1

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban�

12-13

Katona Éva

IMMUNOASSAY

Az immunassay-k jelentősége “Az analitikai biokémia hátaslova”

Alkalmazás

Részesedés Analit típusa Koncentráció tartomány

Gyógyszerszint meghatározás

26% Kis molekulák 10 nM-mM

Fertőző betegségek 21% Baktériumok, vírusok, nagy molekulák, antitestek, metabolitok

low

Endokrinológia

33% Kis molekulák, nagy molekulák beleértve az antitesteket is (70% <5 kDa)

pM-nM

Immunológia allergia, autoimmunitás, egyéb

7% Antitestek pM-nM

Tumor 5% Nagy molekulák, antitestek pM-nM

Egyéb (specifikus proteinek stb.)

8% Nagy molekulák > nM

Immunoassay típusok

Homogén - Heterogén

Direkt - Indirekt

Kompetitív - Nem kompetitív

AZ IMMUNASSAY-K TÍPUSAI

Ab:Ag + Ab:Ag-L + Ag-L Kompetitív (a reagens mennyisége limitált) szimultán: Ab + Ag + Ag-L több lépéses: 1. lépés: Ab + Ag Ab:Ag + Ab 2. lépés: Ab:Ag + Ab + Ag-L Nem kompetitív (a reagens feleslegben van)

Ab:Ag + Ab:Ag-L + Ag-L

HETEROGÉN: a komplexben kötött és szabadon lévő ligandummal jelzett reagenst a lekötődött jel detektálása előtt elválasztjuk

HOMOGÉN: a kötött és szabad jelzett reagens elválasztása nem szükséges

L=ligand: radioaktív izotóp, fluorofór, enzim, chemiluminescens, kofaktor, inhibitor, fém, partikulum, szubsztrát, polinukleotid

Csak abban az esetben használatos, ha egy specifikus és nagyon érzékeny módszerre van szükség. A RIA hátrányai: •  a nagy γ-sugárzó izotóp atomokkal történő jelölés, mint a

I125 gyakran nem megfelelő (a gyógyszerek kis molekulák, nem hatékony a jelölés vagy csökken az antigenitásuk)

•  a tríciummal való jelölés megfelelő, de ennek hátránya, hogy a H3 β-sugárzó és a β -scintillációs számlálás lassú és körülményes.

•  Csak heterogén módszer lehet.

Antigén helyett az antitest jelölése izotóppal: immunoradiometric assay (IRMA)

RADIOIMMUNOASSAY (RIA)

2

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) I.

A módszer elve:

•  egy fluoreszkáló anyaghoz (fluorofór) kémiai kötéssel antigént (gyógyszer, hormon, metabolit) kapcsolnak (konjugátum)

•  a fluorofórhoz kötött antigént megvilágítják polarizált fénnyel

•  Ha a konjugátumhoz nem kötődik antitest, szabadon rotál az oldatban és a beeső és az emittált fény síkja egymáshoz képest elmozdulhat.

•  Ha a konjugátumhoz antitest kötődik, az antitest molekula nagy mérete kb. 100x-ra csökkenti annak rotációs relaxációs idejét. Ez azt jelenti, hogy csak kis elmozdulás jöhet létre ugyanannyi idő alatt, ezért az elnyelt és kibocsátott fény ugyanabban a síkban polarizált.

•  Az emittált fény polarizációjának mértéke arányos a szabad konjugátum mennyiségével.

•  Ha a mintában lévő szabad antigén korlátozott mennyiségű antitest kötőhelyeiért versenyez a konjugátummal, a fény polarizációjának mértéke jelzi a minta antigén koncentrációját.

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) II.

A mintában nincs antigén

(az összes jelzett antigén antitesthez kötött – lassú rotáció)

At Ag At-Ag + antitest jelzett

antigén

minta

síkban polarizált beeső fény

ugyanabban a síkban kibocsátott fluoreszcencia

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) III.

