Immunologiein der Labormedizin

Konteptvorlesung 2Themenblock 8

Beda M. Stadler

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KV 8.2 2

KV2 im Überblick

• Was sind Immunassays?• Was versteckt sich hinter

den Abkürzungen?• Assay Beispiele um

immunologische Prinzipien zu vertiefen

• Aussagekraft von Labordaten

• Vertrauensgrenzen

Lernziele: Immunologie in der Labormedizin

                         

 

KV 8.2 3

Was ankreuzen?

KV 8.2 4

KV3 im Überblick

• Präzipitationsteste• Agglutinations Teste• Antigen-Antikörper Teste

• Allgemein• Allergie Diagnostik• Flowzytometrie• HLA Diagnostik• Autoimmun Diagnostik

• Sensitivität und Spezifität von Labortesten

Immunologie in der Labormedizin

KV 8.2 5

Identität

1

A

4

2

3

6

5

PartielleIdentität

1

A

4

2

3

6

5

Keine Identität

1

A

4

2

3

6

5

Immunodiffusion(Ouchterlony Gel)

A12

AntigenKontrollserumTestserum

KV 8.2 6

Antigen

Präzipitinkurve

+Anti-A

Anti-B

Anti-C

CBA

Antikörper Immunkomplex

Imm

unko

mpl

ex

Antigen

Prozone PostzoneÄquivalenz

KV 8.2 7

Radiale Immunodiffusion

AK Konzentration

Dia

met

er2

AgAgAgAg

Antikörper im Gel

KV 8.2 8

Serum Elektrophorese

gammabeta

alpha2

alpha1

Albumin

-

+

Globuline

Paraproteinämie-Patient

KV 8.2 9

Immun-Elektrophorese

IgAAlbumin Transferrin IgGIgM

+

Normales Serum

Patienetenserummit IgA Mangel

Antikörper gegenSerumproteine

-

Beispiel

KV 8.2 10

Direkter Coombs Test

KV 8.2 11

Der indirekte Coombs Test

Patienten Serum

Erythrozyten+

Step 1

+

Coombs Reagens(Antiglobulin)

Step 2

z.B. anti-RhD Antikörper

KV 8.2 12

Passive Hämagglutination(Beispiel: Anti-Syphilis Antikörper)

KV 8.2 13

Latex Agglutination

KV 8.2 14

Blutgruppenbestimmung: Geltechnik

Resultat: Blutgruppe A RhD neg

monoklonaler Antikörper gegen Blutgruppen A Antigen in der oberen Gelmatrix

KV 8.2 15

z.B. Schwangerschaftstest

rapid determination of human chorionic gonadotropin (hCG) in urine specimens

Primary antibodies (anti-hCG labelled or on solid phase)Secondary antibodies (anti-Ig on solid phase)

KV 8.2 16

Allergieserologie: welcher Test?

Anti-2-Glycoprotein 1 (IgG) ELISA U/ml <15

Cardiolipin-Antikörper (IgG) SYNELISA GPL-U/ml <12

ECP ("eosinophil cationic protein") FEIA g/L 2.5-15

Tryptase FEIA g/L 1-13.5

Methylhistamin RIA µg/g Kreatinin 70-160

Total IgE FEIA kIU/L (altersabhängig)

Allergen-spezifisches IgE (RAST)

FEIA Rastklassen 0-6 0

Allergen-spezifisches IgG FEIA mg/L < 50 mg/L

Präzipitine Immundiffusion qualitativ negativ

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenz-bereich

KV 8.2 17

KV 8.2 18

Isotop Enzyme

Messung derMessung derRadioaktivitätRadioaktivität

oderoderEnzymaktivitätEnzymaktivität

Immun Assay: RIA & ELISA

• Enzyme • Linked • Immuno • Sorbent • AssayAntikörperAntikörperAntigenAntigen

markiertermarkierterAntikörperAntikörper

• Radio • Immuno • Assay

KV 8.2 19

ELISA

Anti-A

Markierter Antikörper

A

EnzymSubstrat

Produkt

KV 8.2 20

Sandwich ELISA

Anti-A

Anti-Antikörper

A

EnzymSubstrat

Produkt

                       

             

