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Identifizierung und Charakterisierung
genetischer Suppressoren der männlich sterilen
opr3-Mutante in Arabidopsis thaliana
Universität Hohenheim Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. A. Schaller
Diplomarbeit von Dagmar Kleeb
Unter Anleitung von Dr. Annick Stintzi
Stuttgart, Mai 2004
Erklärung: Hiermit versichere ich, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig verfaßt, andere als die
angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und die den benutzten Werken wörtlich
oder inhaltlich entnommenen Stellen als solche kenntlich gemacht habe.
Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgte eine Charakterisierung von genetischen Suppressoren der opr3-Mutante von Arabidopsis thaliana. In der opr3-Mutante liegt eine Mutation im Gen für die OPDA-Reduktase 12-Oxo-Phytodiensäure-10,11-Reduktase 3 (OPR3) vor, so daß der Jasmonsäurebiosyntheseweg gestört ist, was zu einem sterilen Phänotyp der opr3-Mutante führt. Die genetischen Suppressoren haben eine zusätzliche Mutation, durch die der fertile Phänotyp des Wildtyps wiederhergestellt wurde. Die Charakterisierung soll dazu beitragen, daß die Signalkaskaden downstream von Jasmonsäure besser verstanden werden. Dazu erfolgte zunächst für die infragekommenden Linien der Nachweis, bei welchen Linien es sich um echte Suppressoren handelt, wobei sechs Linien identifiziert werden konnten. Über ein Kreuzungsexperiment wurde nachgewiesen, daß drei der Suppressor-Mutationen dominant und drei rezessiv waren. Desweiteren erfolgte für alle sechs Linien die Rückkreuzung mit opr3, mit dem Ziel, Nebenmutationen zu eliminieren, als Basis für ein später auszuführendes Mapping durch Kreuzung der Suppressoren mit dem Ecotyp Landsberg erecta, bei dem die betroffenen Gene genau identifiziert werden sollen. Um festzustellen, ob die Suppressor-Mutationen OPDA-abhängig sind, wurde eine opr3/aos-Doppelmutante hergestellt. Außerdem wurden die Suppressoren mit der aos-Mutante gekreuzt. Die hieraus in F2 entstehenden homozygoten Pflanzen sollen später mit der o. g. Doppelmutante gekreuzt werden, um Pflanzen zu erhalten, die in opr3, aos und in der Suppressormutation homozygot sind. Für die phänotypische Charakterisierung der Suppressoren wurden die drei Parameter Blühbeginn, Länge des Haupttriebs und Schotenöffnung gemessen, um eventuelle Abweichungen von der normalen Entwicklung aufzuzeigen. Außerdem wurden mikroskopi-sche Untersuchungen an den jeweils ersten drei bis vier geöffneten Blüten (ausgehend vom Blütenstand des Haupttriebs) ausgeführt, die interessanterweise zeigten, daß bei den verschiedenen Suppressoren bezüglich der Freisetzung von Pollen signifikante Unterschiede im zeitlichen Verlauf festzustellen sind. Desweiteren wurde die Pollenkeimung untersucht, die mit Pollenkeimungsraten zwischen 46,7 und 72,3 % zeigte, daß die Prozesse, die für eine normale Entwicklung von Pollen und Antheren notwendig sind, in allen sechs Suppressoren zwar nicht 100%ig, aber doch im wesentlichen wiedererlangt wurden. Eine molekulare Charakterisierung erfolgte unter Verwendung der molekularen Marker MBP, WIMBP, VSP2 und OPR1, für die eine RT-PCR auf RNA der Suppressoren ausgeführt wurde und PDF1.2, für welches ein Northern Blot ausgeführt wurde. Dabei konnte festgestellt werden, daß in den Blüten dreier Suppressoren der streng jasmonsäureabhängige Marker VSP2 angeschaltet ist.
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Blütenentwicklung 2 1.2 Männliche Sterilität 3 1.3 Octadecanoid-Pathway 5 1.4 Männlich sterile Mutanten im Jasmonsäure-Biosyntheseweg 7 1.5 Männlich sterile Mutanten in der Signalkaskade downstream
von Jasmonsäure 11 1.6 Jasmonsäure als Signalmolekül 12 1.7 Crosstalk 16 1.8 Genetische Suppressoren von opr3 werden eingesetzt, um die
Jasmonsäure-Signalkaskade besser zu verstehen 19 2 Materialien und Methoden 20 2.1 Materialien 20 2.1.1 Enzyme, Puffer, Chemikalien, Lösungen 20 2.1.2 Primer 24 2.1.3 Medien 25 2.1.4 Geräte und Kits 25 2.1.5 Bakterienstämme und Vektoren 26 2.2 Methoden 27 2.2.1 Anzucht der Pflanzen 27
2.2.2 Ernten von Blatt- und Blütenmaterial 27 2.2.3 DNA-Extraktion 28 2.2.4 Kanamycintest und Kontroll-PCR 28 2.2.5 Nachweis über das homozygote Vorhandensein der Mutation,
die die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst 29 2.2.6 Blütenentwicklung 29 2.2.7 Pollenkeimung 30 2.2.8 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung der
Pflanzen 30 2.2.9 Kreuzungen 31 2.2.10 RNA-Extraktion 31 2.2.11 RT-PCR zur Herstellung von cDNA aus RNA und Testgel 33 2.2.12 PCR auf cDNA 34 2.2.13 Mini-Präparation von Vektor-DNA 34 2.2.14 Restriktionsverdau des Vektors 35 2.2.15 Reinigung der PDF1.2 cDNA 35 2.2.16 Northern Blot 36 3 Resultate 38 3.1 Screening auf mögliche Suppressoren 40 3.2 Homozygote Suppressor-Mutation 44 3.3 Sind die Suppressoren dominant oder rezessiv? 45 3.4 Sind die Suppressor-Mutationen OPDA-abhängig? 48 3.4.1 Herstellung einer Doppelmutante: aos x opr3 48
3.4.2 Suppressor x aos 50 3.5 Phänotypische Charakterisierung der Suppressoren 51 3.5.1 Unterschiede der verschiedenen Suppressoren in der
Blütenentwicklung 52 3.5.2 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung
der Pflanzen 57 3.5.3 Pollenkeimung 59 3.6 Molekulare Charakterisierung der Suppressoren 63 4 Diskussion 73 5 Literaturverzeichnis 79
1 Einleitung 1 __________________________________________________________________________
Kapitel 1
Einleitung
Im Laufe der Evolution haben Pflanzen immer bessere Methoden entwickelt, um ihre
Reproduktion sicherzustellen und sich vor Fremdeinflüssen zu schützen. Die physiologischen
Abläufe, die bei der Entwicklung zur reifen Pflanze und deren Produktion von Samen eine
Rolle spielen, sind hochkomplex. Derzeit sind wir noch weit davon entfernt, diese Vorgänge
vollständig zu verstehen. Es existieren jedoch bereits viele interessante Erkenntnisse, deren
Weiterentwicklung in Zukunft zu einem tieferen Verständnis führen soll.
Eine Schlüsselrolle spielen die Jasmonate (Jasmonsäure und deren Methylester), die als
Wachstumsregulatoren fungieren und als Signalmolekül die Verteidigung bzw. Wundabwehr
auslösen. Sie sind weit über das Pflanzenreich verbreitet und werden in verschiedenen Arten
von Geweben gefunden. Jasmonate beeinflussen so unterschiedliche Prozesse wie
Pollenentwicklung, Fruchtreifung, Wurzelwachstum, Rankenwindung, UV-Schutz, Wund-
reaktion und Resistenz gegenüber Insekten und Pathogenen. Die Produktion von Jasmonaten
führt dazu, daß verschiedene Gene induziert werden, die für die genannten Prozesse sowie für
die Jasmonsäurebiosynthese benötigt werden (Devoto and Turner 2003). In dieser Studie
werden wir unsere Strategie beschreiben, mit der wir besser verstehen wollen, wie
Jasmonsäure zur Reifung des männlichen Gametophyten beiträgt.
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1.1 Blütenentwicklung
Will man herausfinden, wie die Blütenentwicklung auf genetischer Ebene reguliert wird, so
ist es besonders interessant zu untersuchen, welche spezifischen Störungen in der Blüten-
morphogenese als Effekt von Mutationen auftreten. Man kann davon ausgehen, daß das
Produkt eines exprimierten Gens, sofern in diesem die Mutation auftritt, mit dem jeweiligen
Entwicklungsschritt zusammenhängt, welcher in der Blütenentwicklung defekt ist. Um diese
Defekte in Mutanten zu untersuchen, muß zunächst ein einheitlicher Standard zugrundegelegt
werden, wobei als Bezugsgröße die natürlichen Entwicklungsschritte einer normal
entwickelten Arabidopsis thaliana-Pflanze verwendet werden. Die Blütenmorphologie einer
Arabidopsis thaliana-Blüte entspricht der einer typischen Brassicacee.
Die Organogenese von der Initiation der Blütenknospenzellen im Apikalmeristem zur fertig
entwickelten Knospe erfolgt in 12 Stadien. In Stadium 1 – 5 bilden sich Blütenprimordium,
Sepalenprimordien, Blütenmeristem, Petalen- und Staminaprimordien. Von Stadium 6 – 12
wachsen diese und in Stadium 12 sind die Petalen so lang wie die langen Staminae. Diese
Analyse stützt sich auf elektronenmikroskopische Aufnahmen (Smyth et al. 1990). In Stadium
13 öffnet sich die Knospe, die Petalen werden sichtbar und die Antheren öffnen sich und
setzen den Pollen frei. Darauf folgt die Verlängerung der Antheren über das Stigma hinaus
(Stadium 14). In Stadium 15 verlängert sich wiederum das Gynoeceum, so daß das Stigma
sich oberhalb der langen Antheren befindet (Smyth et al. 1990). Ab Stadium 13 erfolgt die
Bestäubung.
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1.2 Männliche Sterilität
Antherenentwicklung
Die Prozesse bei der Entwicklung der Antheren laufen in zwei Phasen ab. Zunächst läuft ein
Programm zur Gewebespezifizierung ab; dabei wird die Morphology der Anthere etabliert,
indem unterschiedliche Zellen und Gewebstypen ausgebildet werden. Hier findet auch die
Meiose der Microsporenmutterzelle mit anschließenden Mitosen statt, sodaß am Ende der
Phase 1 Microsporentetraden in den Pollensäcken zu finden sind. In Phase 2 läuft ein
Degenerationsprogramm ab, wobei aber zunächst die Pollenkörnerdifferenzierung stattfindet,
die Anthere sich vergrößert und durch Verlängerung des Filaments nach oben geschoben
wird. Daraufhin findet die Degeneration eines Teils des Gewebes statt, einige Zellen sterben
ab und dadurch öffnet sich die Anthere, um die Pollenkörner freizusetzen (Goldberg et al.
1993). Dazu müssen die betroffenen Septumzellen und Stomiumzellen ein im zeitlichen
Verlauf exakt gesteuertes Zelldegenerationsprogramm durchlaufen (Sanders et al. 1999). Die
Septumzellen degenerieren früher als die Stomiumzellen.
Die zellulären und molekularen Prozesse, die der Entwicklung von reifem, funktionsfähigem
Pollen zugrundeliegen, werden derzeit noch nicht vollständig verstanden. Um genauere
Erkenntnisse zu erzielen, ist die Untersuchung von Mutanten sinnvoll, bei denen ein Defekt in
der männlichen Sterilität vorliegt. Es existieren bereits mehrere männlich sterile Arabidopsis
thaliana-Mutanten, mit Mutationen in verschiedenen Stadien der Pollenentwicklung; diese
können als Werkzeug herangezogen werden, um die einzelnen Regulationsmechanismen
detailliert zu analysieren (Sanders et al. 1999). Beispiele hierfür sind die Mutanten ms1
(Wilson et al. 2001), ms2 (Aarts et al. 1997), ms5 (Glover et al. 1998), pop1 (Preuss et al.
1993) und ams1 (Sorensen et al. 2003).
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In der dde1/opr3-Mutante zum Beispiel sind die Prozesse der Pollenfreisetzung gestört, da die
zeitlichen Abläufe nicht normal funktionieren. Der Pollen wird bei dde1/opr3 zu spät frei-
gesetzt. Zu diesem Zeitpunkt sind die Stigmapapillen nicht mehr empfänglich für die Bestäu-
bung (Sanders et al. 1999, Sanders et al. 2000).
Durch den Einsatz von T-DNA- oder EMS-Mutagenisierung können große Mengen Pflanzen
gescreent werden, um männlich sterile Pflanzen zu erhalten. Bei diesen treten vielfältige
Defekte auf, die alle zu männlicher Sterilität führen, so z. B. Defekte bei der Ausbildung einer
normalen Antherenmorphologie, Produktion von Mikrosporen, Pollendifferenzierung, beim
Pollenfreisetzungsmechanismus oder dem Zeitpunkt des Öffnens der Antheren. Es können
Mutanten gefunden werden, bei denen die Antheren sich zu spät oder überhaupt nicht öffnen,
oder bei denen kein Pollen gefunden wird. Mindestens ein Drittel der männlich sterilen
Mutanten haben Defekte im Pollenfreisetzungsprozeß, wobei der Pollen selbst meist voll
funktionsfähig ist und sogar für Kreuzungen verwendet werden kann. Bei einem solchen
großangelegten Screening wurden z. B. die Mutanten non-dehiscence 1 oder delayed-
dehiscence1 (Pollen nicht funktionsfähig) gefunden, außerdem die Mutante pollenless3
(Sanders et al. 1999). Bei genauer Charakterisierung der jeweiligen Mutanten und Identi-
fizierung der mutierten Gene, die den Defekt auslösen, können diese Mutanten viel dazu bei-
tragen, ein genaueres Verständnis der physiologischen Schritte zu erlangen.
Männliche Sterilität durch Defekte, die den Jasmonsäure-Signalweg betreffen
Unter den männlich sterilen Linien sind diejenigen auffällig, deren mutierte Gene in den
Jasmonsäure-Biosyntheseweg involviert sind (Sanders et al. 2000; Stintzi and Browse 2000;
Ishiguro et al. 2001, Von Malek et al. 2002). Alle Mutationen, die den Jasmonsäure-
Biosyntheseweg und den darauffolgenden Signalweg (Xie et al. 1998) in irgendeiner Form
unterbrechen, führen zu männlicher Sterilität. Für die männliche Fertilität in Arabidopsis
thaliana ist das Vorhandensein von Jasmonsäure unabdingbar.
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1.3 Octadecanoid-Pathway
Abb. 1: Biosyntheseweg der Jasmonsäure. In der opr3-Mutante fehlt das Enzym OPR3, so daß keine Jasmonsäure synthetisiert werden kann.
(3R, 7S)-jasmonic acid (JA)
O
COOH
O OPR 3
3 Cycles of β-oxidation
COOH
12 OPDA REDUCTASE
3-oxo-2(2’[Z]-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic
COOH
α-linolenic acid (18:3)
COOHOOH
13-hydroperoxylinolenic acid
COOHO
12,13-epoxyoctadecatrienoic
(9S,13S)-12-oxo-phytodienoic acid (OPDA)
O
COOH
LIPOXYGENASE
ALLENE OXIDE SYNTHASE
ALLENE OXIDE CYCLASE
opr3
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Octadecanoide wie die Jasmonsäure sind in geringen Mengen wirksame bioaktive Kom-
ponenten, die vielfältige Aspekte der pflanzlichen Reaktionen auf ihre biotische und
abiotische Umwelt beeinflussen (Review: Devoto and Turner 2003).
Die Biosynthese der Jasmonsäure (s. Abb. 1) beginnt mit der Oxidation von aus der Chloro-
plastenmembran freigesetzter α- Linolensäure (Review: Schaller F 2001), die in
(9Z,11E,15Z,13S)-13-hydroperoxy-9,11,15-octadecatrienoic acid (13(S)-HPOT) umgewan-
delt wird. Diese Reaktion wird von 13-Lipoxygenase (LOX) katalysiert. 13(S)-HPOT wird
von AOS in ein instabiles Epoxid (12,13(S)-epoxy-9(Z),11,15(Z)-octadecatrienoic acid,
12,13-EOT) umgewandelt, welches von AOC (allene oxide cyclase) zyklisiert wird. Dadurch
entsteht OPDA (12-oxo-10,15(Z)-phytodienoic acid), welche von einer NADPH-abhängigen
OPDA-Reduktase (OPR3) an der 10,11-Doppelbindung reduziert wird, wodurch OPC-8:0 (3-
oxo-2(2´(ZI-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic acid) entsteht. Durch drei β-Oxidationen
entsteht schließlich Jasmonsäure, das Endprodukt des Biosynthesewegs (Schaller F 2000).
AOS katalysiert die Eingangsreaktion in den Octadecanoid-Signalweg. An dieser Stelle tritt
ein Rückkopplungseffekt ein, der beim Vorhandensein von Jasmonsäure ausgelöst wird. Bei
Pflanzen mit konstitutiver AOS-Expression wird das Wachstum eingeschränkt und OPDA
akkumuliert zu wesentlich höheren Konzentrationen als es normalerweise der Fall ist
(Kubigsteltig and Weiler 2003).
AOC mRNA wurde in Tomaten in hohen Konzentrationen in Blütenknospen, Blütenstengeln
und Wurzeln gefunden, was mit erhöhten Mengen an Jasmonsäure, OPDA und Jasmonsäure-
Isoleucin-Konjungat korreliert (Hause et al. 2000). In Arabidopsis thaliana gibt es vier AOC-
Gene, die wohl redundant sein müssen, so daß beim Ausfall eines dieser Gene trotzdem noch
genug AOC produziert wird. Daher konnten bisher noch keine aoc-Mutanten detektiert
werden.
