži, a zatim diseminiraju u perifernu krv, slezenu, jetru, limfne čvorove i na kraju u druga tkiva. Akutna leu-kemija (AL) sindrom je klonalnih zloćudnih bolesti matičnih hematopoeznih stanica. Promjene genoma koje se otkriju pri dijagnozi AL-a prate se u različitim fazama liječenja (remisija, relaps bolesti).

Za praćenje malignoga klona primjenjuju se prije svega metode koje imaju veliku osjetljivost i specifič-nost, a to su upravo metode molekularne biologije.

Kriterij za postavljanje dijagnoze akutne leukemije jest nalaz leukemijskih stanica u koštanoj srži, u pe-rifernoj krvi (PK) i u ekstramedularnim tkivima. Ko-štana srž obično je hipercelularna uz infiltraciju leu-kemijskih blasta i redukciju normalne hematopoeze.

Tradicionalno, podjela leukemija je polazila od mor-foloških značajki leukemijskih stanica, tj. koja je sta-nična loza zahvaćena, mijeloične ili limfocitne (Ta-blica 52.1.).

Najnovija podjela AL-a uključuje sve one kliničke, biološke i laboratorijske pokazatelje koji određuju i prognozu akutne leukemije (t – translokacija).

Akutna mijeloična leukemija – AMLPrema SZO-i iz 2001. i 2008. godine podjela AML uz fenotipska obilježja (morfologija, citokemija, imuno-fenotipizacija, citogenetika i molekularna) uključuje i prognozu akutne leukemije. To je prva podjela le-ukemija koja govori o važnosti promjena u genomu stanice pri postavljanju dijagnoze.

Temelj modernog pristupa podjeli AML je upravo obavezno pretraživanje genoma na poznate nam

Slika 52.2. Metoda I-FISH, amplifikacija N-MYC, parafinski rez

Slika 52.3. Metoda I-FISH na citološkom razmazu, CEP proba za kromosom 12, (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).


specifične promjene koje imaju dijagnostičku, tera-pijsku ali i prognostičku vrijednost.

Prema SZO, AML su podijeljene na 6 skupine (Tabli-ca 52.2.), a određene su veličinom tumorske mase (>20 % blasta u koštanoj srži, perifernoj krvi).

U prvoj skupini su AML-a s ponavljajućim (specifič-nim) citogenetskim promjenama, kao što su AML s translokacijom t(8;21)(q22;q22), AML1(CBF-alfa)/ETO, akutna promijelocitna leukemija s t(15;17)(q22;q11-12) i varijantama, PML/RAR-alfa, AML s eozinofilijom u koštanoj srži inv(16)(p13;q22) ili t(16;16)(p13;q11), CBF-beta/MYH11. Akutne mijelo-ične leukemije s tim promjenama ubrajaju se u sku-pinu AML povoljne prognoze za razliku od AML-e s promjenama lokusa 11q23 / MLL, promjene lokusa 3q26, te kompleksne promjene koje se ubrajaju u prognostički nepovoljnu skupinu AML-a. U drugoj podskupini su AML-e sa promjenama pridruženim mijelodisplaziji i njihova prognoza je loša. Sekundar-ne AML, treća podskupina leukemija, obično su po-sljedica kemoterapije. Taj tip AML-a ima nepovoljnu prognozu. Četvrta skupina su AML ne klasificirane drugačije, zatim skupina mijeloidni sarkom te mijelo-

idne proliferacije vezane uz Downov sindrom. Udio blasta u koštanoj srži ili perifernoj krvi potreban za postavljanje dijagnoze AML iznosi 20 % ili više mije-loblasta i/ili monoblasta/promonocita i/ili megakari-oblasta. U slučajevima kada je nađena specifična pro-mjena u kariotipu bolesnika s AML udio blasta može biti i manji od 20 %.

Podjela SZO-e na neki način je moderna nadopuna na staru francusko-američko-britansku podjelu (FAB).

Za rutinsku klasifikaciju AML još uvijek se uz novu podjelu SZO primjenjuje i FAB - citomorfološka kla-sifikacija. Zajednička francusko-američko-britanska skupina podijelila je AML u podtipove ovisno o stup-nju diferencijacije i sazrijevanja. Osnovni morfološki pokazatelj akutnih leukemija jest stanica tipa blasta

Tablica 52.1. Podjela AL prema morfološkim značajkama leukemijskih stanica (t = translokacija)

Leukemija Promjene Odrasli % Djeca %

ALL t (9;22)t (1;9)t (4;11)t (5;14)t (11;19)t (9;11)t (17;19)t (8;14)

25–402–35<1<1<1<14–5

4–65–62<1<1<1<11–2

ALL – (T-loza) -t (11;14)t (1;14)t (10;14)

10–305–101–31–3

20–305–101–31–3

AML t (8;21)t (15;17)inv (16)t (9;11)t (9;22)t (6;9)

5–105–105–101–51–3<1

5–105–105–105–10<1<1

Tablica 52.2. Podjela akutnih mijeloičnih leukemija – SZO

AML s ponavljajućim citogenetskim promjenama• AML s t(8;21)(q22;q22), (AML1/ETO;RUNX1-RUNX1T1)• Akutna promijelocitna leukemija AML s t(15;17)

(q22;q11-12) i varijantama, (PML/RAR-alfa)• AML s eozinofilijom u koštanoj srži inv(16)(p13;q22) ili

t(16;16)(p13;q11), (CBF-beta/MYH11)• AML s 11q23 (MLL) promjenom, t(9;11)

(p22;q23);MLLT3-MLL• AML s t(6;9)(p23;q34);DEK-NUP214• AML s inv(3)(q21;q26) ili t(3;3)(q21;q26); RPN1-EVI1• AML s mutacijom NPM1, AML s mutacijom CEBPAAML s znacima mijelodisplazije• AML iz prethodne mijelodisplazije• AML bez prethodne mijelodisplazijeAML – sekundarne nakon terapije• Nakon alkilirajućih tvari• Nakon epipodofilotoksina (neke ALL)• Ostale AMLAML koje nisu drugdje uvrštene• AML minimalno diferencirana (FAB – M0)• AML bez sazrijevanja (FAB – M1)• AML sa sazrijevanjem (FAB – M2)• Akutna mijelomonocitna leukemija (FAB – M4)• Akutna monocitna leukemija (FAB – M5a i M5b)• Akutna eritroidna leukemija (FAB – M6a i M6b)• Akutna megakariocitna leukemija (FAB – M7)• Akutna bazofilna leukemija• Akutna panmijeloza s mijelofibrozomMijeloični sarkomMijeloidne proliferacije u Downovom sindromuBlastična plazmocitoidna neoplazma dendritičkih stanica


koja predstavlja nediferenciranu ili slabo diferencira-nu stanicu krvotvornog tkiva.

Ono što je važno naglasiti, a to je da se u rutinskoj dijagnostici dokazuje i/ili isključuje postojanje spe-cifičnih promjena genoma u određenog tipa / pod-tipa AML. Upravo time napravljena je „privremena� poveznica između stare FAB podjele i nove podjele SZO.

Kao klonalni biljezi mogu se iskoristiti specifične citogenetske promjene koje nalazimo u određenih tipova/podtipova akutnih leukemija (Tablica 52.3.).

Ova podjela također potvrđuje vrijednost citogenet-skih promjena u dijagnostici, klasifikaciji, terapiji, ali i u prognozi bolesti.

Specifične kromosomske promjene imaju veliko kliničko značenje kao neovisni prognostički poka-zatelj. Upravo radi toga citogenetske se promjene dijele u povoljne, nepovoljne i u inermedijarne (Ta-blica 52.4.). Tako bolesnici s AML i citogenetskim

promjenama kao što su: t (8;21) u AML-M2, t (15;17) u AML-M3 i inv (16), t(16;16) u AML-M4 imaju dobru prognozu bolesti, što znači bolje preživljenje. Bole-snici s nepovoljnim citogenetskim promjenama prije ulaze u relaps bolesti (Slika 52.4.).

Citogenetske se promjene opisuju u oko 80 % bo-lesnika s AML-om. Kariotipske promjene mogu za-hvaćati samo jedan (u oko 55 % slučajeva) ili više kromosoma (oko 45 % slučajeva).

Primarne citogenetske promjene koje nalazimo u bo-lesnika s AML-om prikazuje tablica 52.5.

U većine bolesnika s AML-om kariotipska promjena zahvaća 8. kromosom. Translokacija t (8;21) ima do-bru prognozu u mlađih bolesnika s AML-M2 (slika 52.5. i 52.6.).

U oko 98 % bolesnika s AML-M3 nalazi se transloka-cija t (15;17).

Inverzija, odnosno delecija 16, del (16) nalazi se u oko 30 % bolesnika s AML-M4 (Slika 52.7.).

Tablica 52.3. Specifične kromosomske promjene u AML

Promjena Učestalost Leukemija Komentar

t (8;21)(q22;q22)t (15;17)(q22;q21)inv (16)(p13q22)t (9;11)(p22;q23)t (6;9)(p23;q32)inv (3)(q21q26)t (3;3)numeričke promjene +8,-5,-7delecije krom.5q-,-5,-7kompleksne

5-12 %97 %10 – 20 %

50 %3-5 %

40 %

40 %7-10 %<10 %

M2M3, M3vM4 s eozinofilijomM5M2, M4M5 s fagocitozomM1, M4, M6AML-svi podtipoviM4, M1 do M7AML-svi podtipovi

Dobra prognozaDobra prognozaDobra prognozaLoša prognozaLoša prognozaLoša prognozaLoša prognozaLoša prognozaLoša prognozaNepoznataLoša prognozaLoša prognoza

Tablica 52.4. Prognostičke skupine za AML

Povoljna Nepovoljna Intermedijarna

t (8 ;21) t (15;17)inv (16)t(16;16)

Dob < 50L < 30,000/µL

promjena kr. 5promjena kr. 7promjena 11q23promjene 3q21-26+8kompleksni kariotipDob > 60L > 30,000/µL

uredan nalaz ili druge neklasificirane promjene kariotipa


1

6

13

19 20 21 22 X Y

14 15 16 17 18

7 8 9 10 11 12

2 3 4 5 mar

Slika 52.5. Translokacija t (8;21) u AML-M2, metoda GTG pruganja

108968472604836241200

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

mjeseci

povoljna 56 %

intermedijarna 68 %

nepovoljna 82 %

vjer

ojat

nost

(%)

Slika 52.4. Vjerojatnost relapsa ispitanika s AML prema prognostičkim skupinama


Tablica 52.5. Primarne citogenetske promjene u bolesnika s AML-om

Kromosom Tip promjene Tip leukemije

1p361p11

t(1;13)(p36;q21)t(1;7)(p11;p11)

dismegakariopoezasek. AML, AML-4

2p21 t(2;11)(p21;q23) isto kao kromosom 1

3q213q21-253q21 i 3q26

t(1;3)(p21;q23)t(3;5)(q21-25;q31-35)ins(3;3)(q26;q21)inv(3)(q21q26)

isto kao kromosom 1abnormalni megakariociti i trombociti

55q5q31-35

-5del(5q)t(3;5)(q21-25;q31-35)

sek.AMLsek.AML

6p236q27

t(6;9)(p23;q34)(6;11)(

AML-2, AML-4 s bazofilijomAML-5, AML-5a

77p117q

-7t(1;7)(p11;p11)del(7q)

sek.AMListo kao kromosom 1sek.AML

88p118q22

+8t(8;16)(p11;p13)t(8;21)(q22;q22)

AML-5a s fagocitozomAML-2 s eozinofilijom

9p21-229q9q34

t(9;11)(p21-22;q32)del(9q)t(6;9)(p23;34)t(9;22)(q34q11)

AML-5, AML-5aAML-1, AML-2

11q13-1411q23

del/t(11)(q13-14)t(10;11)(p14;q13)del/t(11)(q23)t(2;11)(q27;q23)t(6;11)(q27;q23)t(9;11)(p21;q23)t(11;17)(q23;q25)t(11;19)(q23-q13)

AML-4, AML-5AML-4, AML-5, AML-5a

12p11-13 del/t(12p) sek.AMLAML-4, AML-2 s bazofilijom

15q22 t(15;17)(q22;q11-12) AML-3

16p1316p1316q22

t(8;16)(p11;p13)inv(16)(p13q22)t(16;16)(q22)del(16)(q22)

AML-4 s eozinofilijom

17p11-q1117q11-1217q25

i(17q)t(15;17)(q22;q11-q12)t(11;17)(q23;q25)

19p13 t(11;19)(q23;p13)

20q del(20q) AML-6

2121q22

+21t(8;21)(q22;q22)

22q1 t(9;22)(q34;q11)


Bolesnici u kojih se promjene nalaze na kromoso-mu 5 ili 7 imaju lošiju prognozu nego ostali bolesni-ci (Slika 52.8.) (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).

Akutna limfocitna leukemija – ALLPodjela akutne limfocitne leukemije prema SZO pri-kazuje tablica 52.6.

Numeričke kromosomske promjene sa strukturnim promjenama ili bez njih utvrđene su u oko 50 % bo-lesnika s ALL-om. Tablica 52.7. prikazuje učestalost numeričkih kromosomskih promjena u bolesnika s ALL-om.

U odraslih bolesnika najčešće se nalazi hiperdiplo-idija s 47–50 kromosoma, dok je u djece učestalija hiperdiploidija s više od 50 kromosoma. Prema re-zultatima dosadašnjih istraživanja, hiperdiploidija je povoljan prognostički činitelj za postizanje remisije te preživljenje bolesnika, osim ako uz hiperdiploidiju ne postoji i Philadelphija kromosom. U tom slučaju bolesnici imaju izrazito lošu prognozu (Slika 52.9.), (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).

LSI 5q31

Slika 52.8. Metoda FISH, lokus specifična proba, pozitivan nalaz del(5q31)

Slika 52.6. Metoda I-FISH, t (8;21), AML1/ETO, (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).

1

6

13

19 20 21 22 X Y

14 15 16 17 18

7 8 9 10 11 12

2 3 4 5 mar

Slika 52.7. Metoda GTG-pruganja, kariotip u bolesnika s AML-M4, 47, xx, inv(16), +21

Tablica 52.6. Podjela akutnih limfocitnih leukemija – SZO*

Prekursorske B – stanične ALL (citogenetske podskupine)• t (9;22)(q34;q11); BCR/ABL• t (v;11q23); preustroj MLL• t (1;19)(q23;p13); E2A/PBX1• t (12;21)(p12;q22); ETV/CBF-alphaPrekursorske T-stanične ALLAkutna leukemija Burkittovih stanica

SZO* Svjetska zdravstvena organizacija


Hiperdiploidija se nalazi u 2–8 % odraslih bolesnika. Bolesnici s gotovo haploidnim brojem kromosoma imaju samo numeričke promjene, dok bolesnici s modalnim brojem kromosoma između 30 i 44 imaju učestale strukturne promjene, mahom translokaci-je. U 50 % slučajeva riječ je o translokaciji t (9;22)(q34;q11) (Slika 52.10.), (Klinička jedinica za cito-

genetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bo-lesti, KBC Zagreb).

Prema dosadašnjim istraživanjima bolesnici s hipo-diploidijom imaju lošu prognozu. Pseudodiploidija se nalazi u oko 50 % odraslih bolesnika s ALL-om. Philadelphija kromosom nađe se u oko 40 % bole-snika s pseudodiploidijom, (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).

Strukturne se promjene nalaze u oko 78 % bolesnika u kojih su utvrđene numeričke kromosomske pro-mjene (Tablica 52.8.).

Tablica 52.7. Učestalost numeričkih kromosomskih promjena u bolesnika s ALL-om

Numeričke promjene Učestalost odrasli % Učestalost djeca %

uredan kariotip 26–34 8–56

hipodiploidija (<46 kromosoma) 2–8 5–6

Pseudodiploidija 7–59 3–42

hiperdiploidija (47–50 kromosoma) 7–17 8–16

hiperdiploidija (>50 kromosoma) 4–9 14–27

blizu triploidija 3 <1

blizu tetraploidija 2 1

Slika 52.9. Hiperdiploidija dokazana metodom GTG-pruganja (metafaza) i I-FISH

Slika 52.10. Translokacija t(9;22), BCR/ABL, dokazana metodom GTG-pruganja i FISH


U oko 30–40 % bolesnika utvrđeno je postoja-nje translokacije t (9;22)(q34;q11). U bolesnika s translokacijom t (4;11) i Ph kromosomom pri dija-gnozi nalazi se velik broj leukocita i blasta. Bolesnici s translokacijom t (8;14) i t (4;11), kao i bolesnici s promjenama 14q+ imaju veći rizik od zahvaćenosti središnjega živčanog sustava nego drugi bolesnici.

Ph kromosom nalazi se u 1–2 % bolesnika s AML-om i u 5 % djece s ALL-om i u 15–35 % odraslih s ALL-om. Gotovo svi slučajevi Ph pozitivnog ALL-a imaju pre-B-imunofenotip, dok su drugi imunofenotipovi rijetki. U 40–65 % bolesnika s Ph+ ALL uz limfoid-ne markere biljega prisutni su i mijeloidni markeri na površini stanica. Prema sadašnjim istraživanjima bolesnici s ALL-om u kojih je prisutan Ph kromosom imaju izrazito lošu prognozu.

Promjene 11q23 česte su citogenetske promjene u bolesnika sa zloćudnim hematološkim bolestima. U bolesnika s ALL-om promjene 11q23 nalaze se u oko 10 % bolesnika. Najčešće je riječ o translokaciji t (4;11)(q21;q23) i t (11;19)(q23;p13). Prema dosa-dašnjim rezultatima preživljenje bolesnika izrazito je loše zbog brzog relapsa bolesti nakon postizanja kompletne remisije (Slika 52.11.).

Promjene 19p13 su rijetke (<5 % odraslih bolesnika), ali su udružene s pre-B ALL, (Klinička jedinica za citogenetiku i FISH dijagnostiku hemato-onkoloških bolesti, KBC Zagreb).

Translokacija t (10;14)(q23;q11) dovodi do preured-be gena za T-stanični receptor. Ova se translokacija nalazi u 4–7 % bolesnika s T-ALL-om.

Translokacija t (8;14)(q24;q32) često je prisutna u bo-lesnika sa zrelim B-staničnim zloćudnim bolestima. Takva se translokacija nalazi u većine bolesnika s B-ALL-om i L3-morfologijom. Oko 85 % ima translo-kaciju t (8;14)(q24;q32), a ostatak translokaciju t (2;8)(p12;q24) i t (8;22)(q24;q11).

Izokromosom se nalazi u 7–9 % bolesnika s ALL-om. Najčešće je riječ o i (7q), i (9q), i (17q) i i (12q). Izo-kromosom i (7q) nalazi se pridružen drugim primar-nim citogenetskim promjenama kao što su t (4;11) ili der (19). Izokromosom i (9q) nalazi se u bolesnika s ALL-L2, pre-B-fenotipa.

Tablica 52.8. Učestalost strukturnih promjena u bolesni-ka s ALL-om

Kromosomska promjena

Učestalost Fenotip FAB

del(6q) <5 % B ili T L1, L2

i(6p) <5 % - -

i(7q) <5 % - -

7q32-35 <5 % T L1 > L2

t(1;7)(p32;q35)t(7;9)(q34;q32)t(7;10)(q35;q24)t(7;11)(q35;p13)

8q24t(2;8)(p12;q24)t(8;22)(q24;q11)

<3–5 % B L3

i (9q) <5 % Pre B L2

t(9;22)(q34;q11) 20–30 % Pre B L1, L2

del(9q)(p21-22) 7–15 % B ili T L1, L2

11q23 3–10 %

t(1;11)(p32;q23) Rana pre-B L1

t(4;11)(q21;q23) Bifenotipska L1, L2

t(10;11)(p12-14) L1, L2

12qt(9;12)(q34;p13)t(12;21)(p11;q22)

3–4 % Pre-B L1, L2

14q11t(1;14)(p32;q11)t(8;14)(q24;q11)t(10;14)(q24;q11)t(11;14)(p13;q11)Inv(14)(q11;q23)

<1 %3–7 %5–7 %<1 %

T L1 > L2

Slika 52.11. Metoda I-FISH, amplifikacija 11q23/MLL


Prema dosadašnjim podatcima, u djece se mogu de-finirani skupine bolesnika s citogenetskim promje-nama koje mogu imati dobru ili lošiju prognozu. Za odrasle bolesnike nema tako dobro definiranih sku-

pina. Prema dosadašnjim rezultatima, smatra se da, zbog vrlo loše prognoze, bolesnike s Ph+ ALL-om treba intenzivno liječiti.

Pitanja i odgovori

1. Koje se citogenetske metode koriste u dijagnostici akutnih leukemija?

GTG-pruganje, -konvencionalne metode i FISH.

2. Koja je specifična promjena za akutnu promijelocitnu leukeniju?

t(15;17).

3. Koje promjene su povoljne u akuntnim mijeloičnim leukemijama?

t(8;21), t(15;17), inv(16).

4. Promjena t(9;22) češća je u AML ili ALL?

U ALL.

5. Translokacija t(8;14) karakteristična je za koji tip ALL?

Burkittov limfom.

LITERATURAAnkathi R, Geetha N, Remani P. et al. Clinical implications of cytogenetic classification in adult acute lymphoblastic leuke-mia patients. J Cancer Res Clin Biol 1996;122:370-379.

Heim S, Mitelman F. Cancer Cytogenetic. New York, NY, Liss, 1987.

Martineau M, Clark R, Farrell DM. et al. Isocromosomes in acute lymphoblastic leukaemia: i(21q) is a significant finding. Genes Cromosomes cancer 1996;17:21-27.

Rabbits TH. Chromosomal translocations in human cancer. Nature 1994;372:143.

Schouten HC, van Putten WL, Hagemeier A. et al. The pro-gnostic significance of chromosomal findings in patients with acute myeloid leukaemia in a study comparing the efficacy of autologous and allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow 1991; 8:377.

Slovak ML, Kopecky KJ, Wolman SR, Henslee-Downey JP, Appelbaum FR, Forman SJ, Blume KG. Cytogenetics corre-lation with disease status and treatment out come in advan-ced stage leukemia post bone marrow transplantation: a Southwest Oncology Groupstudy (SWOG-8612) Leuk Res 1995;19(6):381-8.

Sullivan MP, Pullen Dj, Crist Wm. et. al. Clinical and biological heterogenity of childhood B cell acute lymphoblastic leuke-mia: Implications for clinical trials. Leukemia 1990;4:6-12.

Zhao L, Chang KS, Estey EH, Hayes K, Deisseroth AB, Li-ang JC. Detection of residual leukemic cells in patients with acute promyelocytic leukemia by the fluorescence in situ hybridisation method: potential for predicting relapse. Blood 1995;85:495.

501

Leukemije i limfomi klonalni su poremećaji hematopoezne stanice karakterizirani stečenim somatskim mu-tacijama. Otkriće molekularnih promjena promijenilo je razumijevanje genetičkih mehanizama uključenih u patogenezu zloćudnih hematoloških bolesti. U leukemijama je otkriveno više od 300 kromosomskih pore-mećaja, a više od 100 tih poremećaja do sada je klonirano i karakterizirano.

Molekularni poremećaji udruženi sa zloćudnim hematološkim bolestima uključuju:

• abnormalna genska premještanja uzrokovana kromosomskim translokacijama, inverzijama i duplikaci-jama s posljedicom aktivacije onkogena; rezultat preuredbe jest fuzijski protein ili poremećeni izražaj gena.

• mutacije i delecije tumorsupresorskih gena (npr. p53).

Dodatno, normalna genska premještanja kao u genima za lake i teške lance imunoglobulina i receptore na limfocitima T služe za dokazivanje klonalnosti koja korelira sa zloćudnošću.

Prva karakterizirana i klonirana kromosomska abnormalnost u leukemijama jest translokacija t(9;22), od-nosno fuzijski gen bcr/abl. Spajanje dijelova gena BCR i ABL uzrokuje aktivaciju gena ABL koja je potrebna i dovoljna za nastanak kronične mijeloične leukemije (KML). Translokacija t(9;22) nalazi se u više od 95 % slučajeva KML-a, ali taj poremećaj nije patognomoničan za KML jer je prisutan u 15–30 % odraslih i 5 % pedijatrijskih ALL-a te u 2 % AML-a. Translokacija t(9;22) recipročna je translokacija u kojoj se veliki dio protoonkogena Abelson (ABL) na položaju 9q34 postavlja unutar gena BCR na položaju 22q11, što rezul-tira nastankom fuzijskoga gena bcr/abl. Konačni je produkt fuzijski protein s povišenom tirozinkinaznom aktivnošću koji utječe na signalne putove unutar stanice uključene u kontrolu stanične smrti, proliferacije i međustanične adhezije. Molekularna masa nastaloga fuzijskog proteina iznosi od 190 do 230 kDa ovisno o mjestu loma u genu BCR. U KML-i lom se većinom zbiva u području m-bcr gena BCR, što ima kao posljedicu nastanak fuzijskoga prijepisa veličine 8,5 kb koji sadržava ekson b2 ili b3 gena BCR i ekson 2 gena ABL. Ova-

P o g l a v l j e 53.Molekularna dijagnostika zloćudnih

hematoloških bolestiRenata Zadro


kva mRNA kodira protein p210 (molekularne mase 210 kD). U 5 % slučajeva mogu se detektirati obje vrste prijepisa kao rezultat alternativnog cijepanja. U rijetkim slučajevima Philadelphia-pozitivne KML lom u genu BCR uključuje područje m-bcr, što ima kao posljedicu sintezu fuzijskoga proteina p190 ili pod-ručje μ-bcr s posljedičnim proteinom p230 s većom molekularnom masom.

KLASIFIKACIJA LEUKEMIJA I LIMFOMAPoznate genske promjene uključene su u podjelu akutnih leukemija i limfoidnih neoplazmi prema SZO. Karakterizacija poremećaja na molekularnoj razini važan je dio dijagnostičkog postupka u svrhu definicije rizika za recidiv bolesti te svrstavanje bo-lesnika u različite terapijske protokole.

Podjela prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji prepoznaje u AML osam podskupina (Tablica 53.1.).

Temeljem smjernica radne skupine za AML Europ-ske leukemijske mreže (ELN) definirano je nekoliko važnih nezavisnih prognostičkih pokazatelja: broj leukocita, razvoj AML iz mijelodisplazije ili AML sa znacima mijelodisplazije, prethodna terapija citosta-ticima drugog zloćudnog tumora i citogenetičke i molekularne promjene u leukemijskim stanicama. O navedenim prognostičkim pokazateljima ovisi inten-zitet odnosno agresivnost liječenja. Prognostičku vri-jednost genetičkih promjena prikazuje Tablica 53.2.

Revidirana podjela limfoidnih neoplazmi prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji uključuje podjelu na prekursorske limfoidne neoplazme, B-limfobla-stične leukemije/limfom (neklasificirane), B-lim-foblastične leukemije/limfom s povratnim citogene-tičkim poremećajima i T-limfoblastičnu leukemiju/limfom (Tablica 53.3.).

Većina B-staničnih limfoma te u manjem broju T-sta-ničnih limfoma karakterizirana je povratnim kromo-somskim translokacijama (Tablica 53.4.) koje uključuju gene za teške i lake lance imunoglobulina i T-stanič-ne receptore s različitim kromosomskim partnerima. Rezultat ovakvog poremećaja jest abnormalni izražaj protoonkogena. Jedan manji dio preuredbi rezultira

Tablica 53.1. Podjela akutnih mijeloičnih leukemija (AML) prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji

Akutna mijeloičnaleukemija s povratnim genetič-kim poremećajima• AML s t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1• AML s inv(16)(p13.1;q22) ili t(16;16)(p13.1;q22);

CBFB-MYH11• APL s t(15;17)(q22;q21); PML-RARA• AML s t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL• AML s t(6;9)(p23:q34); DEK-NUP214• AML s inv(3)(q21;q26.2) ili t(3;3)(q21;q25.2);

RPN1-EVI1• AML (megakariocitna) s t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1• Podtip: AML s mutiranim NPM1• Podtip: AML s mutiranom CEBPA

Akutna mijeloična leukemija sa znacima mijelodisplazij e

Mijeloidni zloćudni tumor nakon liječenja

Akutna mijeloična leukemija, koja nije drugdje uvrštena• AML s minimalnom diferencijacijom• AML bez sazrijevanja• AML sa sazrijevanjem• Akutna mijelomonocitna leukemija• Akutna monoblastna/monocitna leukemija• Akutna eritroidna leukemija• Čista eritroidna leukemija• Eritroleukemija, eritroidna/mijeloidna• Akutna megakarioblastna leukemija• Akutna bazofilna leukemija• Akutna panmijeloza s mijelofibrozom

(akutna mijelofibroza; akutna mijeloskleroza)

Mijeloični sarkom (ekstramedularni mijeloični tumor; granulocitni sarkom, klorom)

Mijeloidna proliferacija zbog Down-ovog sindroma• Prolazni poremećaj mijelopoeze

(prolazna mijeloproliferativna bolest)• Mijeloidna leukemija pridružena Down-ovom sindromu

Blastični plasmacitoidni zloćudni tumor dendritič-nih stanica

Akutne leukemije neodređene krvotvorne loze • Akutna nediferencirana leukemija• Akutna leukemija miješanog fenotipa s t(9;22)

(q34;q11.2); BCR-ABL1• Akutna leukemija miješanog fenotipa s t(v;11q23);

preustro j MLL • Akutna leukemija miješanog fenotipa, B/mijeloidna,

koja nije drugdje uvrštena• Akutna leukemija miješanog fenotipa, T/mijeloidna,

koja nije drugdje uvrštena• Podtip: Limfoblastična leukemija/ limfom stanica

prirodni h ubojica (engl. Natural killer)

Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti | 503

Tablica 53.3. Podjela akutnih limfoidnih leukemija prema Svjetskoj zdravstvenoj organizaciji

Prekursorske limfoidne neoplazme

B-limfoblastična leukemija/limfom, koja nije drugdje uvrštena

B-limfoblastična leukemija/limfom s povratnim citogenetičkim poremećajima• t(9;22) BCR/ABL1, 25 % odraslih, <5 % dječje B-ALL• t(v;11q23), preuredba 11q23, djeca <1 godine, povećana učestalost u odraslih• t(12;21) ETV6/RUNX1, 25 % dječeje B-ALL• hiperdiploidija, 25 % dječje B-ALL• hipodiploidija• t(5;14) IL3/IGH• t(1;19) E2A/PBX1

T-limfoblastična leukemija/limfom

Tablica 53.2. Prognostička vrijednost genetičkih poremećaja

Genetička skupina Podskupina

Povoljna t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1inv(16)(p13.1q22) ili t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11mutirani NPM1 bez FLT3-ITD (normalni kariotip)mutirana CEBPA (normalni kariotip)

Intermedijarna I mutirani NPM1 i FLT3-ITD (normalni kariotip)NPM1 divlji-tip i FLT3-ITD (normalni kariotip)NPM1 divlji-tip bez FLT3-ITD (normalni kariotip)

Intermedijarna II t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLLCitogenetičke promjene koje nisu povoljne ili nepovoljne

Nepovoljna inv(3)(q21q26.2) ili t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214t(v;11)(v;q23); preuredba MLL -5 or del(5q); -7; promjena(17p); kompleksni kariotip

Tablica 53.4. Kromosomski poremećaji u NHL

Histološki tip Translokacija Uključeni geni Molekularna analiza

MCL t(11;14)(q13;q32) BCL1 IgH FISH, PCR

FL>DLCL t(14;18)(q32;q21) BCL2 IgH PCR, FISH

KLL/SLL t(14;19)(q32;q13) BCL3 IgH FISH

DLCL>FL t(3;14)(q27;q32) BCL6 IgH FISH

ALCL t(2;5)(p23;q35) NPM ALK RT-PCR

LPL t(9;14)(p13;q32) PAX5 IgH FISH

MALT t(11;18)(q21;q21) API2 MALT1 PCR

MCL – limfom stanica zone plašta; FL – folikularni limfom; DLCL – difuzni limfom velikih stanica; KLL/SLL – kronična limfoidna leuke-mia/limfom malih limfocita; ALCL – anaplastični limfom velikih stanica; LPL – limfoplazmocitoidni limfom; FISH – fluorescentna in situ hibridizacija; (RT) - PCR – (reverzna transkripcija) – lančana reakcija polimerazom


stvaranjem novoga fuzijskog proteina. Aneuploidija i delecija specifičnih kromosomskih područja sekun-darni su događaji koji nisu specifični za pojedinu vrstu limfoma, ali su vrijedna prognostička informacija.

