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K. Gabin-Gauthier, ETSL

ETSL

Immuno-enzymologie appliquée au sérodiagnostic

de la toxoplasmose TP 5 Deuxièmepartie

GABIN-GAUTHIER

27/01/2010

I. LA TOXOPLASMOSE ............................................................................................................................................................ 2

II. PRINCIPE DES REACTIONS D’IMMUNO-ENZYMOLOGIE ....................................................................................................... 2

1. PRINCIPE GENERAL ................................................................................................................................................................ 2

2. LE TEST PLATELIA TOXOIGG .................................................................................................................................................... 3

III. MODE OPERATOIRE ........................................................................................................................................................ 4

1. TEST ELISA ........................................................................................................................................................................ 4

IV. FEUILLE DE RESULTATS .................................................................................................................................................... 6

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IMMUNO-ENZYMOLOGIE APPLIQUEE AU SERODIAGNOSTIC

DE LA TOXOPLASMOSE

TP 5 Deuxièmepartie

I. La toxoplasmose Voir TP5 première partie !

II. Principe des réactions d’immuno-enzymologie

1. Principe gé néral

Ce sont des réactions de type EIA (Enzyme Immuno Assay), Ag-Ac, spécifiques permettant de mettre en

évidence un complexe Ag-Ac en utilisant une enzyme directement fixée ou indirectement fixée sur les

complexes immuns. Lorsque l’on ajoute ensuite le substrat de l’enzyme, il y a libération d’un composé coloré que

l’on peut doser par spectrométrie. Le substrat de l’enzyme est encore appelée substance chromogène. Les

principales enzymes utilisées sont la phosphatase alcaline (PAL), la peroxydase de raifort (PEROX) et la β-

Galactosidase (β-GAL). On n’abordera ici que les techniques en phase dite hétérogène, c’est-à-dire dans

lesquelles le comportement de l’enzyme libre est identique à celui de l’enzyme fixée au complexe Ag-Ac.

C’est une technique très sensible (10 à 20ng/mL, voire moins) mais qui reste très onéreuse et parfois délicate à

mettre en œuvre. Ces techniques sont encore appelées ELISA pour Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.

Ces techniques possèdent de nombreuses variantes : ELISA indirecte, ELISA sandwich, ELISA compétitif. Ces

réactions se déroulent toujours en plusieurs étapes, avec des étapes indispensables de lavage pour éliminer les

réactifs n’étant pas intervenus dans la réaction Ag-Ac.

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Figure 1 : Les 3 principales variantes de technique ELISA qui permettent la détermination qualitative ou

quantitative d’un antigène ou d’un anticorps. Chaque technique peut être rendue quantitative par comparaison

avec des courbes étalons préparées avec des concentrations connues d’Ac ou d’Ag. L’anticorps peut être

déterminé par un ELISA indirect (a), tandis qu’un Ag peut être déterminé par un ELISA sandwich (b) ou

compétitif (c). Dans l’ELISA compétitif, qui est un dosage de type compétitif, la concentration de l’Ag est

inversement proportionnelle à la couleur produite.

2. Le te st Pl atel ia ToxoIgG

Platelia™ Toxo IgG est un test permettant la détection et le titrage des anticorps IgG anti-T. gondii dans le

sérum ou le plasma humain par une méthode immuno-enzymatique en phase hétérogène sur phase solide.

L’antigène T. gondii est utilisé pour sensibiliser la microplaque. Un anticorps monoclonal marqué à la peroxydase

et spécifiquement dirigé contre les chaînes gamma humaines (anti-IgG) est utilisé comme conjugué. La mise en

œuvre du test comprend les étapes suivantes :

Etape 1

Les échantillons à étudier ainsi que les calibrateurs sont dilués puis déposés dans les cupules de la microplaque.

Durant cette incubation de 1 heure à 37°C, les IgG anti-T. gondii présentes dans l’échantillon se lient à l’antigène

T. gondii fixé sur les cupules de la microplaque. Les IgG non spécifiques du T. gondii et les autres protéines

sériques sont éliminées par les lavages pratiqués à la fin de l’incubation.

Etape 2

Le conjugué (anticorps monoclonal spécifique des chaînes gamma humaines et marqué à la peroxydase) est

déposé dans toutes les cupules de la microplaque. Durant cette incubation de 1 heure à 37°C, l’anticorps marqué

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se lie aux IgG sériques ayant réagi avec l’antigène T. gondii. Le conjugué non lié est éliminé par les lavages

pratiqués à la fin de l’incubation.

Etape 3

La présence des complexes (Ag T. gondii, IgG anti-T. gondii, conjugué anti-IgG) éventuellement formés est

révélée par l’addition dans chaque cupule d’une solution de révélation enzymatique.

Etape 4

Après incubation à température ambiante (+18-30°C), la réaction enzymatique est stoppée par addition d’une

solution d’acide sulfurique 1N. L’absorbance lue à 450/620 nm est proportionnelle à la quantité d’IgG anti-T.

gondii présente dans l’échantillon testé. L’absorbance est convertie en UI/ml à l’aide d’une gamme standard de

référence.

Le test doit être validé par une série de témoins qui seront précisés dans la suite du protocole.