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OPDA ist in Arabidopsis-Blättern zu 90 % in der Chloroplastenmembran lokalisiert, und zwar
in Form von MGD-OPDA (sn1-O-(12-oxophytodienoyl)-sn2-O-(hexadecatrienoyl)-
monogalactosyl diglyceride) und kann aus der Membran durch eine spezifische Lipase
freigesetzt werden. Dies könnte die Ursache dafür sein, daß bei Verwundung extrem schnell
freies OPDA für die Jasmonsäureproduktion zur Verfügung steht (Stelmach et al. 2001). Bis
zur Produktion von OPDA werden alle Schritte von Plastidenenzymen katalysiert. Der einzige
bekannte Ort, an dem β-Oxidation stattfindet, ist aber das Peroxisom, so daß man davon
ausgehen kann, daß OPDA vom Plastid zum Peroxisom transportiert wird (Stintzi and Browse
2000), zumal auch schon bekannt ist, daß OPR3 ebenfalls im Peroxisom lokalisiert ist
(Strassner et al. 2002).
Sowohl in Arabidopsis thaliana als auch in Lycopersicon esculentum wurden verschiedene
OPR-Proteine entdeckt, deren Verwandschaftsgrade bereits aufgeklärt sind. Ein Vergleich der
Wildtyppflanzen und opr3-Pflanzen zeigte, daß es sich bei dem im Peroxisom vorkommenden
OPR-Protein um OPR3 handelt (Strassner et al. 2002). Von den in Arabidopsis thaliana vor-
kommenden Isoformen von OPR ist nur OPR3 in der Lage, dasjenige Stereoisomer von
OPDA zu reduzieren, welches für die Jasmonsäureproduktion benötigt wird (Stintzi and
Browse 2000, Stintzi et al. 2001).
1.4 Männlich sterile Mutanten im Jasmonsäure-
Biosyntheseweg
Wie schon zuvor erwähnt gibt es verschiedene männlich sterile Arabidopsis thaliana-
Mutanten, bei denen keine Jasmonsäure produziert wird.
dad1-Mutante:
Die dad1-Mutante (defective in anther dehiscence) hat Defekte beim Öffnen der Antheren, bei
der Pollenreifung und beim Öffnen der Blüten. Diese können durch die Applikation von
exogener Jasmonsäure aufgehoben werden, was auf eine Unterbrechung des Jasmonsäure-
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biosynthesewegs hinweist. Bemerkenswert ist, daß bei Applikation von Linolensäure derselbe
Effekt auftritt. Von der Mutation ist also ein Gen upstream von Linolensäure betroffen. Es
handelt sich bei DAD1 um das lipolytische Enzym, welches die Freisetzung von
Phospholipiden aus der Chloroplastenzellmembran verursacht (Ishiguro et al. 2001).
fad-Mutante:
Durch die Charakterisierung der fad3-2 fad7-2 fad8 Triple-Mutante wurde zum ersten Mal
nachgewiesen, daß Jasmonate für die männliche Fertilität unabdingbar sind. In dieser Mutante
sind die drei Fettsäuredesaturase-Gene außer Funktion gesetzt, die für die Desaturierung von
18:2 (Linolsäure) zu 18:3 (Linolensäure) verantwortlich sind. Deshalb fehlt in der Mutante die
Linolensäure als Vorläufer von Jasmonsäure, daher ist sie männlich steril. Fertilität kann
durch exogene Jasmonsäureapplikation an gerade noch geschlossenen Blüten wiedererlangt
werden. Pollenuntersuchungen zeigen, daß die Pollenkörner sich nicht vollständig entwickeln.
Bei Applikation entweder von α-Linolensäure oder von Jasmonat entwickelt sich der Pollen
normal. Die Untersuchungen zeigen, daß die Linolensäure ein Vorläufer von Oxylipinen ist,
durch die Reifungsprozesse und Pollenfreisetzung reguliert werden (McConn and Browse
1996).
aos-Mutanten:
Zwei Arbeitsgruppen identifizierten unabhängig voneinander eine aos-Mutante:
Die dde2-2-Mutante ist durch eine frame-shift-Mutation in AOS männlich steril. Durch
genetische Komplementation des mutierten Phänotyps konnte die Notwendigkeit von AOS
für die Fertilität bestätigt werden (Von Malek et al. 2002).
Die zweite aos-Mutante hat einen knock-out-Defekt im Gen CYP74A, welches für AOS
(allene oxide synthase) codiert. Der im Wildtyp beobachtete enorme Anstieg der
Jasmonsäurekonzentration ca. 1 h nach Verwundung tritt in der aos-Mutante nicht auf.
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Außerdem sind die Antheren- und Pollenentwicklung defekt, was zu männlicher Sterilität
führt. Wie schon bei dad 1, fad3-2 fad7-2 fad8 und opr3 (s. nächster Abschnitt) kann auch
hier die Fertilität durch exogene Jasmonsäureapplikation wiedererlangt werden. Interessant ist
auch, daß die Transkription des VSP (vegetative storage protein) und der Lipoxygenasen
durch Verwundung im Gegensatz zum Wildtyp nicht induziert werden können. Zudem wurde
an Pflanzen, die AOS konstitutiv exprimieren, festgestellt, daß bis zur doppelten Menge
wundinduzierte Jasmonsäure im Vergleich zum Wildtyp zu finden ist (Park et al. 2002).
opr3-Mutante:
Bei der Charakterisierung der männlich sterilen opr3-Mutante, bei der die Mutation im Gen
für die OPDA-Reduktase 12-Oxo-Phytodiensäure-10,11-Reduktase 3 (OPR3) liegt, wurde
festgestellt, daß alle aufgetretenen Defekte durch die Transformation von OPR3 cDNA
aufgehoben werden können. Außerdem kann bei opr3-Pflanzen durch Applikation von
exogener Jasmonsäure die Fertilität wiederhergestellt werden, was mit OPDA nicht zu
erreichen ist. OPDA kann Jasmonsäure als chemisches Signal für die Antheren- und
Pollenreifung nicht ersetzen (Stintzi and Browse 2000). Desweiteren wurde nachgewiesen,
daß OPR1 und OPR2 nur in sehr geringem Ausmaß 9S,13S-OPDA reduzieren, wohingegen
OPR3 als einziges der drei Isoforme 9S,13S-OPDA sehr effizient reduziert (Schaller F et al.
2000, Strassner et al. 2002). Dies impliziert, daß OPR3 als relevantes Enzym für die Bildung
von Jasmonsäure verantwortlich ist, so daß Untersuchungen an der opr3-Mutante besonders
vielversprechend sind.
Untersuchungen an verwundeten und unverwundeten Blättern jeweils vom Wildtyp und von
opr3 zeigten, daß bei opr3 nach Verwundung keine erhöhte Jasmonsäureproduktion im
Vergleich zu unverwundeten Blättern stattfand, wohingegen beim Wildtyp 3 h nach
Verwundung eine stark erhöhte Jasmonsäuremenge gefunden werden konnte (Stintzi et al.
2001).
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Besonderheiten der opr3-Mutante (Stintzi and Browse 2000, Stintzi et al. 2001, Sanders et al.
1999):
• Das Gen für 12-Oxo-Phytodiensäure-10,11-Reduktase 3 ist durch zufällige Insertion
eines T-DNA-Inserts von ca. 17 kb außer Funktion gesetzt worden (s. Abb. 2).
Insert: t-DNA
Exon 4 Exon 3 Exon 2 Exon 1 Abb. 2: Molekulare Struktur des OPR3-Locus in der opr3-Mutante. Die Größenverhältnisse sind nicht repräsentativ. Das 17 kb T-DNA-Insert wird als Dreieck dargestellt. Exons sind als Rechtecke dargestellt, Introns als Linien zwischen den Exons. Die dickere Linie in Intron 2 repräsentiert ein Tnat1-ähnliches Transposon von 1,1 kb, welches im Ws-Ökotyp vorkommt, aber nicht im Columbia-Ökotyp.
• Nach Verwundung wird keine Jasmonsäure produziert, aber 50 % der normalen
OPDA-Menge (Stintzi et al. 2001).
• Solange die Blütenknospe noch geschlossen ist, entwickeln sich die Blütenorgane
normal, aber die Antherenfilamente verlängern sich nicht, um die Antheren oberhalb
des Stigmas zu positionieren.
• Zum Zeitpunkt, an dem die Blüte sich öffnet, findet kein gleichzeitiges Öffnen der
Antheren statt.
• Die Pollenkörner sind überwiegend nicht funktionsfähig, die Pollenkeimungsrate liegt
unter 4 %, im Gegensatz zu 97,6 % beim Wildtyp.
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1.5 Männlich sterile Mutanten in der
Signalkaskade downstream von Jasmonsäure
Im Gegensatz zu den Mutanten, die keine Jasmonsäure synthetisieren, zeigen diese Mutanten
keine Reaktion auf Jasmonsäure.
coi1-Mutante:
Das chloroseinduzierende Phytotoxin Coronatin ist ein Analogon zu Methyljasmonat und
verursacht dieselben Effekte, also gehemmtes Wurzelwachstum, erhöhte Anthocyanin-
akkumulation und eine stärkere Expression zweier Proteine von ca. 31 und 29 kD (Feys et al.
1994). Coronatininsensitive Arabidopsis thaliana-Mutanten (coi1) sind nicht nur un-
empfindlich gegenüber Coronatin (die o. g. Effekte sind hier nicht zu finden), sondern zeigen
ebenfalls keine Reaktion auf Jasmonsäure und verwandte Komponenten. Coi1-Mutanten sind
männlich steril, in logischer Konsequenz daraus, daß Jasmonsäure für die Fertilität wichtig ist
(zur Zeit dieser Untersuchungen noch nicht nachgewiesen), coi1 aber auf Jasmonsäure nicht
reagiert (Feys et al. 1994). Im Gegensatz zu opr3 kann die männliche Fertilität nicht durch
Jasmonsäureapplikation wiedererlangt werden. Desweiteren wurde festgestellt, daß die coi1-
Pflanzen abnormen Pollen produzierten. Es wurde vermutet, daß COI1 die Reaktion auf
Methyljasmonat beeinflußt und in der Blütenentwicklung eine Rolle spielt (Feys et al. 1994).
Das von COI1 codierte Protein enthält ein N-terminales F-Box-Motiv und eine LRR-Domäne
(leucine rich repeat) (Xie et al. 1998). F-Box-Proteine bilden zusammen mit Cullin und Skp1
die E3 Ubiquitinligase, die als SCF-Komplex bekannt ist (Turner et al. 2002, Bai et al. 1996).
COI1 hat also mit der Ubiquitinierung und Degradation von Faktoren zu tun, die die Reaktion
auf Jasmonsäure negativ regulieren (Review: Berger 2002). Vermutlich spielt die Degradation
von Proteinen eine große Rolle für die verschiedenen Signalprozesse im Leben von Pflanzen
(Review: Berger 2002). Man kann davon ausgehen, daß die Substanz, die der mit Hilfe von
COI1 gebildeten E3 Ubiquitinligase als Substrat dient, eine Schlüsselrolle bei der Jasmon-
säureregulation spielt (Turner et al. 2002).
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jar1-Mutante:
Die jar1-Mutante ist ebenfalls gegen Coronatin und Methyljasmonat resistent. Im Gegensatz
zu coi1 ist jar1 aber fertil. Es wird vermutet, daß es sich bei JAR1 nicht um eine Signaltrans-
duktionskomponente handelt, sondern wahrscheinlich um ein Enzym, welches Jasmonsäure
biochemisch modifiziert (Tiryaki and Staswick 2002, Staswick et al. 2002).
1.6 Jasmonsäure als Signalmolekül
Jasmonsäure induziert als Signalmolekül die Expression verschiedener Gene, die im
folgenden noch genauer erläutert werden. Dabei hat eine Proteinphosphatase aktivierende
Funktion, die Repression erfolgt durch eine Proteinkinase (Jensen et al. 2002, Rojo et al.
1998).
Obwohl opr3-Pflanzen keine Jasmonsäure bilden, konnte eine starke Resistenz gegenüber der
Diptere Bradysia impatiens und dem Pilz Alternaria brassicicola nachgewiesen werden. Die
Induktion der Wundreaktionsgene, von denen man bereits annahm, sie seien jasmonsäure-
abhängig, zeigte sich auch bei opr3, was zu der Vermutung veranlaßt, daß Cyclopentenone
zum Teil die Rolle von Jasmonsäure übernehmen können. Durch die Behandlung von opr3-
Pflanzen mit OPDA konnte eine starke Expression verschiedener Gene gezeigt werden
(Stintzi et al. 2001).
Es wird vermutet, daß durch die Perzeption von Jasmonsäure verschiedene Signalwege
ausgelöst werden können. Einer ist für die jasmonsäureabhängige Staminae- und
Pollenentwicklung verantwortlich, ein anderer ist für die jasmonsäureabhängige Streß- und
Verteidigungsreaktion zuständig und könnte außerdem auch durch OPDA induziert werden
(Stintzi et al. 2001, Turner et al. 2002). Für beide wurde hier gezeigt, daß sie COI1-abhängig
sind.
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Downstream von Jasmonsäure dürften die beiden Signalweg mit Hilfe von COI1 in Gang
gesetzt werden, bei einem dritten Weg könnte möglicherweise ein elektrophiler Effekt der
Cyclopentenone eine Rolle spielen. Einen Hinweis dafür, daß OPDA und/oder dnOPDA eine
genregulatorische Aufgabe hat, liefert die Beobachtung, daß OPDA unabhängig von COI1 die
Gene GST1, RNS1 and OPR1 aktivieren kann. Das hierfür benötigte Signalmolekül ist noch
nicht bekannt. Diese Gene können sowohl im Wildtyp als auch in opr3 durch Verwundung
induziert werden und sind nicht jasmonsäureabhängig (Stintzi et al. 2001).
Für die Feinabstimmung der Expression der Verteidigungsgene dürften Cyclopentenone und
Jasmonate gemeinsam und durch verschiedene, bisher noch nicht genau verstandene Wechsel-
wirkungen zusammenspielen.
Wenn auch der Octadecanoid-Biosyntheseweg bis zur Produktion von Jasmonsäure
inzwischen gut verstanden wird, so ist dennoch downstream von Jasmonsäure noch nicht
bekannt, wie die Signalübermittlung weiterläuft. Es wurden einige Proteine gefunden, die
unter verschiedenen Bedingungen von Jasmonsäure induziert werden, und die jetzt als
Markergene verwendet werden, um den Versuch zu unternehmen, die Jasmonsäure-
Signalkaskade zu verstehen. Am eindeutigsten identifiziert wurden MBP, AtVSP, Thi2.1 und
PDF1.2.
Bevor diese Proteine exprimiert werden, ist MPK4 zwischengeschaltet, eine Proteinkinase,
die 2 bis 5 min nach Verwundung induziert wird (Petersen et al. 2002). Mpk4-Mutanten
zeigen auch nach Jasmonsäurebehandlung keine Expression von PDF1.2 und Thi2.1. MPK4
trägt also zur Regulierung der Expression von den durch Jasmonsäure induzierbaren Genen
bei (Petersen et al. 2000).
Über die cex1-Mutante wurde nachgewiesen, daß AtVSP (vegetative storage protein), Thi2.1
(plant defense-related thionin) und PDF1.2 (defensin) bei konstitutiver Jasmonsäure-
expression akkumulieren, da sie ebenfalls konstitutiv exprimiert werden. Das Genexpressions-
muster der cex1-Mutante entspricht dem eines mit exogener Jasmonsäure behandelten
Wildtyps. Somit könnte CEX1 ein negativer Regulator des auf Jasmonsäure folgenden Signal-
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wegs sein (Xu et al. 2001). Einen weiteren Hinweis darauf, daß die Expression der o. g.
Proteine durch Jasmonsäure induziert wird, erhält man durch die Beobachtung, daß in der
jasmonsäureinsensitiven coi1-Mutante keines dieser Proteine exprimiert werden kann (Xu et
al. 2001, Xie et al. 1998).
In Arabidopsis thaliana wurden zwei verschiedene cDNAs für VSPs identifiziert. VSP1 und
VSP2 werden sowohl für die Differenzierung von Geweben als auch bei Verwundung
benötigt (Utsugi et al. 1998). Bei der Untersuchung einer cDNA-Bibliothek von mRNAs, die
hauptsächlich in Blütenorganen exprimiert werden, wurden Klone gefunden, die für VSPs
codieren. Diese VSP mRNAs wurden auch in sehr geringen Mengen in Blättern gefunden und
traten bei Verwundung in wesentlich höheren Konzentrationen auf (Utsugi et al. 1996).
Die Expression von MBP-Transkripten erfolgt in verschiedenen Geweben und zeigt v. a. eine
Reaktion auf Verwundung und auf Methyljasmonat (Taipalensuu et al. 1997). Transkripte des
MBP1- und MBP2-Gens werden ausschließlich und in reichlichen Mengen in Blüten
exprimiert, wurden aber nicht bei coi1 gefunden. In unreifen Blüten sind MBP mRNAs in
hohen Konzentrationen vorhanden, und zwar vor allem in den reproduktiven Organen, also im
Gynoeceum und in den Staminae (sowohl in Antheren als auch im Filament). MBP hängt mit
dem Glucosinolat-System zusammen, bei dem Glucosinolate von Myrosinaseenzymen
(Thioglucosidasen) hydrolisiert werden, um Substanzen mit einem weitreichenden Spektrum
biologischer Aktivitäten herzustellen, die für die Pathogenabwehr wichtig sind (Capella et al.