METODOLOŠKI PRISTUPI U OTKRIVANJU MOLEKULARNIH POREMEĆAJA UDRUŽENIH S LEUKEMIJAMA I LIMFOMIMAZloćudne se hematološke bolesti dijagnosticiraju na osnovi stanične morfologije i površinskih biljega, imunohistokemije i citogenetičkih abnormalnosti. U tablici 53.5. navedene su tehnike koje se rabe u molekularnoj dijagnostici hemoblastoza, a u tablici 53.6. prikazana je usporedba osjetljivosti različitih metoda detekcije.

Reverzna transkripcija/lančana reakcija polimerazom (RT-PCR) tehnika je otkrivanja vrlo malih količina specifičnih fuzijskih prijepisa, rabi se u rutinskoj mo-lekularnoj dijagnostici te za procjenu odgovora na terapiju. Kvantitativni RT-PCR određuje broj kopija DNA te je osobito koristan za utvrđivanje minimalne ostatne bolesti.

Minimalna ostatna bolestIako mnogi bolesnici postižu potpunu hematološku remisiju te remisiju prema morfološkim i imunološ-kim kriterijima, u određenog broja bolesnika doći će do recidiva bolesti. Populacija zloćudnih stanica pri-sutna u malom broju ispod granice osjetljivosti stan-dardnih tehnika razlog je recidiva bolesti i naziva se minimalnom ostatnom bolesti. Mnoga su istraživanja pokazala da je otkrivanje i kvantifikacija ostatnih tu-morskih stanica u značajnoj sprezi s kliničkim isho-dom bolesti. Kvantitativno mjerenje smanjenja broja leukemijskih stanica tijekom početne faze liječenja ima visoku prognostičku vrijednost.

Metode otkrivanja minimalne ostatne bolesti uključu-ju tehnologije za otkrivanje ostatnih zloćudnih stanica ispod praga osjetljivosti konvencionalnih metoda (Ta-blica 53.6.). Tehnike za otkrivanje minimalne ostatne bolesti trebaju imati osjetljivost u rasponu 105–106. Metode koje se osnivaju na lančanoj reakciji polime-razom najprihvatljivije su za utvrđivanje minimalne ostatne bolesti, a kvantifikacija ostatne bolesti pojed-nostavnjena je uvođenjem automatizirane tehnologije PCR-a u stvarnom vremenu (engl. real-time PCR).

Genski čipoviPosljednjih su 10-ak godina istraživanja uporabom genskih čipova pridonijela detaljnijoj molekularnoj podjeli zloćudnih hematoloških bolesti. Navedenom se tehnologijom dobiva na brz i reproducibilan na-čin kvantitativni podatak o izražaju tisuća gena. U ta-kvim se pokusima sonde DNA nanose na staklenu ili silikonsku podlogu ili najlonsku membranu, a ciljne

Tablica 53.5. Tehnike u molekularnoj dijagnostici zlo-ćudnih hematoloških poremećaja

Tehnike probiranja kromosomskih poremećaja u genomu• “multikolor� fluorescentna in situ hibridizacija (FISH)• komparativna genomska hibridizacija

Analize ciljanih kromosomskih poremećaja• lančana reakcija polimerazom analize DNA (PCR)• reverzna transkripcija-lančana reakcija polimerazom

analize RNA (RT-PCR)• PCR u stvarnom vremenu (engl. real-time PCR)• PCR-SSP (genotipizacija polimorfizma jednog nukleotida)• FISH

Analize praćenja minimalne ostatne bolesti• nested PCR (dvostruko umnožavanje)• kvantitativni PCR (Q-PCR ili Q-RT-PCR)

Analize profila izražaja gena• globalni• specifični• umnožene RNA s rezova tkiva

Tablica 53.6. Osjetljivost različitih metoda detekcije

Metoda Osjetljivost (1 stanica/n stanica)

Citogenetika 1/25

Interfazni FISH 1/500

Imunofenotipizacija 1/102 – 104

Nested PCR 1/103 – 106

Real time PCR 1/103 – 105

Mikrosateliti PCR 1/102 – 104

Molekularna dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti | 505

se probe cDNA ili cRNA označene fluorescentnom bojom ili biotinom hibridiziraju te mjeri intenzitet fluorescencije svake sonde.

S pomoću mikropostroja moguće je utvrditi profil izražaja gena karakterističan za pojedinu podskupi-nu AML i ALL. Pokazano je da su tipični profili izra-žaja gena povezani s pojedinim kariotipom u AML; izražaj gena u ALL s preuredbom gena MLL razlikuje se od ALL i AML bez preuredbe gena MLL. U ALL, prema profilu izražaja gena razlikuju se T-ALL, hi-perploidna, te akutne limfoidne leukemije s preured-bom MLL, BCR/ABL1, TEL/ANL-1, E2A/PBX1 i nova podskupina ALL.

Difuzni limfom velikih stanica zloćudna je hemato-loška bolest u kojoj nije bilo moguće odrediti pod-

skupine na osnovi morfologije stanica. Uporabom mikropostroja DNA otkrivena su dva molekularno različita oblika DLBCL-a s profilom izražaja gena ka-rakterističnim za različite stadije diferencijacije lim-focita B: profil izražaja gena karakterističan za stani-ce limfocita B germinativnog centra (GC-DLBCL) te geni koji se normalno induciraju tijekom aktivacije in vitro limfocita B periferne krvi (PB-DLBCL). Po-kazano je da povoljniji ishod bolesti imaju oni bo-lesnici u kojih je profilom izražaja gena utvrđen tip GC-DLBCL.

Profil izražaja gena pomaže u području klasifikacije zloćudnih hematoloških bolesti i u predviđanju is-hoda, što omogućuje prilagodbu i raniju primjenu terapije u korist svakoga pojedinog bolesnika.

LITERATURABahloul M, Asnafi V, Macintyre E. Clinical impact of molecu-lar diagnostics in low-grade lymphoma. Best Pract Res Clin Haematol 2005;18:97-111.

Bench AJ. The role of molecular genetic analysis within the diagnostic haemato-oncology laboratory. Intl J Lab Hematol 2011;34:21-34.

Campo E, Swerdlow SH, Harris NL, Pileri S, Stein H, Jaffe ES. The 2008 WHO classification of lymphoid neoplasms and beyond: evolving concepts and practical applications. Blood 2011;117:5019-32.

Dietel M, Sers C. Personalized medicine and development of targeted therapies: the upcoming challenge for diagnostic molecular pathology. A review. Virchows Arch 2006;448:744-55.

Döhner H, Estey EH, Amadori S, Appelbaum FR, Büchner T, Burnett AK, et al. Diagnosis and management of acute myelo-id leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 2010;115:453-74.

Hubank M. Gene expression profiling and its application in studies of haematological malignancy. Brit J Haematol 2004;124:577-94.

Rumpold H, Webersinke G. Molecular pathogenesis of Phi-ladelphia positive chronic myeloid leukemia – is it all BCR-ABL? Curr Cancer Drug Targets 2011;11:3-19.


Pitanja i odgovori

1. Na čemu se osniva laboratorijska dijagnostika zloćudnih hematoloških bolesti?

Stanična morfologija, površinski biljezi na stanicama, imunohistokemijska analiza i citogenetičke i molekularne abnormalnosti.

2. Koliko različitih fuzijskih proteina može nastati kao posljedica translokacije t(9;22) u kroničnoj mijeloičnoj leukemiji?

p210, p230 i p190.

3. Koje su prognostički povoljne genetičke promjene u akutnim mijeloičnim leukemijama?

t(8;21), inv(16), mutirani NPM1 i CEBPA bez mutiranog FLT3.

4. Koja je laboratorijska metoda najosjetljivija u otkrivanju fuzijskih prijepisa u leukemijama i limfomima?

Nested PCR ili kvantitativni PCR.

5. Koje su prednosti uporabe mikropostroja u hemato-onkologiji?

Kvantitativni podatak o izražaju velikog broja gena, detaljna molekularna podjela, predviđanje ishoda bolesti, prilagodba terapije.

507

Primarne imunodeficijencije nasljedni su poremećaji razvoja i/ili funkcije imunosnog sustava. Danas je poznato oko 200 različitih oblika primarnih imunodeficijencija, a definirano je više od 150 mutacija gena. Incidencija je oko 10 na 100000 živorođenih. Znatno je veća incidencija u populacijama s visokom stopom konsangviniteta, kao i u genetski izoliranih populacija. Primarne imunodeficijencije klasificirane su u osam skupina, ovisno o dijelu imunosnog sustava koji ima poremećenu funkciju (tablica 54.1.). U kliničkoj slici prevladavaju rekurentne, teške infekcije i infekcije oportunističkim uzročnicima. Ovisno o dijelu imuno-snog sustava koji je zahvaćen poremećajem postoji sklonost infekcijama određenim uzročnicima (tablica 54.4.). Neke primarne imunodeficijencije obilježene su poremećajem imune regulacije, a u nekim sindro-mima poremećaj imunosti samo je jedan dio kliničke slike. Prema podacima Europskog registra primarnih imunodeficijencija (ESID) najčešće su primarne imunodeficijencije s poremećajem produkcije protutijela koje čine više od 50 % bolesnika. Slijede po učestalosti poremećaji stanične imunosti, poremećaji broja i funkcije granulocita i drugi dobro definirani sindromi imunodeficijencije. Bolesnici s imunodeficijencijama češće obolijevaju od autoimunih i malignih bolesti. Broj dijagnosticiranih bolesnika manji je od očekivane incidencije, posebice u nekim sredinama. Stoga se pokušava edukacijama liječnika, ali i javno zdravstvenim mjerama poboljšati informiranost o tim bolestima. Rana, odnosno pravovremena dijagnoza ključna je za svakog bolesnika jer o tome ovisi kvaliteta njihova života i životna prognoza. Posebice je važno prepoznati bolesnike s najtežim oblicima primarnih imunodeficijencija, npr. s teškom kombiniranom imunodeficijen-cijom (SCID) obzirom da je ishod liječenja transplantacijom krvotvornih matičnih stanica znatno povoljniji u djece mlađe od 3 mjeseca, odnosno u djece koja nisu imale ozbiljnih komplikacija, posebice infekcija. Na poremećaj imunosti treba posumnjati u djeteta, odnosno odrasle osobe koja ima rekuretne, teške infekcije koje ne reagiraju na uobičajeno antimikrobno liječenje, odnosno infekcije uzrokovane oportunističkim uzročnicima infekcija.

P o g l a v l j e 54.Primarne imunodeficijencije

Jadranka Kelečić, Ana Merkler


KLINIČKA SLIKAPodjela imunodeficijencija Osnovna podjela imunodeficijencija temeljena je na dijelu imunološkog sustava koji je zahvaćen po-remećajem (tablica 54.1.). Na osnovu kliničke pre-zentacije, odnosno anamneze, kliničkog nalaza, in-fekcija i drugih simptoma može se posumnjati na dio imunološkog sustava u kojem se nalazi poreme-

ćaj. Posebnu pozornost treba obratiti na bolesnika u kojega se nađu dva ili više znakova koji ukazuju na mogući poremećaj imunosti (The Jeffrey Modell Foundation warning signs for PID, Tablica 54.2. i 54.3.). Uz težinu i lokalizaciju infekcija uzročnici in-fekcija značajan su čimbenik na osnovu kojega se može posumnjati na određeni poremećaj imunosti (Tablica 54.4.).

Tablica 54.1. Podjela imunodeficijencija (Intenational Union of Immunological Societies Expert Committee on Primary Immunodeficiency, 2009.)

Poremećaji produkcije protutijela: XLA (Spolno vezana agamaglobulinemija), CVID (Obična varijabilna imunodefici-jencija), prolazna hipogamaglobulinemija ranog djetinjstva, manjak podrazreda IgG

Kombinirane stanično-humoralne imunodeficijencije: SCID (Teška kombinirana imunodeficijencija), Retikularna disgeneza, CD40 ligand deficijencija, deficijencija klase II MHC

Dobro definirani sindromi imunodeficijencije: Wiskott-Aldrichov sindrom (WAS), teleangiektatična ataksija (AT), Nijmegen breakage sindrom, Bloom sindrom, Hiper IgE sindrom, Comel-Netherton sindrom

Bolesti uzrokovane imunosnom disregulacijom: Obiteljska hemofagocitna limfohistiocitoza (FHL), Limfoproliferativ-ni sindromi (XLP, ALPS), Griscelli sindrom, Hermansky-Pudlak sindrom

Prirođeni poremećaji broja ili funkcije fagocita: Teška kongenitalna neutropenija (SCN), Ciklička neutropenija (CN), Kronična granulomatozna bolest (CGD), Schwachman-Diamond sindrom

Poremećaji urođene imunosti: anhidrotska ektodermalna displazija s imunodeficijencijom, HSE (herpes simpleks viru-sni encefalitis), kronična mukokutana kandidijaza, IRAK-4

Autoinflamatorni poremećaji. Obiteljska mediteranska groznica, Hiper IgD sindrom, Blau sindrom

Deficijencije komplementa : C1 inhibitor deficijencija, C1q deficijencija, properdin deficijencija

Tablica 54.2. Deset znakova koji ukazuju na primarnu imunodeficijenciju u djece

Četiri ili više upala srednjeg uha tijekom godine dana

Dvije ili više ozbiljnih upala sinusa u godinu dana

Liječenje antibioticima tijekom 2 ili više mjeseci bez povoljno g učinka

Dvije ili više upala pluća tijekom godine dana

Nenapredovanje na tjelesnoj težini ili usporen rast

Ponavljani apscesi kože ili unutarnjih organa

Uporni mlječac (soor) ili gljivična infekcija kože

Infekcije koje se moraju liječiti parenteralnom primjenom antimikrobnih lijekova

Dvije ili više teških infekcija (meningitis, celulitis, sepsa)

Primarna imunodeficijencija u obitelji

(Jeffrey Modell Foundation warning signs for PID)

Tablica 54.3. Deset znakova koji ukazuju na primarnu imunodeficijenciju u odraslih

Dvije ili više upala srednjeg uha tijekom godine dana

Dvije ili više upala sinusa tijekom godine dana u bolesnik a bez atopije

Jedna upala pluća godišnje tijekom nekoliko godina

Kronični proljev i gubitak tjelesne težine

Ponavljane virusne infekcije (prehlade, herpes, bradavice, kondilomi)

Opetovana potreba za liječenjem infekcija intravenskim antibioticima

Opetovani apscesi kože ili unutarnjih organa

Uporni osip ili gljivična infekcija kože

Infekcije inače nepatogenim mikobakterijama

Primarna imunodeficijencija u obitelji

(Jeffrey Modell Foundation warning signs for PID)

Primarne imunodeficijencije | 509

Anamnestički podaci koji ukazuju na mogući poremećaj imunosti:

• rekurentne bakterijske infekcije

• rekurentne infekcije uzrokovane istim uzročnikom

• dvije ili više teških infekcija (sepsa, meningitis, pneumonija, peritonitis, osteomijelitis)

• infekcije uzrokovane oportunističkim uzročnicima

• atipična klinička slika infekcije

• neodgovarajući odgovor na uobičajeno antmi-krobno liječenje

• apscesi unutarnjih organa ili rekurentni apscesi potkožnog tkiva

• kronični proljev

• nenapredovanje

• tvrdokorna kandidijaza kože i sluznica (soor)

• zakašnjelo otpadanje pupčanog bataljka (>4 tjedna)

• kasno nicanje mliječnih zubi

• pojava bradavica otpornih na uobičajeno liječenje

• bronhiektazije nejasnog uzroka i nekontrolora-na opstruktivna plućna bolest

• atipična autoimuna bolest i/ili limfoproliferacija

• podatak o imunodeficijenciji, neobjašnjenoj smrti malog djeteta ili konsangvinitetu u obitelji

Klinički nalazi koji ukazuju na mogući poreme-ćaj imunosti:

• odsutnost limfnog tkiva (tonzile, limfni čvorovi)

• limfadenopatija

• organomegalija

• gingivitis, ulkusi usne šupljine, afte

• teško cijeljenje rana

• telangiektazija, ataksija

• parcijalni albinizam, promijenjena struktura vlasi

• kronični ekcem, dermatitis

• batičanje prstiju

• vaskulitis

• dizmorfija, posebice anomalije lica i mikrocefalija

Tablica 54.4. Infekcije povezane s glavnim skupinama primarnih imunodeficijencija

Uzročnik Humoralne ID CIDs Poremećaj fagocita Poremećaj komplementa

Virusi Enterovirusi Svi, posebiceCMV, RSV, EBV,Parainfluenza tip 3

Ne Ne

Bakterije S. pneumoniae,H. influenzae,Moraxella catarr.,P. aeruginosa,S. aureus,N. meningitidis,M. pneumoniae

Kao kod humoralnihID, ali i:Salmonella typhi,Listeria monocytogenes,crijevne bakterije

S. aureus,P. aeruginosa, Nocardia asteroides,Salmonella typhi

Kao kod humoralnih ID,posebice N. meningitidis

Mikobakterije Ne Netuberkulozne,uključujući BCG

Netuberkulozne,uključujući BCG

Ne

Gljive Ne Candida species,Aspergillus species,Cryptococcusneoformans,HistoplasmaCapsulatum,PneumocystisJiroveci

Candida species,Aspergillus species

Ne

Protozoe GiardiaLamblia

Toxoplasma gondii,Cryptosporidium parvum

Ne Ne

(JACI 2010;125:S182-94)


PRIMARNE IMUNODEFICIJENCJE S POREMEĆAJEM PRODUKCIJE PROTUTIJELAPrimarne imunodeficijencije s poremećajem pro-dukcije protutijela najčešće su primarne imunode-ficijencije koje se mogu dijagnosticirati kako u do-jenačkoj, tako i u kasnoj životnoj dobi. Poremećaji produkcije protutijela čine 50 do 70 % primarnih imunodeficijencija. Klinički su obilježene ponav-ljanim, najčešće bakterijskim infekcijama dišnog i probavnog sustava, te kože. Uz infekcije, u bole-snika s humoralnim imunodeficijencijama postoji sklonost razvoju autoimunih i malignih bolesti. Ma-ligne bolesti javljaju se s većom učestalošću u bo-lesnika s CVID-om i XLA-om, a rijetko u bolesnika sa selektivnim manjkom IgA i deficijencijama IgG podrazreda.

Kongenitalna agamaglobulinemija najčešće se pre-zentira ponavljanim infekcijama dišnog sustava obič-no u razdoblju nakon 3. mjeseca života do 2. godine. Sklonost bakterijskim infekcijama uzrokovana je gu-bitkom zaštitnih protutijela dobivenih od majke uz nemogućnost produkcije vlastitih protutijela. U tih su bolesnika značajno snižene razine svih razreda imunoglobulina, a analizom subpopulacija limfocita periferne krvi ne nalaze se biljezi B-limfocita (CD19/CD20). Moguća je genomska analiza kojom se u 85 % bolesnika s agamaglobulinemijom nalazi mutacija u genu za Brutonovu tirozin kinazu koja je uzrok spolno vezane agamaglobulinemije (XLA).

Prolazna hipogamaglobulinemija ranog djetinjstva blagog je kliničkog tijeka, iako i ti bolesnici mogu obolijevati od teških infekcija. U laboratorijskim na-lazima nalazi se snižena razina imunoglobulina G i A uz uredan broj B limfocita. Nadomjesno liječenje imunoglobulinima indicirano je u tih bolesnika ako je razina IgG < 3,5 g/L.

Obična varijabilna imunodeficijencija (CVID) naj-češća je simptomatska humoralna imunodeficijencija s incidencijom od 1:10000 do 1:50000. Do sada je nađeno nekoliko mutacija koje su odgovorne za po-remećaj funkcije B limfocita, ICOS, BAFF-R, TACI, te

manjak MSH5. Broj B limfocita može biti normalan ili snižen. Razina serumskog IgG snižena je za više od 2 standardne devijacije od očekivane, kao i razina IgA, a u nekih je bolesnika snižena i razina IgM. Dijagno-za bolesti obično se postavi u kasnom djetinjstvu ili mladosti, no simptomi se mogu pojaviti u bilo kojem životnom razdoblju. Klinička slika obilježena je reku-rentnim bakterijskim infekcijama dišnog i probavnog sustava. Bolesnici s običnom varijabilnom imunode-ficijencijom imaju povećan rizik razvoja malignih bo-lesti, posebice NHL i karcinoma želuca.

KOMBINIRANE STANIČNO-HUMORALNE IMUNODEFICIJENCIJETeška kombinirana imunodeficijencija (SCID) jedna je od najtežih primarnih imunodeficijencija. Nekoli-ko različitih mutacija uzrok je udruženog poremeća-ja stanične i humoralne imunosti. Bolest je klinički obilježena teškim, rekurentnim, odnosno perzisten-tnim bakterijskim, gljivičnim i virusnim infekcijama, nenapredovanjem, kroničnim proljevom, osipom. Najvažnije obilježje SCID-a je izrazito snižen broj T limfocita, udružen sa značajnom hipogamaglobuli-nemijom ili agamaglobulinemijom. Iako je T-limfo-penija jedno od najvažnijih obilježja teške kombini-rane imunodeficijencije u nekih oblika bolesti njihov broj može biti normalan, ili čak povećan, kao npr. kod Ommenovog sindroma ili u slučaju značajnog prolaza majčinih limfocita u tijeku trudnoće koji mogu biti uzrokom GVHD-a. Na poremećaj stanične imunosti treba posumnjati djece s apsolutnim bro-jem limfocita < 2500. Kliničku sliku SCID-a uzrokuje nekoliko različitih mutacija, a već nalaz limfocitnih subpopulacija može nas uputiti na mogući genski poremećaj. Bez liječenja transplantacijom krvotvor-nim matičnim stanica ili genskog liječenja, koje je moguće za bolesnike s X-SCID-om, te bolesnike s nedostatkom adenozin deaminaze (ADA-SCID) ti bolesnici umiru u ranom djetinjstvu. Za ishod lije-čenja presudna je rana, odnosno pravovremena di-jagnoza jer je npr. znatno uspješnije liječenje tran-splantacijom krvotvornih matičnih stanica u djece s


teškom kombiniranom imunodeficijencijom koja su liječena u prva 3 mjeseca života (preživljenje 95 %), nego u kasnijoj dobi, kada komplikacije, najčešće infekcije znatno smanjuju povoljan ishod liječenja (preživljenje 60 do 70 %).

DOBRO DEFINIRANI SINDROMI IMUNODEFICIJENCIJEWiskott-Aldrich sindrom (WAS), teleangiektatična ataksija (AT), Nijmegen breakage sindrom (NBS), Bloom sindrom, Hiper IgE sindrom, Comel-Nether-ton sindrom neki su od dobro definiranih sindroma obilježje kojih je, uz druge poremećaje, poremećaj imunosti.

Teleangiektatična ataksija (AT) je autosomno rece-sivna bolest čiji je uzrok mutacija u ATM genu, prote-in kinazi koja sudjeluje u popravku DNA. Klinički se manifestira progresivnom cerebelarnom ataksijom, okulokutanom telangiektazijom i imunodeficijenci-jom. Ataksija se javlja u ranom djetinjstvu, dok se karakterističan znak, okulokutana telangiektazija obično javlja u dobi od 4 do 6 godina. Neki bole-snici nemaju infekcije, niti poremećaje imunosti. U bolesnika s tipičnom kliničkom slikom može se naći poremećaj humoralne imunosti, stanične imunosti, ili njihova kombinacija. Najčešće se nalazi snižena razina IgA, IgG2, IgG4, te ponekad limfopenija. U oko 10 % AT- bolesnika bolest se u ranoj fazi može manifestirati teškim infekcijama, povišenom ili nor-malnom razinom IgM uz sniženu razinu IgG i IgA, odnosno kliničkom slikom hiper-IgM sindroma. AT je imunodeficijencija s najvećim rizikom razvoja ma-ligne bolesti od svih imunodeficijencija. Sklonost razvoju malignih bolesti vezana je uz brojne translo-kacije i lomove kromosoma.

Nijmegen breakage sindrom (NBS) rijetka je auto-somno recesivna bolest koja se klinički manifestira mikrocefalijom, nestabilnošću kromosoma, poveća-nom osjetljivošću na ionizirajuće zračenje, imunode-ficijencijom i velikom sklonosti razvoja malignih bo-lesti limfnoga tkiva. Iako se javlja u cijelome svijetu češća je u srednjoj i istočnoj Europi.

POREMEĆAJI IMUNOSNE REGULACIJEU bolesnika s poremećajem imunosne regulacije po-većana osjetljivost na infekcije nije glavni problem.

Spolno vezani limfoproliferativni sindrom (XLP) rijetka je imunodeficijencija koja se klinički najčešće manifestira kao fulminantna infekcija Eb-stein - Barrovim virusom, disgamaglubulinemijom i limfomom. Klinička slika fulminantne infekciozne mononukleoze posljedica je neadekvatnog imuno-loškog odgovora na EBV infekciju koja je obilježena nekontroliranim brojem EBV inficiranih B limfocita, CD8+ T limfocita i makrofaga, te često i znakovima hemofagocitne limfohistiocitoze. Druga uobičajena manifestacija XLP je poremećaj humoralne imunosti praćen limfoproliferacijom B stanica. Ponekad, no vrlo rijetko bolest se može manifestirati kao auto-imuni poremećaj, aplastična anemija, plućna limfo-idna granulomatoza. XLP je uzrokovan mutacijom SH2DIA. U XLP bolesnika s tom mutacijom znatno je povećan rizik razvoja Non Hodgkin B staničnog limfoma ili drugih limfoproliferativnih bolesti. Među-tim, u nekih bolesnika nema dokaza EBV infekcije, pa se može pretpostaviti da je sam genski poremećaj uzrok razvoja limfoma. Izlječenje bolesti moguće je jedino transplantacijom krvotvornih matičnih stani-ca. Transplantacijom krvotvornih matičnih stanica treba liječiti i asimptomatske bolesnike koji imaju HLA podudarnog srodnog davatelja, kao i bolesni-ke s HLP čija je bolest kontrolirana kemo i imuno-terapijom. Prije transplantacije krvotvornih matičnih stanica bolesnici s XLP mogu se liječiti kombinaci-jom IVIG-a i rituximaba kako bi se prevenirala EBV infekcija.

Autoimuni limfoproliferativni sindrom (ALPS) klinički obilježava nemaligna limfoproliferacija (lim-fadenopatija i/ili splenomegalija koja je prisutna više od 6 mjeseci) i autoimune citopenije. ALPS je uzro-kovan poremećajem apoptoze limfocita. U perifer-noj krvi nalazi se povećan udio CD4-CD8- dvostruko negativnih T limfocita. Konačna dijagnoza postavlja se analizom ekspresije Fas (CD95) i molekularnom genomskom analizom.


POREMEĆAJI BROJA ILI FUNKCIJE GRANULOCITANa taj poremećaj upućuju piogene infekcije, reku-rentne infekcije uha, nosa i ždrijela, infekcije donjih dišnih puteva, i znatno rjeđe oportunističke gljivične infekcije, u prvom redu Aspegillusom. Kod sniženog broja granulocita (apsolutni broj granulocita<1500) diferencijalno dijagnostički treba razmišljati o auto-imunoj neutropeniji, dijagnoza koje se može potvr-diti nalazom antigranulocitnih protutijela, benignoj neutropeniji dojenačke dobi, cikličkoj neutropeniji i najtežem obliku, kongenitalnoj neutropeniji. Kada je broj granulocita uredan treba posumnjati na pore-mećaj njihove funkcije, što se ovisno o poremećaju može dokazati analizom respiracijskog praska, testo-va fagocitoze i konačno molekularnom genomskom analizom.