A mintában jelen van az antigén (a mintában lévő antigén az antitesthez kötődik – a jelzett antigén szabadon rotál)

At-Ag + Ag + At antitest

Ag jelzett

antigén

minta

síkban polarizált beeső fény

Depolarizált fluoreszcencia A detektálás síkjában csökkent

fluoreszcencia intenzitás

+ Ag antigén a mintában

FLUORESCENT POLARIZATION IMMUNOASSAY (FPIA) IV.

•  A készülékek a polarizált fény intenzitását mérik, ami fordított arányban áll a minta antigén koncentrációjával.

antigén koncentráció

pola

rizác

ió

Immunoassay típusok - nem kompetitív

első At Ag Ag

At

jel második At

jel

direkt at indirekt

direkt ag

At

jel Ag

szendvics

At 1

Ag

jel

At 2

Immunoassay formációk - kompetitív 1

Ag

jelzett At a reagensben

jelöletlen At a mintában

!!!

3

Immunoassay formációk - kompetitív 2

jelzett Ag a reagensben jelöletlen At a

reagensben vagy a felszínen Ag a mintában

A szilárd felszín típusai • 96 lyukú mikrotitráló lemez felszíne (polystirol, PVC stb)

(ELISA) • Reakciócső felszíne (RIA) • Latex partikulumok felszíne (pl. MEIA) • Mágneses partikulumok felszíne (automatizált heterogén

immunoassay-k)

JELZÉSEK 1. Izotóp (125I: γ, T1/2= 60 nap

57Co: γ, T1/2= 270 nap 3H: β, T1/2= 12.26 év 14C: β, T1/2= 5760 év)

Enzim tormaperoxidáz HRPO (oxidoreduktáz) alkalikus foszfatáz AP (primer alkoholok, fenolok és aminok foszfát észtereinek hidrolízise) β-D- galaktozidáz glükóz oxidáz glükóz-6-foszfát dehidrogenáz kataláz ureáz

JELZÉSEK 2. Fluorofór (megvilágítva fényt emittál)

1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP⇒ MU

Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) acridium észter acridium szulfonamid isoluminol

Biotin Protein A Kofaktor Inhibitor DNS

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Microwell Products

�

4

Enzyme-Linked ImmunoSorbent (ELISA) – leggyakrabban peptidek, proteinek, antitestek és hormonok kimutatására és meghatározására szolgál. Általában 96-well plate-t használunk (Corning’s/Nunc/Costar stb.), de lehet 384 well,

stb. Lépései: • A lemezt bevonjuk (capture) az antigénre specifikus elfogó antitesttel (1-10µg/

ml) leggyakrabban karbonát-bikarbonát pufferben (pH:9.5), inkubálás 2 h szobahőn vagy egy éjszakán át 4°C-on

•  mosás • A szabadon maradt felszín blokkolása (0,5-1% BSA), inkubálás 0,5-1 h szobahőn •  mosás • Standardok/minták bemérése (50-100 µl/well), inkubálás 1 h szobahőn •  mosás • Az antigénre specifikus, enzimmel (HRP/AP) konjugált jelző antitest bemérése,

inkubálás 1 h szobahőn •  mosás • Szubsztrát adása és detektálás Az inkubálási időket és hőmérsékleteket minden ELISA esetén optimalizálni kell.

ELISA (szendvics típus) Ha az elfogó antitest biotinált és streptavidinnel bevont ELISA lemezt használunk, az elfogó, jelző antitesteket és a mintát egyszerre is bemérhetjük. Az inkubálási idő letelte után mossuk a lemezt majd bemérjük az enzim szubsztrátját és detektálunk (egylépéses ELISA).

ELISA (szendvics típus)

Streptavidinnel fedett felület

Reagensek Reakció

FXIII HRP-vel jelölt anti-FXIII-A jelzô antitest

A A B B

A A B B

Biotinilált anti-FXIII-B elfogó antitest

Az egy lépéses szendvics ELISA FXIII meghatározás elve

A lemez rázatása szükséges!