III. Mode opératoire

1. Test ELISA

Vous disposez par binôme de : 40µL de sérum d’un patient

20µL de chaque calibrateur de contrôle de titre connu : R3 0UI/mL ; R4a 6UI/mL ; R4b 60UI/mL ; R4c 240UI/mL

1 barrette ELISA de 8 puits coatés avec l’Ag Toxoplasma gondii 2,5mL de diluant R7

1,3 mL solution de lavage concentrée ou R2 40µL de solution de conjugué R6 à diluer au 1/51 de R7

1,8 mL de la solution de chromogène R9 (substrat de l’enzyme) 900µL de la solution d’arrêt R10

1) Diluer les calibrateurs R3, R4a, R4b, R4c au 1/21 dans le diluant (R7), soit 300 μl de Diluant (R7) puis 15

μl d’échantillon. Bien homogénéiser (Vortex).

2) Diluer l’échantillon de sérum du patient à tester au 1/21 dans le diluant (R7), soit 300 μl de Diluant (R7)

puis 15 μl d’échantillon. Bien homogénéiser (Vortex). Effectuer cette dilution en double (duplicate).

3) Distribuer dans chaque cupule 200μl des calibrateurs et des échantillons dilués selon le schéma établit.

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A B C D E F G H

R3 R4a R4b R4c Inc Inc PBS PBS

4) Couvrir la microplaque d’un film adhésif. Incuber immédiatement à 37°C ± 1°C dans une étuve pendant 1

heure ± 5 minutes.

5) Avant la fin de la première incubation, préparer la solution de travail du conjugué (R6+R7). Calculez le

volume nécessaire pour chaque binôme : 8 cupules avec 200µL (soit 1600 µL/binôme), puis par l’ensemble

du groupe (10 binômes). Le total devrait faire 16 mL au minimum. La dilution à réaliser est au 1/51 avec

par exemple 0,5mL de R6 dans 25mL de diluant R7. Pour 20 mL de solution de travail, on devra donc

ajouter 0,4mL de R6 (400µL ; P1000) dans 20mL de R7 (éprouvette). La dilution sera faite directement

dans le réservoir !

6) Avant la fin de la première incubation, préparer la solution de lavage à partir de R2 pour 2 binômes. La

dilution à réaliser est au 1/20 soit pour 50 mL : 2,5 mL de R2 (x10) (pipette graduée de 5mL) dans 47,5

mL d’eau distillée (éprouvette). Faire la dilution directement dans le réservoir numéroté !

7) Retirer le film adhésif, vider le contenu de toutes les cupules dans un conteneur pour déchets

contaminés (contenant de l’hypochlorite de sodium) et procéder à 4 lavages avec 350 μl de la Solution de

Lavage diluée (R2). Sécher les barrettes par retournements sur une feuille de papier absorbant et taper

légèrement afin d’éliminer la totalité de la Solution de Lavage.

8) Distribuer immédiatement 200 μl de la solution de travail du conjugué (R6+R7) dans toutes les cupules.

Agiter délicatement cette solution avant l’emploi.

9) Couvrir la microplaque d’un film adhésif neuf et incuber à 37°C ± 1°C

10) Retirer le film adhésif, vider le contenu de toutes les cupules (conteneur pour déchets contaminés) et

procéder à 4 lavages avec 350 μl de la Solution de Lavage diluée (R2). Sécher les barrettes par

retournement sur une feuille de papier absorbant et taper légèrement afin d’éliminer la totalité de la

Solution de Lavage.

11) Distribuer rapidement, et à l'abri de la lumière vive, 200 μl du Chromogène (R9) dans toutes les cupules.

Laisser la réaction se développer à l’obscurité pendant 30 ± 5 minutes à température ambiante (+18-

30°C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif.

12) Arrêter la réaction enzymatique en ajoutant 100 μl de la Solution d’Arrêt (R10) dans chaque cupule.

Adopter la même séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de révélation.

13) Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Lire l’absorbance à l’aide d’un lecteur de plaques dans les

30 minutes qui suivent l’arrêt de la réaction. Les barrettes doivent toujours être conservées à l’abri de

la lumière avant la lecture. Lire à double longueur d’onde 450/620 nm puis également à 450 nm puis à

620 nm en réalisant un blanc contre l’air (une cupule vide). Comparez les résultats.

14) Validation et résultats :

A R4a ≥ 0,200

A R4b ≥ 0,400

A R4a/DO R3 ≥ 5,000

A R4b/DO R4a ≥ 2,20

A R4c/DO R4b ≥ 1,15

Négatif : Titre < 6UI/mL

Douteux : 6UI/mL ≤ Titre < 9 UI/mL

Positif : Titre ≥9 UI/mL

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IV. Feuille de résultats

Immunoenzymologie

Schématisez toutes les étapes de cette technique pour un sérum positif en utilisant les symboles

suivants :

Ag Toxoplasma gondii : Ig anti Toxoplasma gondii :

Ig anti Ig humaines marquées à la PAL :

Substrat de l’enzyme sous sa forme initiale : Substrat modifié par l’enzyme :

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De quelle technique s’agit-il ? Pourquoi ?

Pourquoi utilise –t-on une lecture avec une double longueur d’onde ?