Teška kongenitalna neutropenija (SCN) genetski je heterogena bolest, ali ima zajednička hematološka i klinička obilježja. Nasljeđuje se autosomno domi-nantno u oko 60 % bolesnika ili autosomno recesiv-no u otprilike 30 % bolesnika. Klinički je definirana zastojem u sazrijevanju mijelopoeze na nivou mijelo-cita/promijelocita, te brojem neutrofilnih granulocita u perifernoj krvi manjim od 0,5x109/L. U kliničkoj slici dominiraju teške bakterijske infekcije od rane dječje dobi. Autosomno recesivni oblik bolesti prvi je opisao Rolf Kostmann 1956.godine. Prije nekoli-ko godina otkriveno je da je uzrok bolesti u autoso-mno recesivno nasljednoj kongenitalnoj neutropeniji mutacija u HAX1 genu. Najčešća mutacija, nađena u oko 50-60 % bolesnika s teškom kongenitalnom neutropenijom je mutacija gena koji kodira netrofil-nu elastazu 2 (ELA 2). U određenog broja bolesnika nije nađena nijedna od poznatih mutacija. Moguć-nost liječenja bolesnika s SCN-om primjenom čim-benika stimulacije granulocitopoeze (G-CSF) koja je moguća od 1987.godine znatno je poboljšan ishod liječenja i kvaliteta života tih bolesnika. Primjenom G-CSF-a povoljan terapijski učinak, odnosno porast apsolutnog broja neutrofilnih granulocita na više od 1,0x109/L postiže se u više od 90 % bolesnika. Većina bolesnika reagira na doze G-CSF-a koje su manje od

25 µg/kg/d, a doza kojom se postiže apsolutni broj neutrofila veći od 1,0x109/L varira od 1 do 120 µg/kg/d. Za bolesnike kod kojih nema povoljnog tera-pijskog odgovora na G-CSF liječenje izbora je alo-gena transplantacija krvotvornih matičnih stanica. Transplantacija krvotvornih matičnih stanica terapij-ska je opcija i u bolesnika sa SCN-om kod kojih je došlo do transformacije u mijelodisplastični sindrom (MDS/leukemija). Bolesnici sa SCN-om imaju znatan rizik obolijevanja od leukemije, posebice AML, ali i ALL, kronične mijelolomonocitne leukemije i bifeno-tipske leukemije.

POREMEĆAJI UROĐENE IMUNOSTINa poremećaj urođene imunosti treba posumnjati u bolesnika s piogenim infekcijama i rekurentnim injekcijama uha, nosa, ždrijela i donjih dišnih puteva u kojih nije nađen poremećaj humoralne imunosti ili poremećaj granulocita. Anhidrotska ektodermalna displazija s imunodeficijencijom i IRAK – 4 deficijen-cija spadaju u tu grupu imunodeficijencija.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKADijagnostički postupci kod sumnje na primarnu imunodeficijenciju• Kompletna krvna slika – određivanje apsolut-

nog broja leukocita, limfocita i neutrofila

• Kvantitativno određivanje razine imunoglobuli-na IgG, IgA, IgM, IgE u serumu

• Određivanje razine podrazreda IgG

• Određivanje titra specifičnih protutijela na cjepi-va (tetanus, difterija, hepatitis B) ili titra protuti-jela na uzročnike preboljelih infekcija

• Odgovor na polisaharidne antigene (određiva-nje titra protutijela nakon cijepljenja cjepivom protiv pneumokoka)

• Određivanje titra izohemaglutinina

• Imunofenotipizacija perifernih mononuklearnih stanica: određivanje apsolutnog broja limfocita T (CD3+), pomagačkih limfocita T (CD3+CD4+),


citotoksičnih limfocita T (CD3+CD8+), limfocita B (CD19+), NK stanica (CD16/CD56)

• Proliferacija limfocita in vitro - mitogenici: PHA, ConA, PWM i antigeni: PPD, candida, tetanus toksoid

• Sposobnost oksidativnog metabolizma fagocita (respiracijski prasak)

• Kožni testovi odgođene preosjetljivosti (PPD, Candida, tetanus toksoid)

• Komplement: CH50, C3, C4

• Dodatne analize komplementa (npr. C1 inhibitor)

• Određivanje razine enzima: adenozin deamina-za, purin nukleozid fosforilaza

• Fagocitoza

• NK-aktivnost

• Određivanje izražaja CD40-liganda (CD154)

• Analiza citokina

• Genomska analiza

MOLEKULARNA GENETIKA I DIJAGNOSTIKATipovi mutacijaPrimarne imunodeficijencije obuhvaćaju sve tipove mutacija, a najčešće su mutacije promjene smisla (eng. missense) i besmislene mutacije (eng. nonsen-se). Također se javljaju i delecije, insercije, duplika-cije i splice site mutacije.

Mutacija promjene smisla je zamjena jedne nukleo-tidne baze drugom, čime dolazi do substitucije ami-nokiselina u proteinskom lancu.

Besmislena mutacija je također zamjena nukleotid-nih baza, ali ovdje se događa da umjesto signala za neku aminokiselinu dolazi do signala za stop kodon i time se zaustavlja sinteza proteina. To rezultira skraćenim proteinom, koji može biti nefunkcionalan.

Insercija je promjena broja nukleotidnih baza u genu tako da se na određeno mjesto umetne jedna ili više baza.

Delecija je promjena u broju nukleotidnih baza gu-bitkom dijela DNA. Malim delecijama se gubi jedna

ili više baza unutar gena, dok se velikim delecijama gubi cijeli gen ili čak i nekoliko susjednih gena.

Duplikacija je pojava kada je dio DNA abnormalno kopiran 1 ili više puta.

Splice site mutacija je mutacija koja se događa pri-likom izrezivanja introna iz primarnog transkripta RNA. Može doći do pogrešnog izrezivanja tako da se dio introna unese u zrelu mRNA ili se može dogoditi da je neki ekson izostavljen.

Genetska heterogenostKod primarnih imunodeficijencija javlja se pojava ge-netske heterogenosti što znači da se ista bolest može pojaviti zbog više različitih razloga. Postoji alelska heterogenost gdje se različite mutacije javljaju unu-tar istog lokusa (gena), i lokusna heterogenost kada mutacije na različitim lokusima (genima) rezultiraju istom bolešću.

Načini nasljeđivanja primarnih imunodeficijencijaNajčešće se primarne imunodeficijencije nasljeđuju po Mendelovom načinu nasljeđivanja, tj. prenoše-njem mutacije nekog gena sa roditelja na djecu. Ali ponekad se može pojaviti i de novo mutacija koja nastaje u spolnim stanicama (jajnoj stanici ili sper-miju) jednog od roditelja ili u samoj oplođenoj jajnoj stanici (zigoti).

Kada se bolest nasljeđuje autosomno recesivno, zna-či da je osoba nasljedila mutacije na oba alela istog autosomnog gena. Osoba može biti homozigot za mutaciju, ako je nasljedila 2 identične mutacije na oba alela istog gena ili složeni heterozigot, ako ima 2 različite mutacije na svakom pojedinom alelu. Kod recesivnih bolesti, heterozigotni nositelji (koji imaju jedan normalni alel i jedan s mutacijom) ne pokazuju simptome bolesti jer je ekspresija alela s mutacijom potisnuta u prisutnosti normalnog alela.

Kod autosomno dominantnog nasljeđivanja osobi je potrebna samo jedna kopija promjenjenog gena da bi se razvila bolest. Roditelj od kojeg je nasljeđena mutacija može i sam imati simptome, ali može biti i asimptomatski nositelj. Autosomno dominantna bo-lest također može biti i posljedica de novo mutacije.


Mutacije u genima na kromosomu X uzrokuju bole-sti sa specifičnim X-vezanim načinom nasljeđivanja. Zbog različitog broja kromosoma X kod muškaraca i žena, te mutacije izazivaju različite posljedice. Kod muškaraca bolest se javlja uvijek jer njegova jedi-na kopija gena sadrži mutaciju. Hemizigotnost kod muškaraca objašnjava velik broj X-vezanih imunode-ficijencija i velik udio muškaraca sa dijagnosticiranim nasljednim imunodeficijencijama. Žene imaju dva kromosoma X pa su uglavnom samo asimptomatski nositelji bolesti.

Prenatalna dijagnostikaPrije odluke o prenatalnom testiranju obavezno je genetsko savjetovanje sa genetskim savjetnikom. Obiteljska mutacija mora biti prethodno utvrđena,

te mora biti potvrđeno da su majka ili otac nositelji bolesti. U slučaju X-vezanih bolesti, važno je pret-hodno utvrditi spol djeteta, jer samo muška djeca mogu oboliti. Uzorci iz kojih se radi prenatalna di-jagnostika su amnijska tekućina i korionske resice.

Genetsko savjetovanjeVrlo je bitno uputiti bolesnika i njegove roditelje na genetsko savjetovanje prije testiranja na neku od pri-marnih imunodeficijencija, da dobiju osnovne infor-macije o ulozi određenog gena u prijenosu primarne imunodeficijencije za koju se vrši testiranje, da sa-znaju kakav oblik testiranja će se provesti (koji će se uzorak uzeti, koliko će analiza trajati, kolika je njena točnost, pozitivne i negativne posljedice testiranja za bolesnika i njegovu obitelj). U slučaju pozitivnog

100

T T T T T TT C C C C CA A A A A A A A AAG G G G G GA A A A AC

A A A A A A A A A A A A A A A AG G G G GT T T T

G G G G G G GG C CA A A A A A A A AT T T T T T T T T T T T T T

TC C C C C C C C

T T T T T T T T T TTT TTG G G G G G GA A A A A A AC C C C C

140

170 180 190

200 210 220 230

150 160

110 120 130

Slika 54.1. Elektroferogram dijela sekvence gena SBDS. Heterozigotna delecija četiri nukleotida uzrokuje pomak u okviru čitanja (eng. frameshift) kod bolesnika sa autosomno recesivnim Shwachman-Diamondovim sindromom (označeno crvenom strelicom). Crveni vrh – timin; plavi vrh – citozin; zeleni vrh – adenin; crni vrh – gvanin, (Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).


rezultata testiranja (potvrde kliničke dijagnoze), bit-no je i genetsko savjetovanje nakon testiranja, da se detaljno razjasne rezultati provedene analize, da bo-lesnik shvati medicinske činjenice, dijagnozu, tijek bolesti, mogućnosti liječenja i da dobije informacije o raznim udrugama, zdravstvenim i socijalnim služ-bama koje bi mu mogle koristiti.

Prednosti molekularne dijagnostike u dijagnozi primarnih imunodeficijencijaMolekularna dijagnostika pomaže liječniku u po-tvrđivanju kliničke dijagnoze, identificiranju novih i atipičnih prezentacija bolesti, postavljanju dijagno-ze kod novorođenčadi gdje konvencionalni dija-gnostički testovi nisu pouzdani. Ovisno o utvrđenoj mutaciji moguća je lakša prognoza bolesti i odluka o tome da li je bolesnik pogodan za gensku tera-piju. Moguće je učiniti presimptomatsko testiranje što pomaže u ranom prepoznavanju bolesti prije ra-zvijanja simptoma. Isto tako molekularne analize se koriste u istraživanju i identifikaciji novih genetskih poremećaja.

Molekularna dijagnostika primarnih imunodeficijen-cija obuhvaća skup testova i metoda koje kao glavni analit koriste DNA. DNA se može izolirati iz perifer-ne krvi kojoj je dodan antikoagulans EDTA, iz amnij-ske tekućine ili iz korionskih resica.

Molekularna dijagnostika primarnih imunodeficijen-cija provodi se metodom sekvenciranja kodirajuće regije gena (eksona). To je metoda kojom se utvr-đuje redoslijed nukleotida (A, T, G, C) u molekuli DNA. Najčešće korištena metoda sekvenciranja je Sangerova dideoksi metoda.

G G G Y GTTT CCC

Slika 54.2. Heterozigotna mutacija promjene smisla kod bolesni-ka sa autosomno dominantnim oblikom neutropenije (označena crvenom strelicom), (Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).

G GA A A A A A A AG G G G G GT T T TC C

Slika 54.3. Hemizigotna besmislena mutacija kod bolesnika sa X-vezanom agamaglobulinemijom (slika lijevo, označeno crvenom strelicom) i ista mutacija kod majke bolesnika u heterozigotnom obliku (slika desno, označeno crvenom strelicom), (Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).


Lančana reakcija polimerazomPrije nego što je DNA spremna za sekvenciranje, po-trebno ju je umnožiti. U tu svrhu se koristi lančana reakcija polimerazom (PCR). Za PCR je potrebna izo-lirana DNA, enzim DNA polimeraza, dvije odgova-rajuće oligonukleotidne početnice, odgovarajući pu-fer sa MgCl2 i smjesa 4 deoksiribonukleotida: dATP, dGTP, dCTP i dTTP.

To je metoda umnožavanja određenog fragmenta DNA na eksponencijalan način koja se bazira na hi-bridizaciji specifičnih oligonukleotidnih početnica i in vitro sintezi kopija željenog fragmenta koji je ogra-ničen i obilježen tim početnicama.

Reakcija PCR provodi se u oko 30-40 ciklusa, a svaki ciklus se sastoji od 3 faze (Slika 54.4.):

1. Denaturacija – razdvajaju se lanci dvostruke uzvojnice kalupne molekule DNA

2. Hibridizacija – prijanjanje oligonukleotidnih po-četnica na denaturiranu DNA

3. Elongacija – enzim DNA polimeraza produljuje lanac DNA od početnica u smjeru 5’-3’ sve dok se ne izgradi nova dvolančana molekula DNA koja je potpuno identična početnoj molekuli DNA

Sangerova dideoksi metoda (sekvencijska reakcija)U sekvencijskoj reakciji (Slika 54.5.) pročišćeni PCR produkt potrebno je obilježiti fluorescentnim bojama kako bi se tijekom procesa kapilarne elek-troforeze fluorescencijski signali mogli detektirati i pretvoriti u podatke o slijedu nukleotida u DNA. Sekvencijska reakcija se provodi po Sangerovoj ili dideoksi metodi. U reakciju se, osim reagenasa koji se koriste za reakciju PCR, dodaju i četiri fluores-centno obilježena dideoksiribonukleotida (ddNTP). Svaki dideoksiribonukleotid je obilježen drugom bojom. Prlikom sinteze lanca DNA, ako se u rastu-ći lanac DNA umjesto deoksiribonukleotida ugradi dideoksiribonukleotid, sinteza lanca se prekida. Tako dobijemo produkte (lance) različitih duljina koji na svojem 3’ kraju sadrže fluorescentno obilje-ženi ddNTP.

Kapilarna elektroforezaKapilarna elektroforeza je analitička metoda razdva-janja nabijenih čestica na temelju njihove elekrofo-retske pokretljivosti u električnom polju. Tijekom ka-

PRVI CIKLUS DRUGI CIKLUS TREĆI CIKLUS

1. DENATURACIJA

2. HIBRIDIZACIJA

Početnica

Početnica

Novi lanac DNA

Novi lanac DNA

3. ELONGACIJA

5’3’

3’5’

Slika 54.4. Lančana reakcija polimerazom


pilarne elektroforeze, produkti sekvencijske reakcije ulaze u kapilare, napunjene polimerom, kao rezultat elektrokineičke injekcije. Visoki napon tjera negativ-no nabijene fragmente DNA kroz kapilare. Fragmenti se, putujući kroz polimer u kapilarama, razdvajaju na temelju svoje molekularne težine. Prije nego stignu do pozitivno nabijene elektrode, odsječci prolaze kroz dio kapilare koji se nalazi prislonjen uz optički čitač, a u isto ih vrijeme laserska zraka veliki broj puta obasjava, pobuđujući fluorescenciju u krajnjim nukleotidima lanaca. Zabilježeni fluorescentni signa-li pretvaraju se u elektroferogram, što je digitalni pri-kaz slijeda nukleotida u obliku vrhova četiri različite boje, označavajući četiri vrste nukleotida.

LIJEČENJELiječenje bolesnika s primarnim imunodeficijencija-ma ovisi o tipu imunodeficijencije. Liječenje humo-ralnih ID temeljeno je na redovitom nadomjesnom liječenju humanim imunoglobulinima, preparatima za intravensku primjenu (IVIG) ili subkutanu primje-nu (SCIG). Preporučena doza za IVIG je 400 do 800 mg/kg svaka 3-4 tjedna. Cilj je nadomjesnog liječe-nja smanjiti učestalost infekcija, a time i kroničnih komplikacija, u prvom redu razvoj kronične plućne bolesti (bronhiektazija) i enterovirusnog meningo-encefalitisa. Poželjna razina imunoglobulina G prije slijedeće infuzije je više od 5,0g/L, a idealna u nor-malnom rasponu za odrasle (7-17 g/L). Uobičajena

doza IVIG-a je 400-500 mg/kg, dok je veće doze po-trebno dati bolesnicima s bronhiektazijama i entero-virusnim meningoencealitisom. SCIG se daje u dozi od 100 mg/kg/tjedan. Prednost liječenja SCIG-om je stabilnija razina IgG i manja učestalost nuspojava. Kontinuirana antibiotska profilaksa nije uobičajena, ali se o njoj može razmisliti u bolesnika s bronhiek-tazijama i ponavljanim upalama paranazalnih sinusa.

U djece sa sumnjom na kombiniranu imunodefici-jenciju potrebno je dati kotrimoksazol radi profilakse Pneumocystis jiroveci infekcije, profilaksu gljivičnih infekcija, suspstituciju imunoglobulina, a infekcije zahtijevaju agresivno liječenje. Često je potrebna nutritivna potpora, ponekad imunosupresija, kao npr. kod sindroma Ommen. U bolesnika sa SCID-om treba dati filtrirane i ozračene krvne derivate radi visokog rizika razvoja GVHD-a, odnosno CMV i EBV infekcije. Ne smiju se cijepiti živim cjepivom kako bi se izbjegla mogućnost vakcinalnih infekci-ja. Liječenje izbora za djecu oboljelu od SCID-a ili drugih staničnih imunodeficijencija je transplantacija krvotvornih matičnih stanica (TKMS). TKMS srodnog davatelja uspješna je u više od 90 % bolesnika. Po-stojanje svjetskih registara dobrovoljnih darivatelja krvotvornih matičnih stanica i banaka umbilikalne krvi omogućilo je uspješno liječenje alogeničnom transplantacijom i u bolesnika koji nemaju podudar-nog srodnog davatelja. Uspjeh transplantacije ovisi o dobi bolesnika i do tada preboljelim infekcijama, i znatno je bolji što je niža životna dob i manji broj

DENATURACIJA HIBRIDIZACIJA ELONGACIJA PRODUKTI

enzimdNTPddNTP

A

C

G

T

A C G

A C

A C G C

A C G C T

A C G C T A

A C G C T A G

A C G C T A G T

Slika 54.5. Sekvencijska reakcija


preboljelih infekcija. U nekih bolesnika s primarnim imunodeficijencijama moguće je i gensko liječenje. To su u prvom redu SCID-X1 i ADA deficijencije, te određeni bolesnici s CGD-i. Kako je 5 bolesnika li-ječenih u dva centra razvilo klonalnu proliferaciju intenzivno se radi na razvoju novih virusnih vektora. Nadomjesno liječenje pegiliranom goveđom adeno-zin-deaminazom (pegademazom) tjednim intramu-skularnim injekcijama dostupno je za bolesnike s ADA deficijencijom (manjkom adenozin deamina-ze). Bolesnici s kompletnim Di George sindromom mogu se liječiti transplantacijom timusa nesrodnog davatelja.

Bolesnici s CGD-i zahtijevaju regularnu antibiotsku i antimikotsku profilaksu (kotrimoksazol, itrako-nazol), te u određenim slučajevima primjenu IFNγ.

Transplantacija krvotvornih matičnih stanica indi-cirana je ako bolesnik ima srodnog podudarnog davatelja, dok o transplantaciji od nesrodnog po-dudarnog davatelja ili umbilikalne krvi treba razmi-šljati u slučaju nezadovoljavajuće kontrole infekcija i inflamatornih komplikacija. U posljednje vrijeme u nekih se bolesnika s CDG primjenjuje gensko li-ječenje.

Regularnom primjenom čimbenika stimulacije gra-nulocitopoeze (G-CSF) postiže se u većine bolesnika s kongenitalnom neutropenijom zadovoljavajući po-rast broja granulocita (više od 1000). Međutim, oko 10 % bolesnika s kongenitalnom neutropenijom u kojih nema odgovora na visoke doze G-CSF-a liječe-nje izbora je alogenična transplantacija krvotvornih matičnih stanica.

C

A G T T T T T T T T TG G C C C C C CG G G G GA A A A A A A A A

T T T T TTA

C C T T T T T T T T TC G G G G G GC C C C C C C C CA A A A A

A C G G G G G GGC C C C C C CA A A A A A A AA

C C C CCT TT T T T TG G G A A A AA A A A AG G G G G G60 70 80

90 100 110 120

130 140 150

160 170 180

Slika 54.6. Prikaz elektroferograma dijela sekvence gena, (Ana Merkler, Klinička jedinica za molekularnu dijagnostiku KBC Zagreb).


Transplantacija krvotvornih matičnih stanica liječenje je izbora i u bolesnika s drugim imunodeficijencija-ma, kao što su WAS, XLP, HLH, IPEX sindrom.

Primarne imunodeficijencije su rijetke bolesti koje zahtijevaju timski rad niza specijalnosti. Osobito je važna pravovremena dijagnoza i liječenje kao bi se spriječio razvoj komplikacija. Ishod liječenja bole-snika s primarnim imunodeficijencijama ovisi o pra-vovremenoj dijagnozi, izboru optimalnog liječenja i tipu imunodeficijencije. Napretkom transplantacijske

imunologije, većom dostupnošću mogućih nesrod-nih darivatelja krvotvornih matičnih stanica danas je moguće liječenje mnogih bolesnika s primarnim imunodeficijencijama alogeničnom transplantacijom krvotvornih matičnih stanica. Definiranje genskih poremećaja omogućilo je kod nekih bolesti gensko liječenje, kao i prenatalnu dijagnostiku. Rana dija-gnoza često je jedan od najvažnijih čimbenika koji određuju konačni ishod bolesti u djece s primarnim imunodeficijencijama.

LITERATURAAl-Herz W, Bousfiha A, Casanova JL et al. Primary immu-nodeficiency diseases: an update on the classification from the International Union of Immunological Societies Expert Committee for Primary Immunodeficiency. Front Immunol 2011;2(54):1-26.

Ameratunga R, Woon ST, Neas K, Love DR. The clinical uti-lity of molecular diagnostic testing for primary immune de-ficiency disorders: a case based review. Allergy Asthma Clin Immunol 2010;6(1):12.

Arkwright PD, Gennery A. Ten warning signs of primary immunodeficiency: a new paradigm is needed for the 21st century. Ann N Y Acad Sci 2011;1238:7-14.

Ballow M, Notarangelo L, Grimbacher B et al. Immunodefici-encies. Clin Exp Immunol 2009;158(Suppl 1):14-22.

Berger M. Choices in IgG replacement therapy for primary immune deficiency diseases: subcutaneous IgG vs. intraveno-us IgG and selecting an optimal dose. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2011;11(6):532-8.

Berliner N. Lessons from congenital neutropenia: 50 ye-ars progress in understanding myelopoiesis. Blood 2008;111(12):5427-32.

Bonilla FA, Fried AJ. Pathogenesis, Diagnosis and Manage-ment of Primary Antibody Deficiencies and Infections. Clin Microbiol Rev 2009;22(3):396-414.

Booth C, Gaspar HB, Thrasher AJ. Gene therapy for primary immunodeficiency. Curr Opin Pediatr 2011;23(6):659-66.

Buckley RH. Molecular defect in human severe combined immunodeficiency and approaches to immune reconstituti-on. Ann Rev Immunol 2004;22:625-55.

Buckley RH. Primary immunodeficiency or not? Making the corect diagnosis. J Allergy Clin Immunol 2006;117(4):756-8.

Chinen J, Shearer WT. Advances in basic and clinical immu-nology in 2011. J Allergy Clin Immunol 2012;129(2):342-8.

Dale DC, Bolyard AA, Schwinzer BG et al. The Severe Chro-nic Neutropenia International Registry: 10-Year Follow-up Report. Support Cancer Ther 2006;3(4):220-31.

de Vries E, Driessen G. Educational paper: Primary immuno-deficiencies in children: a diagnostic chalange. Eur J Pediatr 2011;170(2):169-77.

Diaz de Heredia C, Ortega JJ, Diaz MA et al. Unrelated cord blood transplantation for severe combined immunodeficiency and other primary immunodeficiencies. Bone Marrow Tran-splant 2008;41(7):627-33.

Eibel H, Salzer U, Warnatz K. Common variable immunode-ficiency at the end of a prospering decade: towards novel gene defects and beyond. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2010;10(6):526-33.

Electrophoresis (DOE Joint Genome Institute) 2004

http://jgi.doe.gov/sequencing/education/how/how_10.html

Filipovich AH. Hematopoietic cell transplantation for corecti-on of primary immunodeficiencies. Bone Marrow Transplant 2008;42(Suppl 1):S49-52.

Genetic Home Reference 2012 http://ghr.nlm.nih.gov/glossary

Hrvatsko društvo za humanu genetiku. Genetičko savjetova-nje: stajalište hrvatskog društva za humanu genetiku Hrvat-skog liječničkog zbora 2010 http://www.humana-genetika.org/wp-content/uploads/2010/06/GENETSKO_SAVJETOVA-NJE-stajaliste_HDHG.pdf

Kaveri SV, Maddur MS, Hedge P, Lacoix-Desmazes S, Bayry J. Intravenous immunoglobulins in immunodeficiencies. More than mere replacement therapy. Clin Exp Immunol 2011;164(Suppl 2):2-5.

Kersseboom R, Brooks A, Weemaes C. Syndromic forms of primary immunodeficiency. Eur J Pediatr 2011;170(3):295-308.


Notarangelo LD. Primary immunodeficiencies. J Allergy Clin Immunol 2010;125(2 Suppl 2):S182-94.

Puck JM, Nussbaum RL. Genetic Principles and Technologies in the Study of Immune Disorders. U: Ochs HD, Smith CIE, Puck JM, ur. Primary Immunodeficiency Diseases: A Molecu-lar and Genetic Approach. 2 izd. New York: Oxford Univer-sity Press; 2007, str. 16-26.

Rezaei N, Mahmoudi E, Aghamohammadi A, Das R, Nichols KE. X-linked lymphoproliferative syndrome. A genetic condi-tion typified by the tried of infection, immunodeficiency and lymphoma. Br J Haematol 2011;152(1):13-30.

Richter D, Sertić J. Uloga genomske analize u primarnim imu-nodeficijencijama. Paediatr Croat 2004;48(Supl 1):131-42.

Rocha V, Locatelli F. Searching for alternative hematopoietic stem cell donors for pediatric patients. Bone Marrow Tran-splant 2008;41(2):207-14.

Roifman CM, Somech R, Kavadas F i sur. Defining combined immundeficiency. J Allergy Clin Immunol 2012;130(1):177-83.

Shehata N, Palda V, Bowen T i sur. The Use of Immunoglo-bulin Therapy for Patients With Primary Immune Deficiency: An Evidence-Based Practice Guideline. Transfus Med Rev 2010;24(Suppl 1):S28-50.

Skoda-Smith S, Torgerson TR, Ohs HD. Subcutaneous immu-noglobulin replacement therapy in the treatment of patients with primary immunodeficiency disease. Ther Clin Risk Ma-nag 2010;6:1-10.

Skokowa J, Germeshausen M, Zeidler C, Welte K. Severe con-genital neutropenia: inheritance and pahophysiology. Curr Opin Hematol 2007;14(1):22-8.

Teachey DT. New advances in the diagnosis and treatment of autoimmune lymphoproliferative syndrome. Curr Opin Pediatr 2012;24(1):1-8.

Wood P. Primary antibody deficiency sydromes. Curr Opin Hematol 2010;17(4):356-61.

33. Wood P, Stanworth S, Burton J et al. Recognition, clini-cal diagnosis and management of patients with primary an-tibody deficiencies:a systematic review. Clin Exp Immunol 2007;149(3):410-23.

Pitanja i odgovori

1. Što su primarne imunodeficijencije?

Nasljedni poremećaji razvoja i/ili funkcije imunosnog sustava.

2. Koji su načini nasljeđivanja primarnih imunodeficijencija?

Autosomno dominantno, autosomno recesivno ili X-vezano.

3. Podjela primarnih imunodeficijencija.

Poremećaji produkcije protutijela, kombinirane stanično-humoralne imunodeficijencije, dobro definirani sindro-mi imunodeficijencije, bolesti uzrokovane imunosnom disregulacijom, prirođeni poremećaji broja ili funkcije fagocita, poremećaji urođene imunosti, autoinflamatorni poremećaji i deficijencije komplementa.

4. Kako se umnaža DNA za potrebe sekvenciranja gena?

Lančanom reakcijom polimerazom.

5. Na čemu se temelji liječenje humoralnih imunodeficijencija?

Redovitom nadomjesnom liječenju humanim imunoglobulinima, preparatima za intravensku primjenu (IVIG) ili subkutanu primjenu (SCIG).

521

U čovjeka se procjena imunosnog sustava, u pravilu, temelji na laboratorijskom ispitivanju in vitro. Valja pretpostaviti je da će razvoj imunologije i novih tehnologija omogućiti još precizniji uvid u funkcioniranje imunosnog odgovora, a time i u mehanizme poremećaja imunosnog sustava. No, važno pitanje u tom pro-cesu jest kako složene laboratorijske testove prenijeti u rutinsku kliničko-laboratorijsku praksu. Drugim riječima, sve veći broj složenih imunoloških testova nameće potrebu za što racionalnijim odabirom testova koji će osigurati odgovarajuću informaciju.