ELISA kalibrációs görbe

Szükség van istmert ag koncentrációjú standardra!

Indirekt ELISA módszer (adott antigénre specifikus antitest kimutatása)

MEIA (Mikropartikuláris Enzim Immuno Assay)

Anti-Troponin I monoklonális antitesttel fedett Latex szemcsék

Üvegszál mátrix

A Mikropartikuláris Enzim Immunoassay (MEIA) elméleti alapjai

A mérendő anyagra specifikus elfogóval fedett szubmikron nagyságú latex részecskéket alkalmaz a módszer. Következmény:

nagy, hatékony felületet az immunreakció számára. a kinetikus reakció felerősödik, csökken az inkubációs idő.

Mintavevő egységben:

A mérendő minta és a szükséges reagensek egy reakcióedénybe kerülnek Mérőegységben: 1.  A minta inkubálódik 2.  A reakcióelegy egy inert üvegszálas mátrix felületére kerül át. Az immunkomplex

fennmarad az üvegszálakon, a reakcióelegy többi összetevője átáramlik, kimosódik. 3.  Az üvegszálas mátrix felületére egy a mérendő anyagra specifikus, alkalikus foszfatázzal

jelzett konjugátum kerül. 4.  Az üvegszálas mátrix felületére 4-Methylumbelliferyl-foszfát (MUP) kerül, melyet az

enzim Methylumbelliferonná (MU) hidrolizál. 4.  A reakció során a mátrix felületén keletkező fluoreszcens MU képződési rátáját mérjük,

ami arányos a mintában lévő analit koncentrációjával.

5

A MEIA reakció lépései Kétlépéses

MINTAVEVŐ EGYSÉG • Minta • Mikropartikulumok • Alkalikus foszfatáz konjugát

REAKCIÓ EGYSÉG A minta és a Mikropartikulumok keverednek

Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik

MOSÁS

Fluoreszcencia mérés

Alkalikus foszfatáz konjugát a mátrixra

MOSÁS

Egylépéses MINTAVEVŐ EGYSÉG • Minta • Mikropartikulumok • Alkalikus foszfatáz konjugát

REAKCIÓ EGYSÉG A minta a Mikropartikulumok és az Alkalikus foszfatáz konjugát keverednek

Reakcióelegy az üvegszálas mátrixra továbbítodik

MOSÁS

Fluoreszcencia mérés

Tipikus standard görbe MEIA módszer esetén

JELZÉSEK Fluorofór (megvilágítva fényt emittál)

1, direkt fluorofór jelzés (FITC, rhodamin stb.) 2, az enzim szubsztrátja válik fluorescens anyaggá pl. MUP⇒ MU

DELFIA: a TRF (Time Resolved Fluorometry) elvén működik

A DELFIA rendszerben a fluorometer 1000 excitációs fényfelvillanást szolgáltatmásodpercenként, melyek kevesebb, mint 1 mikrosecundumig tartanak. A fluoreszcenciamindegyik impulzus után 400 és 800 mikrosecundum között mérhet!

JELZÉSEK Luminescens (kémiai reakció közben fényt emittál) Enzim szubsztrátja kemiluminescens fényemisszióval stabilizálódik, pl: AP

szubsztrátja az adamantil 1,2-dioxetan arylfoszfát (AMPPD) isoluminol (A HRPO hatására, H2O2 jelenlétében bekövetkező luminol oxidáció fényemisszió

jelerősségét 1000-szeresre növelhetjük, ha a közegben szubsztituált fenolok, vagy naftolok vannak (pl. 4-jodofenol). Az enhanced kemilumineszcenciás jel 2-20 perc időtartamban jól leolvasható. Ezt a jelképzést sok automatizált módszer használja)

acridium észter, acridium szulfonamid (A jel keletkezésekor alkalikus közegben az észter kötés hasad s egy instabil N-metilakridon származék keletkezik, amely jellemző hullámhosszúságú fény felvillanások emissziójával stabilizálódik. A fényintenzitás mértéke a közeg lumineszcens anyag koncentrációjával arányos.)