2001).
PDF1.2 wird gemeinhin als Marker verwendet, um die jasmonatabhängigen Verteidigungs-
mechanismen zu charakterisieren. Beim PDF1.2-Promoter hat eine GCC-Box die Schlüssel-
rolle, um die PDF1.2-Reaktion auf Jasmonate auszulösen. In diesem Zusammenhang wurde
der Transkriptionsfaktor AtERF2 (ethylene response factor) identifiziert, der die Trans-
kription von PDF1.2, Thi2.1 und PR4 (basic chitinase) aktiviert.
1 Einleitung 15 __________________________________________________________________________
Diese sind alle im Besitz einer GCC-Box im Promoter. Die ERFs scheinen also nicht nur für
den Ethylen-Signalweg wichtig zu sein, sondern durch die Interaktion mit der GCC-Box auch
für die Regulierung der Gene, die downstream von Jasmonsäure ihren Wirkungsbereich haben
(Brown et al. 2003). Wie die verschiedenen Signalkaskaden, die bei den physiologischen
Abläufen in Pflanzen in Aktion treten, untereinander wechselwirken, ist noch weitgehend
ungeklärt.
Thionine sind basische, cystein-reiche Peptide mit toxischen und antibakteriellen Eigen-
schaften. Thi2.1 kann in Arabidopsis thaliana-Samen durch Methyljasmonat, Verwundung,
Silbernitrat, Coronatin und Sorbitol induziert werden, was zu einer lokalen und systemischen
Expression führt. Für alle diese Fälle konnte nachgewiesen werden, daß die Thi2.1-Induktion
über den Octadecanoid-Signalweg erfolgte. An coi1-Mutanten konnte keine Expression
festgestellt werden (Bohlmann et al. 1998).
Bei der Charakterisierung von 10 cet-Mutanten (constitutive expression of Thi2.1) mit
Mutationen in 5 verschiedenen Loci wurde gezeigt, daß bei einigen eine bis zu 40fache
Überproduktion von OPDA und Jasmonsäure vorlag, andere hatten diesselben Werte wie
Wildtyp-Pflanzen. Zwei Mutanten zeigten eine starke Induktion sowohl des Jasmonsäure-
Signalwegs als auch des Salicylsäuresignalwegs. Es konnte nachgewiesen werden, daß Thi2.1
und Pdf1.2 unabhängig voneinander aktiviert wurden, was eher überrascht, da beide durch
Jasmonsäure induziert werden. Desweiteren konnten spontan auftretende Nekrosen (Zelltod)
beobachtet werden, die oft mit einer Aktivierung des SAR-Signalwegs (systemic acquired
resistance) in Verbindung stehen (Hilpert et al. 2001). Wie die involvierten Signalwege
miteinander interagieren, müssen zukünftige Untersuchungen genauer klären. Die
unabhängige Aktivierung von Thi2.1 und Pdf1.2 läßt vermuten, daß sich der Signalweg
downstream von Jasmonsäure aufgabelt und verschiedene Komponenten von Jasmonsäure
induziert werden.
1 Einleitung 16 __________________________________________________________________________
Über DDRT-PCR (differential display reverse transcription-polymerase chain reaction) wurde
nachgewiesen, daß in jasmonsäurebehandelten opr3-Antheren mindestens vier Gene induziert
werden: Lipoxygenase, desweiteren ein bHLH Transkriptionsfaktor, ein Epithiospecifier-
Protein sowie ein unbekanntes Protein. Vermutlich spielen diese Proteine im Jasmonsäure-
Signalweg und bei einigen Entwicklungsschritten ebenfalls eine Rolle. Vier weitere Proteine,
die erst etwas später induziert werden, ein extensin-ähnliches Protein, ein Peptid-
Transportmolekül und zwei unbekannte Proteine, könnten ebenfalls für die Reifung von
Antheren und Pollen wichtig sein (Mandaokar et al. 2003).
1.7 Crosstalk
Im vorherigen Kapitel wurde bereits angedeutet, daß die verschiedenen Signalkaskaden
miteinander interagieren, und daß die Art und Weise wie dies geschieht, bisher noch in
keinster Weise durchschaubar ist. Wenn schon die hochkomplizierten Abläufe der einzelnen
Signalkaskaden nur mit größtem Aufwand herausgefunden werden können, so wird es durch
deren Interaktion nicht gerade überschaubarer. Beim Versuch, sich an einen diesbezüglichen
Erkenntnisgewinn zumindest anzunähern, konnten aber doch einige interessante Infor-
mationen gewonnen werden.
Bei der Regulierung von Verteidigungsmechanismen und Wundantwort interagieren
Jasmonsäure und Ethylen, die in Arabidopsis thaliana beide bei Verwundung oder Pathogen-
befall gebildet werden. Sowohl Mutanten, die im Octadecanoid-Signalweg gestört sind, als
auch solche, die im Ethylen-Signalweg gestört sind, zeigen gegenüber Pathogenbefall eine
stark erhöhte Anfälligkeit. Offensichtlich sind beide Signalkaskaden für die Resistenz not-
wendig. Der synergistische Effekt könnte durch die Interaktion vieler verschiedener Gene, die
für Abwehrproteine codieren, zustande kommen, z. B. PR5, PDF1.2, und CHI-B (Ellis und
Turner 2001). Wie dies aber genau geschieht, ist momentan noch nicht nachvollziehbar. Im
Falle von VSP wurde gezeigt, daß in ethyleninsensitiven Mutanten die Expression höher ist,
1 Einleitung 17 __________________________________________________________________________
der Ethylensignalweg also die Induktion von VSP unterdrückt. Hier zeigt sich, daß der sonst
synergistische Effekt im Gegenteil auch antagonistische Auswirkungen haben kann (Ellis und
Turner 2001).
Die cev1-Mutante (constitutive expression of VSP1) hat eine erhöhte Jasmonat- und
Ethylenproduktion, eine konstitutive Expression von Streßreaktionsgenen und ist resistent
gegenüber Pilzbefall. CEV1 wird hauptsächlich in Wurzelgewebe exprimiert und die Wurzeln
von cev1 enthalten halb so viel Cellulose wie Wildtyp-Wurzeln. Es wurde nachgewiesen, daß
es sich bei CEV1 um die Cellulose-Synthase CeSA3 handelt. Eine weitere Mutante, rsw1, die
ebenfalls eine Mutation in der Cellulose-Synthase ausweist, hatte eine konstitutive Expression
in VSP (Ellis et al. 2002). Wie die Cellulose-Synthase den Jasmonsäure- und Ethylen-
Signalweg beeinflussen kann, ist noch nicht klar, aber offensichtlich besteht ein
Zusammenhang.
Ein Zusammenhang zwischen dem Jasmonsäure- und dem Ethylen-Signalweg zeigt sich auch
bei der Aktivierung von ERF1 (ETHYLENE RESPONSE FACTOR), der dazu beiträgt, das
Fortschreiten von Krankheiten zu verhindern. Eine schnelle Expression von ERF1 kann
sowohl von Ethylen als auch von Jasmonat einzeln oder synergistisch ausgelöst werden. Eine
Mutation in nur einem der beiden Signalwege verhindert bereits die Induktion von ERF1.
ERF1 reguliert vermutlich die Expression vieler Gene, die auf Ethylen oder Jasmonsäure
reagieren und agiert als Schlüsselelement downstream vom Knotenpunkt zwischen den beiden
Signalwegen (Lorenzo et al. 2003).
Ethylen beeinflußt auch die Antherenentwicklung, insbesondere die Pollenfreisetzung. Bei
ethyleninsensitiven Mutanten wurde nachgewiesen, daß bei diesen zwar eine normale
Entwicklung der Ovarien abläuft, jedoch das Öffnen der Antheren erst mit beträchtlicher
Verspätung stattfindet, so daß der freigesetzte Pollen nicht mehr zur Befruchtung führen kann.
Bei diesen Mutanten kann Ethylenbehandlung zu einer wiederum beschleunigten
Pollenfreisetzung führen. Man kann davon ausgehen, daß Ethylen einen Prozess in Gang
setzt, der in den Antheren direkt vor der Pollenfreisetzung stattfindet (Rieu et al. 2003).
1 Einleitung 18 __________________________________________________________________________
Außerdem wurde an Petunia inflata nachgewiesen, daß die Bestäubung eine Ethylen-
produktion im Stempel verursacht, was bei der Entwicklung des Pollenschlauchs eine Rolle
spielt (Holden et al. 2003).
Ein weiteres Beispiel für crosstalk ist bei der oben bereits erwähnten cet-Mutante zu finden.
Diese wurde für Kreuzungen verwendet, um verschiedene Doppelmutanten mit anderen
Mutanten (z. B. triple fad und coi1) anzufertigen. Bei deren Charakterisierung zeigte sich, daß
die CET-Gene in einer Signalkaskade an einer Stelle agieren, an der sich eine Abzweigung
sowohl zum Jasmonsäuresignalweg als auch zum salicylsäureabhängigen SAR-Signalweg
befindet (Nibbe et al. 2002).
Unsere Herangehensweise, mit der wir versuchen wollen, die Jasmonsäure-Signalkaskade zu
verstehen, unterscheidet sich von den Methoden, die bisher angewandt wurden, um die cet1-
und cev1-Mutanten zu erhalten. In diesen Arbeiten wurde ein jasmonatabhängiger Promoter
(Thionin oder VSP) verwendet, um die Expression eines Reportergens in Gang zu setzen.
Dann, nach Mutagenisierung dieser transgenen Linien, wurde versucht, Pflanzen zu identi-
fizieren, in denen die Expression des Reportergens verändert ist. Wir halten es für
vielversprechender, durch Suppressormutationen in jasmonsäuredefizienten Pflanzen den
Wildtyp-Phänotyp wiederherzustellen, anstatt einer geänderten Genexpression zu folgen.
1 Einleitung 19 __________________________________________________________________________
1.8 Genetische Suppressoren von opr3 werden
eingesetzt, um die Jasmonsäure-Signalkaskade
besser zu verstehen
Da in der opr3-Mutante keine Jasmonsäure gebildet wird, ist die Signalkaskade, die für eine
korrekte Staminae- und Pollenentwicklung verantwortlich ist, downstream von Jasmonsäure
abgeschaltet. Durch die Herstellung von Suppressoren, die durch eine zweite Mutation wieder
fertil sind, muß trotz Abwesenheit von Jasmonsäure die Signalkaskade wieder angeschaltet
sein. In der vorliegenden Arbeit wurden genetische Suppressoren des opr3-Phänotyps
charakterisiert. Diese Charakterisierung erfolgte auf 2 Plattformen; zunächst wurde eine
phänotypische Charakterisierung vorgenommen, desweiteren erfolgte eine molekulare
Charakterisierung.
2 Material und Methoden 20 __________________________________________________________________________
Kapitel 2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien 2.1.1 Enzyme, Puffer, Chemikalien, Lösungen DNA-Extraktion aus Pflanzenmaterial DEX-Puffer 0,14 M Sorbitol
0,22 M Tris-HCl, pH 8,0 (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) 0,222 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) 0,8 M NaCl 0,8 % CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) 1 % Sarcosine auf 100 ml aufgefüllt Direkt vor der Extraktion wurden 20 µl β-Mercaptoethanol pro ml DEX hinzugegeben.
Gelelektrophorese 50 x TAE-Puffer 242 g Tris HCl (TAE = Triacetat-EDTA) 57,1 ml CH3COOH 100 ml 0,5 M EDTA pH 8 mit H2O auf 1 l aufgefüllt EtBr wird nach Verdünnen der konzentrierten Lösung zugegeben 14 µg/l 0,8 % Agarose Gel (200 ml) 1,6 g Agarose 200 ml TAE-Puffer (1x)
2 Material und Methoden 21 __________________________________________________________________________ 1,0 % Agarose Gel (200 ml) 2 g Agarose 200 ml TAE-Puffer (1x) 1,2 % Agarose Gel (200 ml) 2,4 g Agarose 200 ml TAE-Puffer (1x) RNA-Extraktion für Mengen ab 1 g Extraktionspuffer (200 ml): 0,2 M Na-tetra-Borat (Borax), pH 9
30 mM EGTA (EGTA = Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid) 1 % SDS (SDS = Natriumlaurylsulfat) auf 200 ml aufgefüllt und autoklaviert 5 mM DTT (Dithiothreitol)
DTT wurde in 10 ml DEPC-behandeltem Wasser (Diethylpyrocarbonat) gelöst filtersterilisiert, davon wurde 1 ml pro 100 ml Puffer zugegeben. Die Aliquots wurden bei – 20 °C aufbewahrt. EDTA (stock solution), 500 mM 18,612 g auf 100 ml aufgefüllt pH 8 (EDTA geht nur bei pH 8 in Lösung) davon 4 ml in 200 ml Puffer für RNA-Fällung
(= 10 mM) Puffer für RNA-Fällung (200 ml) 4 M LiCl
10 mM EDTA (4 ml aus 500 mM stock solution)
Waschpuffer 2 M LiCl
5 mM EDTA (aus Puffer für RNA-Fällung 1 : 1 mit DEPC- H2O verdünnt)
RNA-Extraktion mit Trizol (nach dem Protokoll des Herstellers) Trizol Invitrogen RT-PCR DNaseI (RNAse-frei) Stratagene, 10 U/µl Oligo (dT) 500 µg/ml dNTPs Fermentas, 10 mM
2 Material und Methoden 22 __________________________________________________________________________ Taq-PCR-Puffer (5 x) 15 mM Mg2+
100 mM (NH4)2SO4 0,08 % Triton 20 % DMSO 250 mM KCl 50 mM Tris/HCl pH 8,3 0,1 M DTT Reverse Transkriptase: Fermentas, 200 U/µl Revert AidTM M-MuLV Elution des Vektorfragments QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN Mini-Präparation von Vektor-DNA Lösung I (50 ml) 25 mM Tris/HCl, pH 7,5 50 mM Glucose 10 mM EDTA Lösung II (25 ml) 0,2 N NaOH 1 % SDS Lösung III (100 ml) 3 M Kaliumacetat: 60 ml 5 M Kac 11,5 ml Eisessig 28,5 ml H2O Lösung IV (50 ml) 3 M Natriumacetat pH 5,2 (mit Eisessig eingestellt) TE-Puffer (100 ml) 10 mM Tris/HCL ph 8,0 1 mM EDTA RNase, pankreatisch (1 ml) Roth
10 mg/ml in TE 10 min bei 85 °C inkubiert (zum Inaktivieren von DNasen) Proteinase K (1 ml) Roth
10 mg/ml H2O
2 Material und Methoden 23 __________________________________________________________________________ Restriktionsverdau SalI (10 U/µl) Fermentas NotI (10 U/µl) Fermentas Puffer 0+ Fermentas Northern Blot Gelpuffer 10x MOPS (500ml) 0,4 M MOPS (4-Morpholinpropansulfonsäure) 100 mM NaOAc 10 mM EDTA mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt autoklaviert Ladepuffer (1 ml) 50 % Glycerol 1 mM EDTA 0,03 % Bromphenolblau autoklaviert 20x SSC 175,3 g NaCl (Salt-Sodium-Citrat) 88,2 g NaCitrat 800 ml ddH2O mit 10M NaOH auf pH 7,0 eingestellt mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt Formaldehydgel 1,56 g Agarose (1,2 %) 93,6 ml ddH2O erhitzt 13 ml 10x Gelpuffer 23,4 ml Formaldehyd RNA-Proben 5,5 µl RNA + H2Ofst 1 µl 10x Gelpuffer 3,5 µl Formaldehyd 10 µl Formamid für 15 min auf 65 °C erhitzt, auf Eis abgeschreckt, zentrifugiert 2 µl Ladepuffer 0,2 µl EtBr 50 x Denhardt’s 5 g Ficoll 5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Rinderserumalbumin (BSA) mit ddH20 auf 500 ml
2 Material und Methoden 24 __________________________________________________________________________ Hybridisierungslösung 50% Formamid 5x SSC 50 mM KPP pH 7.0 2x Denhardt’s sss DNA 100 µg/ml 0,5 % SDS Lösung 1 1x SSC 0,5 % SDS Lösung 2 0, 2 SSC 0,5 % SDS Verschiedenes Primer-Oligonucleotide QIAGEN Phenol/Chloroform Mischungsverhältnis 1 : 1 6x DNA-Probenpuffer 0,25 % w/v Bromphenolblau 0,25 % w/v Xylencyanol FF 30 % Glycerin in Wasser Oberflächensterilisation 70 % EtOH, 10 min von Arabidopsis thaliana-Samen abgesaugt
50 % Natriumhypochlorid ca. 2 Tropfen Tween 20 zugegeben, 15 min
5 x in H2Ost. gewaschen in 500 µl sterilen 0,1 % Agar 2.1.2 Primer OPR3-2int403R cgacaaaagccgtttattaaacagtacag 12OPDAR.ATG (55) atgacggcggcacaagggaactc KFLB135 (LB) atgcatagatgcaccgaaatcagcca EF1α;1202R ggctccttctcaatctccttaccagaac EF1α;817 ccagtgggacgtgttgagactggtatga -36VSP2 atcacaaactaaacaataaaccataccat 824VSP2R ggacaatgcgatgaagatagattcttaag -26MBP2 tcagggtattttctgaagttaaagataga MBP2-2359R accatggtccatggacgttatttaacgga -26WIMBP cagatagataaaagaagtcaacaacgatg WIMBP3039R aaagtgtgtaaactatcatcaaaagatac -25OPR1 tcatcaacagttttttacaaaagaaatg TAA OPR1 R aacacactacattacattattgataaca
2 Material und Methoden 25 __________________________________________________________________________ 2.1.3 Medien MS-Medium 4,4 g MS-Fertigmedium, Duchefa (Murashige und Skoog) mit ddH2O auf 1 l aufgefüllt pH 5,8 30 g Saccharose 8 g Agar autoklaviert MSKan Agar MS-Medium (für Petrischalen) 750 µl einer Kanamycin-Stammlösung
(100 mg/ml) zugegeben Pollenkeimungsmedium 17 % Saccharose 1,65 mM Borsäure 2 mM CaCl2 0,6 % Agar (Duchefa) pH 7 (KOH) LBAmp Agar 20 g LB Broth (Duchefa)
12 g Agar (Duchefa) ddH2O ad 1 Liter autoklaviert (20 min) bei Gießtemperatur Zugabe von 1 ml Ampicillin (Duchefa) – Stocklösung
(100 mg/ml, sterilfiltriert) steril in Petrischalen abgefüllt LBAmp Medium 20 g LB Broth (flüssig) ddH2O ad 1 Liter autoklaviert (20 min) Zugabe von 1 ml Ampicillin-Stocklösung 2.1.4 Geräte und Kits Zentrifuge Sorvall® RC 5B Plus Rotoren Sorvall® Type SS-34
Sorvall® Type HS-4 Elektrophoresegerät EasyCast Electrophoresis Systems (für Agarosegele) Owl Scientific, Inc.