Najvažnije indikacije za laboratorijsko ispitivanje imunosnog sustava jesu stanja koje karakterizira poremećaj u prepoznavanju ili odstranjenju tuđih antigena, a koje nazivamo imunodeficijencijama ili imunodeficijencij-skim sindromima. U odnosu na uzrok, imunodeficijencijski sindromi dijele se na primarne (urođene) i sekun-darne (stečene), a oba dovode do sličnih kliničkih stanja koja se očituju rekurentnim ili kroničnim infekcija.

U usporedbi s primarnima, sekundarne su imunodeficijencije znatno učestalije, a nastaju kao posljedica teške pothranjenosti, zaraze (npr. AIDS, ospice, parazitske bolesti), autoimunih bolesti (npr. SLE) i primje-ne agresivnih oblika liječenja (kortikosteroidima, imunosupresijskim lijekovima, citostaticima i zračenjem, presadbom tkiva i organa).

Do danas je opisano oko 200 kliničkih entiteta primarnih imunodeficijencijskih sindroma, a za više od 100 je poznat genetski uzrok. To su relativno rijetke bolesti čija incidencija iznosi 1:300 do 1:500000 u općoj popu-laciji. Najčešće se otkriju u novorođenačkoj i dječjoj dobi (60 %), dok se preostale otkriju tek u odrasloj dobi. Premda su rijetki, primarni imunodeficijencijski sindromi bitni su zbog sljedećih razloga: 1. brza i adekvatna dijagnoza bolesti može spasiti život ili znatno unaprijediti kvalitetu života oboljelog djeteta; 2. poznavanje genske prirode poremećaja imunosnog sustava omogućuje prenatalnu dijagnostiku i pridonosi planiranju obitelji i 3. omogućuju upoznavanje složenih mehanizama imunoregulacije. Važnost ranog otkrivanja pore-mećaja pokazuje i činjenica de je u nekoliko saveznih država SAD-a nedavno uveden novorođenački probir

P o g l a v l j e 55.Laboratorijska dijagnostika

imunodeficijencijskih sindromaDrago Batinić


na SCID s pomoću testa za otkrivanje odsječaka DNA T-staničnog receptora (TRECs) koji je značajno una-prijedio rano otkrivanje SCID-a i teške limfopenije limfocita T.

Imunodeficijencije nastaju zbog poremećaja nespe-cifične ili specifične imunosti, a u odnosu na izvršni krak imunosnog odgovora, poremećaj može nastati na razini stanične imunosti, humoralne imunosti ili zahvaća oba kraka imunosnog odgovora (mješovite imunodeficijencije). Na razini nespecifične imuno-sti oštećenje zahvaća fagocite, NK stanice ili sustav komplementa, dok na razini specifične imunosti poremećaj dovodi do smanjenoga broja ili funkcije limfocita T ili B, odnosno do smanjenog ili potpunog izostanka izlučivanja protutijela.

S kliničkoga stajališta, imunodeficijencije se očituju zarazama rekurentnog ili kroničnog tijeka, otporno-šću na antimikrobnu terapiju, specifičnom vrstom uzročnika i često atipičnom kliničkom slikom. Oso-ba pod povećanim rizikom za razvoj zarazne bolesti naziva se kompromitiranim domaćinom (engl. com-promised host), a osoba s oštećenim i nedostatnim imunosnim odgovorom naziva se imunokompromi-tiranim domaćinom. Imunodeficijencije se, konačno, povezuju i s nastankom autoimunih bolesti, alergija, hematoloških poremećaja, malapsorpcijskog sindro-ma i neoplazmi limfnoga tkiva.

DIJAGNOSTIKA PRIMARNIH IMUNODEFICIJENCIJSKIH SINDROMADijagnoza primarnih imunodeficijencijskih sindro-ma posebno je značajna tijekom prve godine života. Naime, ako se ne dijagnosticiraju i ne liječe na vri-jeme, primarni imunodeficijencijski sindromi često završavaju letalno. U svrhu odgovarajuće labora-torijske dijagnostike, posebnu pažnju treba usmje-riti na anamnezu i kliničku sliku. Podatci važni za dijagnozu uključuju dob u kojoj je došlo do pojave prvih znakova bolesti, rast i razvoj djeteta, ishod ci-jepljenja živim mikroorganizmima, učestalost, težina i vrsta infekcija i sl. Obiteljska je anamneza važna jer može upozoriti na dijagnozu imunodeficijencije

(npr. podatak o iznenadnoj smrti dojenčadi u obite-lji, konsagvinitet, i sl.). Liječnik mora poduzeti kli-ničko-laboratorijska ispitivanja kako bi utvrdio vrstu i opseg oštećenja i locirao poremećaj na staničnoj i molekularnoj razini. Osim ispitanika, kliničko-la-boratorijska obradba treba uključiti i članove obite-lji. Budući da ne postoji jedinstveni test kojim bi se utvrdili poremećaji imunosnog sustava, to je obično potrebno učiniti nekoliko pretraga u svim slučajevi-ma sumnje na imunodeficijenciju.

Vrsta zaraznog uzročnika i zahvaćeni organi obično daju korisne smjernice u otkrivanju naravi imunološ-kog poremećaja (Tablica 55.1.). Primjerice, osobe s nedostatnim humoralnim odgovorom imaju poveća-nu sklonost zarazi inkapsuliranim piogenim bakterija-ma (Staphylococcus sp. i Streptococcus pneumoniae) i enterovirusima. Nasuprot, osobe s nedostatnom funkcijom limfocita T ponajčešće pate od virusnih i gljivičnih infekcija, a česte su i zaraze s Pneumocy-stis sp. Drugi važni klinički znakovi imunodeficijen-cija jesu kronični proljev, malapsorpcija, a katkad i malnutricija, pa se u dijagnostici moraju isključiti au-toimune i kronične upalne bolesti (npr. gluteinska enteropatija). Najčešći uzročnici navedenih simptoma jesu Giardia, Cryptosporidium i rotavirusi. U bole-snika s primarnom imunodeficijencijom pažnju treba usmjeriti i na opći status (zastoj u rastu), limfne čvo-rove (koji nedostaju ili su povećani), organomegaliju, osip i kožne promjene, usnu šupljinu, kao i na hema-tološke nalaze (na primjer, trombocitopenija je važan nalaz u dijagnostici Wiskott-Aldricheva sindroma).

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKAU načelu, imunološke pretrage u rutinskoj praksi mo-žemo podijeliti na testove pretraživanja („screening�), (Tablica 55.2.) i na specijalne testove (Tablice 55.3.-55.5), a u odnosu na ispitivano svojstvo na fenotip-ske, genotipske i funkcijske pretrage. Za velik broj imunoloških pretraga, posebice funkcijskih testova limfocita, još uvijek nema „zlatnog standarda�, pa se stoga izvode u specijaliziranim centrima i laboratori-jima. Laboratorijsku dijagnostiku imunodeficijencija

Laboratorijska dijagnostika imunodeficijencijskih sindroma | 523

treba započeti testovima pretraživanja (engl. scre-ening) humoralne i stanične imunosti, uključujući fagocite. Na osnovi rezultata testova pretraživanja liječnik indicira specijalističke pretrage za ispitivanje humoralne i stanične imunosti u svrhu utvrđivanja ra-zine i opsega oštećenja imunosnog sustava. Konačno, biokemijske i molekularnogenetičke analize definira-ju poremećaj na supcelularnoj i molekularnoj razini, čime se ujedno postavlja i konačna dijagnoza bolesti.

Pretraživanje humoralne imunostiGlavni efektori humoralne imunosti jesu protutijela čiju funkciju dopunjuje („komplementira�) sustav komplementa. Protutijela su proizvod plazma-stani-ca, krajnje diferenciranih limfocita B.

Pretrage humoralne imunosti nedvojbeno su pouz-danije i manje podložne interpretaciji negoli pretrage stanične imunosti, posebice kad je riječ o mjerenju razine serumskih imunoglobulina kao mjere funkci-je limfocita B. Pretraživanje humoralne imunosti uk-ljučuje sljedeće testove: a) elektroforezu serumskih proteina; b) određivanje razine imunoglobulinskih razreda (IgA, IgG i IgM) u serumu; c) određivanje titra izohemaglutinina; d) određivanje titra specifič-

nih protutijela i e) ispitivanje funkcije komplementa (Tablica 55.2).

Elektroforeza serumskih proteinaProtutijela su sadržana u frakciji γ-globulina (imuno-globulina), a njihova serumska razina ovisi o dobi te o odnosu između sinteze i potrošnje ili gubitka. Treba napomenuti da elektroforeza serumskih pro-teina ne može kvantificirati pojedinačne imunoglo-bulinske razrede.

Mjerenje razine imunoglobulinskih razredaMjerenje koncentracije serumskih imunoglobulin-skih razreda izvodi se u tekućoj fazi (npr. laserskom nefelometrijom) ili u polučvrstom mediju (npr. ra-dijalnom imunodifuzijom). Druge tehnike uključuju radioimunotest i enzimski imunotest, posebice kada se mjeri razina IgE i IgD. Neto-koncentracija imuno-globulina u serumu ovisi o više činitelja, kao što su dob, stupanj sinteze, tkivne razdiobe, potrošnje i gu-bitka imunoglobulina. Stoga se pri tumačenju nalaza moraju uzeti u obzir normalne vrijednosti za lokalno stanovništvo, ali i različiti metabolički činitelji, od-nosno bolesti koje mogu biti povezane s gubitkom

Tablica 55.1. Povezanost između specifičnog imunodeficita i predispozicije za zarazu specifičnim uzročnikom

Oštećenje Uzrok (bolest ili ijatrogeni učinak) Najčešći uzročnici zaraze

neutropenija hemoblastoze, citostatici, aplastična anemija gram-bakterije, Staphyloccocus. aureus, Candida sp., Aspergillus sp.

kemotaksije granu-locita

Chediak-Higashijev sindrom Streptoccocus pneumoniae, Haemophilus influ-enze

splenektomija trauma, liječenje trombocitopenije H. influenze, S. Pneumoniae, streptokoki

manjak C3-komple-menta

urođenSLEjetrene bolesti

S. pneumoniae, S. Pneumoniae, Pseudomonas sp., Proteus sp.

manjak ili oštećenje funkcije limfocita T

aplazija timusaHodgkinova bolestsarkoidozalepra (guba)

Listeria monocytogenes, Mycobacterium sp., Candida sp., Aspergillus sp., Cryptoccocus neo-formans, Herpes simplex, Herpes zoster

manjak ili oštećenje funkcije limfocita T

AIDS Pneumocystis carinii, Cytomegalovirus, herpes simplex, Candida sp., Mycobacterium avium

manjak limfocita B ili protutijela

AgamaglobulinemijaKLLMM

S. pneumoniae, streptokoki, H, influenze, N. meningitidis, S. aureus, Klebsiella pneumoniae, E. coli, Giardia lamblia


proteina. Istodobno mjerenje razine drugih proteina u serumu (npr. albumina) s pomoću elektroforeze važno je za procjenu cjelokupnog gubitka serumskih proteina i imunoglobulina.

Mjerenje titra izohemaglutininaMjerenje titra izohemaglutinina anti-A i anti-B služi kao pokazatelj proizvodnje “prirodnih� protutijela ra-zreda IgM. Ta se protutijela sintetiziraju u svih osoba (osim u onih krvne grupe AB), a nastaju kao reakcija na ubikvitarne bakterijske antigene čija građa naliku-je na polisaharide antigena krvnih grupa (križna re-akcija). Osoba krvne grupe A razvija protutijela anti-B, osoba grupe B razvija anti-A, a osoba krvne grupe 0 razvija anti-A i anti-B. Izohemaglutinini se sinteti-ziraju u prvim godinama života, pa do treće godine većina (98 %) zdrave djece krvnih grupa A, B i 0 imaju titar izohemaglutinina najmanje 1:16. Manjak izohemaglutinina pokazatelj je oštećenja humoralne imunosti, čak i u one djece koja mogu imati uredan nalaz serumskih imunoglobulina (npr. u djece obo-ljele od Wiskott-Aldricheva sindroma).

Mjerenje specifičnog imunosnog odgovora nakon imunizacijeStvaranje protutijela na specifične antigene najbolji je pokazatelj cjelokupne B-stanične funkcije. Riječ je o ispitivanju titra specifičnih protutijela razreda

IgG prije i nakon imunizacije antigenima cjepiva, pri čemu se istodobno ispituje i aferentni (prepo-znavanje protutijela) i eferentni krak (proizvodnja protutijela) humoralnog odgovora. Pri tome se tre-ba strogo držati pravila da se djetetu sa sumnjom na imunodeficijenciju nikada ne daju cjepiva od živih mikroorganizama (BCG, polio, morbili). Od T-ovi-snih antigenaobično se rabe cjepiva protiv tetanusa, difterije ili ona koja sadržavaju Haemophilus influ-enze, dok se za procjenu odgovora na T-neovisne antigene primjenjuju cjepiva koja sadržavaju polisa-haride pneumokoka. Normalni humoralni odgovor očituje se povećanjem titra specifičnog protutijela nakon dva tjedna od primjene proteinskih cjepiva (npr. difterija i tetanus), odnosno tri tjedna od pri-mjene polisaharidnih cjepiva. No, djeca mlađa od 2 godine obično vrlo slabo odgovaraju na polisaha-ridna cjepiva. U bolesnika s agamaglobulinemijom ne će se razviti većina (ili sve) vrsta protutijela, oni s izdvojenim manjkom IgG2 mogu imati teškoća u sintezi protutijela na polisaharide, dok će bolesnici s manjkom IgA ili prolaznom hipogamaglobulinemi-jom imati normalni odgovor na cjepiva.

Analiza komplementaRazina komplementa u serumu određuje se testom ukupne hemolitičke aktivnosti seruma, (CH50). Te-stom se ispituje klasični put aktivacije komplementa,

Tablica 55.2. Testovi za pretraživanje primarnih imunodeficijencijskih sindroma

Pretraga Mjerni parametar Sastavnica

Leukociti i diferencijalna krvna slika • morfologija i apsolutni broj neutrofilnih granulocita• apsolutni broj limfocita• apsolutni broj trombocita

– granulociti– limfociti T i B– medijatori

Komplement • ukupna hemolitička aktivnost (CH50)• razina C3, C4 i C1-inhibitora

– komplement

Elektroforeza proteina • γ-globulini (cjelokupna protutijela) – limfociti B

Imunoglobulini u serumu • IgA• IgG• IgM

– limfociti B

Razina funkcijskih protutijela • protutijela na krvne grupe• protutijela na antigene cjepiva

– limfociti B

Kožni test • reakcija kasne preosjetljivosti (PPD, candidin) – limfociti T


pa je stoga koristan za pretraživanje većine nedostat-nosti sustava komplementa. Vrijednost CH50 = 0 nala-zi se pri manjku komponenti C1-C8, dok se u manjku C9 vrijednosti CH50 kreću od 25 do 50 % normalne vrijednosti. Test CH50 ne će otkriti manjak properdina ili faktora D (tada je potrebno učiniti specijalni test – AH50). Manjak faktora I ili H udružen je s pove-ćanom potrošnjom C3 i stoga sniženom vrijednosti CH50. Manjak C1-inhibitora udružen je sa sniženom razinom C4.

Pretraživanje stanične imunostiZa pretraživanje stanične imunosti rabe se dvije osnovne pretrage – krvna slika i kožno testiranje in vivo (tablica 55.2).

Krvna slikaOsnovna pretraga za procjenu stanične imunosti in vitro jest krvna slika koja mora sadržavati relativni i apsolutni broj limfocita, neutrofila i trombocita, kao i morfološke značajke stanica periferne krvi (npr. broj i veličinu granula u neutrofilima, oblik i veliči-nu trombocita i sl.). U ocjeni imunodeficijencije tre-ba se voditi činjenicom da apsolutni broj leukocita, neutrofila i limfocita također ovisi o dobi ispitanika. Na primjer, limfopenija je definirana brojem limfocita <2500/µL krvi u neonatalnoj dobi, <4000/µL u doje-načkoj (5-12 mjeseci) dobi i <1000/µL krvi odrasloj dobi. Smanjen broj limfocita može biti izdvojeni na-laz ili može biti udružen s kvantitativnim poreme-ćajem drugih leukocita, kao što je npr. limfopenija s eozinofilijom ili limfopenija s trombocitopenijom.

Kožni test in vivoZa funkcijsku procjenu stanične imunosti in vivo primjenjuje se kožno testiranje po tipu odgođene (kasne) preosjetljivosti. Sastoji se od intradermalne injekcije antigena, a reakcija se očitava nakon 48 i 72 sata. Pozitivnom reakcijom smatra se nalaz indu-racije minimalne veličine 5×5 mm na mjestu injekcije antigena. Tim se testom ispituje funkcija memorijskih limfocita T, tj. reakcija na antigene zaraznih klica s kojima je osoba prethodno došla u dodir prirodnim putem ili cijepljenjem (PPD, antigeni Candidae ili

mumpsa). Stoga se ti antigeni nazivaju i anamnestič-kim (engl. recall), a reakcija koju induciraju naziva se anamnestički odgovor. Negativan nalaz ne znači uvijek manjak limfocita T, već se može raditi o dis-funkciji, odnosno anergiji limfocita T koja se viđa u različitim patološkim stanjima. Za dojenčad i malu djeca ne preporučuje se kožno testiranje zbog visoke učestalosti lažno negativnih odgovora, tj. nedovoljne prethodne izloženosti djece navedenim antigenima. Preporuka je SZO da se testiranje s pomoću sintet-skoga spoja DNCB više ne izvodi, jer je taj spoj mu-tagen i uzrokuje nekrozu tkiva.

Specijalni testovi za dijagnostiku primarnih imunodeficijencijskih sindromaSpecijalni testovi za dijagnostiku imunodeficijencij-skih sindroma indicirani su nakon što poznati rezul-tati testova pretraživanja, a nikako prije njih. Speci-jalne testove za procjenu broja i funkcije limfocita T i B prikazuju tablice 55.3. i 55.4.

Relativni i apsolutni broj limfocitnih subpopulacijaOsnovna metoda za određivanje relativnog i apsolut-nog broja pojedinih razreda i podrazreda limfocita u perifernoj krvi jest imunološka fenotipizacija limfo-cita s pomoću monoklonskih protutijela i protočne citometrije. Imunološka fenotipizacija leukocita te-melji se na otkrivanju membranskih LDA-a iz sustava CD s pomoću specifičnih monoklonskih protutijela. Danas se rabi višestruko bojenje stanica, od 3 do 6 biljega u istom uzorku stanica čime se omogućuje analiza udjela pojedinih vrsta limfocita, njihov stu-panj diferencijacije, kao i imunofenotipske aberacije u vidu neizražaja određenih biljega.

Paleta monoklonskih protutijela koja se rabi u di-jagnostici ovisi o indikaciji. Osnovnim panelom za imunološku fenotipizaciju limfocita otkriva se rela-tivni i apsolutni broj limfocita T i njihovih subpo-pulacija (pomagačkih i citotoksičnih), limfocita B i NK-stanica u perifernoj krvi, a katkada se ista analiza radi i s uzorcima koštane srži.

Pri tumačenju i prikazivanju rezultata limfocitnih subpopulacija treba se služiti referentnim vrijedno-stima. Stoga liječnik treba poznavati raspone nor-


malnih vrijednosti vlastita kliničkog laboratorija, a u znanstvenim istraživanjima treba formirati vlastite kontrolne skupine. Udio i apsolutni broj limfocitnih subpopulacija u krvi ovisi o dobi i spolu, pa za djecu i starije osobe uvijek treba tražiti primjerene referen-tne raspone, uključujući one iz velikih serija ispita-nika iz literature. Pri tome treba imati na umu da je apsolutni broj stanica važniji podatak nego njihov udio u zajedničkoj lozi. Praćenje limfocitnih subpo-pulacija pokazalo se vrijednim za dijagnostiku speci-fičnih imunodefcita (npr. parcijalnog Di Georgeova sindroma) i praćenje bolesnika s imunodeficitom, posebice u kontekstu specifične terapije.

Prošireni panel biljega rabi se kako bi se dokaza-la, odnosno isključila određena imunodeficijencija

(Tablica 55.4). Primjerice, razvojni oblici (subpopu-lacije) limfocita B važni su u dijagnostici humoral-nih imunodeficijencija, posebice obične varijabilne imunodeficijencije u kojoj defekt B-loze može nastati na različitim razvojnim razinama. Stoga se u dijagno-stici tog poremećaja određuju različiti razvojni oblici B-stanica, od onih nezrelih (tranzicijskih) do me-morijskih stanica. Na taj način protočna citometrija pomaže ne samo u otkrivanju već i u klasifikaciji po-remećaja. Slično, i specifičan imunofenotip limfocita T može upozoriti na određeni poremećaj. Primjerice, nalaz povećanog udjela dvostruko negativnih (CD4-CD8-) limfocita T s receptorom TCRαβ+ predstavlja jedan od važnih kriterija za dijagnozu autoimunog limfoproliferativnog sindroma.

Tablica 55.3. Specijalni testovi limfocita u dijagnostici primarnih imunodeficijencijskih sindorma

Limfociti B Limfociti T i NK

Protočna citometrija - relativni i apsolutni broj limfocita B (CD19+/CD20+)(dodatna ispitivanja navedena u tablici 55.3.)

Protočna citometrija - relativni i apsolutni broj: limfociti T (CD3+)pomagački limfociti T (CD3+CD4+)citotoksični limfociti T (CD3+CD8+)omjer CD4/CD8NK stanice (CD3-CD16+56+)(dodatna ispitivanja navedena u tablici 55.3.)

Određivanje serumske razine podrazreda IgG(IgG1-IgG4)

Stvaranje protutijela na cjepiva (npr. pneumokokni polisaharid)

In vitro proizvodnja protutijela na podražaj mitogenika (PWM) i proteina A

Proliferacija limfocita in vitro inducirana:mitogenicima (PHAa, ConAb i PWMc)antilimfocitnim protutijelima (CD3)antigenima (PPDd, tetanusni toksoid)alogeničnim stanicama (MLR)e

Analiza gena (primjeri mutacija):agamaglobinemija: Btk, CD79a i CD179bhiper IgM sindrom: TNFSF5, AICDA, UNGkasne hipogamaglobulinemije: ICOS Testovi citotoksičnosti:

NK aktivnosttestovi citotoksičnosti limfocita T

Određivanje citokina (Th1 vs. Th2):u limfocitimau nadtalogu podraženih limfocita

Enzimski test: ADAf i PNPg u lizatu eritrocitaFISH za 22q11 i 10p11 (delecija)

Analiza gena (primjeri mutacija):SCID: IL-2RG, JAK3, IL7RA, IL2R, RAG1, RAG2MHC I: TAP1, TAP2MHC II: MHC2TACD3: CD3D, CD3E, CD3G, ZAP-70Wiskot Aldrichev sindrom: WASP

a fitohemaglutinin; b konkavalin A; c korovski mitogen (engl. pokeweed mitogen); d purificirani proteinski derivat iz kulture Mycobacterium tuberculosis; ekultura pomiješanih limfocita; fadenozin deaminaza; g purin-nukleozid fosforilaza;


Funkcijski testovi limfocitaPostoje brojni testovi limfocitne funkcije, no oni su, u načelu, složeni i nestandardizirani. Stoga se u svojem radu liječnik treba osloniti na što točni-ju reprodukciju rezultata vlastitog laboratorija, a ne težiti “točnom� rezultatu. Usporedbe s vlastitim laboratorijskim kontrolama, kao i korelacija s tije-kom i ishodom bolesti posredno približavaju razu-mijevanju uloge mjerene pojave u funkciji određe-nih stanica. Funkcijski testovi limfocita T uključuju mjerenje proliferacije limfocita, analizu citokina i imunoglobulina podraženih limfocita, i testove ci-totoksičnosti.

Od funkcijskih ispitivanja limfocita najčešće se izvodi test proliferacije limfocita in vitro, dok se složenije analize izvode u specijaliziranim laboratorijima.

Aktivacija i proliferacija limfocita in vitroLimfociti se mogu aktivirati i potaknuti na poliklon-sku proliferaciju in vitro primjenom nespecifičnih aktivatora (mitogenika, superantigena, forbol-estera i antilimfocitnih protutijela), dok se aktivacija za an-tigen specifičnih receptora inducira “memorijskim� antigenima i alogeničnim molekulama HLA (tj. alo-geničnim stanicama).

Mitogenici su poliklonski aktivatori limfocita, a najče-šće se rabe lektini fitohemaglutinin (PHA), konkava-lin A (ConA) i korovski mitogen (PWM). PHA i ConA služe za procjenu aktivacije limfocita T, a zahtijevaju prisutnost monocita za stimulaciju limfocita T. Uobiča-jeni aktivatori limfocita B jesu PWM (učinak ostvaruje putem limfocita T) i stafilkokni protein A (SPA). Drugi nespecifični aktivatori limfocita jesu forbol-esteri (npr. PMA) i superantigeni, kao što je TSST. Forbol-esteri izravno aktiviraju PKC, čime se zaobilazi početna faza aktivacije limfocita putem receptora. Superantigeni aktiviraju limfocite T tako da se izravno vežu za β-la-nac TSR-a i za molekulu II. razreda HLA na antigen-predočnim stanicama. Protutijela koja se rabe za nes-pecifičnu aktivaciju limfocita T uključuju protutijela na signalnu (CD3) i kostimulacijsku molekulu (CD28), kao i na različite adhezijske molekule (npr. CD2).

Nasuprot poliklonskim aktivatorima, antigeni podra-žuju samo one limfocite koji izražavaju specifične re-ceptore za te antigene. Za mjerljivi odgovor limfocita T na antigene in vitro rabe se antigeni iz cjepiva, odnosno antigeni ubikvitarnih uzročnika, čime se is-pituje memorijski odgovor limfocita. Stoga je testira-nje antigenima manje učinkovito u dojenačkoj dobi i u malene djece. Najčešće se rabe tetanusni toksoid

Tablica 55.4. Specifični limfocitni imunofenotipovi u odabranim primarnim imunodeficijencijama

Imunofenotip Vrst stanica Imunodeficijencija

• IgM+CD24+CD38+CD19+IgM+ CD21slabo+

CD27+IgD-

• tranzicijski limfociti B (= ili ↓)• CD21slabo+ (= ili ↑)memorijski limfociti B (= ili ↓)

Oblici obične varijabilne imunodefici-jencije (CVID)

TCRαβ+CD4-CD8- ↑dvostruko negativni (CD4-CD8-) limfociti TCRαβa Autoimuni limfoproliferativni sindrom

CD4+CD154- CD154-negativni pomagački limfociti T nakon aktiva-cije in vitro

X-vezani hiper IgM sindrom

CD19+CD40- CD40-negativni limfociti B Autosomno-recesivni hiper IgM sin-drom

CD3+/HLA-ABC- HLA-ABC-negativni limfociti T Sindrom “golih� limfocita

CD20+HLA-DR-CD3+HLA-DR-

HLA-DR-negativni limfociti B i monocitiHLA-DR-negativni limfociti T nakon aktivacije in vitro Sindrom manjka HLA-DR

CD4+CD45RO+ memorijski limfociti majke Omenov sindrom

CD3+CD43- CD43 (sijaloforin)-negativni limfociti T Wiskott-Aldrichev sindrom

aTCRαβ, T-limfocitni receptor tipa αβ.


(TT), ekstrakt Candide albicans, tuberkulin (PPD) i streptolizin/streptodornaza.

Proliferacija limfocita na alogenične stanice u reakciji pomiješanih limfocita (MLR) dodatna je metoda za procjenu funkcije limfocita T. Zbog svoje relativne složenosti postupak nije u rutinskoj uporabi, nego se obično izvodi u specijaliziranim centrima za pre-sadbu krvotvornih matičnih stanica.

U procjeni stupnja aktivacije i proliferacije limfocita in vitro rabe se različite tehnike, što ovisi o veličini i opre-mljenosti laboratorija. Tradicionalni postupak mjerenja proliferacije limfocita jest metoda ugradnje radioaktiv-no obilježenog timidina ([3H-thyimidine]) u DNA proli-ferirajućih limfocita. Umjesto ugradnje radioaktivnog ti-midina, danas su razvijene sljedeće tehnike: a) mjerenje ugradnje neradioaktivnog spoja brom-deoksiuridina (BrdU) s pomoću fluorescentnih anti-BrdU protutijela i protočne citometrije; b) analiza sadržaja DNA protoč-nom citometrijom (mjeri se udio stanica u proliferaciji) i c) mjeri se izražaj aktivacijskih biljega CD69 ili CD25 na limfocitima s pomoću protočne citometrije. Treba na-pomenuti da se analizom izražaja aktivacijskih biljega (npr. CD69) na limfocitima podraženima tijekom kra-ćeg perioda (4–6 sati) ne mjeri proliferacija limfocita, nego samo početna faza, tj. aktivacija limfocita.

Analiza citokina i imunolgobulina podraženih limfocitaZa dokaz proizvodnje protutijela od podraženih lim-focita B in vitro najčešće se rabi analiza nadtaloga kultura s pomoću enzimskog imunotesta (ELISA). No, postupak se malokad izvodi u rutinskom radu.

Citokini su glavni posrednici imunoloških stanica ko-jima se ostvaruje imunološki odgovor. Početni opti-mizam glede dijagnostičke vrijednosti mjerenja razine citokina u biološkim materijalima (npr. u krvi i likvoru) polako je nestao nakon što je pokazano da ta informa-cija u većini slučajeva nema veliku kliničku vrijednost. Ipak, u pojedinim oblicima imunodeficijencija i u istra-živačke svrhe često se rabi mjerenje razine citokina podraženih limfocita in vitro. Pri tome se obično pri-mjenjuje ELISA za mjerenje izlučenih citokina u nadta-logu kultura podraženih limfocita, dok novije metode uključuju protočnu citometriju za mjerenje intracelular-

nih citokina i ELISPOT, metodu za imunocitokemijski dokaz proizvodnje citokina u pojedinom limfocitu. Tim se postupcima mogu otkriti funkcijski odjeljci po-draženih limfocita T: limfociti Th1 luče citokine (IFN-γ, TNF i IL-2) odgovorne za razvoj stanične imunosti, dok limfociti Th2 luče citokine (IL-4, IL-5, IL-10) odgovorne za sazrijevanje limfocita B i humoralne imunosti.