KV 8.2 21

Standardisierung

KV 8.2 22

Beispiel: Flowzytometrie 

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich

HLA-B27 Zytofluorometrie qualitativ positiv/negativ

Lymphozyten Zytofluorometrie Zellen/l 1200-2800

CD3 absolut ZytofluorometrieBerechnung

Zellen/l% der Lymphozyten

690-254055-84

CD4 absolut ZytofluorometrieBerechnung

Zellen/l% der Lymphozyten

410-159031-60

CD8 absolut ZytofluorometrieBerechnung

Zellen/l% der Lymphozyten

190-114013-41

NK-Zellen ZytofluorometrieBerechnung

Zellen/l% der Lymphozyten

90-5905-27

B-Zellen ZytofluorometrieBerechnung

Zellen/l% der Lymphozyten

90-6606-25

KV 8.2 23

sample

red fluorescence

sorted cells

sheet flow

nozzle

laser

forward scatter

right angle scatter

green fluorescenceprism

FACS

FluorescenceActivatedCellSorter

KV 8.2 24

Zellpopulationen

• Linkalle CD Marker

?

KV 8.2 25

CD-Antikörper CD Antigen Funktion Vorkommen

CD 2 Rezeptor für CD 58 (LFA-3), alternativer Aktivierungsweg von T-Lymphozyten unreife und reife T-lymphozyten

CD 3 T-Zell-Rezeptor-assoziierte polypeptidketten, Signaltransduktion reife T-Lymphozyten

CD 4 assoziative Erkennungsstruktur (Bindung an MHC-Klasse II Moleküle), HIV-Rezeptor T-Helferzellen, Monozyten, Makrophagen

CD 8 Bindung an MHC-Klasse I Moleküle zytotoxische T-Lymphozyten

CD 14 Rezeptor für bakterielles Endotoxin (LPS=Lipopolysacharid) Monozyten, Makrophagen

CD 16 Fc-gamma Rezeptor III NK-Zellen, Monozyten-Subpopulationen, Makrophagen

CD 23 niedrig affiner (bindender) Rezeptor für IgE B-Lymphos, follikuläre dendritische Zellen (=FDC)

CD 25 Interleukin-2-Rezeptor aktivierte T-Lymphozyten

IgM Antigenrezeptor unreife + reife B-Lymphos

IgD Antigenrezeptor reife B-Lymphos

HLA-DR MHC-Klasse II Moleküle, Bindung von Antigenpeptiden

AG-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, Monozyten, B-Zellen), aktivierte T-Lymphos

KV 8.2 26

Eine Immunantwort verfolgen

KV 8.2 27

CD-Marker bei der Diagnose von lymphohämopoietischen Erkrankungen

  Stammzelle Prä-B. frühe B. mittlere B. reife B. plasmozytoide B. Plasmazelle

  

  ALL   PLL, Burkitt Lymphom

CLL, foll. L.

Haarzell-L.

Waldenström Myelom

CD19                            

CD 20                            

CD 34                            

CD 52                            

CD138                            

KV 8.2 28

Beispiel: HLA Typisierung

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich

HLA-B27 Zelllyse qualitativ positiv/negativ

HLA-Typ I (A, B, C) (serologisch) Zelllyse qualitativ Phänotypisierung

HLA-Typ I (A, B) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung

HLA-Typ II (DR) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung

HLA-Typ II (DQ) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung

HLA-Typ II (DP) PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung

HLA-Typ Organempfänger PCR-SSP qualitativ Phänotypisierung

T-Zell Cross-match Zelllyse qualitativ negativ

B-Zell Cross-match Zelllyse qualitativ negativ

Leukozytenantikörper Zelllyse qualitativ negativ

KV 8.2 29

HLA Typisierung einst...