2 Material und Methoden 26 __________________________________________________________________________ UV-Vis Photometer CaryVarian Transfer-Membran Nitrozellulose Membran, Schleicher & Schuell Vakuumrotator Savant QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 2.1.5 Bakterienstämme und Vektoren E. coli 37F10 Glycerin-Stock bluescript (pSport) Insert: AT5G44420 (= PDF1.2)
2 Material und Methoden 27 __________________________________________________________________________
2.2 Methoden 2.2.1 Anzucht der Pflanzen
Samen der jeweiligen Linien wurden in einem Eppendorf-Gefäß in 0,1%igem Agar suspen-
diert und 24 – 72 h bei 4 °C vernalisiert. Anschließend wurden sie auf gedämpfter Erde
ausgebracht und im Gewächshaus unter einer Plastikabdeckung belassen, bis die Keimlinge 4
Blätter hatten. Dann wurde die Abdeckung entfernt.
Vom wt ws, von der opr3- Mutante, der aos-Mutante und den Suppressoren 10, 17.1, 18,
21.2, 22 und 24 wurden über ca. 6 Monate hinweg alle 14 Tage 24 Pflanzen angezogen.
Als Wachstumsbedingungen wurden 22°C und ein Rhythmus von 16 h Tag/8 h Nacht
angestrebt. Im Gewächshaus traten jedoch jahreszeitlich- und wetterbedingte Schwankungen
auf.
2.2.2 Ernten von Blatt-und Blütenmaterial
Das verwendete Blatt- und Blütenmaterial wurde sofort nach Entfernen von der Pflanze mit
Flüssigstickstoff schockgefroren und danach entweder sofort verwendet oder bis zur
Verwendung im – 80 °C-Gefrierschrank aufbewahrt. Besonders bei dem für RNA-Extrak-
tionen verwendeten Material wurde darauf geachtet, daß keine zeitliche Verzögerungen bis
zum Einfrieren eintraten, um Verfälschungen des Ergebnisses zu vermeiden, da mRNA nach
Verwundung sehr schnell gebildet wird.
2 Material und Methoden 28 __________________________________________________________________________
2.2.3 DNA-Extraktion
Ca. 10 mg Blattmaterial wurden in ein Eppendorfgefäß gegeben. Es wurde entweder
Frischmaterial oder bei – 80 °C eingefrorenes Material verwendet. Die Eppendorfgefäße
wurden in Flüssigstickstoff gestellt und das gefrorene Material zunächst mit einem
Plastikpistill feingerieben.
Dann wurden 100 µl DEX-Puffer zugegeben und das Gewebe mit dem Plastikpistill (der
vorher in Flüssigstickstoff gekühlt worden war) zerrieben. Anschließend wurden 100 µl
Chloroform zugegeben, 10 s durchmischt und bei 65 °C für 30 min inkubiert. Die Proben
wurden 5 min zentrifugiert und die obere, wässrige Phase in ein neues Eppendorfgefäß
überführt. Mit einem gleichgroßen Volumen Isopropanol (100 µl) wurde bei Raumtemperatur
präzipitiert. Danach wurden die Proben nochmals zentrifugiert (bei 14000 g für 5 min). Der
Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde einmal in 70%igem EtOH (300 µl) gewaschen
und der Überstand abgekippt. Eventuell noch vorhandenes restliches Ethanol wurde
abpipettiert. Dann wurde das Pellet getrocknet und anschließend in 30 µl filtersterilisiertem
Wasser resuspendiert.
2.2.4 Kanamycintest und Kontroll-PCR
Die opr3-Mutante weist in OPR3 ein Insert auf, welches eine Kanamycinresistenz trägt. Um
nachzuweisen, daß die Suppressoren nach wie vor homozygot das Insert in OPR3 tragen,
wurden alle verwendeten Suppressoren-Linien auf ihre Kanamycinresistenz getestet. Dazu
wurden jeweils mindestens 100 Samen oberflächensterilisiert und auf MSKan-Platten
ausgebracht. Nur wenn keine sensitiven Pflanzen zu finden waren, konnte die Linie
weiterverwendet werden.
2 Material und Methoden 29 __________________________________________________________________________
Um sicherzugehen, daß es sich bei vereinzelt auftretenden sensitiven Pflanzen nicht um
Kontaminationen handelt (falscher Samen oder von anderweitigen transgenen Pflanzen
eingeflogenes Pollenkorn), wurde parallel dazu eine PCR ausgeführt, bei der folgende
Primerpaare verwendet wurden:
LB und opr3 int
opr3 int und 55
Bei einem echten Suppressor erscheint in der ersten Spur eine Bande von 1,235 kb, in der
zweiten Spur ist keine Bande zu erkennen, weil das Fragment mit dem T-DNA-Insert mehr
als 17 kb hätte, was natürlich nicht amplifiziert werden kann. Wenn hier nur eine Bande
auftrat, war die Mutation in opr3 homozygot und mit diesen Linien konnte weitergearbeitet
werden.
2.2.5 Nachweis über das homozygote Vorhandensein der
Mutation, die die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst
Wenn die Mutation, die die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst, heterozygot wäre, würde
eine Segregation von 3 : 1 (fertile : sterile Pflanzen) stattfinden, d. h. von 24 Pflanzen wären
ca. 6 Pflanzen steril. Über ca. 6 Monate wurden von den sechs untersuchten Suppressoren alle
14 Tage je 24 Pflanzen angepflanzt. Nur wenn alle Pflanzen fertil waren, konnte die Linie
weiterverwendet werden.
2.2.6 Blütenentwicklung
Um festzustellen, wann bei den Suppressoren die Pollenfreisetzung stattfindet, wurden jeweils
die ersten 3 – 4 geöffneten Blüten des Haupttriebes von einer Pflanze jeder Suppressorlinie
untersucht. Dazu wurden Sepalen und Petalen wegpräpariert. Die Blüten wurden unter dem
Mikroskop so fotografiert, daß erkennbar war, bei welcher Blüte der Pollen bereits frei-
gesetzt war. Zum Vergleich wurden auch je eine Pflanze vom Wildtyp ws und von opr3
untersucht.
2 Material und Methoden 30 __________________________________________________________________________
2.2.7 Pollenkeimung
Um den Prozentsatz der keimfähigen Pollen für die verschiedenen Suppressoren festzustellen,
wurde Pollen auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht. Dazu wurden von jeder Linie jeweils
die ersten drei geöffneten Blüten, die bereits Pollen freigesetzt hatten, verwendet. Pro Linie
wurden vier Pflanzen ausgewertet, so daß pro Linie die Daten von 12 Blüten zur Verfügung
stehen. Als Vergleich wurden wt ws-Pflanzen und opr3-Pflanzen mit ausgewertet. Vom
Wildtyp wurden nur 2 Pflanzen ausgewertet, also 6 Blüten.
Um den Pollen auftragen zu können, wurden die Sepalen, Petalen und das Gynoeceum
wegpräpariert. Die Staubblätter wurden dann unter einem Binocular vorsichtig auf das
Medium aufgetupft, so daß der Pollen freigesetzt wurde (ca. 200 Pollenkörner pro Blüte). Die
Staubblätter wurden anschließend wie ein Pinsel verwendet, um die Pollenkörner auf eine
Fläche mit ca. 1 cm Durchmesser zu verteilen. Die Platten wurden geschlossen und 24 h bei
Tageslicht stehengelassen.
Am nächsten Tag wurden für jede Blüte die Gesamtzahl der Pollen sowie die Zahl der
gekeimten Pollen ausgezählt. Für jeweils alle Blüten aus einer Linie wurden diese Werte
aufaddiert und die Prozentsätze berechnet. Für jede Linie wurde ein repräsentatives Foto
gemacht.
2.2.8 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung der
Pflanzen
Vom Wildtyp ws, der opr3-Mutante und den Suppressoren 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24
wurden jeweils 10 durchschnittliche Pflanzen ausgewählt, um die folgenden Parameter zu
untersuchen:
• Länge des Haupttriebs, Ø nach 50 Tagen
• Blühbeginn nach wie vielen Tagen
• Erste Schote öffnet sich nach wie vielen Tagen
Die Pflanzen wurden täglich untersucht. Die Länge des Haupttriebs wurde nach 50 Tagen
exakt ausgemessen.
2 Material und Methoden 31 __________________________________________________________________________
2.2.9 Kreuzungen
Beim maternalen Kreuzungspartner wurden von den drei am weitesten entwickelten noch
geschlossenen Blüten Sepalen, Petalen und Staminae entfernt. Beim paternalen Kreuzungs-
partner wurden von den drei jüngsten schon geöffneten Blüten Sepalen, Petalen und
Gynoeceum entfernt. Diese Blüten befanden sich mindestens in Stadium 12, so daß die
Antheren bereits geöffnet waren und Pollen freigesetzt hatten. Um diesen Pollen für die
Kreuzung zu nutzen, wurden die Antheren der an der paternalen Blüte verbliebenen Staminae
auf das an der maternalen Blüte verbliebene Gynoeceum aufgetupft. Anschließend erhielt das
bestäubte Gynoeceum eine Plastikhülle, um das Einfliegen weiterer Pollenkörner von anderen
Pflanzen zu verhindern und um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten.
2.2.10 RNA-Extraktion
Die RNA-Extraktionen wurden je nach Menge des jeweils vorhandenen Materials nach zwei
verschiedenen Methoden ausgeführt. Für größere Mengen ist die Extraktion mit der längeren
Methode geeignet. Für kleine Mengen (z. B. bei Extraktion aus Blütenmaterial, von dem nicht
viel vorhanden ist) ist diese Methode nicht geeignet, deshalb wurde mit der Trizol-Methode
extrahiert, die aber meist nicht so sauber ist wie die andere Methode. Für beide Methoden
wurde nur autoklaviertes Laborzubehör verwendet, um Kontakt des Materials mit RNase zu
verhindern.
Nach der Extraktion wurde die Ausbeute durch OD260-Messung bestimmt (1 OD260 = 40
µg/ml RNA).
2 Material und Methoden 32 __________________________________________________________________________
RNA-Extraktion für Mengen ab 1 g
Das Blattmaterial wurde in flüssigem Stickstoff fein zermörsert. Dann wurden 2,5 ml
Extraktionspuffer (50 °C) je Gramm Frischgewicht zugegeben und weiter gemörsert. Die
entstandene Flüssigkeit wurde in ein Oak Ridge-Gefäß überführt und 20 min bei 14000 g mit
dem SS-34 Rotor bei 4 °C zentrifugiert. Dann wurde der Überstand abgenommen, in ein
Falcon-Gefäß überführt, mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform-Gemisch (1 : 1) ver-
setzt und während 5 min stark geschüttelt. Daraufhin wurde nochmals 20 min zentrifugiert,
diesmal bei 4000 rpm und 4 °C. Die obere wässrige Phase wurde nochmals in ein Falcon-
Gefäß überführt und mit dem gleichen Volumen Phenol/Chloroform-Gemisch (1 : 1) versetzt,
nochmal 5 min geschüttelt und widerum zentrifugiert. Anschließend wurde die obere wässrige
Phase abgenommen, in ein neues Falcon-Gefäß überführt und das gleiche Volumen
Chloroform zugegeben. Das Falcon-Gefäß wurde wieder 5 min stark geschüttelt und 20 min
bei 4000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde abgenommen, in ein Oak
Ridge-Gefäß überführt und mit einem Volumen kaltem Puffer für RNA-Fällung versetzt. Nun
wurde die Probe auf Eis gestellt und über Nacht im Kältelabor bei 4 °C gefällt.
Am nächsten Tag erfolgte eine Zentrifugation von 30 min bei 12.000 rpm bei 4 °C. Der
Überstand wurde verworfen und das Pellet mit Waschpuffer gewaschen. Daraufhin wurde 30
min bei 12000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde wieder verworfen. Das Pellet
wurde in 200 µl ddH2O gelöst und in ein Eppendorf-Gefäß überführt. Daraufhin erfolgte die
Fällung mit 1/50 Volumen NaCl (5 M) und 2,5fachem Volumen 95%igem EtOH. Die Probe
wurde 30 min auf Eis gestellt und anschließend 25 min bei 14000 rpm und 4 °C zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 75%igem EtOH gewaschen. Danach
wurde 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dann wurde nochmal kurz
zentrifugiert und das restliche EtOH vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wurde getrocknet und
in 40 µl DEPC-behandeltem Wasser gelöst. Die Lagerung der RNA erfolgte bei – 80 °C.
2 Material und Methoden 33 __________________________________________________________________________
RNA-Extraktion mit Trizol
Die Probe wurde mit 1 ml Trizol pro 50 – 100 mg Pflanzenmaterial homogenisiert, 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert. Der Überstand wurde weiterverwendet und mit
0,2 ml Chloroform per ml Trizol versetzt. Die Probe wurde für 15 s stark geschüttelt und für 3
min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde für 15 min bei 12000 rpm und 4 °C
zentrifugiert. Die obere wässrige Phase, in der sich die RNA befand, wurde in ein neues
Eppendorf-Gefäß überführt. Nun wurden 0,5 ml Isopropanol pro ml Trizol zugegeben und für
10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde für 10 min bei 12000 rpm und 4
°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 75%igem EtOH
gewaschen. Dazu wurde 1 ml 75%iges EtOH pro verwendetem ml Trizol verwendet. Die
Probe wurde durchmischt und für 5 min bei 7500 rpm und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet getrocknet. Am Schluß wurde das Pellet in DEPC-
behandeltem H2O gelöst. Um die schwerlösliche RNA besser lösen zu können, wurde sie für
10 min bei 55 °C inkubiert.
2.2.11 RT-PCR zur Herstellung von cDNA aus RNA und Testgel
Um sicherzustellen, daß in der PCR ausschließlich cDNA als Matritze vorliegt, mußte
zunächst die in der RNA evtl. noch vorhandene DNA beseitigt werden (DNA-Verdau). Dazu
wurde die für die RT-PCR verwendete RNA (1,5 bis 5 µg) mit 0,5 µl DnaseI (RNAse-frei)
versetzt und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Dann wurde die Dnase bei 75 °C für 15 min hitze-
inaktiviert. Anschließend wurde die Reverse Transkription wie folgt durchgeführt:
2 Material und Methoden 34 __________________________________________________________________________
Es wurden 0,33 µl Oligo (dT) aus einer 500µg/ml-Stammlösung und 1 µl 10 mM dNTPs
dazugegeben und mit Wasser auf 12 µl aufgefüllt. Dann wurde bei 65 °C für 5 min inkubiert.
Anschließend erfolgte die Zugabe von 4 µl 5x First Strand Buffer und von 2 µl 0,1m DTT.
Bei 37 °C wurde für 2 min inkubiert und anschließend 1 µl Reverse Transkriptase (MLV)
zugegeben. Nun wurde bei 37 °C für 50 min inkubiert. Dann wurde bei 70 °C für 15 min
inkubiert, um die Reverse Transkriptase zu inaktivieren.
2.2.12 PCR auf cDNA
Die cDNA wurde auf eine eventuelle Expression von Myrosinase Binding Protein (MBP, 2,4
kb), Wound Inducible Myrosinase Binding Protein (WIMBP, 3 kb), Vegetative Storage
Protein (VSP, 860 bp) und OPR1 (1,2 kb) untersucht. Für den PCR-Ansatz wurde jeweils 1 µl
cDNA verwendet. Zusätzlich zum Primerpaar des jeweils untersuchten Proteins wurde als
interner Standard das Primerpaar für den Elongation Factor (EF, 400 bp) verwendet.
2.2.13 Mini-Präparation von Vektor-DNA
37F10-Klone von E. coli, die einen bluescript-Vektor mit einem PDF1.2-Insert (cDNA)
enthalten, wurden auf einer LBAmp-Platte ausplattiert und über Nacht inkubiert.