Mjerenje izražaja liganda CD40 (CD154) na limfocitima TTijekom aktivacije limfocita T dolazi do izražaja mo-lekule CD154, liganda za molekulu CD40 na limfocitu B. Ta je stanična interakcija posebno važna, jer omo-gućuje imunosni odgovor na antigene ovisne o timu-su (tj. o limfocitima T). Veza između liganda CD40 na limfocitu T i CD40 na limfocitu B dovodi do aktivacije limfocita B, a citokini koje izlučuje aktivirani limfo-cit T (IL-4, IFN-γ i TGF-β) omogućuje prekopčavanje imunoglobulinskog razreda u limfocitu B (IgM→IgG/IgA/IgE). U osoba s manjkom ili nedostatnom funk-cijom CD40-liganda (CD154) na limfocitima T izosta-je stanična kooperacija i mogućnost prekopčavanja imunoglobulinskog razreda ("sindrom hiper IgM"). Danas je poznato da taj sindrom uključuje nekoliko inačica, ovisno o genskom oštećenju ne samo limfo-cita T nego i limfocita B (npr. neizražaj CD40). Stoga i ne začuđuje nalaz CD154 na aktiviranim limfocitima T u dijela bolesnika sa sindromom hiper IgM.

Testovi citotoksičnostiU citotoksične testove ubrajaju se test citotoksičnost limfocita T i NK aktivnost. Oba testa primjenjuju istu metodologiju, tj. oslobađanje radioaktivnog kroma ([51Cr]) ili drugih pogodnih spojeva (npr. fluorescen-tne boje) iz prethodno obilježenih ciljnih stanica. Novije metode rabe protočnu citometriju s pomoću koje se može mjeriti udio lizirani (mrtvih) stanica ili pak sniženje udjela vitalno obilježenih (fluorescen-tih) ciljnih stanica.

Testovi citotoksičnosti limfocita T obično se ne izvode u rutinskom dijagnostičkim laboratoriju. Naj-češće se rabi test ubijanja alogeničnih (tuđih) stani-ca i test ubijanja vlastitih stanica zaraženih virusima (obično limfocita B zaraženih virusom EBV-a). U oba


slučaja ciljne stanice (alogenične stanice ili virusom za-ražene vlastite stanice) najprije se obilježe pogodnim markerom, potom inkubiraju s efektorskim (ispitiva-nim) limfocitima T, a stupanj otpuštanja markera (radi-oaktivnoga spoja ili boje) razmjeran je stupnju citolize.

NK aktivnost mjeri spontanu citolitičku aktivnost prirodnoubilačkih ili NK stanica (prema engl. na-tural killer). Za razliku od citotoksičnih limfocita T, kojima za razvoj u stanice-ubojice treba i nekoliko dana, NK stanice djelotvorne su već nakon nekoliko sati od inkubacije ciljnim stanicama. Njihova se aktiv-nost klasično mjeri testom oslobađanja radioaktivno-ga kroma iz ciljnih stanica, slično testu citotoksičnosti limfocita T. No, za razliku od citotoksičnih limfocita T, mjerenje citotoksične aktivnosti NK stanica ne za-htijeva ciljne stanice podudarne u lokusu HLA. Ciljne stanice u testu NK aktivnosti jesu stanice ljudskih tu-morskih staničnih linija, od kojih je najpoznatija linija K562. Ciljne i izvršne stanice (limfociti periferne krvi) međusobno se pomiješaju u određenim omjerima i inkubiraju tijekom 4 sata, nakon čega se izmjeri radi-oaktivost oslobođena iz ciljnih stanica. Umjesto radi-oaktivnog testa, danas se sve više rabi fluorescentna metoda s pomoću protočne citometrije.

Pretrage fagocitaSpecijalni testovi fagocita (neutrofila i monocita/makrofaga) uključuju ispitivanje adhezijskih biljega i funkcijske testove fagocita (tablica 55.5).

Izražaj adhezijskih molekula fagocitaImunodeficit zbog manjka adhezijskih molekula fa-gocita naziva se leukocitnim adhezijskim defektom tipa 1 (LAD1). Fagociti (posebice neutrofili) pokazu-ju oslabljenu kemotaksiju, adherenciju i endocitozu, a klinički se poremećaj očituje povećanim brojem leukocita, infekcijama kože (bez granuloma), peri-dontitisom i crijevnim fistulama. Uzrok poremećaja leži u nedostatku heterodimernih površinskih adhe-zijskih glikoproteina – leukocitnog funkcijskog anti-gena LFA-1/CD11a, receptora za komplement iC3b (CR2/CD11b) i receptora za komplement C3d (CR4/CD11c). Nedostatak tih molekula nastaje zbog ab-normalne biosinteze β-lanca (CD18) koji je zajednič-ki lanac svim navedenim adhezijskim receptorima.

Funkcijski testovi fagocitaAntimikrobna aktivnost fagocita može se podije-liti u četiri međusobno povezana mehanizma: a) migraciju stanica u smjeru kemijsko-biološkog po-dražaja (kemotaksija); b) adherenciju; c) fagocitozu i d) unutarstaničnu razgradnju mikroorganizama. Ispitivanje kemotaksije neutrofila in vitro može se provesti s pomoću specijalnih Boydenovih ko-morica (kemotaksija neutrofila kroz filtar u smjeru podražaja) ili u mekom agaru koji omogućuje kre-tanje neutrofila u smjeru podražaja. Fagocitoza se ispituje na različite načine: jednostavnije, metode služe citomorfološku analizu obojenih neutrofila s ingestiranim kvasnicama, dok se suvremenije me-tode temelje na protočnocitometrijskoj analizi flu-orescentnog signala neutrofila i monocita nakon fagocitoze obilježenih (fluorescentnih) bakterija. Sposobnost oksidativnog metabolizma fagocita (respiracijskoga praska, engl. respiratory burst) može se, također, ispitati na nekoliko načina. Sta-rija metoda, poznata pod nazivima redukcija boje NBT-a ili formazanski test, temelji se na pretvor-bi tetrazolijske soli NBT-a u netopljive precipitate formazana u citoplazmi i na membrani neutrofila nakon podražaja odgovarajućim tvarima (npr. for-bol-esterom). Danas, međutim, sve više prevlada-va protočnocitometrijska analiza koja se temelji na mjerenju fluorescencije stanica nakon konverzije nefluorescentnog u fluorescentni spoj unutar ne-utrofila nakon podražaja aktivatorima (npr. jono-micinom i forbol-esterom). Nesposobnost razvoja respiracijskog praska karakterističan je nalaz u bo-lesnika s kroničnom granulomatoznom bolesti. In-tenzitet fluorescencije granulocita ne otkriva samo bolesnike (negativni nalaz) nego i prenositelji ove X vezane bolesti, kao i dvije inačice (genotipa) bo-lesti – X vezanu i autosomno-recesivnu. Mikrobi-cidnu aktivnost, tj. unutarstaničnu, razgradnju mi-kroorganizama omogućuju produkti oksidativnog metabolizma (tzv. respiracijskog praska) fagocita – H2O2 i reaktivni radikali (OH- i O2

-), kao i mi-krobicidne tvari – laktoferin, lizozim i defenzini. U tom se postupku granulociti inkubiraju bakterijama i ljudskim serumom (izvorom komplementa i op-


sonina), nakon čega se u određenim vremenskim intervalima određuje broj živih bakterija u nadtalo-gu inkubacijske smjese. Metoda je prilično složena i nestandardizirana, pa se relativno rijetko izvodi.

Molekularnobiološke analizeVelik broj primarnih imunodeficijencija nastaje zbog oštećenja gena koji kodiraju molekule uključene u imunosni odgovor. Stoga je za konačnu dijagnozu bolesti potrebno učiniti molekularnu analizu na razi-ni gena i/ili biokemijsku analizu abnormalnih produ-kata (tablica 55.3). Razvoj tehnologije sekvenciranja gena na temelju fluorescencije i kapilarne elektro-foreze omogućuje još izravniju primjenu analize mutacija u velikoga broja imunodeficijencija. Ta je činjenica bitna i za genetsko savjetovanje temelje-no na prenatalnoj dijagnostici i otkrivanju nositelja mutacije. Važnost takve tehnologije pokazana je na sindromu hiper IgM: dok je prije smatran jedinstve-nim poremećajem, analiza mutacija gena pokazala je da je riječ o nekoliko tipova oštećenja gena koja zahvaćaju ne samo limfocite T nego i limfocite B. U skladu s tim je i raznolika klinička prezentacija tog sindroma. Iz navedenoga proizlazi da napredak la-boratorijske tehnologije omogućuje sve bolji uvid u razumijevanje imunopatogeneze specifičnih imuno-deficijencija, a ta činjenica postavlja nove zahtjeve pred klinički laboratorij.

SEKUNDARNE IMUNODEFICIJENCIJESekundarne imunodeficijencije mnogo su češće od primarnih, a nastaju kao rezultat mnogobrojnih pa-toloških stanja. Najčešće uzroci stečene imunode-ficijencije jesu pothranjenost, metaboličke bolesti (šećerna bolest, Cushingov sindrom), zarazne bole-sti (AIDS, citomegalovirus), autoimune bolesti (npr. SLE), opsežne ozljede (posebice toplinske), primjena imunosupresijskih lijekova i zračenja, kao i presadba tkiva i organa. Oštećenje može zahvatiti nespecifič-nu (npr. kožu, sluznice i njihove izlučine, normalnu mikrobnu floru, granulocite i fagocitozu, NK stanice i komplement) i specifičnu imunost (limfocite T i B, odnosno protutijela). No, u većine imunokompromi-tiranih bolesnika postoji združen poremećaj obrane, kao što je npr. oštećenje sluznice zračenjem i citosta-ticima i smanjen broj lekocita u krvi.

Dijagnostika sekundarnih imunodeficijencijaU načelu, laboratorijska dijagnostika sekundarnih imunodeficijencija ne razlikuje se od dijagnostike primarnih imunodeficijencija. U oba slučaja labora-torijska dijagnostika ima za cilj i predviđanje vrste po-tencijalne zaraze, jer zaraze u takvih bolesnika često imaju atipični oblik i više uzročnika (npr. pneumonija uzrokovana citomegalovirusom i Pneumocystis sp. u bolesnika s presađenom koštanom srži) (tablica 55.1).

Tablica 44.5. Specijalni testovi fagocita u dijagnostici primarnih imunodeficijencijskih sindroma

Oksidativni prasak (NBT-test, protočna citometrija)

Protočna citometrija za analizu izražaja adhezijskih molekula (CD11/CD18)

Kemotaksija

Fagocitoza

Enzimski test MPO-e i G6PD-e

Mikrobicidna aktivnost fagocita

Biopsija koštane srži

Analiza gena (primjeri mutacija):• X-vezana kronična granulomatozna bolest: CYBB• autosomno-recesivna kronična granulomatozna bolest: CYBA, NCF1, NCF2• manjak leukocitnih adhezijskih molekula: ITGB2, FLJ11320• Chediak-Higashijev sindrom: LYST


NOVIJE SPECIJALNE PRETRAGE LIMFOCITARiječ je o testovima koji su do prije koju godinu bili mahom eksperimentalni, a danas su neki od njih postali sastavnim dijelom novorođenačkog probira na tešku združenu imunodericijenciju. Među njima su izdvajaju T-stanična spektratipizacija (engl. T-cell spectratyping), tehnologija MHC/HLA-tetramera te analiza TREC-a.

T-stanična spektratipizacija označuje analizu varijabil-nih regija β-lanaca (Vβ) receptora limfocita T s pomo-ću metode PCR. U normalnim su prilikama sve obitelji Vβ-lanaca (n=24) podjednako zastupljene u receptori-ma limfocita T, što upućuje na poliklonsku narav lim-focita T u periferiji. U nekim imunodefcijencijama (npr. u Omenovu sindromu) i nakon presadbe krvotvornih stanica, nalazi se ograničen broj obitelji Vβ-lanaca re-ceptora limfocita T u krvi i u tkivima. Taj nalaz govori u prilog oligoklonskog razvoja limfocita T.

Tehnologija HLA/MHC tetramera važna je za određi-vanje broja antigen specifičnih limfocita T, posebice u istraživanjima virusnih zaraza, cijepljenja i auto-imunosti, pa je za sada ograničena na specijalizirane istraživačke centre.

Analiza TREC-a. Pojednostavnjeno, tijekom razvoja limfocita T, višak genskog materijala koji je odgovo-ran za receptor limfocita T biva izrezan iz DNA i tvori kružne strukture unutar stanice (TRECs). Novonastali (naivni) limfociti T jesu TREC+ stanice, dok limfociti T nakon podražaja i dioba gube TREC, pa se smanju-je i ukupni udio TREC+ stanica u periferiji. Metoda se najčešće rabila u istraživanju T-staničnih imunodefi-cijencija (npr. Di Georgeova sindroma) i oporavka limfocita T nakon transplantacije krvnotvornih ma-tičnih stanica. Danas je, međutim, postala rutinskom metodom novorođenačkog probira na SCID i teške limfopenije T u dijela saveznih država SAD-a što go-vori u prilog što ranijeg otkrivanja poremećaja prije nego što dođe do infekcija i trajnog oštećenje tkiva.

Mogućnosti ispitivanja imunološkog sustava sve su veće, posebice kada se to pitanje razmatra u sklopu suvremenih laboratorijskih tehnika. No, pravi izazov za laboratorij jest prijenos sve složenijih laboratorij-skih tehnika u klinike i kliničke laboratorije. Bez ulaska suvremenih tehnologija i metoda u rutinski laboratorij ne će biti moguće odgovoriti na sve veće zahtjeve za brzom i pouzdanom dijagnostikom, a time i odgovarajućim liječenjem bolesnika s imuno-deficijencijom.

LITERATURABatnić D. Laboratorijska dijagnostika imuno deficijencijskih sindroma. Paediatr Croat 2005;49(1):39-47.

Batinić D, Malenica B. Racionalni pristup laboratorijskoj dija-gnostici imunoloških poremećaja. Paediatr Croat 2012;56(Supl 1):53-61.

Bonilla FA, Bernstein IL, Khan DA, Ballas ZK, Chinen J, Frank MM, et al. Practice parameter for the diagnosis and manage-ment of primary immunodeficiency. Ann Allergy Asthma Immunol 2005;94(5 Suppl 1):S1-63.

Cant A, Battersby A. When to think of immunodeficiency? Adv Exp Med Biol 2013;764:167-77.

Kelly BT, Tam JS, Verbsky JW, Routes JM. Screening for seve-re combined immunodeficiency in neonates. Clin Epidemiol 2013;5:363-9.

Marodi L, Notarangelo LD. Immunological and genetic ba-ses of new primary immunodeficiencies. Nat Rev Immunol 2007;7:851-61.

Notarangelo LD. Primary immunodeficiencies. J Allergy Clin Immunol 2010;125(2 Suppl 2):S182-94.

Reust CE. Evaluation of primary immunodeficiency disease in children. Am Fam Physician 2013;87(11):773-8.

Somech R, Amariglio N, Spirer Z, Rechavi G. Genetic pre-disposition to infectious pathogens: a review of less familiar variants. Pediatr Infect Dis J 2003;22(5):457-61.

Wehr C, Kivioja T, Schmitt C, Ferry B, Witte T, Eren E, et al. The EUROclass trial: defining subgroups in common variable immunodeficiency. Blood 2008;111(1):77-85.


Pitanja i odgovori

1. Na što ukazuje manjak izohemaglutinina u djeteta krvne grupe AB?

Normalan fiziološki nalaz.

2. Što treba znati pri analizi limfocitnih subpopulacija periferne krvi?

Apsolutni broj je važniji podatak od relativnog broja.

3. U kojih bolesnika je nemogućnost razvoja respiracijskog praska u granulocitima karakterističan nalaz?

U bolesnika s kroničnom granulomatoznom bolešću.

4. Čime treba biti završena moderna dijagnostika primarnih imunodeficijencijskih sindroma?

Dijagnostiku treba završiti molekularnom analizom na razini gena i/ili biokemijskom analizom (produkta).

5. Koji navod nije točan za funkcijske testove imunosnih stanica in vitro:

Moguća je pouzdana usporedba kvantitativnih rezultata između laboratorija; oslanjaju se na reprodukciju re-zultata vlastitog laboratorija; radi se o složenim testovima; uglavnom su nestandardizirani, korelacija s tijekom bolesti posredno približava razumijevanje njihove uloge u imunopatogenezi bolesti.

533

HEMOSTAZAHemostaza predstavlja složeni proces međusobno povezanih reakcija koje sudjeluju u zaustavljanju krvare-nja nakon ozljede krvne žile. Prema preciznijoj kliničkoj definiciji hemostaza je obrambeni mehanizam koji održavanjem krvi u tekućem stanju i kontroliranim sprječavanjem prekomjernog gubitka krvi iz intravasku-larnog prostora neprekidno štiti organizam od krvarenja i patoloških trombotičkih događaja kao što su infarkt miokarda, moždani udar, arterijska ili duboka venska tromboza (DVT).

Fiziološka hemostaza uključuje uravnoteženo međudjelovanje trombocita s brojnim prokoagulacijskim i an-tikoagulacijskim čimbenicima (faktorima zgrušavanja i njihovim inhibitorima) s endotelom krvnih žila. Svaki poremećaj ravnoteže između prokoagulacijskih i antikoagulacijskih čimbenika bez obzira na uzrok rezultira patološkom hemostazom, pa tako pojačano djelovanje antikoagulacijskih čimbenika nakon ozljede krvne žile uzrokuje različite stupnjeve krvarenja, dok pojačana aktivnost prokoagulacijskih čimbenika rezultira prekomjernom aktivacijom sustava zgrušavanja i posljedičnom trombozom.

Proces hemostaze uključuje tri osnovne faze: primarnu hemostazu (prva faza) u kojoj nastaje trombocitni ugrušak, sekundarnu hemostazu tj. proces zgrušavanja krvi (druga faza) koju karakterizira nastajanje fibrin-skog ugruška na mjestu nastalog trombocitnog ugruška, te fibrinolizu (treća faza) u kojoj se odvija proces liziranja stvorenog fibrinskog ugruška.

Primarna hemostazaPrimarna hemostaza je proces interakcije (međudjelovanja) trombocita s elementima oštećene stijenke krvne žile koji rezultira nastajanjem trombocitnog ugruška. Proces primarne hemostaze uključuje slijed međusobno povezanih reakcija koji se sastoji od adhezije (priljubljivanja) trombocita na komponente subendotela, ak-

P o g l a v l j e 56.

Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze

Désirée Coen Herak i Marija Miloš


tiviranja i promjene oblika trombocita, lučenja sadr-žaja iz trombocitnih granula što u konačnici dovodi do agregacije trombocita i retrakcije ugruška. Nepo-sredno nakon ozljede krvne žile započinje proces primarne hemostaze početnim priljubljivanjem trom-bocita na izloženi subendotelni vanstanični matriks. U subendotelnom vanstaničnom matriksu nalazi se veći broj različitih liganada kao što su kolagen, von Willebrandov faktor (VWF), laminin, fibronektin i trombospondin, koji se vežu na različite trombocit-ne receptore, što omogućuje čvrsto priljubljivanje (adheziju) i aktiviranja trombocita te lučenje sadr-žaja iz trombocitnih granula. Trombocitne α- i guste granule sadrže brojne aktivne spojeve od kojih su adenozin difosfat (ADP), adenozin trifosfat (ATP) i serotonin snažni aktivatori trombocita koji svojim izravnim djelovanjem pojačavaju proces primarne hemostaze. Trombociti također sintetiziraju farma-kološki aktivne molekule tromboksan A2 i aktivi-rajući faktor trombocita koji se vežu na specifične membranske receptore drugih trombocita, privlače i aktiviraju nove trombocite i time doprinose naku-pljanju trombocita. Istodobno kao posljedica akti-vacije trombocita dolazi do premještanja negativno nabijenih fosfolipida iz unutarnjeg u vanjski mem-branski dvosloj i dramatičnog povećanja sadržaja fosfatidilserina na vanjskoj strani membrane, čime se stvara kritična katalitička površina za aktiviranje faktora zgrušavanja.

Normalno odvijanje primarne hemostaze nije mogu-će bez aktivnog međudjelovanje trombocita s faktori-ma zgrušavanja: VWF i fibrinogenom, koji predstav-ljaju dva najvažnija adhezijska proteina u primarnoj hemostazi. VWF je veliki multimerični glikoprotein (GP) koji se osim u subendotelnom matriksu nalazi u plazmi, α- granulama i Weibel-Paladijevim tjelešcima i čini poveznicu između tkiva i trombocita. Veže se na izloženi kolagen, te na trombocite preko veznog mjesta koji se nalazi na GP Ibα, glavnom receptoru za VWF i sastavnom dijelu kompleksa GPIb/IX/V. Si-metrična struktura molekule fibrinogena omogućuje međusobno povezivanje trombocita vezanjem na ak-tivirani trombocitni receptor GPIIb/IIIa što rezultira agregacijom trombocita i nastankom trombocitnog

ugruška. Trombocitni ugrušak samo je privremena mjera za zaustavljanje krvarenja, dok se aktivacijom sustava zgrušavanja i stvaranjem trombina slijedom međusobno povezanih i kontroliranih reakcija u procesu sekundarne hemostaze nastali trombocitni ugrušak stabilizira i učvršćuje pomoću niti fibrinskih polimera.

Sekundarna hemostazaRazličiti modeli sustava zgrušavanja krvi mijenjali su se tijekom vremena ovisno o trenutnim spoznajama pojedinih komponenata sustava zgrušavanja i njiho-vim funkcijama. Doprinos u razumijevanju hemostat-skog procesa omogućilo je otkriće staničnog modela zgrušavanja krvi. Za razliku od kaskadnog modela prema kojem nakon ozljede krvne žile fibrinski ugru-šak nastaje aktivacijom unutarnjeg ili vanjskog puta zgrušavanja, stanični model pojašnjava i dokazuje kako unutarnji i vanjski put zgrušavanja nisu dva odvojena i neovisna mehanizma, već se međusobno isprepliću i zajedno sudjeluju u procesu zgrušavanja krvi. Prema staničnom modelu reakcije zgrušava-nja krvi odvijaju se na TF-stanicama, trombocitima i endotelnim stanicama, koje s obzirom na njihova prokoagulacijska ili antikoagulacijska svojstva ima-ju različite uloge u procesu zgrušavanja. Pri tome trombociti zauzimaju središnju ulogu u podržavanju prokoagulacijskih reakcija, dok su endotelne stanice krvnih žila nužne za održavanje antikoagulacijskih osobina krvnih žila. U procesu zgrušavanja razlikuju se 3 faze: početna, amplifikacijska i propagacijska faza (Slika 56.1.).

Početna faza zgrušavanja započinje nakon ozljede krvne žile vezanjem plazmatskog FVII, od kojeg se 1-2 % nalazi u aktivnom obliku (FVIIa), s tkivnim faktorom (TF) vezanim na membrani ekstravasku-larne stanice koja sintetizira TF (TF-stanica, npr. fi-broblasta). Aktivni enzimski kompleks staničnog TF i FVIIa (TF-VIIa) aktivira FVII vezan na površini sta-nice koja izražava TF u kompleks TF-VIIa koji akti-vira FIX i FX u aktivne serinske proteaze FIXa i FXa. FIXa napušta TF-stanicu i veže se na trombocitnu površinu. FXa može aktivirati plazmatski FV, a FXa koji ostaje vezan na površini stanice koja nosi TF,

Hemostaza i laboratorijska dijagnostika poremećaja hemostaze | 535

veže se u kompleks s FVa koji iz protrombina stvara malu količinu trombina. Stvorena količina trombina predstavlja <5 % ukupne količine trombina koji na-staje u procesu zgrušavanja, te je dovoljna samo za aktivaciju nekih faktora zgrušavanja (FV, FVIII i FXI) i trombocita, ali ne i za pretvorbu fibrinogena u fibrin i nastajanje hemostatskog ugruška.

Amplifikacijska faza zgrušavanja započinje ak-tivacijom faktora zgrušavanja V, VIII i XI. U plazmi se FVIII nalazi u kompleksu s VWF koji služi kao specifični nosač FVIII i štiti ga od prerane proteoli-tičke razgradnje. VWF se veže na trombocitni GPIbα, na koji se veže i trombin i to u neposrednoj blizini kompleksa FVIII-VWF. Trombin aktivira FVIII i otcje-pljuje FVIIIa iz kompleksa s VWF, pa se relativno ne-stabilni FVIIIa stvara izravno na trombocitnoj povr-šini i na istoj veže preko specifičnog veznog mjesta. Nanomolarna količina trombina nastalog u početnoj fazi zgrušavanja aktivira FV i FXI koji se vežu na trombocite adherirane na ekstravaskularnim kom-ponentama matriksa na mjestu ozljede krvne žile. Proces vezanja na proteine matriksa, posebice na kolagen, djelomično aktivira trombocite i lokalizira ih na mjestu izlaganja TF. Trombin je najsnažniji fizi-ološki agonist trombocita, a za maksimalni hemostat-ski učinak trombocita nužno je vezanje trombina na tri različita vezna proteina: GPIbα i dva transmem-

branska receptora iz superobitelji proteazom aktivi-ranih receptora (PARs) vezanih na protein G, PAR1 i PAR4. Vezanje trombina na kompleks GPIb/IX/V značajno olakšava aktivaciju PAR1 te katalizira akti-vaciju trombocita. Trombin hidrolitičkim cijepanjem aktivira PAR1 i PAR4, a signal se u stanicu prenosi preko proteina G, s tim što PAR1 potiče aktivaciju trombocita kod niskih koncentracija trombina, dok PAR4 doprinosi aktivaciji trombocita samo kod viso-kih koncentracija trombina.

Rezultat aktivacije trombocita je izlučivanje hemo-statski aktivnih tvari iz trombocita među kojima i četiri faktora zgrušavanja pohranjenih u α-granula-ma i citoplazmi trombocita (fibrinogena, FV, FXI i FXIII), koji izravno sudjeluju u nastajanju stabilnog fibrinskog ugruška. Aktivacija trombocita, FV, FVIII i FXI omogućava nastajanje prokoagulacijskih kom-pleksa i velike količine trombina u propagacijskoj fazi zgrušavanja, s tim što se na površinu aktiviranih trombocita prvo vežu aktivirani kofaktori Va i VIIIa te FXIa, pa tek nakon toga faktori zgrušavanja koji čine prokoagulacijske enzimske komplekse.

Propagacijska faza zgrušavanja započinje veza-njem FIXa, nastalog aktiviranjem FIX djelovanjem kompleksa TF-VIIa, na površinu trombocita. Dodat-na količina FIXa nastaje i drugim mehanizmom, dje-lovanjem prethodno vezanog FXIa na trombocitnoj

VIIa

VIIa

IXa IX

IX

XIa

XIa

XII

(IIa)

Va

XIa VIIIa

Xa

XI

X

Xa

II

(IIa)

VVIII/VWF

Trombin

TROMBIN

Fibrinogen

Fibrin

TF-stanica

TF Va

TF

Trombocit

Aktiviranitrombocit

VaVIIIa

Slika 56.1. Prikaz svih procesa koji se odvijaju tijekom procesa zgrušavanja krvi (početne, amplifikacijske i propagacijske faze zgrušavanja) prema staničnom modelu zgrušavanja


površini na FIX. Vezani FIXa stvara s vezanim FVIIIa tenazni enzimski kompleks, što predstavlja osnovu za nastajanje fiziološki značajnih koncentracija FXa na aktiviranoj trombocitnoj membrani. Tenazni kompleks 105-106 puta brže aktivira FX od samog FIXa te 50-100 puta brže od kompleksa TF-FVIIa. Enzimskom aktivnošću tenaznog kompleksa FIXa-FVIIIa nastaje >90 % od ukupno stvorenog FXa. U protrombinazni kompleks može se vezati jedino FXa koji je nastao na površini trombocita jer je zaštićen od djelovanja nekoliko inhibitora zgrušavanja: ini-bitora puta TF (TFPI), antitrombina (AT) i heparina, što omogućuje vezanje s FVa u kompleks koji ima aktivnost protrombinaze. Za razliku od toga FXa koji nastaje djelovanjem kompleksa TF-VIIa na FX biva inhibiran prije nego što dođe u blizinu aktiviranih trombocita. Djelovanjem protrombinaze nastaje do-statna koncentracija trombina za nastajanje stabilnog fibrinskog ugruška. Trombin prvo iz fibrinogena otcjepljuje fibrinopeptide A i B te aktivira FXIII u aktivnu transglutaminazu što omogućuje polimeri-zaciju fibrinskih vlakana i učvršćivanje fibrinskog ugruška.

Različiti proteini koji sudjeluju u procesu zgrušava-nja krvi (faktori zgrušavanja) nalaze se u cirkulaciji u različitim koncentracijama, ovisno o njihovim spe-cifičnim ulogama (Tablica 56.1.). Komponente koje sudjeluju u ranoj fazi zgrušavanja nalaze se u mnogo manjim koncentracijama u odnosu na one faktore koji sudjeluju u kasnijim fazama zgrušavanja. Visoka koncentracija fibrinogena neophodna je za nastaja-nje fibrinskog ugruška, dok je niska koncentracija FVIII dostatna za aktivaciju FX. Od faktora ovisnih o vitaminu K, FVII se nalazi u najnižoj koncentraciji, FIX i FX u intermedijarnim, a FII u najvišoj koncen-traciji. Prirodni inhibitori zgrušavanja su uglavnom inhibitori serinskih proteaza, osiguravaju lokalizira-no zgrušavanje samo na mjestu oštećenja krvne žile. Hemostatski najvažniji prirodni inhibitori zgrušava-nja s antikoagulacijskim djelovanjem su: AT koji in-hibira IXa, Xa, XIa i kompleks TF-VIIa, heparinski kofaktor II, TFPI koji inhibira TF, VIIa i Xa, protein C koji u aktiviranom obliku inhibira Va i VIIIa i protein S (Tablica 56.1.).