Eltérően a fluoreszcencia méréstől, itt nincs besugárzási fény, és jel csak a lumineszcens molekulából származik, így a háttér teoretikusan nem ad jelet. Eltérően a radioaktív bomlástól, a kémiai reakcióból származó összes foton rövid idő alatt rendelkezésre áll, így növelve a potenciális specifikus aktivitást.

JELZÉSEK 4. Elektrokemiluminescens immunoassay (ECLIA)

A rutenium(II) tris (bipiridil) [Ru(bpi)33+], egy platina elektród felületén gerjesztődik, majd

alapállapotba kerül fény (elektrokemilumineszcens) emisszióval. A reakcióban elektron donorként tripropilamin (TPA) vesz részt. A Ru(bpi)3

3+ komplex redukciójával nyerjük a gerjesztett állapotú Ru(bpi)3

2+ komplexet, amely elektronleadás mellet fénykibocsátással tér vissza alapállapotába. Ezt a fénykibocsátást (620 nm) mérik egy átfolyó elektrokémiai cellában. Elektrondonor felesleg mellett a ruténium sokszorosan gerjeszthető, ami a jel erősödését eredményezi.

6

JELZÉSEK: IPCR

Chimera biotech

Amplifikáció: valós-idejű PCR kettősen jelzett próba alkalmazásával (Fluorescens festék + quencher) Miközben a DNS-polimeráz hosszabbítja a PCR primert, az exonukleáz aktivitása hasítja a primer közelében bekötődött próbát. A quencher és fluorescens festék egymástól való eltávolodása fluorescens jelet szolgáltat.

Biochip

• Multi-analyte assay-k végzésére létrehozott szilárd fázisú technika, a felszín az analit tekintetében inert.

7

Biochip Carrier Production

> 20 million biochips per year

Kompetitív Immunoassay

Y Y

SZUBSZTRÁT

ANTITEST

ANALIT

E

KONJUGÁTUM

{DETEKTÁLÁS

TESZT RÉGIÓK

Assay Panelek •  DOA monitorozás (Amphetamine, Methamphetamine, Cocaine, Barbiturates, Cannabinoids, Opiates,

Methadone, Benzodiazepines, Lorazepam, Phencyclidine, Creatinine) •  Tumor monitorozás •  Tumor PSA •  Cardiális markerek •  Reproduktív hormonok •  Thyroid hormonok •  Antibiotikumok •  Cytokinek

Kompetitív Biochip Assay Negatív vizelet kontroll Cannabinoids

Amphetamine

Cocaine Methamphetamine

Opiates

Methadone Benzodiazepines

Barbiturates Phencyclidine

Cannabinoids Amphetamine

Cocaine Methamphetamine

Opiates

Methadone Benzodiazepines Barbiturates

Phencyclidine

DoA pozitív vizelet

Tulajdonságok

•  Más immunoassay-kel összehasonlítva a teljesítőképessége megfelelő.

•  A GC/MS eredményekkel jobban megegyező eredményeket ad. •  Az amphetamine és methamphetamine, valamint a

benzodiazepine meghatározások a drog azonosításhoz további segítséget nyújtanak.

•  Minta: 7 uL minta / biochip Vizelet Vér – teljes vér Szérum Nyál

• 

8

Előnyök •  Magas hozamú, automata analizátor

–  108 minta/óra •  Párhuzamos mérés

–  Ugyanazon mintából egy időben több teszt mérődik –  1188 teszt /óra (+creatinin)

•  Kis minta térfogat –  7 ul mintából 10 teszt mérhető szimultán –  Különösen lényeges vér és nyál esetén

•  Kevesebb minőségi kontroll anyag szükséges –  Multi analit kontrollok (ár!)