Aus 6 Kolonien wurden je 2,5 ml LBAmp Flüssigmedium angeimpft. Diese wurden mit 220
rpm bei 37 °C über Nacht inkubiert. Um die Plasmid-DNA zu erhalten, wurde eine
Minipräparation ausgeführt.
1,5 ml der Über-Nacht-Kultur wurden in Eppendorf-Gefäße überführt und 2 min bei
Raumtemperatur abzentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen; das Pellet
wurde in 100 µl Lösung I resuspendiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung II wurden die
Proben 5 min auf Eis inkubiert. Dann wurden 150 µl Lösung III zugegeben und nochmals 5
min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde 5 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert und der
2 Material und Methoden 35 __________________________________________________________________________
Überstand in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Es folgte eine Ethanolfällung, indem das
zweifache Volumen EtOH zugegeben wurde, 15 min bei – 22 °C inkubiert wurde und 15 min
bei 4 °C abzentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in 200 µl TE gelöst, mit 1 µl pankreatischer
RNase versetzt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Es wurden 4 µl 10% SDS und 2 µl Proteinase
K (10 mg/ml) zugegeben und 30 min bei 37 °C inkubiert. Nun wurde mit 200 µl
Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert, dann mit 200 µl Chloroform. Nach dem Ausschütteln und
abzentrifugieren (2 min bei voller Drehzahl) wurde die Oberphase vorsichtig abpipettiert und
in ein neues Eppendorf-Gefäß überführt. Es folgte eine weitere Ethanol-fällung; dazu wurden
1/10 Volumen Lösung IV und das 2,5fache Volumen EtOH zugegeben und 30 min bei – 20
°C inkubiert, bei 4 °C abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wurde
mit 200 µl eiskaltem 70% EtOH gewaschen und 5 min bei 4 °C abzentrifugiert. Das EtOH
wurde abpipettiert, der Niederschlag getrocknet und in 30 µl ddH2O resuspendiert.
2.2.14 Restriktionsverdau des Vektors
Um die im bluescript-Vektor enthaltene PDF1.2 cDNA zu erhalten, wurde ein Restriktions-
verdau mit SalI und NotI ausgeführt.
Dazu wurden jeweils 2 µl DNA mit 0,5 µl SalI, 0,5 µl NotI, 2 µl 10x Puffer und 15 µl H2Ofst.
versetzt. Die Ansätze wurden für 3 h bei 37 °C inkubiert.
2.2.15 Reinigung der PDF1.2 cDNA
Die Proben wurden zum Auftrennen der DNA-Fragmente auf ein 1,0 % Agarose-Gel
aufgetragen. Die PDF1.2-Banden wurden ausgeschnitten und mit dem „QIAquick Gel
Extraction Kit“ aus dem Gel extrahiert. Dabei wurde nach der Anleitung des Herstellers
vorgegangen. Zur Reinigung der DNA wurde eine EtOH-Fällung ausgeführt.
2 Material und Methoden 36 __________________________________________________________________________
2.2.16 Northern Blot
Um die eventuelle Expression von PDF1.2 zu erhalten, wurde eine Northern Blot Hybridi-
sierung ausgeführt.
RNA-Gel und Transfer
Um zu überprüfen, daß die RNA nicht degradiert war, wurde das Gel vor Ausführung des
Blots kurz auf UV-Licht gelegt und fotografiert.
Zunächst wurden alle verwendeten Materialien und Lösungen gereinigt und möglichst
autoklaviert. Die Gelelektrophorese wurde während 15 min bei 100 V und dann während ca. 5
h bei 80 V in 1x Gelpuffer ausgeführt. Danach wurde das Gel zweimal für 15 min in DEPC-
behandeltem H2O gewaschen. Anschließend wurde das Gel in 10x SSC gewaschen. Der Blot
wurde folgendermaßen aufgebaut: Über eine runde Glasschale, die mit 10x SSC als
Transferpuffer gefüllt war, wurde zunächst eine Glasplatte gelegt. Darauf wurden 2 Lagen
Whatman 3 MM gelegt, deren Enden in den 10x SSC-Puffer eingetaucht wurden. Darauf
wurde das Gel plaziert. Es folgte eine Nitrocellulosemembran, die zuvor in H2O und dann in
10x SSC getaucht worden war. Anschließend folgten nochmal 3 Lagen Whatman 3 MM in
der exakten Größe des Gels und in 10x SSC befeuchtet. Ganz oben wurde ein Stapel
Papierhandtücher plaziert, welcher mit einem kleinen Gewicht (ca. 200 g) beschwert wurde.
Der Transfer erfolgte über Nacht.
Nach dem Transfer wurde der Blot kurz in 2x SSC geschwenkt und dann zwischen dickes,
nasses Papier gelegt, um ein Austrocknen zu verhindern. Die RNA wurde mittels UV-
crosslink bei 1200 J kovalent an die Membran gebunden. Danach wurde der Blot bis zur
weiteren Benutzung feucht bei 4 °C aufbewahrt.
2 Material und Methoden 37 __________________________________________________________________________
Radioaktive Markierung der Sonde
Die PDF1.2-Sonde (25 ng) wurde mit [α32P]-dCTP radioaktiv markiert. Dazu verwendete
man das RadPrime DNA Labeling System (Invitrogen). Die Sonde wurde mittels einer
Gelfiltration über eine selbst hergestellte Sephadex G50-Säule von den nicht inkorporierten
Nukleotiden gereinigt. Der Einbau des [α32P]-dCTP wurde mit dem Scintillationszähler
überprüft.
Hybridisierung
Die Membran wurde in H2O und in 5x SSC geschwenkt und dann mindestens 2 h bei 42 °C in
der Hybridisierungslösung vorinkubiert. Dann wurde die Sonde 10 min in kochendem Wasser
denaturiert, auf Eis abgekühlt und anschließend zugegeben. Anschließend ließ man sie bei 42
°C und 80 rpm über Nacht hybridisieren. Um unspezifisch gebundene Sonde zu entfernen,
wurde die Membran mit steigender Stringenz zuerst in 1x SSC mit 0,5 % SDS, dann in 0,2x
SSC mit 0,5 % SDS bei 60 °C mehrmals gewaschen. Daraufhin folgte eine Autoradiografie.
3 Resultate 38 __________________________________________________________________________
Kapitel 3
Resultate
In der vorliegenden Arbeit wurden genetische Suppressoren der opr3-Mutante charakterisiert,
bei denen durch eine zweite Mutation der sterile Phänotyp der opr3-Mutante unterdrückt und
somit der fertile Phänotyp des Wildtyps wiederhergestellt wurde. Da in der opr3-Mutante der
Jasmonsäurebiosyntheseweg gestört ist, können mit Hilfe dieser Suppressoren die Gene
gefunden werden, die downstream von Jasmonsäure eine Rolle spielen und deren Funktion
bestimmt werden. Diese Untersuchungen sollen zu einem besseren Verständnis der Signal-
kaskaden, die durch das Vorhandensein von Jasmonsäure ausgelöst werden, beitragen.
Herstellung möglicher Suppressoren mittels EMS-Mutagenisierung
Um ein Screening nach genetischen Suppressoren der opr3-Mutante durchzuführen, wurde
Ethyl-Methan-Sulfonat (= EMS) verwendet. Dieses methyliert in der DNA am Guanin eine
der Bindungsstellen, so daß 6-Ethylguanin entsteht, welches nur noch 2 Bindungsstellen hat
und somit an Thymin bindet, anstatt an Cytosin. So entsteht eine Punktmutation, die zur Folge
hat, daß ein Gen entweder außer Funktion gesetzt wird, teilweise außer Funktion gesetzt wird,
qualitativ verändert wird, oder konstitutiv exprimiert wird.
Führt man ein Ethylmethansulfonat-Sättigungsmutagenese-Experiment aus, ist mit 95%iger
Wahrscheinlichkeit in jedem beliebigen G:C-Basenpaar des Genoms eine Punktmutation zu
finden (nach Jander et al. 2003). Mit dem in der vorliegenden Arbeit ausgeführten Experiment
wurde der Sättigungsbereich nicht erreicht, die Anzahl der Mutationen ist dennoch sehr hoch.
In jedem gefundenen Suppressor ist mit vielen Nebenmutationen zu rechnen, die ebenfalls zu
phänotypischen Veränderungen führen können.
3 Resultate 39 __________________________________________________________________________
Es wurden im Vorfeld der Arbeit zwei unabhängige Screenings von EMS-mutagenisierten
Pflanzen durchgeführt:
Erstes Screening:
• EMS-Mutagenisierung von ca. 50000 opr3-gl1-Samen
• ca. 20000 M1-Pflanzen keimten und wurden während der Blüte mit Jasmonsäure
besprüht, um M2-Samen zu erhalten. Dieser Schritt war notwendig, da in den M1-
Pflanzen die durch EMS verursachten Mutationen nur einen DNA-Strang betreffen
(die Mutation ist hemizygot, deshalb könnten nur dominante Suppressoren oder
eventuelle Kontaminanten fertil sein). Diese Vorgehensweise stellte sicher, daß auch
rezessive Mutationen gefunden werden konnten.
• Es wurden 46 Pools von M2-Samen geerntet
• Aus jedem Pool wurden 3000 M2-Samen gepflanzt. Diese Population von
überwiegend sterilen Pflanzen wurden auf fertile Pflanzen geprüft.
• Daraus wurden 4 echte Suppressoren erhalten, und zwar die Linien 10, 18, 22 und 24
Zweites Screening:
• EMS-Mutagenisierung von ca. 50000 opr3-Samen
• ca. 10000 Pflanzen keimten und wurden während der Blüte, als bereits sichtbar war,
welche fertil und welche steril sind, selektiert; die vier fertilen wurden von den
anderen getrennt, weil es sich um dominante Suppressoren handeln könnte. Ein Blatt
jeder der vier Pflanzen wurde für eine DNA-Extraktion geerntet (s. Material und
Methoden), außerdem wurden die Samen geerntet. Die sterilen Pflanzen wurden mit
Jasmonsäure besprüht, um M2-Samen zu erhalten.
• Es wurden 36 Pools von M2-Samen geerntet.
• Dann wurden 3 Schalen mit jeweils 500 M2-Samen pro pool bepflanzt (ab hier
Bestandteil der vorliegenden Arbeit).
3 Resultate 40 __________________________________________________________________________
• In diesen wurden 70 fertile oder teilweise fertile Pflanzen aus 28 verschiedenen Pools
gefunden, die mögliche Suppressoren sind. Von diesen wurden M3-Samen geerntet.
Außerdem wurde von den fertilen M2-Pflanzen jeweils ein Blatt für eine DNA-
Extraktion geerntet. Mit dieser DNA wurde eine PCR vorgenommen, um zu unter-
suchen, ob es sich um echte Suppressoren oder eventuelle Kontaminationen handelt.
3.1 Screening auf mögliche Suppressoren Bei der EMS-Mutagenisierung wurden verschiedene Linien gewonnen, die als Suppressor in
Frage kommen. Um zu selektieren, welche der fertilen Pflanzen für eine Suppressor-
Charakterisierung verwendet werden können, mußte zunächst nachgewiesen werden, daß
keine Kontaminationen vorliegen, z. B. von zufällig angeflogenen Pollenkörnern auf eine
Pflanze in der vorherigen Generation oder versehentlich eingetragenen anderweitigen Samen.
opr3 ist eine T-DNA-Insertions-Mutante. Bei einem echten opr3-Suppressor ist das T-DNA-
Insert im OPR3-Gen homozygot vorhanden. In einer fertilen M2-Pflanze, die daraus ent-
standen ist, daß ein Wildtyp-Pollenkorn auf einer wieder mutagenisierten M1-Pflanze
gelandet ist, befindet sich das T-DNA-Insert nur auf einer Kopie des OPR3-Gens, so daß
Jasmonsäure produziert werden kann. In fertilen Pflanzen, die durch die Kontamination durch
einen fremden Samen entstanden sind, ist keine T-DNA vorhanden, daher sind diese Pflanzen
im OPR3-Locus wildtypisch. Dies kann durch PCR getestet werden, indem man die passende
Primerkombination verwendet. Ebenso können Kanamycin-Segregationsraten bestimmt
werden, da das NPT II-Gen, welches für die Kanamycinresistenz verantwortlich ist, durch
eines der in der T-DNA vorhandenen Gene codiert wird.
3 Resultate 41 __________________________________________________________________________
LB
opr 3 int 55
Exon 4 Exon 3 Exon 2 Exon 1 Abb. 3: Molekulare Struktur des OPR3-Locus in der opr3-Mutante und Lage der PCR-Primer. Die Größenverhältnisse sind nicht repräsentativ. Das 17 kb T-DNA-Insert wird als Dreieck dargestellt. Exons sind als Rechtecke dargestellt, Introns als Linien zwischen den Exons. Die dickere Linie in Intron 2 repräsentiert ein Tnat1-ähnliches Transposon von 1,1 kb, welches im Ws-Ökotyp vorkommt, aber nicht im Columbia-Ökotyp. Die Pfeile zeigen die Position der verschiedenen Primer, welche für die PCR-Experimente verwendet wurden.
PCR-Ergebnisse
Für den PCR-Test wurde von den fertilen Pflanzen der jeweiligen Linien jeweils ein Blatt
geerntet, um eine DNA-Extraktion auszuführen (s. Material und Methoden). Auf jede Probe
wurden 2 PCR-Reaktionen ausgeführt, entweder mit der Primerkombination opr3int/LB oder
mit opr3int/55 (s. Abb. 3 zur Position der Primer). Wenn das T-DNA-Insert den OPR3-Locus
unterbricht, ist mit der Primerkombination opr3int/LB eine Bande von ca. 1,1 kb zu erwarten.
Da die T-DNA ungefähr 17 kb lang ist, kann bei den von uns angewendeten PCR-
Bedingungen (2 min extension time) mit der Primerkombination opr3int/55 keine Ampli-
fizierung erwartet werden. Wenn aber die T-DNA nicht vorhanden ist, ampflifizieren die
Primer opr3int/55 eine 0,4 kb-Bande, wenn das OPR3-Gen im Columbia Ökotyp auftritt, oder
eine 1,7 kb-Bande, wenn es sich um den Wassilevkia Ökotyp handelt. Zwischen den beiden
Ökotypen ist an diesem Locus ein Polymorphismus vorhanden.
Eine fertile F3-Pflanze, die mit der letzteren Primerkombination eine dieser beiden Banden
zeigt, kann also im OPR3-Locus nicht homozygot mutant sein, ist deshalb kein echter
Suppressor und wird verworfen. Unter den 70 fertilen M3-Pflanzen, für die eine PCR
ausgeführt wurde, zeigten 13 nur bei der Primerkombination opr3int/55 eine Bande, also
handelte es sich um Wildtyp-Kontaminationen. 26 zeigten bei beiden Primerkombinationen
eine Bande und sind deshalb OPR3/opr3. 31 zeigten nur bei der Primerkombination, die den
left border-Primer der T-DNA enthält, eine Bande und sind konsequentermaßen „echte“
Suppressoren.
3 Resultate 42 __________________________________________________________________________ 1 kb- 0,5 kb- 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Abb. 4: 1% Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. Die PCR-Produkte in Spur 1 kommen durch die Primerkombination opr3int/LB zustande. Die in Spur 2 resultieren aus der Primerkombination opr3int/55. Bei der Kontrolle 1 handelt es sich um eine heterozygote opr3/OPR3 Col, Kontrolle 2 ist eine Negativkontrolle ohne DNA. PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 62 °C, elongation 2 min bei 72°C, 30 Zyklen.
Abbildung 4 zeigt die PCR-Ergebnisse, bei denen die o. g. Primerkombinationen verwendet
wurden, nicht für alle 31, sondern nur für diejenigen Suppressoren, die im Laufe dieser Arbeit
weiter charakterisiert werden. Wie man sieht, kann für jeden Suppressor nur eine Bande
beobachtet werden, und zwar bei der Primerkombination opr3int/LB. Die DNA der
Positivkontrolle stammt von einer fertilen F3-Pflanze, die tatsächlich heterozygot
(OPR3/opr3) ist, und da die Bande in Spur 2 eine Länge von 0,4 kb aufweist, weiß man, daß
die Wildtyp-Kopie von OPR3 aus dem Columbia-Ökotyp stammt.
Anmerkung: Alle vier fertilen M2-Pflanzen, deren Samen vor der Jasmonsäurebehandlung im
zweiten Screening geerntet worden waren, erwiesen sich als Wildtyp-Kontaminationen und
nicht als dominante Suppressoren. Daher wurden sie verworfen.
Abbildung 4 zeigt, daß bezüglich des T-DNA-Inserts in opr3 bei den Suppressoren 10, 17.2,
18, 21.2, 22 und 24 die Voraussetzung für einen echten Suppressor erfüllt ist.
sup 10 sup 18 sup 22 sup 24 sup 17.1
sup 21.2
Kon-trolle 1
Kon-trolle 2
3 Resultate 43 __________________________________________________________________________
Kanamycintest
Das Ergebnis der PCR wurde überprüft, indem die Nachkommen der fertilen Pflanzen auf
kanamycinhaltigem Medium getestet wurden. Durch das T-DNA-Insert wurde eine Kana-
mycinresistenz eingebracht. In homozygoten opr3-Mutanten findet in der nächsten
Generation keine Segregation statt, so daß alle Nachkommen auf Kanamycin wachsen
können. Wäre das T-DNA-Insert nur heterozygot vorhanden, würde eine Segregation von 3 :
1 (resistent : sensitiv) stattfinden. ¼ der Pflanzen würde daher nur zwei kleine Keimblätter
bilden, die kein Chlorophyll haben und würden über dieses Stadium nicht hinauskommen.