FibrinolizaFibrinoliza je proces liziranja stvorenog fibrinskog ugruška koji na taj način regulira lokalizirano stva-ranje ugruška, a u najvećoj mjeri ovisi o aktivaci-ji plazminogena. Plazminogen se može aktivirati djelovanjem tkivnog ili urokinaznog aktivatora plazminogena pri čemu nastaje ključni enzim fi-brinolitičkog sustava plazmin. Iako plazmin može hidrolizirati nekoliko različitih supstrata, najzna-čajnije je njegovo djelovanje na fibrinogen i fibrin. Razgradnja fibrinskog ugruška odvija se stupnjevito pri čemu nastaju razgradni produkti različite mole-kularne mase. Završni, odnosno najmanji razgradni produkt nastao fibrinolitičkim djelovanjem plazmina na umreženi fibrin je D-dimer približne molekularne mase od 190 kDa, koji se sastoji od 2 kovalentno povezane D-domene susjednih γ-lanaca fibrinskog polimera.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA POREMEĆAJA HEMOSTAZELaboratorijska dijagnostika ima ključnu ulogu u dija-gnostici i praćenju većine hemostatskih poremećaja, kao i praćenju antikoagulacijske i nadomjesne tera-pije. Načelno, u dijagnostici hemostatskih poreme-ćaja preporuča se postupni dijagnostički pristup, pa se u tu svrhu provode različite pretrage prve (pre-trage probiranja), druge (određivanje funkcionalnih aktivnosti pojedinih komponenti, pretrage funkcije trombocita) i treće razine koje se izvode samo u spe-cijaliziranim laboratorijima (određivanje prisutnosti nespecifičnih i specifičnih inhibitora zgrušavanja, određivanje koncentracije antigenih komponenti pojedinih komponenti),

Pretrage probiranja u hemostazi (Osnovne koagulacijske pretrage)Za laboratorijsko otkrivanje većine klinički važnih hemostatskih poremećaja u prvom se koraku izvode pretrage probiranja (globalne pretrage): protrombin-sko vrijeme (PV), aktivirano parcijalno trombopla-stinsko vrijeme (APTV), fibrinogen (Fbg) i rjeđe


Tablica 56.1. Karakteristike (značajke) faktora zgrušavanja i prirodnih inhibitora zgrušavanja

Protein (kratica) Kromosom Funkcija In vivot1/2 (h)

Koncentracijau plazmi (nM)

Kliničko stanje

Krvarenje Tromboza

Fibrinogen (FI) 4q23-q32 Supstrat 100-150 7600 + +

Protrombin (FII) 11p11 Neaktivna serinska proteaza ovisna o vita-minu K

50-120 1400 + +

Tkivni faktor (FIII) 1p22-p21 Receptor-kofaktor / / / /

Faktor V (FV) 1q21-25 Prokofaktor 12-36 20 + +

Faktor VII (FVII) 13q34 Neaktivnaserinska proteaza ovi-sna o vitaminu K

4-6 10 + +

Faktor VIII (FVIII) Xq28 Prokofaktor 10-16 0,7 + +

Faktor IX (FIX) Xq27.1-q27.2 Neaktivnaserinska proteaza ovi-sna o vitaminu K

18-24 90 +

Faktor X (FX) 13q32-qter Neaktivnaserinska proteaza ovi-sna o vitaminu K

36-48 170 +

Faktor XI (FXI) 4q35 Neaktivnaserinska proteaza

40-80 30 +

Faktor XII (FXII) 5q33-qter Neaktivna serinska pro-teaza kontaktni faktor

50-70 375 +?

Prekalikrein (PK) 4q34-q35 Neaktivna serinska proteaza

35 450

Visokomolekularni kininogen (HMWK)

3q26qter Kofaktor 150 6000

Faktor XIII (FXIII)FXIIIAFXIIIB

6p24-251q31-q32.1

Neaktivna transgluta-minaza

150-300 90 +

Von Willebrandov faktor (VWF)

12p13.13 Medijator 24 + +?

Antitrombin (AT) 1q22-25 Inhibitor serinskih proteaza

50-70 3400 +

Protein C (PC) 2q14-21 Neaktivna serinska proteaza ovisna o vita-minu K

6-8 60 +

Protein S (PS) 3q11.2 Kofaktor ovisan o vita-minu K

42 300 +

Trombomodulin (TM) 20p12-cen Receptor-kofaktor / / +?

Heparinski kofaktor II (HC II)

22q11 Inhibitor serinskih proteaza

1200 +/-

Inhibitor puta tkivnog faktora (TFPI)

2q31-32.1 Inhibitor tipa Kunitz / 2,5 +?

Inhibitor fibrinolize aktiviran trombinom (TAFI)

13q14.11 Neaktivnaprokarboksipeptidaza

0,17 75 +?

t1/2-vrijeme poluživota


trombinsko vrijeme (TV), kao i broj trombocita, dok se pretrage funkcije trombocita obično ne izvode u okviru osnovnog ispitivanja. Rezultati pretrage pro-biranja unutar referentnih intervala ne isključuju mo-gućnost postojanja blagog manjka pojedinih faktora zgrušavanja, te je stoga bitno rezultate interpretirati zajedno s podacima iz osobne i obiteljske anamneze. U tablici 56.2. prikazani su najčešći mogući uzroci dobivenih rezultata pretraga probiranja. Slijede pre-trage mjerenja aktivnosti pojedinačnih faktora zgru-šavanja kao i metode miješanja s normalnom plaz-mom.

Protrombinsko vrijeme (PV)PV je globalna koagulacijska pretraga kod koje se mjeri brzina nastanka ugruška (u sekundama) u re-akcijskom sustavu u kojem se u uzorak citratne plaz-me dodaje reagens tromboplastin (TF) i kalcij. TF iz reagensa veže i aktivira FVII što rezultira aktivacijom vanjskog puta zgrušavanja, nastankom trombina i ugruška. Dobiveni rezultat ovisi o aktivnostima FII, FV, FVII, FX i fibrinogena. PV se koristi kao pretra-ga probira na nasljedne i stečene poremećaje „vanj-skog� i „zajedničkog� puta zgrušavanja te kao pretra-ga laboratorijskog praćenja oralne antikoagulacijske

Tablica 56.2. Mogući uzroci i tumačenje rezultata hemostatskih pretraga probiranja

PretragaMogući uzrok (poremećaj)

PV APTV Fbg TV Broj trombocita

NN N N N Poremećaj stijenke krvnih žila

Poremećaj funkcije trombocitaManjak FXIII ili inhibitora plazminavon Willebrandova bolest

P N N N N Manjak FVIIPočetna faza oralne antikoagulacijske terapije

N P N N N Manjak FVIII, FIX, FXI, FXII, PK ili HMWKvon Willebrandova bolestInhibitori na FVIII, FIX, FXI ili FXIILupus anticoagulant

N ili P N ili P N N N Niskomolekularni heparinDirektni inhibitori FX

P P N N N Manjak vitamina KOralna antikoagulacijska terapijaManjak FII, FV ili FXInhibitori na FII, FV ili FX Kombinirani manjak FV i FVIII

N ili P P N P N Visokomolekularni heparin

P P N P N Direktni inhibitori trombina

P P ↓ P N Bolesti jetreAfibrinogenemija, hipo-ili disfibrinogenemijaHiperfibrinoliza

N N N N ↓ Trombocitopenija

P P N ili ↓ N ↓ Bolesti jetre

P P N ili ↓ P ↓ Diseminirana intravaskularna koagulacija Masivna transfuzijaAkutna bolest jetre

N-rezultat unutar referentnog intervala; P-rezultat izvan referentnog intervala: PV<0,70, APTV i TV-rezultat iznad gornje granice referen-tnog intervala


terapije (Slika 56.2.). Slika 56.3. prikazuje preporu-čeni algoritam laboratorijskog ispitivanja sniženog rezultata PV udjela.

Aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTV)APTV je globalna koagulacijska pretraga kod koje se uzorak citratne plazme prethodno inkubira s re-agensom koji se sastoji od fosfolipida i aktivatora kontaktnog sustava (kaolin, silika, elaginska kiseli-na), pri čemu dolazi do aktivacije FXII, FXI i FIX. Nakon dodatka kalcija u reakcijsku smjesu dolazi do aktivacije FX i kaskade reakcija koje rezultiraju nastankom trombina i ugruška, što se zabilježi kao vrijeme nastanka ugruška (u sekundama. Dobiveni rezultat ovisi o aktivnostima FII, FV, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII i fibrinogena (Slika 56.2.). APTV se koristi kao pretraga probira na nasljedne i stečene pore-mećaje „unutarnjeg� puta zgrušavanja, na prisutnost

lupus antikoagulanta te kao metoda laboratorijskog praćenja heparinske terapije. Slika 56.4. prikazuje preporučeni algoritam laboratorijskog ispitivanja produljenog rezultata APTV-a (sekunde).

Fibrinogen (Fbg)Preporučena metoda za mjerenje aktivnosti Fbg je Claussova metoda kod koje se mjeri vrijeme zgru-šavanja razrijeđenog uzorka citratne plazme nakon dodatka standardizirane koncentracije trombina u suvišku (Slika 56.2.), a dobiveno vrijeme zgrušava-nja razmjerno je aktivnosti fibrinogena u uzorku u g/L. Mjerenje aktivnosti Fbg koristi se za otkrivanje nasljednog ili stečenog poremećaja sinteze fibrino-gena (afibrinogenemija, hipofibrinogenemija, disfi-brinogenemija), povećane potrošnje u diseminiranoj intravaskularnoj koagulaciji (DIK-u), u primarnoj fibrinogenolizi, za praćenje trombolitičke terapije i kao rizičnog faktora arterijske tromboze.

HMWKPK FXII

FXIIa

FXI

FXIa

FIXaFVIIIa

FVIII

FII FIIa

FVa FV

FXa

FVIIa

FVII

TFCa2+

Ca2+

Ca2+

FIXFX

FibrinFibrinogen

Tromboplastin

APTV reagens(aktivator + fosfolipidi)

TV

PV

APTV

UNUTARNJI PUT

VANJSKI PUT

Trombin

Slika 56.2. Pojednostavljeni shematski prikaz sustava zgrušavanja krvi prema kaskadnom modelu kojim se objašnjavaju hemostatske pretrage probiranja: aktivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTV), protrombinsko vrijeme (PV) i trombinsko vrijeme (TV)


Na vrijednosti fibrinogena utječu dob, spol, puše-nje, stres te ukupna tjelesna masa, a porast kon-centracija fibrinogena opažen je sa starosnom dobi, kod pušača i u trudnoći. Snižene vrijedno-sti fibrinogena (g/L) mogu biti rezultat smanjene sinteze fibrinogena u jetri, (npr. ciroza jetre i kod otrovanja) ili njegove povećane potrošnje kao npr. u DIK-u.

Trombinsko vrijeme (TV)TV je koagulacijska pretraga kod koje se mjeri brzi-na nastanka ugruška (u sekundama) u reakcijskom sustavu u kojem se u uzorak citratne plazme dodaje reagens trombin koji prevodi fibrinogen u fibrin (Slika 56.2.). Određivanje TV se koristi kao pretraga probi-ranja na poremećaje nastajanja fibrina, u slučajevima

sumnje na afibrinogenemiju, hipofibrinogenemiju i disfibri-nogenemiju, te za razlikovanje poremećaja stvaranja fibrina od stanja uslijed prisutstva he-parina u uzorku.

Mjerenje aktivnosti pojedinačnih faktora zgrušavanjaZa mjerenje aktivnosti poje-dinačnih faktora zgrušavanja najčešće se koristi koagulacij-ska metoda u jednom stupnju koja predstavlja prilagođenu metodu PV za FII, FV, FVII i FX i prilagođenu metodu APTV za FVIII, FIX, FXI i FXII. Metoda se temelji na svojstvu razrijeđene citratne plazme bolesnika da skrati tj. korigi-ra PV ili APTV plazme koja ima aktivnost mjerenog fak-tora <0,01 kIU/L (deficijentna plazma). S obzirom da su u reakcijskom sustavu u suviš-ku prisutni svi faktori zgruša-vanja osim mjerenog faktora,

Slika 56.3. Preporučeni algoritam ispitivanje sniženog PV-a

snižen PV

specifični inhibitorina faktore zgrušavanja

(rijetko kupus antikoagulant)

snižen PV

miješanje s normalnomplazmom

aktivnost faktorazgrušavanja VII

normalan PV

Slika 56.4. Preporučeni algoritam ispitivanja produljenog APTV-a

miješanje s normalnomplazmom

normalan APTV

aktivnost faktorazgrušavanjaVIII, IX, XI i XII

produljen APTV

produljen APTV

pretrage na prisutnostlupus antikoagulanta

pozitivne

lupusantikoagulant

negativne

specifični inhibitorina faktore zgrušavanja


vrijeme nastanka ugruška ovisno je samo o aktiv-nosti ispitivanog faktora u uzorku plazme. Analizu je potrebno izvoditi u 3 razrjeđenja uzorka citratne plazme, kako bi se dobila točna aktivnost mjerenog faktora zgrušavanja i isključila moguća prisutnost in-hibitora zgrušavanja (npr. lupus antikoagulant).

Metode miješanja s normalnom plazmomMetodama miješanja s normalnom plazmom ispituje se uzrok sniženog PV-a ili produljenog APTV-a. Na-kon miješanja uzorka citratne plazme s normalnom plazmom u omjeru 1:1 ponavlja se mjerenje PV i/ili APTV. Potpuna korekcija rezultata upućuje na sniže-nu aktivnost faktora zgrušavanja dok nepotpuna ko-rekcija rezultata ukazuje na inhibiciju koagulacijske reakcije specifičnim inhibitorima usmjerenim na fak-tore zgrušavanja ili nespecifičnim inhibitorima kao što je lupus antikoagulant. Metoda je osobito korisna za ispitivanje produljenog APTV-a, dok je sniženi PV u većini slučajeva posljedica smanjene aktivnosti fak-tora zgrušavanja.

D-dimeri Određivanje koncentracije D-dimera izvodi se enzi-mimunokemijskom analizom uporabom monoklon-skih antitijela specifičnih za epitope koji sa nalaze na fibrinskom fragmentu D-dimer, ali ne i na fibrino-genskom fragmentu D, drugim razgradnim produk-tima fibrinogena ili nativnom fibrinogenu, u uzorku plazme ili pune krvi. Referentni interval i granična vrijednost za isključivanje tromboze ovisna je o re-agensu i sustavu koji se primjenjuju za određivanje koncentracije D-dimera. Koncentracija D-dimera glo-balni je pokazatelj stvaranja fibrina in vivo i predstav-lja izrazito osjetljiv, ali nespecifičan parametar, pa se na temelju povišene koncentracije D-dimera ne može pouzdano utvrditi dijagnoza. Niske koncentracije D-dimera normalno su prisutne u plazmi zdravih osoba, a smatra se da su rezultat fiziološke fibrinolize. U ra-zličitim patološkim stanjima kao npr. DIK-u i venskoj tromboemboliji koja uključuje DVT i plućnu emboliju (PE), prekomjerno stvaranje fibrina može uzrokovati nastajanje intravaskularnih tromba. Kao rezultat fibri-nolize dolazi do porasta koncentracija D-dimera, čije

vrijednosti mogu biti i do 100 puta više od normalnih vrijednosti. Koncentracija D-dimera može biti povi-šena i nakon većih operativnih zahvata, traume, u malignim bolestima, bolestima jetre, bolesti srpastih stanica, sepsi i preeklampsiji itd. D-dimeri imaju vi-soku negativnu prediktivnu vrijednost jer vrijednosti niže od granične vrijednosti isključuju trombozu.

Pretrage funkcije trombocitaTrombociti imaju važnu ulogu u održavanju normalno-ga hemostatskog odgovora za koju je uz normalan broj nužna i njihova normalna funkcija. Bolesnici s pore-mećajima broja (kvantitativnim) i/ili funkcije (kvalita-tivnim) trombocita uobičajeno imaju krvarenja u kožu i sluznice različitog stupnja te pojačano krvare nakon operacije ili traume. Stoga su pretrage funkcije trom-bocita nužne za utvrđivanje mogućeg uzroka krvare-nja, za razlikovanje poremećaja funkcije trombocita od koagulacijskih poremećaja i postavljanje dijagnoze na-sljednih i stečenih poremećaja krvarenja. Poremećaje funkcije trombocita mnogo je teže dijagnosticirati od koagulacijskih poremećaja jer do danas ne postoji niti jedna pretraga probiranja koja bi bila dovoljno osjetlji-va na sve poznate poremećaje trombocita.

U prošlosti se ispitivanje funkcije trombocita rabilo isključivo za mjerenje i praćenje sposobnosti trombo-cita u adheziji i agregaciji. Adhezivnost trombocita is-pituje se mjerenjem vremena krvarenja, jedinom pre-tragom in vivo, koja ukazuje na reakciju trombocita sa stijenkom krvne žile s ciljem stvaranja trombocit-nog ugruška i dugi je niz godina bila jedina pretraga za ispitivanje funkcije trombocita. Ovom pretragom mjeri se vrijeme potrebno za potpuni prestanak kr-varenja na mjestu standardizirane veličine i dubine incizije kože kod tlaka od 40 mmHg koji se održava za cijelo vrijeme izvođenja pretrage. Pretragom se najčešće otkrivaju kvalitativni poremećaji trombocita, a produženo vrijeme krvarenja rezultat je sniženog broja trombocita ili poremećaja funkcije trombocita. Najčešća pretraga koja je ujedno i “zlatni standard� za ispitivanje funkcije trombocita optička je agrega-cija trombocita. Pretraga omogućuje ispitivanje me-đudjelovanja između receptora i liganada nužnih za održavanje hemostaze in vivo mjerenjem učinka ago-


nista na aktivaciju trombocita in vitro i međusobno povezivanje trombocita. Optičkom agregometrijom trombocita ispituje se % porasta transmisije svjetlo-sti u uzorku plazme bogate trombocitima nakon dodatka agregirajućeg sredstva (agonista) određe-ne koncentracije što rezultira nastajanjem agregata trombocita i razbistravanjem plazme. Agonisti koji se najčešće koriste su ADP, adrenalin, arahidonska ki-selina, kolagen i ristocetin, od kojih svi agonisti osim ristocetina mogu potaknuti otpuštanje ADP-a i ATP-a iz gustih granula, što pojačava agregaciju trombocita i dovodi do dodatnog porasta transmisije svjetlosti. Rezultati se izražavaju kao % maksimalne agregaci-je, odnosno stupanj agregacije u točno određenom vremenskom periodu. Osim optičke agregometrije trombocita moguće je i mjerenje stupnja agregacije trombocita u uzorcima pune krvi pri čemu nastajanje agregata trombocita rezultira promjenom otpora.

U nekoliko posljednjih godina razvijeno je i nekoliko novih testnih sustava za ispitivanje funkcije trombo-cita u punoj krvi kako bi in vitro što bolje imitirali procese koji se događaju nakon ozljede krvne žile in vivo, a posebice sa svrhom ispitivanja aktivacije trom-bocita u fiziološkim uvjetima brzine protoka krvi u arterijama. Prvi takav sustav koji se pojavio na tržištu i koji se najčešće koristi je analizator funkcije trom-bocita (Platelet Function Analyzer) PFA-100. PFA-100 je specifični instrument za ispitivanje funkcije trom-bocita, kojim mjerimo kapacitet primarne hemostaze u uzorku pune citratne krvi. Citratna krv se aspirira kod konstantnog negativnog tlaka na otvor promjera 147 µm na membranu obloženu kolagenom i ADP-om ili kolagenom i adrenalinom. U prisutnosti ovih aktivatora trombocita i fiziološke brzine protoka krvi u arterijama (5000-6000 s-1) pod standardizira-nim uvjetima dolazi do adhezije, aktivacije i agrega-cije trombocita te stvaranja trombocitnog ugruška. Trombocitni ugrušak prekriva otvor na membrani, a funkcija trombocita mjeri se kao funkcija vremena potrebnog za stvaranje trombocitnog ugruška. Iako je zamišljen kao test probiranja na funkciju trombo-cita pokazalo se kako uporabom ovog sustava nije moguće otkriti sve poremećaje funkcije trombocita, te da nekoliko čimbenika utječe na rezultate: broj

trombocita <50x109/L, vrijednost hematokrita <0,25 L/L, VWF te ishrana (hrana bogata flavonoidima).

Unatoč napretku u mogućnostima analize funkcije trombocita, do današnjeg dana još uvijek ne postoji osjetljiva i specifična dijagnostička pretraga funkci-je trombocita koja omogućuje razlikovanje između poremećaja funkcije vezane uz adheziju, agregaciju, aktivaciju i sekreciju. Kako svaka pojedina pretraga trombocita mjeri različite aspekte funkcije tromboci-ta, jedini je mogući pristup u dijagnostici poremećaja funkcije trombocita uporaba kombinacije odgovara-jućih pretraga za svaki pojedini slučaj.

LABORATORIJSKO PRAĆENJE ANTIKOAGULACIJSKE TERAPIJELijekovi koji se koriste za prevenciju i liječenje trom-boembolijskih bolesti godinama su bili ograničeni na 3 osnovne skupine: antagoniste vitamina K, he-parine i aspirin, a tijekom zadnjih godina postao je dostupan veliki broj novih antikoagulacijskih lijeko-va. Laboratorijsko praćenje antikoagulacijske terapi-je sastoji se od praćenja rizika i posljedica mogućeg krvarenja (hemoglobin, hematokrit, broj tromboci-ta, okultno krvarenja i sl.), koje je zajedničko svim vrstama lijekova i specifičnog praćenja terapije koje uključuje procjenu specifičnog antikoagulacijskog učinka pojedinog lijeka.

Antagonisti vitamina KAntagonisti vitamina K koriste se za prevenciju i li-ječenje tromboembolijskih bolesti kao što su DVT, PE, infarkt miokarda i moždani udar. Derivati su 4-hidroksi kumarina a najvažniji predstavnik skupi-ne je varfarin. Antikoagulacijski učinak temelji se na inhibiciji enzima koji sudjeluju u redukciji vitamina K (vitamin K epoksid reduktaza i vitamin K reduktaza), nužnog za sintezu faktora zgrušavanja FII, FVII, FIX i FX i prirodnih inhibitora zgruđavanja proteina C i S. Vitamin K-H2 sudjeluje kao esencijalni kofaktor u reakciji posttranslacijske modifikacije γ-glutamilnih ostataka ovih proteina pri čemu nastaju vezna mjesta za kalcijeve ione, nužna za vezanje faktora zgruša-


vanja na fosfolipidne površine i njihovu aktivnost. Tijekom ove reakcije dolazi do oksidacije vitamina K u oksidirani oblik, vitamin K epoksid, koji se za ponovnu aktivnost mora reducirati.

Varfarin je racemična smjesa R- i S-enantiomera, od kojih je S-varfarin 3-5 puta aktivniji i metabolizira se u jetri djelovanjem enzima CYP2C9, koji je odgovo-ran za 85 % metabolizma varfarina. Opisani su genski polimorfizmi CYP2C9, a najučestaliji polimorfni aleli u bjelačkoj populaciji su CYP2C9*2 i CYP2C9*3, po-vezani s fenotipom sporijeg metabolizma i potrebom za nižom dozom lijeka. Dokazani su i polimorfizmi u genu za podjedinicu 1 enzima vitamin K epoksid reduktaze (VKORC1), koji su također odgovorni za interindividualne razlike u osjetljivosti na varfarin.

Terapijski učinak varfarina zahtjeva laboratorijsko praćenje iz više razloga. Varfarin ima usku terapijsku širinu s dramatično smanjenim učinkom kod primje-ne doze koja je manja od optimalne i velikim rizikom za krvarenja kod primjene više doze. Već spomenu-te interindividualne razlike u učinku varfarina, kao i utjecaj prehrane i lijekova koji se istovremeno ko-riste, dodatan su razlog za laboratorijsko praćenje terapije antagonistima vitamina K. Terapijski učinak antagonista vitamina K prati se mjerenjem PV-a, s obzirom da je PV pretraga osjetljiva na aktivnost vi-tamin K ovisnih faktora zgrušavanja FII, FVII i FX. Nedostatak PV-a su značajne razlike u dobivenim re-zultatima ovisno o analizatoru, vrsti reagensa (trom-boplastina) i seriji proizvedenog reagensa, što dovo-di do različitih rezultata između laboratorija, pa čak i unutar istog laboratorija u različitom vremenskom periodu. U svrhu standardizacije rezultata PV-a osmi-šljen je internacionalni normalizirani omjer (INR) koji predstavlja matematičku pretvorbu rezultata PV izra-ženog u sekundama (PVsek):

INR =

ISIPV ispitanika (sek)

PV normalne plazme (sek)

gdje je ISI je internacionalni indeks osjetljivosti. ISI je mjera osjetljivosti tromboplastina na manjak ko-

agulacijske aktivnosti faktora zgrušavanja u odno-su na referentni pripravak tromboplastina Svjetske zdravstvene organizacije (SZO), a koji se dobije u složenom postupku kalibracije kojeg preporuča SZO. Prema definiciji, vrijednost ISI od 1,0 označava istu osjetljivost ispitivanog tromboplastina i interna-cionalnog referentnog pripravka SZO prema manj-ku koagulacijske aktivnosti faktora zgrušavanja. SZO preporuča uporabu tromboplastina s ISI vrijednosti-ma blizu 1,0. Protokol kalibracije tromboplastina uk-ljučuje mjerenje PV-a ispitivanim tromboplastinom i ispitivanom metodom, te referentnim pripravkom i referentnom metodom u 20 plazmi zdravih davatelja i 60 plazmi bolesnika na stabilnoj terapiji varfarinom. ISI predstavlja nagib pravca koji se dobije ortogonal-nom regresijom dobivenih rezultata u koordinantom sustavu log-log gdje su na os X nanešene vrijednosti dobivene ispitivanom metodom i ispitivanim trom-boplastinom, a na os Y vrijednosti dobivene referen-tnom metodom i referentnim pripravkom. U praksi se ovaj složeni postupak kalibracije ne provodi rutin-ski, nego se većina laboratorija oslanja na vrijednost ISI određenu od strane proizvođača za određenu kombinaciju instrumenta i tromboplastina, iako to nije uvijek idealno. Zadnjih godina u porastu je zani-manje za instrument-specifičnom kalibracijom INR-a uporabom plazmatskih kalibratora s točno definira-nim vrijednostima INR-a, čime se postupak pojed-nostavljuje i smanjuje mogućnost pogreške, iako i ovaj sustav ima svoje nedostatke. Danas na tržištu postoji više komercijalnih plazmatskih kalibratora za direktnu kalibraciju INR-a.

Usprkos nekim nedostacima, sustav INR-a doveo je do smanjenja interlaboratorijskih razlika u mjerenju PV-a i predstavlja preporučenu metodu za praćenje terapije varfarinom. Preporučena vrijednost INR-a kod terapije srednjeg intenziteta iznosi 2,0-3,0, a kod terapije visokog stupnja (intenziteta) 2,5-3,5 (Tablica 56.3.). Vrijednost INR>4,5 povećava rizik za krvare-nja 6 puta dok vrijednost INR>7,0 povećava rizik 40 puta.

Valja imati na umu da je antitrombotski učinak var-farina odgođen i nastupa tek nakon 60-72 h, nakon smanjenja aktivnost protrombina (FII), koji ima naj-


duži poluživot u cirkulaciji. Početni učinak varfarina i pad vrijednosti PV-a posljedica je smanjenja aktiv-nosti FVII koji ima najkraći poluživot u cirkulaciji, ali nije ključan za antitrombotski učinak (Tablica 56.1.). Osim toga, u prvim satima varfarinske terapije dolazi i do smanjenja aktivnosti prirodnih antikoagulanata proteina C i S, koji se također stvaraju u jetri ovisno o vitaminu K, što dovodi do potencijalnog protrom-botičkog učinka varfarina u prvih 24-48 h od početka terapije. Zbog navedenog se, kao uvod u terapiju varfarinom, koristi heparin koji se može isključiti nakon što se postigne stabilna vrijednosti INR>2,0 tijekom dva dana.

Heparin i niskomolekularni heparinNefrakcionirani heparin (UFH) je heterogena smjesa polisaharidnih lanaca molekulske mase od 3000 do 30000 Da. Indirektni antitrombotski učinak heparina posljedica je vezanja na AT, pri čemu na AT dolazi do konformacijskih promjena i ubrzavanja reakcije inhibicije serinskih proteaza, posebice trom-bina i FXa. Heparin inhibira samo slobodni trombin i FXa u plazmi.

Osim po molekularnoj masi heparinski lanci hetero-geni su i po antikoagulacijskom učinku i farmakoki-netskim svojstvima. Samo jedna trećina heparinskih lanaca sadrži pentasaharidnu strukturu, jedinstvenu sekvencu od 5 saharidnih jedinica koja je nužna za vezanje na AT i za antikoagulacijski učinak. Inhibi-cija trombina odvija se stvaranjem ternarnog kom-pleksa između pentasaharidne sekvence heparina,

AT i trombina, za što je potrebna duljina heprinskih lanaca od najmanje 18 saharidnih jedinica, dok za inhibiciju FXa nije potrebno nastajanje ternarnog kompleksa. Stoga molekule heparina s manje od 18 saharidnih jedinica ne mogu inhibirati trombin, ali imaju svojstvo inhibicije FXa. Heparinski lanci vežu se na različite proteine plazme, ali i stanične elemen-te (endotelne stanice, trombocite, makrofage, oste-oblaste), čime njegov antitrombotski učinak postaje izrazito nepredvidljiv, kao i mogući neželjeni učinci (krvarenje, osteoporoza, pojava heparinom inducira-ne trombocitopenije - HIT-a). Heparin ima bimoda-lan klirens, pa se duži lanci izlučuju brzim staničnim mehanizmom, dok se kraći lanci izlučuju sporim, bubrežnim mehanizmom. Zbog svega navedenog učinak heparina je nepredvidljiv i individualan, pa je potrebno laboratorijsko praćenje terapije.