KV 8.2 30

Überlebensrate Nierentransplantate

Number of HLA mismatches

A & B DQ & DR 0 0

A & B DQ & DR3 or 4 1 or 2

KV 8.2 31

HLA-B27 Typisierung mittels FACS

KV 8.2 32

HLA Typisierung serologisch

KV 8.2 33

PCR

KV 8.2 34

HLA: Molekulare Diagnostik

KV 8.2 35

Array Technologie

                                                                                                                                                                                                                             

                                                                                                                                                                                                                             

„DNA Chips“

KV 8.2 36

Western Blot: Prinzip

KV 8.2 37

HIV: Western Blot

1.1. Lane 1, HIV+ serumLane 1, HIV+ serum(positive control) (positive control)

2.2. Lane 2, HIV- serum Lane 2, HIV- serum (negative control) (negative control)

3.3. Lane A, Patient A Lane A, Patient A 4.4. Lane B, Patient B Lane B, Patient B 5.5. Lane C, Patient CLane C, Patient C

KV 8.2 38

Beispiel: Autoimmunserologie

Analyse Messprinzip Masseinheit Referenzbereich

Rheumafaktor Nephelometrie IU/ml < 20

Zellkerne (ANA) IIF Titer < 1:80

Thyreoidea Thyroglobulin Agglutination Titer < 1:400

C1-Esteraseinhibitor (funktionell) Fotometrie % des Normwertes 70-130%

C1q-tragende Immunkomplexe ELISA g/ml < 35

Hautbiopsie DIF qualitativ negativ

Schleimhautbiopsie DIF qualitativ negativ

KV 8.2 39

Nephelometry

KV 8.2 40

Immunfluoreszenz

Antinukleäre Antikörper (ANA)

Ag

Fluorochrommarkierter AK

Gewebe

KV 8.2 41

Maus Lymphknoten gefärbt mit einem anti-T-Zell Antikörper

KV 8.2 42

In situ Hybridisierung

KV 8.2 43

FISH

KV 8.2 44

FISH Beispiel

Fluorescent in situ hybridisation of a small intestinal biopsy in a case of Whipple's disease (confocal laser scanning microscopy). Tropheryma whipplei rRNA is blue, nuclei of human cells are green and the intracellular cytoskeletal protein vimentin is red. Magnification approximately 200 x.

KV 8.2 45

Immunhistochemie

Human Papillomavirus DNA demonstrated by In Situ Hybridisation (pink)in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green)

KV 8.2 46

Sensitivität und Spezifität

• Sensitivität (epidemiologisch)

• Sensitivität (analytisch)• niedriger Titer• Serokonversion• Verdünnung

KV 8.2 47

oder...

• Sensitivität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei kranken Personen positiv ausfällt

• Spezifität = Wahrscheinlichkeit, dass Test bei gesunden Personen negativ ausfällt

KV 8.2 48

Genauigkeit der Labordiagnostik

X 100%echt Positive

echt Positive + falsch NegativeSensitivität =

X 100%echt Negative

echt Negative + falsch PositiveSpezifität =

KV 8.2 49

Aussagekraft der Labordiagnostik

echt Positive + falsch Positive

echt PositiveX 100%

positiverprädiktiver Wert =

echt Negative + falsch Negative

echt NegativeX 100%

negativerprädiktiver Wert =

KV 8.2 50

Prädiktive Werte

• Population #1, die Prävalenz der Infektion ist hoch• Population: 1000 Seren getestet

• 50 Seren von infizierten Individuen• 950 Seren von nicht infizierten Individuen

• Test Results: 50 positive: • 45 aus der infizierten Gruppe• 5 falsch positive aus der nicht infizierten Gruppe

• Der positive prädiktive Wert ist:

PPV = 45/ 45+5 = 90%• 9 von 10 positiven Resultaten sind von infizierten

Individuen

Annahme: Test Sensitivität = 100% / Spezifität = 99.5%

KV 8.2 51

Prädiktive Werte

• Population #2, die Prävalenz der Infektion ist tief• Population: 1000 Seren getestet

• 7 Seren von infizierten Individuen• 993 Seren von nicht infizierten Individuen

• Test Results: 7 positive: • 2 aus der infizierten Gruppe• 5 falsch positive aus der nicht infizierten Gruppe

• Der positive prädiktive Wert ist:

PPV = 2/ 2+5 = 28.6%

Annahme: Test Sensitivität = 100% / Spezifität = 99.5%

KV 8.2 52

KV2 im RückblickImmunologie in der Labormedizin

• Traditionelle Serologie• Moderne

immunologische Teste• Molekularbiologische

Methoden• Outlook: Point-of-care

testing ?

Immunologie Wahlpraktikum 3. Studienjahr 2004„Ein Einblick in die Labormedizin“

http://www.immunology.unibe.ch/teaching/Praktikum/praktikum.htm