Wenn es sich um Wildtyp-Pflanzen handelt, erhält man 100 % sensitive Pflanzen.
100 – 150 M3-Samen von jeder der 70 fertilen Pflanzen wurden oberflächensterilisiert (s.
Material und Methoden) und auf MS-Platten, die 50 µg/ml Kanamycin enthielten, ausplattiert.
Ca. 10 Tage nach Keimung wurden die Kanamycinraten ermittelt. In allen Fällen bestätigten
die gefundenen Daten die PCR-Ergebnisse.
Nachdem diese beiden voneinander unabhängigen Methoden beide zu denselben Schluß-
folgerungen führten, konnten wir darauf vertrauen, daß die Pflanzen, die wir als „echte
Suppressoren“ ausgewiesen haben, dies auch tatsächlich sind. Als eine dritte Methode hätte
man noch entweder die Abwesenheit oder die Anwesenheit des OPR3-Transkripts in den
fertilen Pflanzen durch Ausführung einer RT-PCR oder eines Northern Blots prüfen können.
In der opr3-Mutante konnte tatsächlich kein Transkript für OPR3 gefunden werden (Stintzi
and Browse 2000). Diese Technik ist aber sehr arbeitsintensiv, so daß wir sie nicht in Betracht
gezogen haben.
Die 31 fertilen M3-Pflanzen, die im OPR3-Locus homozygot für das T-DNA-Insert waren,
gehören zu 18 Pools von M2-Samen. Daher muß man zugeben, daß Suppressoren aus
verschiedenen M2-Pools zwar aus unterschiedlichen Mutationsereignissen stammen, aber
dennoch allelisch zueinander sein können. Andererseits könnten fertile Individuen innerhalb
eines Pools „Geschwister“ sein oder auch nicht. Um das Arbeiten mit „Geschwistern“ zu
verhindern, haben wir ein fertiles Individuum pro Pool zufällig ausgewählt und 12 Samen
individuell gepflanzt. Wir überprüften, ob sich bei der Blüte immer noch alle M4-Individuen
3 Resultate 44 __________________________________________________________________________
als fertil erwiesen. Überraschenderweise produzierten nur die Nachkommen von zwei Linien,
nämlich 17.1 und 21.2, eine annehmbare Samenmenge. Die Nachkommen von 7 Linien (die
in der Folge keine weitere Beachtung mehr fanden) produzierten ein paar teilweise ver-
längerte Schoten, die ein paar Samen enthielten, und die Nachkommen von 9 Linien waren
komplett steril, wie opr3.
Falsche positive Linien sind bei genetischen Screens üblich; da opr3 allerdings keinen
schwach ausgeprägten Phänotyp hat, d. h. opr3 produziert niemals irgendwelche Samen, ist es
doch einigermaßen überraschend, daß so viele Linien in der vorherigen Generation eine
annehmbare Samenmenge produzierten. Eine Ursache für die vollständige oder teilweise
Sterilität dieser 16 Linien könnte die hohe Temperatur sein, die im Hochsommer im
Gewächshaus herrschte. Möglicherweise sind diese Linien nur konditional fertil, also nur bis
zu einer maximalen Temperatur, die im Rahmen dieser Arbeit aber nicht genau bestimmt
wurde.
Wir entschieden uns, uns auf die vier zuvor isolierten Suppressoren 10, 18, 22, 24 und die neu
identifizierten 17.1 und 21.2 zu konzentrieren.
3.2 Homozygote Suppressor-Mutation
Für die Charakterisierung sollten nur Linien verwendet werden, welche die Mutation, die die
Suppression des opr3-Phänotyps verursacht, homozygot tragen. Bei den o. g. Linien traten bei
allen Pflanzungen in der nächsten Generation nur fertile Pflanzen auf (es wurden mindestens
300 Pflanzen pro Linie beobachtet). Würde die Suppressor-Mutation nur heterozygot vor-
liegen, würde in der nächsten Generation bei einer dominanten Mutation eine Segregation von
3 : 1 (fertil : steril) stattfinden. Da keine sterilen Pflanzen aufgetreten sind, waren die Linien
10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24 alle homozygot in der Suppressormutation.
3 Resultate 45 __________________________________________________________________________
Bei einem dominanten Suppressor denkt man an eine Mutation, die der Pflanze entweder eine
neue Funktion (gain-of-function-Mutation) oder eine qualitativ veränderte Funktion einbringt.
Diese sind auch heterozygot funktionsfähig. Andererseits findet man in einem rezessiven
Suppressor am häufigsten den Funktionsverlust eines Gens, z. B. eines negativen Regulators,
daher werden (in einer diploiden Pflanze) zwei Kopien dieses Gens benötigt, um eine
Veränderung herbeizuführen. In unserem Screen auf „wiedererlangte“ Fertilität bei opr3-
Pflanzen kann diese nur bei homozygoten Pflanzen beobachtet werden. Dies zeigt die
Notwendigkeit, blühende M1-Pflanzen zu besprühen, um M2-Samen zu erhalten und zu
verhindern, daß diese rezessiven Suppressoren verloren gehen.
3.3 Sind die Suppressoren dominant oder
rezessiv?
Da die Suppressoren homozygot waren, wurde als nächstes bestimmt, ob die Mutationen
dominant oder rezessiv sind. Dazu wurde folgendes Kreuzungsexperiment ausgeführt:
Die sechs Suppressoren-Linien 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24 wurden mit opr3-Pflanzen
gekreuzt. Dabei dienten opr3-Pflanzen als weiblicher Kreuzungspartner, die Suppressoren
jeweils als männlicher Kreuzungspartner. Durch Kreuzungen der Suppressoren mit opr3
konnte festgestellt werden, welche der Mutationen dominant oder rezessiv sind, je nachdem
wieviele fertile bzw. sterile Pflanzen in F1 auftraten.
Prinzip dieses Nachweises: Bei einem homozygoten Suppressor sind nach Kreuzung mit opr3 in F1 alle Pflanzen
genetisch gleich. Diese können entweder alle fertil oder alle steril sein. Wenn alle fertil sind,
ist die Mutation dominant. Wenn alle steril sind, ist die Mutation rezessiv.
3 Resultate 46 __________________________________________________________________________
Suppressor
Anzahl F1-Pflanzen
steril/fertil
dominant/rezessiv
10
16
steril
rezessiv
17.1
5
steril
rezessiv
18
4
fertil
dominant
21.2
23
steril
rezessiv
22
3
fertil
dominant
24
6
fertil
dominant
Tabelle 1: Nach Kreuzung der Suppressoren mit opr3 ist in F1 zu sehen, welche Linien in der Suppressor-Mutation dominant oder rezessiv sind. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse des Kreuzungsexperiments. Bei den Suppressoren 10, 17.1 und
21.2 traten nur sterile Nachkommen auf, also handelt es sich um rezessive Mutationen. Bei
den Suppressoren 18, 22 und 24 traten nur fertile Nachkommen auf, also handelt es sich um
dominante Mutationen.
Um die Nachkommen der Rückkreuzungen mit den rezessiven Suppressoren nicht zu
verlieren, besprühten wir die sterilen Pflanzen mit Jasmonsäure, um Samen zu erhalten.
Würde ein dominanter heterozygoter Suppressor vorliegen, bei dem die Mutation nur auf
einem Gen vorhanden ist und somit in F1 mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 % auftritt,
wäre die Hälfte der Pflanzen fertil, die andere Hälfte müßte steril sein. Dieser Fall ist bei den
Kreuzungen der Suppressoren mit opr3 nicht aufgetreten, was eine weitere Bestätigung der
bisher gefundenen Ergebnisse war. Die verwendeten Suppressoren sind also alle homozygot
3 Resultate 47 __________________________________________________________________________
in der Suppressormutation. Die Zahl der F1-Pflanzen für die Kreuzung mit den dominanten
Suppressoren ist allerdings statistisch nicht ausreichend, um eine sichere Aussage zu treffen.
Rückkreuzung: Suppressor x opr3
Durch die EMS-Mutagenisierung ist damit zu rechnen, daß außer der Suppressor-Mutation
noch mehrere hundert andere Mutationen vorhanden sind, die mit der Unterdrückung des
opr3-Phänotyps nichts zu tun haben. Die o. g. sechs Suppressoren-Linien wurden mehrfach
mit opr3 rückgekreuzt, um unerwünschte Nebenmutationen zu eliminieren. Pro Rück-
kreuzung eliminiert man ungefähr die Hälfte der Nebenmutationen:
BC1: 50 %, BC2: 25 %, BC3: 12,5 % etc. Die opr3-Pflanzen dienten als weiblicher
Kreuzungspartner, die Suppressoren als männlicher Kreuzungspartner.
Linie vorhandene Samen
Suppressor 10 BC1 F1, BC2 F1
Suppressor 17.1 BC1 F1
Suppressor 18 BC1 F1
Suppressor 21.2 BC1 F1
Suppressor 22 BC1 F1, BC2 F1
Suppressor 24 BC1 F1
Tabelle 2: Rückkreuzungen mit opr3. BC1 = 1. Rückkreuzung (backcross), BC2 = 2. Rückkreuzung, F1 = F1-Generation
Von den Suppressoren 10, 17.1, 21.2 und 24 konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit
Samen aus der ersten Rückkreuzung gewonnen werden, von den Suppressoren 18 und 22
konnten sogar bereits Samen aus der zweiten Rückkreuzung gewonnen werden (s. Tab. 2).
Später soll mit diesen Samen ein Mapping durchgeführt werden, um herauszufinden auf
welchem Chromosom und an welcher Stelle im Chromosom sich die Mutation befindet, die
die Suppression des opr3-Phänotyps auslöst.
3 Resultate 48 __________________________________________________________________________
Um ein grobes Mapping anzufertigen, reichen zwei Rückkreuzungen aus. Dabei kann man
immerhin feststellen, auf welchem Chromosom die Mutation liegt und ungefähr an welchem
Ende des Chromosoms. Für ein feines Mapping, bei dem die Position der Mutation auf dem
Chromosom ziemlich exakt festgestellt werden kann, muß man ca. 4 – 5 mal rückkreuzen,
bevor man die Pflanze mit einer Wildtyp-Pflanze eines anderen Ökotyps kreuzt. In unserem
Fall ist opr3 im Ws-Ökotyp und die Kreuzung wird mit Ler (Landsberg erecta) ausgeführt
werden. Zwischen diesen zwei Ökotypen ist eine bemerkenswerte Anzahl von genetischen
Markern identifiziert worden.
Für die Linien 18 und 22 ist also bereits ein grobes Mapping durchführbar. Für das feine
Mapping sowie die anderen Linien müssen weitere Kreuzungen ausgeführt werden.
3.4 Sind die Suppressor-Mutationen OPDA-abhängig?
3.4.1 Herstellung einer Doppelmutante: aos x opr3
In opr3 wurde gezeigt, daß Jasmonsäure und nicht OPDA das Signalmolekül ist, welches bei
der Reifung von Antheren und Pollen involviert ist (Stintzi und Browse 2000). Bei den
Verteidigungsreaktionen agiert aber OPDA ebenso wie Jasmonsäure als Signalmolekül
(Stintzi et al. 2001). Wenn nun in einem Suppressor eine jetzt veränderte Funktion OPDA
(oder einem Derivat von OPDA) ermöglichen würde, anstelle von Jasmonsäure als Signal-
molekül zu agieren, so könnte dies durch das „Entfernen“ der Quelle für OPDA demonstriert
werden. AOS, in Verbindung mit AOC, ist verantwortlich für die Zyklisierung von 13-
Hydroxyperoxylinolensäure zu OPDA. Da im Arabidopsis-Genom nur ein AOS-Gen
vorhanden ist, und eine männlich sterile aos-Mutante (echtes knock-out) verfügbar ist, würde
das Kreuzen des Suppressors mit aos die Methode der Wahl sein, OPDA zu eliminieren. aos
ist aber sowohl im OPR3-Locus als auch im Suppressor-Locus wildtypisch. Daher würde in
der F2-Generation aus einer solchen Kreuzung nur eine von 64 Pflanzen für alle drei Mutatio-
3 Resultate 49 __________________________________________________________________________
nen homozygot sein, die extrem schwierig zu herauszufinden wäre. Eine Alternative ist,
zuerst aos und opr3 zu kreuzen, in F2 eine Doppelmutante zu erhalten (1/16 der Pflanzen)
und anschließend diese Doppelmutante mit dem Suppressor zu kreuzen. In F2 wird 1/16 der
Pflanzen den richtigen Genotyp aufweisen.
Homozygote aos-Pflanzen (wildtypisch für OPR3) und homozygote opr3-Pflanzen (wild-
typisch für AOS) wurden also miteinander gekreuzt. Dabei dienten die aos-Pflanzen als
maternaler Kreuzungspartner, die opr3-Pflanzen als paternaler Kreuzungspartner, nachdem
sie mit Jasmonsäure besprüht worden waren, um funktionsfähigen Pollen zu erhalten. Das
Ziel dieser Kreuzung war die Herstellung einer Doppelmutante, die in opr3 und aos homo-
zygot ist. Die Doppelmutante kann später verwendet werden, um eine eventuelle OPDA-
Abhängigkeit nachzuweisen.
In F1 erhielt man lauter genotypisch gleiche Pflanzen, die alle sowohl in aos als auch in opr3
mutant waren, allerdings nur heterozygot (und deshalb fertil). Nach Selbstung erhielt man in
F2 16 verschiedene Genotypen, von denen in mehreren Stufen diejenigen 15 eliminiert
werden mußten, die nicht den gewünschten Genotyp aufwiesen (s. Tab. 3).
F2
AOS/OPR3
AOS/opr3
aos/OPR3
aos/opr3
AOS/OPR3
AOS/AOS OPR3/OPR3 fertil
AOS/AOS OPR3/opr3 fertil
AOS/aos OPR3/OPR3 fertil
AOS/aos OPR3/opr3 fertil
AOS/opr3
AOS/AOS opr3/OPR3 fertil
AOS/AOS opr3/opr3 steril
AOS/aos opr3/OPR3 fertil
AOS/aos opr3/opr3 steril
aos/OPR3
aos/AOS OPR3/OPR3 fertil
aos/AOS OPR3/opr3 fertil
aos/aos OPR3/OPR3 steril
aos/aos OPR3/opr3 steril
aos/opr3
aos/AOS opr3/OPR3 fertil
aos/AOS opr3/opr3 steril
aos/aos opr3/OPR3 steril
aos/aos opr3/opr3 steril
Tabelle 3: Kreuzungsschema für die F2-Generation aus der Kreuzung zwischen aos und opr3.
3 Resultate 50 __________________________________________________________________________
Zuerst wurden diejenigen eliminiert, die keine Mutation in OPR3 aufwiesen (blau), indem die
Tatsache genutzt wurde, daß diese keine Kanamycinresistenz trugen. Dazu wurden F2-Samen
auf MSKan-Platten ausplattiert, so daß nur die Pflanzen mit Kanamycinresistenz überlebten.
Dadurch wurde bereits ¼ der Genotypen eliminiert.
Von den erhaltenen Pflanzen wurden 48 Stück auf Erde übertragen und großgezogen. Die
fertilen wurden verworfen (gelb). Somit blieben nur noch sechs Genotypen übrig, die alle
steril waren. Von den sterilen Pflanzen wurde Material für eine DNA-Analyse eingefroren,
die Pflanzen wurden mit Jasmonsäure besprüht und geerntet.
Die weiteren Schritte sind nicht mehr Bestandteil der vorliegenden Arbeit, sondern werden in
einer weiterführenden Arbeit ausgeführt, sollen aber der Vollständigkeit halber kurz erläutert
werden: Diejenigen Pflanzen, die in OPR3 heterozygot sind (grau), können nachgewiesen und
eliminiert werden, indem man die DNA mit OPR3-Primern amplifiziert. Alle Pflanzen, die
dann noch übrig sind, sind bereits homozygot in opr3. Über eine PCR auf cDNA mit AOS-
Primern kann man aus den restlichen Pflanzen die Doppelmutante detektieren (rot).
3.4.2 Suppressor x aos
Die o. g. sechs Suppressoren-Linien wurden jeweils mit der homozygoten aos-Mutante ge-
kreuzt. Dabei dienten die aos-Pflanzen als weiblicher Kreuzungspartner, die Suppressoren als
männlicher Kreuzungspartner. Es wurden jeweils sechs Kreuzungen pro Linie angefertigt, so
daß 36 Kreuzungen entstanden sind. Aus jeder Kreuzung wurden F1-Pflanzen großgezogen,
die alle fertil waren und wieder einzeln geernet wurden.
In F2 findet Segregation statt; die F2-Samen der homozygoten Pflanzen werden zur späteren
Verwendung geerntet. Die homozygoten Pflanzen zu finden wird hier wesentlich einfacher
sein, weil man nur dem fertilen Phänotyp zu folgen braucht. Die Suppressoren 10, 18, 22 und
24 sind glabrous (keine Trichome auf den Blättern), ein Merkmal, welches in F2 wieder auf-
3 Resultate 51 __________________________________________________________________________
tritt und als Kontrolle dienen kann, ob die Kreuzung funktioniert hat. Dieser Schritt soll
ebenfalls in einer weiterführenden Arbeit ausgeführt werden.
Die hieraus entstehenden homozygoten Pflanzen sollen später mit der o. g. Doppelmutante
gekreuzt werden.