UFH se koristi u terapiji DVT i PE, te kod akutnog infarkta miokarda i angine pectoris. Primjenjuje se intravenozno pri čemu se daje bolus doza od 5000 U, a nakon toga kontinuirana infuzija od 32000 U tijekom 24 sata. Antikoagulacijski učinak je trenutan, a kao antidot se koristi protamin sulfat.

Niskomolekularni heparin (LMWH) je smjesa polisaharidnih lanaca duljine 1000 do 10000 Da, a dobiva se kemijskom ili enzimskom depolimerizaci-jom UFH. Upravo je razlika u duljini polisaharidnih lanaca osnova razlika u djelovanju između LMWH i UFH. Dok UFH ima jednak inhibicijski učinak prema FXa i trombinu (1:1), LMWH ima jači inhibicijski uči-nak prema FXa (omjer iznosi od 4:1 do 2:1 ovisno o

Tablica 56.3. Preporučene vrijednosti antikoagulacijske terapije izražene preko INR-a

Indikacije za terapiju antagonistima vitamina K Preporučeni INR

Prevencija i liječenje duboke venske tromboze i plućne embolije 2,0 - 3,0

Fibrilacija atrija 2,0 - 3,0

Bolesti srčanih zalistaka 2,0 - 3,0

Umjetni srčani zalisci životinjskog podrijetla 2,0 - 3,0

Umjetni srčani zalisci od sintetskog materijala 2,5 - 3,5

Sekundarna prevencija od embolije nakon akutnog infarkta miokarda 2,0 - 3,0

Sekundarna prevencija od ponovnog infarkta miokarda 3,5 - 4,5


duljini lanaca i vrsti pripravka). LMWH se manje veže na proteine plazme, makrofage i endotelne stanice, čime mu učinak postaje značajno predvidljiviji, kao i duljina poluživota u plazmi. Također, smanjeno ve-zanje LMWH na trombocite čini ga pouzdanijim i u smislu razvoja HIT-a. LMWH se koristi u liječenju i prevenciji venske tromboembolije (veliki ortoped-ski zahvati, operativni zahvati kod onkoloških paci-jenata, prevencija kod pacijenata na kemoterapiji) i kod akutnog koronarnog sindroma, a primjenjuje se subkutano, 1-2 puta dnevno.

Antikoagulacijski učinak UFH prati se mjerenjem APTV-a kod uobičajenih terapijskih doza, dok se kod visokih doza, koje se daju kod perkutanih koro-narnih intervencija i kardiokirurških zahvata, koristi aktivirano vrijeme zgrušavanja (ACT). APTV se mjeri 6 sati nakon bolus doze heparina i na temelju dobi-venog rezultata podešava daljnja intravenska terapija pomoću nomograma. Preporučeni terapijski raspon za APTV je 1,5 - 2,5 puta dulji APTV u odnosu na bazalnu vrijednost (bazalno mjerenje APTV-a prije početka terapije). S obzirom da raspon nije potpu-no jednak za svaki pojedini APTV reagens i metodu koje se koriste u laboratorijima, preporuča se izrada specifične kalibracije za svaku kombinaciju reagen-sa i instrumenta te određivanje terapijskog raspona

APTV-a pomoću specifične anti-Xa metode za mjere-nje aktivnosti heparina u krvi. Ovom metodom mjeri se intenzitet inhibicije aktiviranog FXa iz reagensa djelovanjem heparina iz uzorka, i to nakon kalibracije specifičnim heparinskim kalibratorima. Ciljna terapij-ska vrijednost za anti-Xa aktivnost s UFH-om je 0,3 do 0,7 anti-Xa kU/L. Stanja u kojima je potrebno izmjeriti aktivnost heparina anti-Xa metodom su kombinira-na terapija anatagonistima vitamina K i heparinom, kombinirana fibrinolitička i heparinska terapija, rezi-stencija na heparin, visoke koncentracije Fbg i FVIII u uzorku, prisutnost lupus antikoagulanta u uzorku, bolesti jetre i kontaminacija uzorka heparinom.

Praćenje terapije LMWH-om u pravilu nije potrebno, iako postoje situacije u kojima se preporuča mjere-nje aktivnosti anti-Xa metodom, koja se izvodi na isti način kao kod UFH, ali nakon kalibracije specifičnim LMWH-kalibratorima. To su sljedeća stanja: kod bo-lesnika s bubreženim bolestima, kod novorođenčadi i trudnica, te kod bolesnika kod kojih tjelesna masa značajno odstupa od idealne, kod dugotrajne pri-mjene i kod velikog rizika za krvarenje ili trombozu. Ciljna vrijednost za terapiju LMWH-om je 0,5 do 1,0 anti-Xa kU/L. Terapija LMWH-om ne može se pratiti mjerenjem APTV-a, jer LMWH ne produljuje APTV ili ga tek neznatno produljuje, ovisno o reagensu.

LITERATURAAnsell J, Hirsh J, Poller L, Bussey H, Jacobson A, Hylek E. The pharmacology and management of the vitamin K antagonists: the Seventh ACCP Conference on Antithrombotic and Throm-bolytic Therapy. Chest 2004;126 (3 Suppl):204S-233S.

Bates SM, Weitz JI. Coagulation assays. Circulation 2005;112:e53-60.

Batty P. Haemostasis; Surgery 2010;28:530-5.

Dahlbäck B. Blood coagulation and its regulation by anti-coagulant pathways: genetic pathogenesis of bleeding and thrombotic diseases. J Intern Med 2005;235:209-23.

Hirsh J, Rashke R. Heparin and low-molecular-weight hepa-rin: the Seventh ACCP Conference on Antithrombotic and Thrombolytic Therapy. Chest 2004;126 (3 Suppl):188S-203S.

Hoffman M, Monroe III DM. A cell-based model of hemosta-sis. Thromb Haemost 2001;5:958-65.

Lasne D, Jude B, Susen S. From normal to pathological hemo-stasis. Can J Anesth 2006;53:S2-11.

Lippi G, Favaloro EJ. Laboratory hemostasis: milestones in Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. Clin Chem Lab Med 2013;51:91-7.

Kitchen S, Makris M. Laboratory tests of hemostasis. U: Prac-tical Hemostasis and Thrombosis. 2. izd. West Sussex: Wiley-Blackwell. 2009; 7-16.

Kitchen S, Preston FE, Olson JD. Internal quality control in the hemostasis laboratory. U: Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis. 1. izd. West Sussex: Wiley-Blackwell. 2009; 43-50.


Pitanja i odgovori

1. Koje su osnovne tri faze zgrušavanja prema staničnom modelu hemostaze?

U procesu zgrušavanja razlikuju se 3 faze: početna, amplifikacijska i propagacijska faza.

2. O kojim faktorima ovise rezultati pretrage APTV?

Dobiveni rezultat ovisi o aktivnostima FII, FV, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII i fibrinogena.

3. O čemu ovise referentni interval D-dimera i granična vrijednost za isključivanje tromboze?

Referentni interval i granična vrijednost za isključivanje tromboze ovisna je o reagensu i sustavu koji se primje-njuju za određivanje koncentracije D-dimera.

4. Što omogućuju pretrage funkcije trombocita?

Pretrage funkcije trombocita omogućuju utvrđivanje mogućeg uzroka krvarenja, za razlikovanje poremećaja funkcije trombocita od koagulacijskih poremećaja i postavljanje dijagnoze nasljednih i stečenih poremećaja krvarenja.

5. Kojim laboratorijskim pretragama se prati djelotvornost antikoagulacijske terapije?

Antikoagulacijska terapija antagonista vitamina K se prati određivanjem PV-a i izražavanjem preko INR-a, viso-komolekularnog heparina APTV-om, a niskomolekularnog heparina mjerenjem anti-Xa aktivnosti.

Mann KG. Biochemistry and phisiology of blood coagulation. Thromb Haemost 1999;82:165-74.

Roberts HR, Monroe DM, Escobar MA. Current concepts of hemostasis: implications for therapy. Anesthesiology 2004;100:722-30.

Wheeler AP, Rice TW. Coagulopathy in critically ill patients: part 2-soluble clotting factors and hemostatic testing. Chest 2010;137:185-94.

Wolberg AS. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews 2007;21:131-42.

547

Nasljedni poremećaji sustava zgrušavanja čine skupinu rijetkih bolesti. Najčešći poremećaji su von Wille-brandova bolest, zatim slijede hemofilija A i B. Hemofilije su nasljedni, recesivni poremećaji koji nastaju uslijed mutacija gena F8 odnosno F9. Hemofilija A je manjak ili kompletan nedostatak aktivnosti faktora VIII, a hemofilija B faktora IX. Sve rasne skupine su podjednako zahvaćene hemofilijom i nema geografske predispozicije. Učestalost hemofilije A je 1 u 5000 živorođene muške djece i 1 u 30000 u hemofiliji B. Preva-lencija hemofilije A je 11.2 slučaja na 100000 muških osoba. Hemofilija A čini 85 % svih hemofilija i najčešća je teška nasljedna koagulopatija. Prevalencija von Willebrandove bolesti je gotovo 1 % opće populacije. Kvantitativni i/ili kvalitativni defekt von Willebrandova faktora uzrokuje bolest, a nastaju uslijed točkastih mutacija ili velikih delecija gena za VWF.

Od hemofilija obolijevaju samo muškarci, dok su žene nositeljice bolesti. Radi se o spolno vezanoj bolesti. Nositeljice bolesti imaju šansu 25 % da im sin boluje od hemofilije, odnosno istu šansu da će kćer biti obli-gatna nositeljica bolesti. Kad postoji više članova obitelji zahvaćeno hemofilijom tada se radi o „obiteljskoj� hemofiliji, dok je „sporadična hemofilija� rezultat de novo mutacije u otprilike 30 % oboljelih. Neke nosite-ljice bolesti imaju sniženu razinu aktivnosti faktora VIII/IX. Ponekad je sniženje toliko da zahtijeva primjenu lijeka, koncentrata faktora VIII/IX. Djeca zdrave žene i muškarca s hemofilijom imat će sve zdrave sinove, a sve kćeri su nositeljice bolesti. Von Willebrandova bolest nasljeđuje se uglavnom autosomno dominantno s varijabilnom ekspresijom.

Sličnosti i razlike između hemofilija A i BHemofilije A i B se ne mogu klinički razlikovati Postoji niz sličnosti između bolesti i to produženo aktivi-rano parcijalno tromboplastinsko vrijeme (APTV), tip krvarenja što uključuje krvarenja u velike zglobove, razvoj inhibitora, nasljeđivanje vezano uz X kromosom, razvoj artropatije. Također postoji i niz različitosti

P o g l a v l j e 57.Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja

sustava zgrušavanjaSilva Zupančić Šalek


i to farmakokinetika faktora zgrušavanja, učestalost pojave bolesti, udio bolesnika prema težini bolesti, mutacije koje uzrokuju bolest (više točkastih mutaci-ja u hemofiliji B nego hemofiliji A), razvoj inhibitora (češće u hemofiliji A), rizici povezani s inhibitorima u hemofiliji B kao pojava anafilaktičke reakcije.

KLINIČKA SLIKA Težina simptoma krvarenja u bolesnika s hemofili-jom A i B ovisi o razini koncentracije nedostatnog faktora. Koncentracija faktora zgrušavanja izražava se u internacionalnim jedinicama (IU); 1 IU definira se kao koncentracija faktora zgrušavanja u 1 mL nor-malne plazme. Zdrava osoba ima koncentraciju fak-tora VIII ili IX 0.50 do 1.50 IU/mL. Koncentracija fak-tora VIII ili IX može se izraziti i u postocima prema normalnoj plazmi definirano kao 100 %. Bolesnici s hemofilijom klasificiraju se u tri skupine prema težini bolesti: teški oblik, umjereni i blagi. Bolesnici s teš-kim oblikom bolesti nemaju mjerljive koncentracije faktora VIII/IX. Oni krvare spontano bez prethodne traume. U bolesnika s umjerenim ili blagim oblikom bolesti plazmatska koncentracija FVIII/IX iznosi 2-5 % ili 6-40 %. Prekomjerno krvarenje javlja se obično nakon malih trauma, stomatoloških zahvata ili ope-racije.

Dijagnoza hemofilije postavlja se odmah po rođenju ako je majka dokazani ili poznati nositelj bolesti. Kad to nije slučaj, dijagnoza bolesti se postavlja tek kad dođe do krvarenja i to spontano ili nakon traume. Karakteristična krvarenja su intrakranijalna u novo-rođenčeta koje se rodi na vrijeme, bolna oteklina velikih zglobova uslijed krvarenja u zglobove, neo-bjašnjive, duboke modrice kad dijete počinje puzati i hodati. Isto tako javljaju se postoperativna krvarenja, supkutana nakon venepunkcija i krvarenja u mišić što može biti spontano ili uslijed traume.

Bolesnici s hemofilijom A i B imaju produženo ak-tivirano parcijalno tromboplastinsko vrijeme i nor-malan nalaz protrombinskog vremena. Iako uredan nalaz, APTV ne znači da je hemofilija isključena i to u slučaju blage hemofilije. Potrebno ja razlikovati

hemofiliju A od von Willebrandove bolesti. Ove se bolesti razliku po načinu nasljeđivanja i kliničkim simptomima krvarenja. Većina slučajeva von Wille-brandove bolesti je blaga pa tako nema kliničke slike krvarenja kao u hemofiliji A već se radi o menoragi-jama, epistaksama i modricama. Jedino teški oblik von Willebrandove bolesti, tip 3 ima tešku kliničku sliku sa svim oblicima krvarenja. Ima više podvrsta von Willebrandove bolesti, no prije postavljanja dija-gnoze hemofilije A potrebno je isključiti defekt veza-nja FVIII i vWF što može uzrokovati sniženje faktora VIII, a radi se o von Willebrandovoj bolesti tipa 2N ili Normandy. Taj oblik bolesti može se pojaviti u žena jer se radi o von Willebrandovoj bolesti i nasljeđuje se autosomno.

Određivanjem koncentracije faktora IX potvrđuje se dijagnoza bolesti. Koncentracija faktora IX se ne mi-jenja tijekom života, osim u onih osoba koji su imali mutaciju u promotorskoj sekvenci gena faktora IX (faktor IX Leiden). U tih bolesnika raste koncentra-cija faktora IX s pubertetom, pa teški oblik bolesti postaje blagi, a blagi se sasvim normalizira s normal-nom koncentracijom faktora IX.

Blaga hemofilija nije povezana sa spontanim krvare-njima. Krvarenja se javljaju samo nakon većih trauma ili operacija. Značajan broj bolesnika dijagnosticira se neposredno pred operaciju u pred operacijskoj koagulacijskoj obradi.

Umjerena hemofilija rijetko povezana sa spontanim krvarenjima, već su krvarenja precipitirana traumom ili operacijom. Prvi se simptomi javljaju u kasnijoj životnoj dobi s većim životnim aktivnostima.

Teški oblik hemofilije ima prosječno od 15 do 35 spontanih krvarenja u zglobove ili mišiće po godi-ni. Glavna manifestacija bolesti je krvarenje u veliki zglob i mišić. Oko 90 % krvarenja se događa u velike zglobove. Najčešće zahvaćeni zglob je koljeno, pa zatim lakat, gležanj, rameni ručni zglob. Koljena i laktovi su osobito vulnerabilni jer moraju podnije-ti rotatorni i kutni stres u relativno slaboj zglobnoj vezi. Tipična promjena za hemofiliju je hemofilična artropatija koja nastaje uslijed opetovanih krvarenja, upala, sinovijalne hipertrofije, destrukcije hrskavice i kosti. Nakon akutnog krvarenja u zglob dolazi do

Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja | 549

autolize eritrocita s odlaganjem hemosiderina u si-novijanom tkivu. To izaziva upalni proces u sinoviji s povišenim proinflamatornim citokinima (IL-6, II, I beta, TNF). Opetovana krvarenja dovode do kro-ničnog trajnog upalnog procesa što je „hemofilična artropatij�. Opetovana krvarenja dovode do razvoja tzv. ciljnog zgloba. Kad dođe do kompletne erozije hrskavice i kosti dolazi do kronične hemofilične ar-tropatije s trajnim oštećenjem zgloba. Ta je faza ka-rakterizirana ograničenjem pokreta, razvojem kon-traktura i progresivnog ukočenja zgloba.

Mišićna se krvarenja javljaju u otprilike 30 % bole-snika s hemofilijom i to su uglavnom spontana kr-varenja. Krvarenja prati bol, oteklina blago povišena temperatura s pojavom ekimoza po tijelu. Krvarenja u veliki mišić mogu biti velika no isto tako se mogu resorbirati u potpunosti, za razliku od malih krvare-nja koja mogu biti opasna u zatvorenom prostoru i izazvati fascijski kompartment sindrom. Posebno su teška retroperitonealna krvarenja u mišić m. psoas major. Oni uzrokuju ograničenje pokreta, nestabil-nost koljena zgloba i drugo.

Najozbiljnije krvarenje je u centralni nervni sustav je može biti fatalno. Incidencija intrakranijalnog krvare-nja je 3.5-4 % u neonatalnom periodu i u zemljama s dobro organiziranom medicinskom skrbi za bolesni-ke s hemofilijom. U bolesnika koji se liječe samo po potrebi učestalost intrakranijalnog krvarenja je 3-10 %. Otprilike 20 % završi letalno s intrakranijalnim krvarenjem, a više od jedne trećine razvije teške po-sljedice krvarenja. Krvarenja mogu biti subduralna, subarahnoidalna, intraspinalna ili intracerebralna.

U 10-15 % bolesnika razvije se gastrointestinalno kr-varenje Taj postotak raste s portalnom hipertenzijom zbog kroničnog hepatitisa ili ciroze jetre.

Klinička slika von Willebrandove bolesti znatno va-rira. Tipično se javlja krvarenje iz sluznica (epistak-se, menoragije), pojačano krvarenje nakon ozljeda ili reznih rana kao i postoperativna krvarenja. Kako postoji više tipova bolesti, tako je i s kliničkom ma-nifestacijom bolesti. Krvarenja u zglobove i mišiće su rijetkost osim u tipu 3 ili teškom obliku von Wille-brandove bolesti. Definitivna dijagnoza se postavlja temeljem niz koagulacijskih testova.

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA Laboratorijsko testiranje je integralni dio kliničke procjene poremećaja sustava zgrušavanja. Važno je točno i brzo dijagnosticirati poremećaj, klasificirati temeljem određenih laboratorijskih rezultata, a oni nam usmjeravaju i prate učinak liječenja. Molekula FVIII je jedna od najnestabilnijih u skupini faktora zgrušavanja. FVIII se lako adsorbira na strane površi-ne, brzo se degradira kad je izložen temperaturi oko-line i u slučaju kad pH vrijednost pada izvan uskog raspona normale. Rezultati s različitim reagencijama i različitim instrumenti daju različite rezultate. Sumnja na hemofiliju postavlja se već testovima probiranja kad nalazimo izolirano produženo APTV u dječaka ili muškarca s prisutnim prekomjernim krvarenjem i pozitivnu anamnezu. Određivanje aktivnosti FVIII/FIX je neophodno jer nad donosi dijagnozu. Faktor VIII je reaktant akutne faze, povišen je u trudnoći i tijekom vježbanja. Pri testiranju na moguću hemo-filiju A ili von Willebrandovu bolest potrebno je te-stiranje ponoviti jer temeljem jednog rezultata se ne smije niti postaviti niti isključiti dijagnoza hemofilije. Najčešći test za mjerenje aktivnosti FVIII/FIX je koa-gulacijska metoda u jednom stupnju. Teško je izvesti ovaj test ako se radi o niskim aktivnosti FVIII manjoj od 3 % (0.03 IU/mL). Modificirani kromogeni test po Yatau omogućava preciznije i točnije određiva-nje aktivnosti u omjeru od 0.1-2 %. Blaga hemofilija A se ne isključuje rezultatima normalne aktivnosti FVIII u jednom stupnju. Poznato je da podskupina bolesnika s blagom hemofilijom A iskazuje različite rezultate aktivnosti FVIII upotrebom različitih meto-da određivanja FVIII. To se odnosi na otprilike 20 % bolesnika s hemofilijom A. Stoga je važno upamtiti da u bolesnika s pozitivnom anamnezom na hemo-filiju a normalnim rezultatima aktivnosti FVIII u testu jednog stupnja, potrebno je učiniti aktivnost FVIII testu dva stupnja ili kromogenim. Manji je broj blažih bolesnika s hemofilijom koji u jednom stupnju testa imaju snižene vrijednosti FVIII, a normalne rezultate u dva stupnja. Praćenje primjene koncentrata faktora zgrušavanja treba pratiti istim testom. Iznimke su pri primjeni rekombinantnog FVIII. Rezultati testiranja


aktivnosti rekombinantnog FVIII normalne dužine rezultati komogenim testom bit će 40-50 % viši nego kad se određuje testom u jednom stupnju. Zatim u rekombinantnom FVIII bez B domene rezultati u jed-nom stupnju su bili 30 % viši od kromogenog testa. Stoga je preporuka koristiti test u jednom stupnju, ali kalibrirati sa standardom bez B domene.

Postavljanje dijagnoze von Willebrandove bolesti temelji se na pozitivnoj anamnezi i kliničkim nala-zima i fenotipskim hemostatskim testiranjem. Od testova probiranja određivanje APTV je značajno jer je osjetljivo na sniženje FVIII. Normalan nalaz FVI-II ne isključuje von Willebrandovu bolest i određi-vanjem PFA-100. Bitno je odrediti broj trombocita, aktivnost FVIII:C, VWF:Ag i jedan funkcionalni test VWF. Samtra se da VWF:CB ima prednost u odnosu na VWF:RCo. Određivanje multimera von Willeban-dova faktora je indicirano u osoba u kojih je već do-kazna patološki nalaz u ostalim fenotipskim testovi-ma. Ovom se metodom dijagnosticiraju kvalitativni defekt VWF i svrstavaju u određene podskupine.

MOLEKULARNA GENETIKA I DIJAGNOSTIKA Gen za faktor IX kloniran je 1982. godine, a fakto-ra VIII 1984. Postoji baza podataka svih otkrivenih mutacija gena, a u teškog oblika bolesti oko 45 % ima inverziju introna 22, dok su ostatak točkaste mu-tacije, dok je samo 5 % malih i velikih delecija. Po-stoji međunarodna internacionalna baza podataka o mutacijama u hemofiliji B gdje većinu čine točkaste mutacije, oko 7 % su kratke adicije ili delecije i oko 3 % velike delecije.

Faktor VIII je veliki plazmatski glikoprotein, jedan od najvećih i najmanje stabilnih. U plazmi cirkulira nekovalentnom kompleksu s von Willebrandovim faktorom. Poluvijek života faktora VIII je 12 sati u odraslih, a kraće je u djece. Von Willebrandov faktor štiti FVIII od prerane proteolitičke razgradnje. Faktor IX se sintetizira u jetri i najveći je protein ovisan o vitaminu K. Plazmatska koncentracija faktora IX je 50 puta manja od FVIII, a poluvijk života je oko 24 sata.

LIJEČENJELiječenje bolesnika s hemofilijom bazira se na pri-mjeni nedostatnog faktora. Doza i trajanje infuzije ovisi o težini bolesti, tj o kliničkoj slici, mjestu i te-žini krvarenja. Faktor zgrušavanja treba primijeniti bez oklijevanja, odmah i bez odgađanja u situaciji akutnog krvarenja, a ne čekati na određene dijagno-stičke pretrage (npr. radiološke pretrage i drugo). Za krvarenja u velike zglobove dovoljno je dati jednu do dvije doze lijeka. Lijek se primjenjuje intravenski ili u kontinuiranoj infuziji, a to uglavnom periope-racijski. U bolesnika s blagom hemofilijom mogu-će je krvarenje rješavati primjenom dezmopresina, sintetskog analoga vazopresina koji povisuje plaz-matsku koncentraciju FVIII i vWF dva do šest puta oslobađanjem endogenih rezervi. Primjenjuje se u dozi od 0.3 µg/kg, intravenski i supkutano. Moguća je intranazalna primjena u dozi od 150 µg/kg. Tim načinom liječenja izbjegla se mogućnost prijenosa vi-rusnih infekcija koje se prenose krvlju. Ne postižu svi bolesnici adekvatnu razinu faktora zgrušavanja na-kon primjene dezmopresina pa je potrebno pažljivo pratiti razinu faktora VIII nakon primjene dezmopre-sina. Antifibrinolitici su lijekovi koji koče fibrinolizu i to na mjestima najveće aktivnosti, usna šupljina i maternica. Istovremena primjena koncentrata faktora VIII i antifibrinolitika povećava rezistenciju ugruška na fibrinolizu. Fibrinska ljepila se koriste tijekom operacijskih zahvata, a u svrhu smanjenja potrebe za nadomjesnom terapijom.

Dva su modaliteta primjene koncentrata faktora VIII/IX. Primjena lijeka samo u slučaju potrebe, akutnog krvarenja tzv. epizodno liječenje ili liječenje po po-trebi. Drugi oblik liječenja je profilaktička primjena lijeka kako bi se prevenirala krvarenja. Studije su jasno pokazale prednost i značajnu učinkovitost u bolesnika liječenih profilaktički u odnosu na one koji su primali lijek po potrebi. Ideja profilaktičkog liječenja rođena je tijekom 1950.-tih godina prošlog stoljeća u Švedskoj. Ideja je prevesti teški oblik bole-sti u umjereni oblik bolesti koji ne dovodi do teških oštećenja zgloba uslijed čestih krvarenja. Bolesnik koji se liječi profilaktičkom terapijom održava nor-

Odabrana poglavlja iz nasljednih poremećaja sustava zgrušavanja | 551

malan mišićnokoštani sustav. Više je shema profilak-se no najzastupljenija je primjena faktora VIII tri puta tjedno ili svaki drugi dan u dozi od 25-40IU/kg TM. U hemofiliji B profilaksa se provodi dva puta tjedno. S profilaksom se započinje u dobi od jedne do dvije godine, a do tada svi teški oblici bolesti pokažu jasne simptome prekomjernog krvarenja. Epizodno liječe-nje provodi se u više od 80 % bolesnika s hemofili-jom A/B, osobito u nerazvijenim zemljama svijeta.

Danas se liječenje bolesnika s hemofilijom provodi primjenom plazmatskih ili rekombinantnih koncen-trata faktora zgrušavanja. Rekombinantni koncentrati faktora VIII su danas lijek izbora u liječenju bole-snika s hemofilijom. Postoje već tri generacije lijeka. Ovi su lijekovi sigurni i nema rizika od prijenosa vi-rusa koji se prenose krvlju.

Genska terapija je u tijeku kliničkih ispitivanja, a he-mofilija je idealna bolest za takav vid liječenja. Gen-skom terapijom hemofilije A i B direktno se korigi-ra molekularni defekt u mutiranom genu. Danas se genska terapija zasniva na ideji dodavanja gena za faktor VIII/IX. Genska terapija je jedini oblik liječenja koja nudi kompletno izlječenje.

Komplikacije u bolesnika s hemofilijom dijelimo na one vezane uz osnovnu bolest i to su primarno ošte-ćenje lokomotornog sustava i smrt uslijed iskrvarenja.

Komplikacije uslijed liječenja bolesnika s hemofili-jom su prijenos infekcija virusima krvlju i razvoj inhi-bitora na FVIII. Tijekom 1980-tih godina svi koncen-trati faktora VIII i IX bili su porijekla ljudske plazme što je omogućilo prijenos infekcije HCV, HBV i HIV-a u bolesnika s hemofilijom. Danas su još uvijek u pri-mjeni koncentrati porijekla ljudske plazme no oni su sada sigurniji i podvrgnuti različitim metodama viru-sne inaktivacije, testirani darivatelji plazme i drugo. Rekombinantni koncentrati faktora VIII stvoreni su rekombinantnom tehnologijom i sigurni su. Danas su na raspolaganju rekombinantni koncentrati fak-

tora VIII, IX, VII i XIII. Prva generacija koncentrata faktora VIII sadržavala je albumin kao stabilizator. u tu svrhu su korišteni životinjski proteini tijekom procesa proizvodnje. Druga generacija ne sadrži al-bumin kao stabilizator ali ga koristi u staničnoj kul-turi. Treća generacija koncentrata faktora ne sadrži ni ljudske niti životinjske proteine.

Razvoj inhibitora, aloantitijela razvija se u 30 % djece s teškim oblikom hemofilije A. Inhibitori se mogu javiti i u osoba s umjerenom ili blagom hemofilijom, no to je rijetkost. U hemofiliji B se javljaju vrlo rijetko i to manje od 3 % bolesnika a tada primjena koncen-trata FIX dovodi do anafilaktičke reakcije. Osobe s inhibitorima dijele se na one visokog titra i to s više od 5 Bethesda j/mL i onih niskog titra s manje od 5 jedinica. Oni s visokim titrom inhibitora reagira-ju promptno na primjenu koncentrata faktora VIII i liječe se koncentratima koji zaobilaze aktivnost fak-tora VIII. To su: aktivirani protrombinski kompleks (FEIBA) i aktivirani rekombinantni faktor VII (Novo-Seven). Studija je pokazala jednaku učinkovitost, no neki bolesnici bolje reagiraju na jedan lijek ili drugi. Inhibitori se mogu eliminirati jedino postupkom in-dukcije imunološke tolerancije (ITI). Ima više proto-kola koji se rabe u tom postupku. Najpoznatiji su: ni-sko dozni, visoko dozni i Malmo protokol. U Malmo protokolu kombinira se ciklofosfamid, intravenski imunoglobulini, imunoadsorpcija ili plazmafereza i koncentrati FVIII. Kompletna remisija se postiže u otprilike 30-80 %. Kad se jednom odstrane inhibitori, rizik ponovne pojave je oko 15 %. Hemofilija B liječi se plazmatskim koncentratima faktora IX i trenutno postoji samo jedan rekombinantni faktor IX. Von Willebrandova bolest liječi se ovisno u tipu bolesti s plazmatskim koncentratom FVIII+vWF, dezmopre-sinom, antifibrinolitikom. Liječenje koje nam stoji na raspolaganju danas omogućava dobru kvalitetu života.


