IL MISTERO DELLA GIOVANE DONNA MORTA

D’INFARTO

Gruppo Biologia Molecolare2009-2010

Autopsia:

• Giovane donna morta (30 anni circa).• Non presenta lesioni corporee.• Nelle coronarie presenta trombosi che le ha

procurato un infarto fulminante: necrosi del tessuto cardiaco muscolare.

Discussione del Caso:

• Fattori: - Obesità - Fumo- Depressione post-parto- Assunzione di sonniferi- Morte sospetta della bisnonna

Il fattore V di Leiden:

Estrazione del DNA dal sangue:

• Separazione dei globuli bianchi dal resto del sangue.• Rottura membrana cellulare (nucleare) tramite

l’enzima proteasi.• Aggiunta dell’Etanolo assoluto (anfipatico)• Centrifugare e inserire i tamponi AW1 eAW2• Aggiunta H2O deionizzata

Amplificazione del DNA: la PCR

• Perché amplifichiamo il DNA?• Il DNA estratto nel passo precedente viene inserito in

una soluzione contenente: - Mastermix (primers e nucleotidi) - Taq polimerasi (polimerizzazione)• Il programma di amplificazione del DNA:

- 94°C (denaturazione)- 60°C (annealing dei primers) -72°C (polimerizzazione)

Cicli PCR:

Digestione con enzimi di restrizione e separazione elettroforetica:

• Dopo la polimerizzazione del DNA viene aggiunto l’enzima di restrizione.

• Scopo: tagliare i vari filamenti di DNA nei punti “specifici”.

• Il gene sano verrebbe tagliato in due punti specifici. • Quando il paziente è affetto dal fattore V Leiden

l’enzima di restrizione taglia solo in un punto il gene Una base azotata è mutata

Analisi elettroforetica:

• Perché eseguire l’analisi elettroforetica?– Separare i pezzi del gene

• Il DNA, essendo carico negativamente, migra verso il polo positivo.

• Gel Agarosio: “rete” che ostacola i filamenti di DNA:– Filamenti corti arrivano più vicino al polo +– Filamenti lunghi si fermeranno più lontano al polo

+ rispetto ai filamenti corti

Possibili errori avvenuti durante l’analisi:

• Taq-Polimerasi

• Primers

• Errore durante l’estrazione del DNA

Conclusioni:

• Donna affetta dal fattore V Leiden• Genitori saranno entrambi eterozigoti• La figlia sarà sicuramente etrozigote, oppure

addiruttura omozigote