3.5 Phänotypische Charakterisierung der
Suppressoren:
Für die phänotypische Charakterisierung wäre es ideal gewesen, eine Analyse an bereits
rückgekreuzten Pflanzen vorzunehmen, um sicherzugehen, daß die beobachteten Phänomene
tatsächlich mit der Suppressor-Mutationen zusammenhängen und nicht aus einer Neben-
mutation resultieren. Im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit war dies jedoch nicht möglich,
daher wurden M3-Samen verwendet. Ein Beispiel für die massiven Auswirkungen von
Nebenmutationen zeigte sich beim Suppressor 10, bei dessen Nachkommen (M 3) des fertilen
Phänotyps vereinzelt Pflanzen auftraten, die um ca. 30 – 40 % größer waren als die anderen
und als Phänotyp „big“ bezeichnet wurden.
Beim Suppressor 10 konnte außerdem beobachtet werden, daß jeweils die ersten ca. 10
Schoten steril blieben und sich erst danach fertile Schoten ausbildeten. Bei den anderen
Suppressoren war dieses Phänomen nicht zu beobachten. Bei allen sechs Suppressoren waren
die Schoten vollständig verlängert. Die „big“-Mutation ist nicht mit dem fertilen Phänotyp
verknüpft, da nach der Rückkreuzung mit opr3 die Pflanzen, die „big“ und fertil sind,
verschwunden waren.
3 Resultate 52 __________________________________________________________________________
3.5.1 Unterschiede der verschiedenen Suppressoren in der
Blütenentwicklung Bei mikroskopischen Untersuchungen wurde festgestellt, daß die verschiedenen
Suppressoren-Linien beim Öffnen der Antheren Unterschiede im zeitlichen Ablauf aufweisen.
Diese wurden fotografisch dokumentiert und können später, sobald bekannt ist, welche Gene
bei den Suppressoren betroffen sind, weitere Erkenntnisse zu den bei der Pollenfreisetzung
eine Rolle spielenden Prozessen liefern.
Dazu wurden jeweils die ersten drei bis vier geöffneten Blüten betrachtet. Damit sind,
ausgehend von einem Blütenstand die jüngsten, gerade geöffneten Blüten gemeint. Die Blüten
wurden fotografiert und werden in den Abbildungen 5 - 12 gezeigt. Außer den fotografierten
Pflanzen wurden noch ca. 3 – 4 andere Pflanzen pro Linie betrachtet, um die Dokumentation
von zufälligen Abweichungen zu vermeiden. Es handelt sich hierbei aber nicht um statistische
Daten.
Wildtyp: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 5: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Wildtyp-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.
Beim Wildtyp sieht man, daß die erste geöffnete Blüte bereits geöffnete Antheren hat. Der
Pollen ist deutlich erkennbar.
3 Resultate 53 __________________________________________________________________________ opr3: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 6: Die ersten drei geöffneten Blüten einer opr3-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.
Bei opr3-Blüten sieht man, wie zu erwarten war, keine freigesetzten Pollen.
Suppressor 10: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 7: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 10-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.
Beim Suppressor 10 sieht man bei der ersten Blüte noch keine Pollen. Bei der zweiten Blüte
sieht man bei genauer Betrachtung beim linken Staubblatt am Rand wenige Pollen, d. h. die
Freisetzung beginnt gerade. Bei der dritten Blüte hat die Freisetzung bereits vollständig
stattgefunden.
3 Resultate 54 __________________________________________________________________________ Suppressor 17.1: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte 4. geöffnete Blüte Abb. 8: Die ersten vier geöffneten Blüten einer Suppressor 17.1-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt.
Beim Suppressor 17.1 sieht man die Freisetzung erst bei der vierten Blüte. Suppressor 18: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 9: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 18-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 18 ist der Pollen bei der ersten Blüte schon sichtbar.
3 Resultate 55 __________________________________________________________________________ Suppressor 21.2: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 10: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 21.2-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 21.2 fangen die Antheren auf dem zweiten Bild an sich zu öffnen. Auf dem
dritten Bild hat die Freisetzung stattgefunden.
Suppressor 22: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte Abb. 11: Die ersten drei geöffneten Blüten einer Suppressor 22-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 22 hat – wie bei 18 und beim Wildtyp – die Freisetzung bereits in der ersten
geöffneten Blüte vollständig stattgefunden.
3 Resultate 56 __________________________________________________________________________ Suppressor 24: 1. geöffnete Blüte 2. geöffnete Blüte 3. geöffnete Blüte 4. geöffnete Blüte Abb. 12: Die ersten vier geöffneten Blüten einer Suppressor 24-Pflanze. Jeweils zwei Sepalen und Petalen wurden entfernt. Beim Suppressor 24 wird der Pollen erst in der vierten Blüte freigesetzt. Obwohl bei allen Suppressoren die Fertilität wiederhergestellt ist, treten doch bezüglich der
Pollenfreisetzung Unterschiede im zeitlichen Verlauf auf. Bei den verschiedenen Suppressor-
Mutationen könnten unterschiedliche Signalmoleküle betroffen sein, die an unterschiedlichen
Stellen in der Signalkaskade eine Rolle spielen.
Besonders hervorzuheben ist die Gemeinsamkeit der Suppressoren 18 und 22, die auch im
unter Punkt 3.6 genannten Experiment bei den Blüten auftrat.
Offensichtlich liegt hier irgendeine Gemeinsamkeit vor.
3 Resultate 57 __________________________________________________________________________ 3.5.2 Beobachtungen an der phänotypischen Entwicklung der
Pflanzen 10 Pflanzen pro Linie Blühbeginn nach x
Tagen Länge des Haupttriebs Ø nach 50 Tagen
Erste Schote öffnet sich nach x Tagen
sup 10
37,7 Tage
19,7 cm
79,2 Tage
sup 17.1
34,5 Tage
33,9 cm
89,8 Tage
sup 18
39,9 Tage
35,5 cm
90,5 Tage
sup 21.2
36,3 Tage
18,7 cm
79,3 Tage
sup 22
34,9 Tage
26,5 cm
63,4 Tage
sup 24
31,8 Tage
20,4 cm
89,1 Tage
opr3
31,8 Tage
38,2 cm
-
wt ws
35,0 Tage
32,0 cm
73,6 Tage
Tabelle 4: Messungen von den drei Parametern Blühbeginn, Länge des Haupttriebs und Schotenöffnung.
Bei der phänotypischen Charakterisierung wurden drei verschiedene Parameter untersucht,
um eventuelle Abweichungen von der normalen Entwicklung aufzuzeigen (s. Tab. 4). Die
Standardabweichung war vernachlässigbar gering.
3 Resultate 58 __________________________________________________________________________
Um die phänotypischen Unterschiede, die in den Pflanzen aufgrund genetischer Variationen
oder durch den Einfluß von Umweltstreß sichtbar sind, identifizieren und interpretieren zu
können, muß zunächst ein Standard vorhanden sein, der den Vergleich mit einer normal
entwickelten Pflanze zuläßt. Zu diesem Zweck haben die Firmen BASF, Bayer, Ciba-Geigy
und Hoechst das sogenannte BBCH-scale eingeführt, bei dem eine Art genetische Nomen-
klatur zur Verfügung gestellt wird, welche die Entwicklungsstadien exakt kennzeichnet.
Dafür wurden Wildtyppflanzen der Arabidopsis thaliana-Subspecies Columbia (Col-0)
verwendet. In Zusammenhang mit anderweitigen effizienten Untersuchungsmethoden wird
durch den Einsatz dieses Standards eine hohe Verarbeitungsmenge bei der Analyse von
Pflanzengenen erreicht (Boyes et al. 2001, Lancashire et al. 1991). Dieser Standard wurde bei
unseren Beobachtungen zur phänotypischen Entwicklung zugrunde gelegt.
Beim ersten Parameter wurde beobachtet, nach wievielen Tagen der Blühbeginn einsetzt.
opr3 blüht deutlich früher als der Wildtyp (ungefähr drei Tage). Dies wurde wiederholt
beobachtet (auch von A. Stintzi) und tritt noch wesentlich extremer zutage, wenn Pflanzen
unter Kurztagbedingungen gehalten werden. Eine Ursache für diese frühe Blütezeit könnte in
der opr3-Mutante das Fehlen von Jasmonsäure sein. Suppressor 24 blüht relativ früh und hat
dieselben Werte wie opr3. Die anderen Suppressoren haben ähnliche Werte wie der Wildtyp
oder blühen etwas später. Besonders bei den Suppressoren 10 und 18 fällt auf, daß sie deutlich
später blühen als der Wildtyp (drei und fünf Tage später). Die Werte, die zwischen opr3 und
dem Wildtyp liegen, entsprechen der Erwartung, d. h. der normale Phänotyp wurde bei diesen
Pflanzen teilweise wiederhergestellt. Weshalb einige Werte höher liegen als beim Wildtyp, ist
nicht geklärt; wenn Jasmonsäure beim Zeitpunkt der Blüte eine Rolle spielt, könnte es sein,
daß Über- oder Unterstimulierung dieser Signalroute für die beobachtete Verzögerung des
Blühzeitpunktes verantwortlich ist. Ebenso könnten sich Auswirkungen von Nebenmutationen
bemerkbar machen.
3 Resultate 59 __________________________________________________________________________
Beim zweiten Parameter wurde 50 Tage nach dem Ausbringen der Samen die Länge des
Haupttriebes gemessen. Hier fiel vor allem auf, daß die Suppressoren 10, 21.2 und 24 sehr
viel langsamer wachsen als der Wildtyp. Auch Suppressor 22 ist etwas langsamer. Bei den
Suppressoren 17.1 und 18 liegen die Werte zwischen denen des Wildtyps und den Werten von
opr3.
Beim dritten der untersuchten Parameter fiel auf, daß besonders der Suppressor 22 aus dem
Rahmen fällt und die erste geöffnete Schote wesentlich früher erscheint als bei allen anderen
Linien. Bei allen anderen öffnete sich die erste Schote deutlich später als beim Wildtyp, beim
Suppressor 22 jedoch deutlich früher als beim Wildtyp. Hier kann im Gegensatz zu anderen
Versuchen keine Gemeinsamkeit mit Suppressor 18 festgestellt werden. Bei den ersten beiden
Parametern wurden keine signifikanten Besonderheiten gefunden; die extrem verfrühte
Schotenöffnung beim Suppressor 22 ist jedoch äußerst auffällig und sollte für spätere
Arbeiten im Auge behalten werden. Sobald das von der Mutation im Suppressor 22 betroffene
Gen identifiziert ist, wird die Überlegung interessant, wie diese Auffälligkeit mit der Mutation
in Verbindung steht.
3.5.3 Pollenkeimung
Alle unsere Suppressoren sind vollständig fertil und bilden eine normale Samenmenge. Dies
könnte aber auch erreicht werden, wenn der Pollen nicht 100%ig funktionsfähig ist. Die
Pollenkeimung wurde in vitro gemessen (s. Material und Methoden) und die Ergebnisse sind
in Tabelle 5 dargestellt.
Für die Pollenkeimung wurden pro Linie 4 Pflanzen untersucht; beim Wildtyp wurden nur 2
Pflanzen untersucht. Bei jeder Pflanze wurden am Haupttrieb die ersten drei geöffneten
Blüten, ausgehend vom Blütenstand, verwendet. Die Auswertung der Platten fand mindestens
24 h nach Auftragen der Pollen auf das Medium statt.
3 Resultate 60 __________________________________________________________________________
Linie Anzahl
Blüten
Gesamtzahl
gezählte Pollen
Pollenkeimungs-
rate
Grundgesamtheit-
Standardabweichung
wt ws 6 3569 88,2 % 2,6
opr3 12 3000 6,9 % 4,5
sup 10 12 5486 72,3 % 20,4
sup 17.1 12 2845 50,3 % 13,1
sup 18 12 7475 72,1 % 19,3
sup 21.2 12 6217 69,3 % 8,8
sup 22 12 8791 51,2 % 16,7
sup 24 12 7143 46,7 % 13,2 Tabelle 5: Pollenkeimung der untersuchten Suppressoren im Vergleich zum Wildtyp und zu opr3. Die Pollen wurden als gekeimt gezählt, sobald ein Pollenschlauch die zweifache Länge eines
Pollenkorns hatte. Bezüglich der Größe des Pollenschlauchs wurden keine Unterschiede
gemacht. Die Pollenschläuche hatten fast immer eine normale Länge (ungefähr wie beim
Wildtyp), nur bei opr3 waren sie meist kurz (meist nicht länger als ein Pollenkorn).
Die Pollenkeimungsexperimente zeigten beim Wildtyp eine Pollenkeimungsrate von 88,2 %
+/- 2,6, bei opr3 dagegen nur von 6,9 % +/- 4,5. Dies entsprach der Erwartung (Stintzi and
Browse 2000).
Die Pollenkeimungsraten der Suppressoren zeigten Werte, die zwar nicht ganz so hoch waren
wie beim Wildtyp, aber doch weit höher als bei opr3.
Die Pollenkeimungsraten zwischen 46,7 % und 72,3 % zeigten eindeutig, daß die Prozesse,
die für eine normale Entwicklung von Pollen und Antheren notwendig sind, bei den ver-
wendeten Suppressoren im wesentlichen wiedererlangt wurden. Die Anzahl der Pollen, die
einen ganz normalen Pollenschlauch ausbildeten, waren für eine normale Selbstbefruchtung
absolut ausreichend. Die Fotos, die jeweils von einem repräsentativen Spot gemacht wurden,
sind in Abbildung 13 zu sehen.
3 Resultate 61 __________________________________________________________________________
Pollenkeimung Wildtyp ws opr3 88,2 % 6,9 % σx = 2,6 σx = 4,5 n = 6 n = 12
Suppressor 10 Suppressor 17.1 72,3 % 50,3 % σx = 20,4 σx = 13,1 n = 12 n = 12
3 Resultate 62 __________________________________________________________________________
Pollenkeimung Suppressor 18 Suppressor 21.2 72,1 % 69,3 % σx = 19,3 σx = 8,8 n = 12 n = 12
Suppressor 22 Suppressor 24 51,2 % 46,7 % σx = 16,7 σx = 13,16 n = 12 n = 12 Abb. 13: Pollenkeimung in vitro, mind. 24 h nach Auftragen der Pollen auf das Medium: Fotografie eines repräsentativen Spots von wt, opr3, und den Suppressoren 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24.
3 Resultate 63 __________________________________________________________________________
3.6 Molekulare Charakterisierung der
Suppressoren
Die molekulare Charakterisierung soll dazu beitragen, die jasmonatabhängigen Mechanismen
besser zu verstehen, die downstream vom Jasmonsäurebiosyntheseweg über verschiedene
Signalkaskaden zu den Jasmonsäurereaktionen führt, von denen uns insbesondere die
Vorgänge in der Blüte interessieren. Für diese Analyse wurden als molekulare Marker MBP,
WIMBP, VSP2, OPR1 und PDF1.2 verwendet (s. Einleitung), weil sie jasmonsäureabhängig
sind und nach Jasmonsäurebehandlung exprimiert wurden. Außer MBP, welches in Blüten
konstitutiv exprimiert wird und coi1-abhängig ist (Capella et al. 2001), werden die
verschiedenen genannten Marker in opr3 unterschiedlich exprimiert (Stintzi et al. 2001).
Die molekulare Charakterisierung wurde entweder mittels RT-PCR (reverse transkriptase
polymerase chain reaction) oder Northern Blot ausgeführt. Für die RNA-Extraktion wurden
jeweils Blätter und Blüten als Ausgangsmaterial verwendet. Da in der Blüte für die Antheren-
und Pollenreifung Jasmonsäure benötigt wird, der Jasmonsäurebiosyntheseweg in den
Suppressoren aber gestört ist, ist eine Analyse auf Blüten-RNA besonders interessant und soll
zeigen, welche der o. g. Proteine eventuell trotz Abwesenheit von Jasmonsäure vorhanden
sind, bzw. bei konstitutiv aktiviertem Jasmonsäuresignalweg exprimiert werden.
RT-PCR
Für die RT wurden jeweils 5 µg RNA verwendet, um unter Verwendung von oligo-dT die
cDNA herzustellen (s. Material und Methoden). Um sicherzustellen, daß bei der RT-PCR
keine Verunreinigung mit DNA auftritt, wurde zuerst eine DNase-Behandlung ausgeführt.
Dazu wurden pro 5 µg RNA 5 units RNase-freie DNase zugegeben. Aus diesem Grund kann
man sicher sein, daß die gefundenen Banden nicht aus einer DNA-Kontamination resultierten,
sondern tatsächlich aus cDNA, die man aus RNA erhalten hat. Abbildungen 14 – 18 zeigen
die RT-PCR-Ergebnisse für alle getesteten Marker.
3 Resultate 64 __________________________________________________________________________
Myrosinase Binding Protein (= MBP) Blätter: MBP2 EF1α 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Blüten: MBP2
EF1α
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Abb. 14: 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –26MBP2/MBP2-2359R. 1 = Suppressor 10 (cDNA), 2 = Suppressor 17.1 (cDNA), 3 = Suppressor 18 (cDNA), 4 = Suppressor 21.2 (cDNA), 5 = Suppressor 22 (cDNA), 6 = Suppressor 24 (cDNA), 7 = opr3 (cDNA), 8 = Wildtyp ws (cDNA), 9 = Acht Stunden nach Verwundung (cDNA), 10 = Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), 11 = Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 57 °C, elongation 3 min 30 s bei 72 °C, 33 Zyklen.