Pitanja i odgovori

1. Koji faktor zgrušavanja nedostaje u hemofiliji B?

U hemofiliji B nedostaje faktor IX.

2. Kolika je koncentracija faktora zgrušavanja u bolesnika s teškim oblikom hemofilije A/B?

Teški oblik bolesti hemofilije A/B ima nemjerljivu koncentraciju faktora VIII/IX navodi se ispod 1 %.

3. Koja su najčešća mjesta krvarenja u bolesnika s teškim oblikom hemofilije A/B?

Najčešća mjesta krvarenja u bolesnika s teškim oblikom hemofilije A/B jesu u velike zglobove i mišiće.

4. Koji se koncentrat faktora zgrušavanja primjenjuje u liječenu hemofilije A?

U liječenju hemofilije A primjenjuje se koncentrat faktora VIII.

5. Što su inhibitori u bolesnika s hemofilijom A?

U bolesnika s hemofilijom A razviju se aloantitijela na faktor VIII i to u 30 %.

LITERATURAAstermark J, Donfield DM, DiMichele DM et al. A randomised comparison of bypassing agents in hemophilia complicated by an inhibitor: the FEIBA NovoSeven comparative (FENOC) study. Blood 2007;109:546-57.

Berntorp E, Shapiro A. Modern haemophilia care. Lancet 2012;379:1447-56.

Bude U, Pienconka A, Will K, Schneppenheim R. Laboratory testing for von Willebrand disease: contribution of multimer analysis to diagnosis and classification. Semin Thromb He-most 2006;32:S14-S21.

Fijnvandraat K, Cnossen MH, Leebeck FWG, Peters MP. Diagnosis and management of haemophilia. BMJ 2012;344:e2707

Husbard AR, Bevan SA, Weller LJ. Coagulation and chromoge-nic assays of FVIII activity: general aspects standardisation and recommendations. Semin Thromb Haematol 2002;28:247-256.

Kouides PA, Phatak PD, Burkart P, Braggins C, Cox C, Bern-stein Z et al. Gynaecological and obstetrical morbidity in wo-men with type 1 von Willebrand disease: results of a patient survey. Haemophilia 2000;6:643-8.

Schramm W, Royal S, Kroner B, Berntorp E, Giangrande P et al. Clinical outcomes and resorce utilization associated with haemophilia care in Europe. Haemophilia 2002;3:181-187.

8.Stonebraker JS, Bolton-Maggs PH, Soucie JM, Walker I, Bro-oker M. A study of variations in the reported haemophilia A prevalence around the world. Haemophilia 2010;16:20-32.

553

Funkcionalno sposobne i zrele krvne stanica nastaju od zajedničke krvotvorne matične stanice (KMS). U koštanoj srži se aktivacijom određenih gena te djelovanjem krvotvornih činitelja rasta, citokina i mikrooko-liša u KMS pokreću procesi: a) proliferacije (staničnog rasta, tj. diobe) što omogućuje samoobnavljanje, b) diferencijacije (usmjeravanja) u pojedinu staničnu liniju, tj. lozu i c) maturacije (sazrijevanja) duž određene stanične linije, od nezrelih do funkcionalno aktivnih, zrelih stanica. Iz KMS-a mogu nastati stanice mijeloid-nog (eritrociti, granulociti, monociti/makrofagi, trombociti) i limfoidnog sustava (T i B limfociti i stanice pri-rodne ubojice). Sve je više istraživanja koja pokazuju da se KMS mogu diferencirati i u stanice jetre, bubrega, pluća, kože, probavnog sustava i u mišićne stanice. Zbog sposobnosti proliferacije i diferencijacije KMS se mogu koristiti u liječenju bolesnika s oštećenom funkcijom koštane srži kao što su bolesnici s aplastičnom anemijom ili bolesnici s jatrogenim oštećenjem koštane srži zbog primjene visokih doza hematotoksičnih lijekova i/ili radioterapije. Klinička primjena KMS-a u obnavljanju funkcije ostalih organa još je uvijek u ranoj fazi ispitivanja.

IZVORI KMSZa liječenje bolesnika KMS se sakupljaju iz koštane srži, periferne krvi i krvi iz pupkovine. One se mogu uzeti od bolesnika (autologne) ili od druge osobe (alogenične: srodne i nesrodne). Ako se radi o alogeničnoj transplantaciji, osobe moraju biti podudarne u antigenima tkivne snošljivosti (HLA).

Samo mali broj bolesnika kojima je potrebno liječenje transplantacijom KMS ima srodnog HLA identičnog darivatelja. Kako bi se što veći broj bolesnika mogao liječiti transplantacijom, u 80-im godinama osnovani su registri dobrovoljnih darivatelja koštane srži. U 2006. godini se 67 neovisnih registara povezalo u među-narodno udruženje (WMDA) u čijoj se bazi podataka nalazi oko 11 milijuna potencijalnih darivatelja KMS-a.

P o g l a v l j e 58.Laboratorijski aspekti transplantacije

krvotvornih matičnih stanicaBranka Golubić Ćepulić, Ines Bojanić


Iako je broj registriranih darivatelja velik, samo za 30 % bolesnika moguće je pronaći imunološki identič-nog darivatelja.

OBRADA PRIPRAVAKA KMSPripravak KMS nakon transplantacije mora dugotraj-no obnoviti funkciju koštane srži.

Postupci obrade pripravaka KMS dijele se na rutin-ske i specijalizirane. Rutinski postupci se koriste za koncentriranje KMS ili uklanjanje nepotrebnih sta-nica i/ili plazme. Temelje se na jednostavnim fizi-kalnim metodama odvajanja stanica prema veličini i gustoći nakon centrifugiranja primjenom staničnih separatora ili staničnih procesora, odvajanjem sta-nica pomoću različitih otopina (npr. koloidna oto-pina HES-a za sedimentaciju eritrocita) i istiskivača plazme (ručnih i automatskih). Oprema za izvođenje

rutinskih postupaka je standardna oprema koja se koristi u proizvodnji i preradi krvnih pripravaka.

Specijalni postupci koriste se radi postizanja veće čistoće i učinkovitosti pripravaka KMS. Za ove po-stupke potrebna je posebna oprema i reagensi koji se koriste u staničnom inženjerstvu (tablica 58.1.).

KONTROLA KVALITETE PRIPRAVKA KMSKontrola kvalitete pripravaka KMS-a mora obuhvatiti testove kojima se može: 1. procijeniti učinkovitost i sigurnost staničnog pripravka 2. nadzirati kvalite-tu postupaka sakupljanja, obrade i pohrane stanica. Opseg kontrole pripravka ovisi o kliničkoj namjeni stanica i složenosti postupka proizvodnje.

Ishod transplantacije KMS ovisi o broju transplantira-nih stanica i njihovoj klonogenoj sposobnosti. Stoga su ključni element za procjenu kvalitete pripravka

Tablica 58.1. Postupci obrade krvotvornih matičnih stanica

Postupak Primjena

Rutinski postupci

Koncentriranje KMS • smanjenje volumena prije zamrzavanja KMS• prvi korak u složenoj obradi KMS uklanjanje eritrocita i plazme prije daljnje obrade

Uklanjanje plazme • uklanjanje ABO nepodudarne plazme - kod male ABO nepodudarnosti• sprječavanje preopterećenja krvotoka u primatelja (djeca, bolesnici male tjelesne mase,

srčani i bubrežni bolesnici)• smanjenje volumena prije zamrzavanja

Uklanjanje eritrocita • sprječavanje hemolize u slučajevima velike ABO nepodudarnosti ili u bolesnika s kli-nički značajnim antieritrocitnim protutijelima ostalih specifičnosti

• ograničavanje količine slobodnog hemoglobina nakon odmrzavanja

Otapanje • otapanje zamrznutog pripravka KMS prije transplantacije

Pranje • uklanjanje DMSO-a i hemoliziranih eritrocita radi smanjenja toksičnosti

Filtracija • uklanjanje agregata stanica prije transplantacije

Specijalizirani postupci

Centrifugalna elutricija • odvajanje staničnih subpopulacija (koncentriranje mononukleara, uklanjanje T-limfocita)

Stanična selekcija • pozitivna i negativna selekcija stanica temeljena na izražaju staničnih biljega (npr. imu-nomagnetska)

Ekspanzija stanica in vitro • povećanje broja KMS i progenitorskih stanica radi bržeg oporavka i boljeg ishoda tran-splantacije

Ostalo • uklanjanje malignih stanica i čišćenje transplantata s monoklonskim protutijelima• farmakološko čišćenje pripravka KMS

Laboratorijski aspekti transplantacije krvotvornih matičnih stanica | 555

KMS-a broj stanica, udio pojedinih vrsta stanica, udio stanica sa specifičnim biološkim biljezima od koji je najvažniji CD34, vijabilnost stanica, klonogena spo-sobnost stanica u staničnim kulturama in vitro i mi-krobiološko testiranje.

U razmazu koštane srži KMS se morfološki ne mogu razlikovati od malog limfocita. Točnije se mogu odrediti imunofenotipizacijom i funkcionalnim te-stovima uzgoja stanica in vitro. Najvažniji identifi-kacijski biljeg KMS je CD34 antigen koji se određuje metodom protočne citometrije. Kako se ovaj biljeg nalazi i na progenitorskim stanicama u ranoj fazi di-ferencijacije, sve CD34 pozitivne stanice nisu i KMS. KMS na površini nema diferencijacijske antigene staničnih linija (Lin-), niti antigene HLA-DR i CD38. S obzirom da još uvijek ne znamo točan izgled niti imunološki fenotip KMS, za procjenu njihovog broja u transplantatu u rutini se koriste surogatni testovi kao što su: brojenje stanica s jezgrom (NC), brojenje monouklearnih stanica (MNC), identifikacija CD34 pozitivnih stanica i kratkotrajna kultura granulocit-no-monocitnih kolonija (CFU-GM). Neizostavni dio kontrole kvalitete pripravka KMS je praćenje brzine oporavka krvnih stanica nakon transplantacije za svakog pojedinog bolesnika.

Broj i vrsta stanicaBrojenje stanica u pripravcima KMS je osnovni test kojim se procjenjuje kvaliteta pripravka kao i učin-kovitost postupaka za uzimanje i obradu KMS. Me-đutim, broj NC ili MNC od male je koristi za procje-nu broja KMS-a u pripravku jer je korelacija između broja zrelih krvnih stanica u koštanoj srži i perifernoj krvi i broja KMS među njima veoma slaba. Ipak u nedostatku boljeg pokazatelja broj NC koristi se još i danas u procjeni kvalitete pripravka KMS porijeklom iz koštane srži. Za uspješnu autolognu transplanta-ciju pripravak KMS iz koštane srži treba imati 2x108 NC/kg tjelesne težine, a za alogeničnu 3x108 NC/kg tjelesne težine. Minimalni broj NC za transplantaci-je krvotvornih matičnih stanica iz krvi iz pupkovine mora biti oko 3x107 NC/kg. U slučajevima kada po-stoji veći rizik neprihvaćanja transplantata kao što je to slučaj u bolesnika s aplastičnom anemijom ili kod

HLA haploidentičnih transplantacija, za uspjeh tran-splantacije je potrebna i dvostruka količina stanica nego u standardnom transplantatu.

Tijekom brojanja stanica u uzorcima KMS pomoću automatskih brojača stanica mogu se učiniti neke tipične greške: u uzorcima koštane srži automatski brojači mogu nakupine masti veličine NC brojati kao stanice; u uzorcima krvi iz pupkovine u ukupan broj NC mogu se ubrojiti i eritrocitoblasti koji ne bi tre-bali biti uključeni u broj stanica kada se procjenjuje kvaliteta transplantata; u uzorcima KMS dobivenih aferezom iz periferne krvi broj stanica može biti vrlo visok pa do greške može doći zbog ograničenja bro-jača ili nepreciznosti pri razrjeđivanju uzoraka.

Imunofenotipizacija KMSOdređivanje broja CD34 pozitivnih stanica protoč-nom citometrijom postalo je rutinska metoda za pro-cjenu količine KMS u krvi bolesnika i transplantatu. Ova metoda dobro korelira s količinom KMS i brzi-nom oporavka krvnih stanica nakon transplantacije. Osim toga priprema uzorka i mjerenje traje oko jed-nog sata tako da rezultati dobivaju brzo. To omo-gućuje pravovremenu i klinički relevantnu procjenu kvalitete pripravka KMS u okolnostima kada treba donijeti odluku o početku ili nastavku sakupljanja KMS.

Do pogreške u mjerenju broja CD34 pozitivnih sta-nica može doći zbog loše uzetog uzorka, kalibracije protočnog citometra, izbora protutijela, tehnike lize uzorka i postavljanja ograda pri analizi uzorka. Bo-lja standardizacija mjerenja je postignuta uvođenjem dobro definiranih protokola od kojih svaki ima neke prednosti i nedostatke.

Analiza vijabilnosti i apoptoze stanicaOstvarenje biološkog ili terapijskog učinka stanične terapije ovisi o vijabilnim stanicama u staničnim pri-pravcima. Stoga je određivanje udjela živih / vijabil-nih i mrtvih stanica prvi korak u određivanju funk-cionalne sposobnosti pripravka KMS. Mrtve stanice gube integritet stanične membrane, gube metabo-ličku aktivnost i otpuštaju citoplazmatski sadržaj u okolni medij. Analiza vijabilnosti stanica je važna


kako kod procjene kvalitete svakog pojedinačnog pripravka KMS tako i kod inicijalne validacije kod uvođenja novih tehnika obrade KMS.

Vijabilnost stanica može se procijeniti bojanjem uzor-ka KMS s triptanskim modrilom i brojenjem obojenih stanica svjetlosnim mikroskopom. S obzirom da se stanična membrana mijenja nakon smrti stanice, ali i tijekom čuvanja, laboratorijske obrade i zamrzavanja, mijenja se količina boje koja ulazi u stanicu. Obojene stanice su mrtve i nemaju više sposobnost diobe. S obzirom da je broj stanica koji se analizira mali, a broj analiziranih KMS još manji, ovaj test ima ogra-ničenu korist u procjeni kvalitete pripravka KMS. (te ne govori ništa o funkcionalnoj vijabilnosti analizi-ranih stanica).

Dodavanje monoklonskih protutijela koja obilježa-vaju stanice koje su nevijabilne ili apoptotične kod određivanja broja CD34+ stanica protočnom citome-trijom je preciznije jer je analiza usmjerena na po-pulaciju stanica čija brojnost korelira s oporavkom hematopoeze i ishodom transplantacije. 7-amino-ak-tinomicin-D (7-AAD) se koristi za identifikaciju nevi-jabilnih (nekrotičnih) stanica. Annexin V je protein ovisan o kalciju (Ca2+) s visokim afinitetom za fosfati-dilserin, a test koji mjeri translokaciju fosfatidilserina s unutarnje na vanjsku stranu membrane identificira stanice u različitim stadijima apoptoze. Ovi biljezi apoptoze su točniji za identifikaciju funkcionalnih stanica prisutnih u pripravcima KMS.

Kratkotrajna kultura KMSZa ispitivanje klonogene sposobnosti pripravka KMS koristi se kratkotrajna kultura stanica s dodatkom različitih činitelja rasta. U staničnoj kulturi mogu se prepoznati granulocitne (CFU-GM), eritroidne (BFU-E) i miješane linije krvotvornih stanica. Klono-gena sposobnost KMS-a se procjenjuje prema bro-ju naraslih kolonija pojedine krvne loze u odnosu na ukupan broj zasađenih stanica. Za rast kolonija potrebno je nekoliko tjedana inkubacije stanica na hranjivim podlogama, u sterilnim uvjetima i u sta-ničnom inkubator što zahtjeva specifičnu opremu i izvježbano osoblje. S obzirom da se rezultat kultura treba čekati dva tjedna, ovaj test se ne može koristiti

u brzoj procjeni kvalitete pripravka KMS-a. Test je teško standardizirati zbog velikog broja činitelja koji utječu na rast stanica. To često uzrokuje nereprodu-cibilnost rezultata osobito između laboratorija. Zbog toga nema opće prihvaćenog minimalnog broja ko-lonija naraslih in vitro koji bi s velikom vjerojatno-šću osigurao hematološki oporavak bolesnika nakon transplantacije KMS-a iako neki istraživači preporu-čuju da broj CFU-GM-a bude >6x105 po kilogramu tjelesne težine primatelja. Tehnička složenost i ne-dostatak pouzdane kliničke korelacije s rezultatima funkcionalnih testova razlog su da se kultura stanica u mnogim centrima više ne koriste u rutinskoj kon-troli kvalitete pripravaka KMS-a.

Mikrobiološko testiranjeMikrobiološko testiranje obuhvaća: 1. ispitivanje da-rivatelja KMS-a na uzročnike zaraznih bolesti koje se prenose krvlju radi sprječavanja prijenosa infekcije s davatelja na bolesnika tijekom infuzije ili iz jednog pripravka u drugi tijekom pohrane u tekućem duši-ku, 2. ispitivanje pripravka KMS na moguće bakterij-sko zagađenje tijekom uzimanja, obrade ili pohrane KMS. Rizik prijenosa zaraznih bolesti transplantatom KMS-a ovisi o: 1. izvoru krvotvotvornih matičnih stanica (autologni ili alogenični), 2. načinu uzima-nja stanica; 3. postupcima laboratorijske obrade; 4. načinu pohrane.

Darivatelji KMS moraju biti testirani na biljege za-raznih bolesti prema međunarodnim standardima i prema lokalnoj epidemiološkoj situaciji.

Uzorci za mikrobiološku kontrolu uzimaju se iz pri-pravaka KMS na kraju laboratorijske obrade, a prije zamrzavanja pripravka. Učestalost zagađenja bakte-rijama ovisi o izvoru matičnih stanica. Odmah na-kon dobivanja informacije o bakterijskom zagađenju pripravka KMS, laboratorij mora o tome obavijestiti bolesnikovog liječnika kako bi se donijela odluka o daljnjim postupcima. Pripravci KMS-a iz koštane srži imaju visok rizik bakterijskog zagađenja tijekom uzimanja KMS zbog višekratnog punktiranja kože i vrećice za sakupljanje KMS. Gotovo isključivo se radi o bakterijama koje pripadaju normalnoj flori kože. Ovo zagađenje rijetko uzrokuje kliničku infekciju


nakon reinfuzije KMS. Rizik bakterijskog zagađenja je nizak za pripravke KMS dobivenih aferezom iz periferne krvi jer je vrećica za uzimanje sastavni dio jednokratnog zatvorenog seta za stanični separator.

Bakterijska zagađenja nastala u tijeku obrade pri-pravka KMS-a imaju znatno težu kliničku sliku jer se uglavnom radi o patogenim bakterijama a ne sa-profitima kože.

Budući da je u nekim slučajevima pripravak KMS jedinstven i nezamjenjiv, pozitivan nalaz mikrobio-loškog testiranja ne znači uvijek da se pripravak ne smije primijeniti. Pripravci zagađeni gram negativnim bakterijama se nažalost uvijek moraju uništiti. Osta-li slučajevi bakterijskog zagađenja pripravaka KMS trebaju se razmotriti s transplantacijskim centrom i u slučaju potrebe primijeniti uz prethodnu profilaksu infekcije infuzijom antibiotika (prema antibiogramu) neposredno prije transplantacije.

ZAMRZAVANJEZamrzavanje stanica postalo je moguće otkrićem kri-oprotektivnog svojstva glicerola i dimetilsulfoksida (DMSO) koji sprječavaju dehidraciju stanica tijekom zamrzavanja. Zamrzavanje je omogućilo dugotrajnu pohranu KMS-a bez većeg gubitka njihove vijabil-nosti i nakon višegodišnjeg čuvanja na niskim tem-peraturama. Ta činjenica koristi se u liječenju auto-lognom transplantacijom KMS i za pohranu krvi iz pupkovine za srodnu i nesrodnu transplantaciju.

Do oštećenja stanica tijekom zamrzavanja dolazi zbog intra- i ekstracelularnog stvaranja kristala leda i dehidracije stanica. Oštećenja ovise o brzini zamrza-vanja. Ako je zamrzavanje brzo, kristali leda nastaju u stanici, što uzrokuje mehaničko oštećenje stanice i njezinu smrt. Ako je proces zamrzavanja sporiji, kri-stali leda nastaju pretežno u izvanstraničnim prosto-rima. Slobodne molekule vode vežu se u kristale leda što uzrokuje koncentriranje soli u izvanstraničnom prostoru koje više ne ulaze slobodno u stanicu, hi-perosmolarnost i oštećenja stanice zbog dehidracije.

KMS se najčešće zamrzavaju u aparatima za kontro-lirano zamrzavanje uz dodatak krioprotektivne oto-

pine DMSO-a i proteina plazme s ili bez makromule-kularne otopine hidroksietil škroba (HES).

DUGOTRAJNA POHRANAVećina laboratorija KMS čuva na temperaturama ni-žim od -1200C u električnim zamrzivačima ili u plino-vitoj ili tekućoj fazi dušika. Na višim temperaturama postoji mogućnost rasta kristala leda zbog tzv. pro-cesa rekristalizacije u kojem voda migrira iz manjih kristala u veće.

Zbog zadržavanja što niže temperature u spremnici-ma, kao i zbog sprječavanja oscilacija temperature, mnogi laboratoriji KMS pohranjuju u tekućem du-šiku. Pri ovakvom načinu čuvanja postoji moguć-nost da se putem tekućeg dušika prenesu uzročni-ci zaraznih bolesti s jednog transplantata na drugi. Opisan je slučaj zaraze tri bolesnika s hepatitisom B nakon transplantacije zbog križne kontaminacije transplantata čuvanih u istom spremniku. Zbog toga transplantati čuvani u tekućem dušiku moraju biti dodatno zaštićeni u dodatnim vrećicama.

Čuvanje transplantata u plinovitoj fazi dušika sma-njuje rizik križne kontaminacije. Međutim, u ovim spremnicima postoji razlika u temperaturi ovisno o položaju. Tako npr. temperatura odmah ispod po-klopca može biti samo -1000C. Pri otvaranju spre-mnika i pri stavljanju pripravaka KMS u nosače, temperatura se može dodatno povisiti. Do ovakvog zagrijavanja može doći i više puta tijekom pohrane KMS što može uzrokovati oštećenje stanica. Kako bi se djelomično spriječila ova oscilacija temperature, nosači u spremnicima moraju biti izrađeni od metala koji dobro provode toplinu.

Neke krioprotektivne otopine dozvoljavaju pohranu KMS-a na višim temperaturama, npr. -800C. S obzi-rom da je -800C radna temperatura električnih zamr-zivača koji se često koriste u laboratorijima, jedan dio transplantacijskih centara koristi ove zamrzivače za pohranu KMS-a. Međutim u ovim zamrzivačima KMS mogu sigurno biti pohranjene tek nekoliko mje-seci od sakupljanja.


Danas se smatra da KMS propisno zamrznute i ču-vane na niskim temperaturama bez oscilacija tem-perature, mogu desetljećima očuvati proliferativnu sposobnost nakon otapanja.

IZDAVANJE KMSPrije izdavanja KMS u transplantacijski centar provje-rava se zadovoljava li pripravak sve zahtjeve kvalite-te. Pregledava se izgled pripravka (cjelovitost pakira-nja, oznaka, promjena boje), a rezultati proizvodnog postupka se još jednom provjere. S obzirom da je pripravak KMS namijenjen isključivo za liječenje određenog bolesnika, mora biti izgrađen sustav identifikacije koji nedvojbeno povezuje pripravak i bolesnika. Ukoliko se otkriju odstupanja, obavješta-va se bolesnikov liječnik i transplantacijski tim koji donose odluku o daljnjem liječenju bolesnika.

Neposredno prije izdavanja staničnog pripravka iz banke ili neposredno prije primjene uz krevet bole-snika potrebno je učiniti dodatne postupke koji su dio proizvodnog procesa (otapanje, pranje, even-tualno uzimanje uzoraka). Prostor u kojem se ove manipulacije rade mora zadovoljiti mikrobiološku sigurnost.

PRAĆENJE USPJEHA TRANSPLANTACIJEUstanova koja je proizvela i izdala pripravak KMS-a mora pratiti uspjeh liječenja i nepoželjne događaje vezane uz primjenu pripravka. Praćenje bolesnika mora obuhvatiti pokazatelje kojima se dokazuje si-

gurnost i učinkovitost pripravka. Sigurnost priprav-ka mjeri se učestalošću i vrstom neželjenih reakcija povezanih s infuzijom pripravka. Učinkovitost pri-pravka mjeri se brzinom hematološkog oporavka pa se stoga prati broj dana od transplantacije do porasta broja granulocita u perifernoj krvi >1 x 109/L i broj dana od transplantacije do rasta broja trom-bocita u perifernoj krvi >20x109/L. Neizostavno se mora pratiti broj bolesnika u kojih nakon transplan-tacije nije došlo do prihvaćanja transplantata. Ako rezultati transplantacije nisu očekivani, potrebno je razmotriti ima li u postupku uzimanja, obrade, pohrane i transporta propusta koji su uzrokova-li neočekivano loš klinički odgovor te eventualne propuste otkloniti.

OSIGURANJE KVALITETE, DOBRA PRIREĐIVAČKA PRAKSA I AKREDITACIJASvi postupci modifikacije staničnog pripravka, od početka proizvodnje do primjene, dio su proizvod-nog procesa. Oni moraju biti trajno nadzirani i do-kumentirani. Ustanove koje se bave proizvodnjom staničnih pripravaka trebaju raditi prema zahtjevima dobre priređivačke prakse i postojećim zakonskim propisima koji reguliraju rad tkivnih i staničnih bana-ka. Za međunarodnu razmjenu transplantata nužna je međunarodna akreditacija prema stručnim stan-dardima koje su izdali Foundation for the Accredita-ton of Cellular Therapy (FACT) i Joint Accreditation Committee ISCT and EBMT (JACIE).


LITERATURABenn H, Rowley SD. Bone marrow and peripheral blood stem cell transplantation. U: Hillyer CD, Silberstein LE, Ness PM, Anderson KC, Roback JD, ur: Blood banking and transfusion medicine. 2. izdanje. Philadelphia: Churchill Livingston Else-vier, 2007:787-822

Benn H, Rowley SD. Collection and processing of peripheral blood stem cell and bone marrow. U: Hillyer CD, Silberstein LE, Ness PM, Anderson KC, Roback JD, ur: Blood banking and transfusion medicine. 2. izdanje. Philadelphia: Churchill Livingston Elsevier, 2007:833-852.

Bojanić I, Golubić Ćepulić B, Nemet D, Raić Lj. Batinić D, Labar B. Osobitosti autolognih krvotvornih matičnih stani-ca iz periferne krvi u pedijatrijskih bolesnika. Lijec Vjesn. 2006;128(1-2):43-8.

Bojanić I, Golubić Ćepulić B. Umbilikalna krv kao izvor ma-tičnih stanica. Acta Med Croatica. 2006;60(3):215-25.

Broxmeyer HE. Umbilical cord blood stem cells: collection, processing and transplantation. U: Hillyer CD, Silberstein LE, Ness PM, Anderson KC, Roback JD, ur: Blood banking and transfusion medicine. 2. izdanje. Philadelphia: Churchill Li-vingston Elsevier, 2007:823-832

Council of Europe: Guide to safety and quality assurance for organs, tissues and cells, 3. izdanje. Council of Europe Publis-hig, Strasbourg, 2007.

Greco N, O’Donnell. Assessment of viability and apoptosis in cellular therapy products. U: Areman EM, Loper K, ur. Cellu-lar therapy: Principles, Methods, and Regulations Bethesda, MD: AABB, 2009: 563-572.

Klein MA, Kadidlo D, McCullough J, et al. Microbial contami-nation of hematopoietic stem cell products: Incidence and cli-nical sequelae. Biol Blood Marrow transplant 2006;12:1142-9.

McKenna DH, Clay ME. Haematopoetic stem cell processing and storage. U: Murphy MF, Pamphilon DH, ur: Practical tran-sfusion medicine. 2. izdanje. Blackwell Publishing, 2005:375-368.

Pravilnik o radu i nadzoru nad zdravstvenim ustanovama ili dijelovima zdravstvenih ustanova s bankama tkiva (NN 1/2006)

Snyder EL, Haley NR. ur. Cellular therapy: A physician’s handbook. AABB Press, Bethesda 2004

Standards for hematopoietic progenitor cell collection, proce-ssing and transplantation. 3. izdanje Joint accreditation com-mittee of ISCT-Europe and EBMT. 2007.

Standards for hematopoietic progenitor cell and cellular pro-duct service. AABB Press, Bethesda 2007.

Pitanja i odgovori

1. O čemu ovisi ishod transplantacije krvotvornih matičnih stanica?

Ishod transplantacije ovisi o broju transplantiranih stanica i njihovoj klonogenoj sposobnosti.

2. Koji je najvažniji identifikacijski biljeg krvotvornih matičnih stanica?

Najvažniji identifikacijski biljeg krvotvronih matičnih stanica je CD34.

3. Koji se biljezi apoptoze određuju u transplantatima krvotvornih matičnih stanica?

Određuju se 7-amino-aktinomicin-D (7-AAD) i aneksin V.

4. Što sve obuhvaća mikrobiološko testiranje transplantata?

Mikrobiološko ispitivanja uključuje ispitivanje darivatelja na uzročnike krvlju prenosivih bolesti i bakterijsko ispitivanje transplantata.

5. Koja je najčešće korištena krioprotektivna otopina koja se koristi za zamrzavanje krvotvornih matičnih stanica?

Najčešće se koristi dimetilsulfoksid (DMSO).

dio ix. - bib.irb.hrbib.irb.hr/datoteka/817914.klinicka_kemija_i_molekularna...443 laboratorijska...

Documents