•  Különböző cut off szintek választhatók –  1 kit különböző cut off szinteken detektál

•  Pl. opiátok 300 és 2000 ng/ml –  Flexibilis, ha a felhasználó másként igényli

•  Biztonságosság –  A mintatartók ajtaja bezáródik a feltöltés után

•  A software jelszóval védett –  A minta carry over vagy kontamináció csökkent

•  csak 1 aliquot minta mérődik 10 helyett –  Az eldobható biochip fertőzések szempontjából kedvezőbb, mint a

többször használt küvetták •  Retrospektív eredményközlés

–  Újabb analízis nélkül ki lehet adni az addig még nem kért eredményeket

•  Creatinin marker –  A minta hamisítást egyetlen méréssel ki lehet deríteni

•  A laboratórium csak a kért teszteket számlázza

Előnyök

• FDA engedély: vizelet minta analizátor

Jelzett detektáló antitest Analit Elfogó antitest Heterofil antitest vagy HAMA A felszín blokkolására használt fehérje Interferáló, keresztreagáló anyag

Az immunassayk-ben előforduló problémák

Heterofil antitestek jelenlétének következményei

INTERFERENCIÁK VIZSGÁLATA A módszer specificitása az alkalmazott antitestek specificitásától függ!

A leggyakoribb interferenciát okozó anyagok immunoassay-k esetén: •  az antigénnel rokon szerkezetű anyagok keresztreakciója

(gyógyszerek!) Poliklonális antitestek esetén a keresztreakció tesztelése minden Lotnál szükséges!

•  endogén humán antitestek (pl. a thyroid autoantitestek a T3 vagy T4-hez kötődnek, a reagens antitestek kötődését gátolva befolyásolják a mérést)

•  heterofil antitestek (humán anti-állat antitestek, befolyásolhatják a reagensben lévő antitestek reaktivitását, gyakran okoznak pozitív interfrenciát a szendvics típusú módszereknél)

INTERFERENCIÁK VIZSGÁLATA

Heterofil antitestek kimutatása: - sorozat hígítás heterofil antitest negatív szérummal és a paralellizmus vizsgálata

egy másik szérummal -  a minta előinkubálása nem-immun szérummal vagy irreleváns specificitású

antitesttel abból az állatfajból, melyre specifikus heterofil antitestet feltételezünk. A heterofil antitest lekötése miatt az előinkubálás után elvégezve a mérést eltérő eredményt kapunk.

-  A heterofil antitest eltávolítása a szérumból Protein-Abszorpcióval, hőkezeléssel, egyéb szeparációs módszerrel.

-  Humán anti-egér antitest kimutatására már létezik módszer.

•  hemolízis •  lipémia •  magas bilirubin •  rheuma faktor (RF)

9

INTERFERENCIÁK VIZSGÁLATA Hemolízis, lipémia, magas bilirubin, rheuma faktor (RF)

•  Szükséges anyagok: - a kérdéses interferáló anygoktól mentes minta, melynek analit koncentrációja

a referencia tartomány felső régiójában van -hemolizátum ismert hemoglobin koncentrációval -intralipid infúziós oldat (lipid összetétele pontosan ismert) -bilirubin standard -rheuma faktor

A vizsgálat kivitelezése: 1.  Az interferáló anyagból n elemű hígítási sort készítünk (a koncentrációk a teszt

koncentrációk 10-szeresei) 2.  A mintából n+1 alikvotot készítünk (450 µL), melyekhez 50-50 µL hígított

interferáló anyagot, ill. hígítót (+1) adunk. 3.  A meghatározást elvégezzük mindegyik így elkészített teszt mintából. 4.  Az interferáló anyagot nem tartalmazó mintához viszonyítva megadjuk a többi

minta %-os analit koncentrációját. 10% eltérés felett tekintjük a hatást interferenciának.

Hemolízis hatása

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

0 20 40 60 80 100 120 140

Hemoglobin (g/L)

mért

FX

III-A

%

Bilirubin hatása

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Bilirubin koncentráció (umol/L)

mért

FX

III-A

%

Triglicerid hatása

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

Triglicerid mmol/L

mért

FX

III-

A %