3 Resultate 65 __________________________________________________________________________ Woundinducible Myrosinase Binding Protein (= WIMBP) Blätter:
EF1α
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Blüten: EF1α 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Abb. 15: 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –26WIMBP/WIMBP3039R. 1 = Suppressor 10 (cDNA), 2 = Suppressor 17.1 (cDNA), 3 = Suppressor 18 (cDNA), 4 = Suppressor 21.2 (cDNA), 5 = Suppressor 22 (cDNA), 6 = Suppressor 24 (cDNA), 7 = opr3 (cDNA), 8 = Wildtyp ws (cDNA), 9 = Acht Stunden nach Verwundung (cDNA), 10 = Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), 11 = Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 57 °C, elongation 3 min 30 s bei 72 °C, 38 Zyklen.
3 Resultate 66 __________________________________________________________________________
Vegetative Storage Protein (VSP), Blätter 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║Suppressor 10 ║Suppressor 17.1║ ║Suppressor 18 ║Suppressor 21.2║ 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║Suppressor 22 ║Suppressor 24 ║ ║ opr3 ║ Wildtyp ws ║
3 Resultate 67 __________________________________________________________________________ 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║ Kontrolle 1 ║ Kontrolle 2 ║ Abb. 16: 1,2%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –36VSP2/824VSP2R. Jeweils vier Spuren nebeneinander von Suppressor 10 (cDNA), Suppressor 17.1 (cDNA), Suppressor 18 (cDNA), Suppressor 21.2 (cDNA), Suppressor 22 (cDNA), Suppressor 24 (cDNA), opr3 (cDNA), Wildtyp ws (cDNA), Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 58 °C, elongation 2 min bei 72 °C, 21, 25, 29 und 33 Zyklen.
Vegetative Storage Protein (VSP), Blüten 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen EF1α ║ Suppressor 10 ║ Suppressor 17.1 ║
3 Resultate 68 __________________________________________________________________________ 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen VSP2 EF1α ║Suppressor 18 ║Suppressor 21.2║ ║ Suppressor 22 ║ Suppressor 24 ║ 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 21 25 29 33 Zyklen
EF1α
║ opr3 ║ Wildtyp ws ║ ║ Kontrolle 1 ║ Kontrolle 2 ║ Abb. 17: 1,2%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –36VSP2/824VSP2R. Jeweils vier Spuren nebeneinander von Suppressor 10 (cDNA), Suppressor 17.1 (cDNA), Suppressor 18 (cDNA), Suppressor 21.2 (cDNA), Suppressor 22 (cDNA), Suppressor 24 (cDNA), opr3 (cDNA), Wildtyp ws (cDNA), Kontrolle 1 (pos.: wt ws-DNA), Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 58 °C, elongation 2 min bei 72 °C, 21, 25, 29 und 33 Zyklen.
3 Resultate 69 __________________________________________________________________________ OPR1 Blätter:
EF1α
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Blüten: EF1α
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb. 18: 0,8%iges Agarose-Gel mit Ethidiumbromid versetzt. In allen Spuren wurden zwei Primerkombinationen gleichzeitig benützt, und zwar EF1α;1202R/EF1α;817 sowie –25OPR1/TAAOPR1R. 1 = Suppressor 10 (cDNA), 2 = Suppressor 17.1 (cDNA), 3 = Suppressor 18 (cDNA), 4 = Suppressor 21.2 (cDNA), 5 = Suppressor 22 (cDNA), 6 = Suppressor 24 (cDNA), 7 = opr3 (cDNA), 8 = Wildtyp ws (cDNA), 9 = Acht Stunden nach Verwundung (cDNA), 10 = Kontrolle 2 (neg.: ohne DNA). PCR-Bedingungen: denaturation 20 s bei 95°C, annealing 40 s bei 57 °C, elongation 1 min 30 s bei 72 °C, 33 Zyklen.
3 Resultate 70 __________________________________________________________________________
Als Kontrollen wurden opr3, wt ws, w 8(= Blätter, 8 h nach Verwundung) und eine
Negativkontrolle ohne cDNA eingesetzt. Bei opr3 sind bei den o. g. Markern keine Banden zu
erwarten, da Jasmonsäure fehlt und somit die von der nachfolgenden Signalkaskade
abhängigen Gene nicht exprimiert werden. Bei wt ws müßte in den Blüten Jasmonsäure
vorhanden sein und somit auch Banden zu sehen sein, zumindest für MBP, VSP und OPR1,
von denen man weiß, daß sie in der Blüte exprimiert werden (Capella et al. 2001, Benedetti et
al. 1995, Biesgen and Weiler 1999), was aber nicht der Fall war. Die Ursache ist ungeklärt. Es
könnte an einem Expressionslevel liegen, welches zu niedrig ist, um im Vergleich zum
Expressionslevel des Elongation Factors noch detektierbar zu sein. Wahrscheinlicher ist aber,
daß es an einem technischen Problem lag, beispielsweise daß die Primer nicht an ihre
Zielsequenz gebunden haben, denn in den Spuren, die zur Kontrolle 1 gehören, bei der die
PCR auf Wildtyp-DNA gemacht worden war, konnte nur bei den Primern für das Myrosinase
Binding Protein (MBP) eine schwache Bande gesehen werden, jedoch nicht für WiMBP und
OPR1. In diesen Kontrollen für Wildtyp-DNA würde man für MBP, WiMBP, OPR1 und VSP
eine Bande mit mehr oder weniger derselben Intensität wie für EF1α erwartet haben. Dies ist
für MBP, WiMBP und OPR1 nicht der Fall, deshalb kann man aus diesen Experimenten keine
Rückschlüsse ziehen. Ein weiteres Indiz für ein technisches Problem zeigt sich, da in der Spur
für w8 ebenfalls keine Banden gefunden werden konnten, obwohl nach Verwundung
eigentlich Jasmonsäure vorhanden ist, und diese Gene wundinduzierbar sind. Die Negativ-
kontrolle enthält keine cDNA und zeigt, daß im Mastermix keine Kontamination aufgetreten
ist.
Bei allen ausgeführten PCRs auf cDNA wurden zusätzlich zum Marker die Primer für den
Elongationsfaktor zugegeben. Für den Elongationsfaktor müssen überall, außer bei der
Negativkontrolle, Banden gefunden werden, da dieser ubiquitär vorkommt. Dies dient als
Kontrolle dafür, daß die PCR prinzipiell erfolgreich und die gleiche cDNA-Menge verwen-
det worden war. Für die verwendeten Primerkombinationen wurde zuvor eine gradient-PCR
im Bereich von 51°C bis 61°C ausgeführt, um den optimalen Temperaturbereich festzustellen,
der bei 57°C lag.
3 Resultate 71 __________________________________________________________________________
Die Bande, die durch den Einsatz von VSP2 entstehen kann, hat eine Länge von 858 bp, wenn
sie aus cDNA entsteht, und hätte eine Länge von 1192 bp, wenn es sich um eine DNA-
Kontamination handeln würde. Bei der PCR mit dem VSP2-Marker wurde diese 858 bp-
Bande bei den Blüten vom Suppressor 18 und vom Suppressor 22 gefunden, außerdem mit
einem sehr niedrigen Expressionslevel beim Suppressor 24. Bei den Suppressoren 10, 17.1
und 21.2 wurde diese Bande nicht gefunden. Bei den Blättern waren ebenfalls keine VSP2-
Banden zu finden, auch nicht bei Suppressor 18 und 22.
Für alle anderen Marker, die getestet wurden, konnte sowohl bei den Blüten als auch bei den
Blättern keine Expression gezeigt werden, vermutlich wegen des zuvor erwähnten tech-
nischen Problems.
Die RT-PCR zeigt, daß nur der streng jasmonsäureabhängige Marker VSP2 angeschaltet ist
und nur in den Blüten, aber nicht in den Blättern, und zwar bei den Suppressoren und nicht in
opr3 und im Wildtyp. Dies ist bei drei Suppressoren der Fall, bei den anderen ist VSP2 nicht
angeschaltet. Dies weist darauf hin, daß die beiden Suppressoren 18 und 22, und in geringe-
rem Ausmaß auch Suppressor 24, VSP2 konstitutiv exprimieren. Bei der cev-Mutante
(constitutive expression of VSP) konnte diese Expression umgekehrt in Blättern, aber nicht in
Blüten beobachtet werden (Ellis and Turner 2001), was die Vermutung nahelegt, daß die
Signalkaskade sich aufzweigt und in der cev-Mutanten eine Mutation im Zweig für die VSP-
Expression in Blättern aufweist, wohingegen unsere Mutation im Zweig für die VSP-
Expression in Blüten aufweist.
Bei den restlichen Suppressoren ist diese „Jasmonsäure“signalkaskade nicht konstitutiv
aktiviert, die beobachtete Fertilität muß also wahrscheinlich eine andere Ursache haben.
3 Resultate 72 __________________________________________________________________________ Northern Blot Der letzte Marker, den wir getestet haben, PDF1.2, ist als wundinduzierbar bekannt, durch
Jasmonsäure oder OPDA. Hier sollte mittels Northern Blot überprüft werden, ob es in den
Suppressoren zu einer konstitutiven Expression dieses Verwundungsmarkers kommt.
Abb. 19: Northern Blot mit Blüten-RNA der Suppressoren 10, 17.1, 18, 21.2, 22 und 24 sowie von opr3 und wt ws,
außerdem von Blättern jasmonsäurebehandelter wt ws- und opr3-Pflanzen. Die auf Nitrocellulose überführte RNA wurde mit
25 µg radioaktiv markierter PDF1.2-Sonde hybridisiert.
Der Northern Blot für PDF1.2 wurde nur für Blüten-RNA ausgeführt, da diese aufgrund der
vorherigen PCR mit dem VSP-Marker am vielversprechendsten zu sein schien. Dennoch
waren keine PDF1.2-Banden zu sehen (s. Abb. 19). Da die beiden Positivkontrollen, die vor
der RNA-Extraktion mit Jasmonsäure besprüht worden waren, Banden aufwiesen, kann davon
ausgegangen werden, daß der Versuch prinzipiell funktioniert hat. Wir können deshalb die
Schlußfolgerung ziehen, daß die Suppressoren die Wundreaktionsgene nicht konstitutiv
exprimieren und somit die Wundreaktion in den Suppressoren nicht „angeschaltet“ ist.
sup 10
sup 17.1
sup 18
sup 21.2
sup 22
sup 24
opr 3 wt ws wt ws + JA
opr 3 + JA
4 Diskussion 73 __________________________________________________________________________
Kapitel 4 Diskussion Die Nullmutation in OPR3 verhindert die Akkumulation von Jasmonsäure in Arabidopsis, die
ihrerseits für den männlich sterilen Phänotyp verantwortlich ist, der in den mutierten Pflanzen
beobachtet wird (Sanders et al. 2000, Stintzi and Browse 2000). Obwohl Jasmonsäure auch
für die pflanzlichen Verteidigungsmechanismen ein kritischer Regulator ist (Review: Berger
2002), wird in opr3 die Fähigkeit, sich gegen Alternaria brassicicola und Bradysia impatiens
zu verteidigen, nicht beeinträchtigt. Man nimmt an, daß OPDA, welches die Verteidigungs-
gene induzieren kann, Jasmonsäure ersetzen kann, wenn es darum geht, Pflanzen vor
Insektenfraß und necrotrophen Pilzen zu schützen (Stintzi et al. 2001).
Der männlich sterile Phänotyp in opr3 ist pleiotroph und beinhaltet eine reduzierte Ver-
längerung des Antherenfilaments während des Blühens, eine Verspätung des Öffnens der
Antheren, so daß die Pollen nicht freigesetzt werden können, außerdem ist der größte Teil des
Pollens nicht funktionsfähig (Stintzi and Browse 2000). Wie Jasmonsäure all diese Prozesse
reguliert ist weitestgehend noch unbekannt, außer im Hinblick auf COI1, welches ein Gen in
der Jasmonsäure-Signalkaskade ist, das alle Reaktionen auf Jasmonsäure kontrolliert, die
zuvor genannt worden sind (Review: Turner et al. 2002).
4 Diskussion 74 __________________________________________________________________________
Um die Jasmonsäuresignalkaskade weiter aufzufächern, haben wir eine genetische An-
näherung unternommen, indem wir auf genetische Suppressoren von opr3 gescreent haben, in
denen trotz fehlender Jasmonsäure die Fertilität wiedererlangt worden ist. Ein ungesättigter
Screen mit 100.000 EMS-mutagenisierten opr3-Samen führte zu ca. 50.000 lebensfähigen
M1-Pflanzen, bei denen wir sechs unabhängige Suppressoren in der M2-Generation
identifizierten. Die Fertilität, gemessen an der Menge der pro Pflanze produzierten Samen,
war für alle Suppressoren ungefähr gleichwertig mit der Samenproduktion beim Wildtyp,
obwohl die Werte der in vitro Pollenkeimungsraten ein breiteres Spektrum zeigten (s.
Resultate).
Die Abwesenheit von 3R,7S Jasmonsäure wurde für zwei Suppressoren nachgewiesen (sup 10
und 22; A. Stintzi, unveröffentlicht) und für die anderen vier Suppressoren erwartet, da es
unwahrscheinlich zu sein scheint, daß EMS, welches Punktmutationen auslöst, die Funktion
des OPR3-Gens, die in der opr3-Mutante durch ein 17 kb T-DNA-Insert unterbrochen wird,
wiederherstellen könnte. Während in Arabidopsis vier weitere Isoforme von OPR existieren,
die untereinander zu mehr als 90 % identisch sind und zu 70 % identisch zu OPR3 sind, ist
deren biologisches Substrat bisher unbekannt. Es handelt sich jedenfalls nicht um 9S,13S
OPDA, welches der Vorläufer der biologisch aktiven 3R,7S Jasmonsäure ist (Review:
Schaller F 2001). Eine Analyse der Kristallstrukturen sowohl von LeOPR1 (Breithaupt et al.
2001) als auch von LeOPR3 (Breithaupt, Schaller, Macheroux and Clausen, Manuskript in
Vorbereitung) zeigt für beide Enzyme eine α8β8-Faßstruktur, in der die Substratbindestelle aus
einem großen, zentralen, hydrophoben Tunnel und einem engen Hohlraum oberhalb des „si
face“ von FMN besteht.
4 Diskussion 75 __________________________________________________________________________
Substrate von OPR1 weisen charakteristischerweise eine α,β ungesättigte Carbonyl-
komponente auf, wie sie auch in OPDA vorkommt. Die Länge und Stereochemie der
Seitenketten schliessen 9S,13S OPDA als Substrat von OPR1 aus. Man könnte sich
vorstellen, daß die Fertilität in den Suppressoren, deren Jasmonsäuregehalt bisher noch nicht
gemessen wurde, dadurch zustande gekommen sein mag, daß in einer der OPR-Isoformen
eine EMS-induzierte Veränderung der Substratspezifität auftrat, durch die dieses Isoform
9S,13S OPDA als Substrat akzeptieren könnte. Selbst wenn aber eine Veränderung der
Substratspezifität für eines der zusätzlich vorhandenen OPRs theoretisch möglich wäre, würde
daraus nicht notwendigerweise auch die Jasmonsäuresynthese resultieren. Sowohl OPR3 als
auch die Enzyme für die β-Oxidation, die für die Verkürzung der octanoyl-Seitenkette von
OPC:8 verantwortlich sind, sind peroxisomale Proteine, während OPR1, 2 und vermutlich
auch 4 und 5 cytosolische Proteine sind (Strassner et al. 2002). Daher würde eine
unterschiedliche Kompartimentierung nicht zulassen, daß die Jasmonsäurebiosynthese über
das OPC:8-Stadium hinausginge. Ein anderer limitierender Faktor dieses Szenarios könnte die
Verfügbarkeit des Substrats sein. 9S,13S OPDA wird im Chloroplasten synthetisiert (Review:
Schaller F 2001), wird aber im Peroxisom benötigt, um von OPR3 zu OPC:8 reduziert zu
werden. Bisher ist noch nicht bekannt, wie OPDA von einem Kompartiment zum anderen
gelangt, und ob der Transfer einen cytoplasmischen Schritt beinhaltet. Allerdings kann man
annehmen, daß OPDA nicht frei durch biologische Membranen diffundiert. Die minimale
Voraussetzung für die Bewegung wäre die Aktivierung in Form eines CoA-Thioesters durch
ein acyl-aktivierendes Enzym. Eine Familie von 63 solcher Enzyme wurde in Arabidopsis
identifiziert (Shockey et al. 2003), und eines davon, welches den Locus für die
Jasmonatantwort (JAR1) definiert, ist in der Lage, Jasmonsäure zu adenylieren, ist aber
inaktiv gegenüber OPDA (Staswick et al. 2002). OPDA könnte ein Substrat für ein
verwandtes Mitglied dieser Familie sein.
4 Diskussion 76 __________________________________________________________________________
Vorausgegangene Arbeiten zeigten, daß 4,5 Didehydroxy-Jasmonat die Fertilität der opr3-
Mutante wiederherstellen kann, und Spuren dieser Substanz wurden einmal in einem der
Suppressoren (sup 10) beobachtet (A. Stintzi, unpublished). Dieses Analogon von Jasmon-
säure kann im Wildtyp oder in opr3 nicht detektiert werden (Stintzi et al. 2001), sollte es aber
vorhanden sein, würde dies vermutlich durch β-Oxidation von OPDA zustande kommen, vor
dem Reduktionsschritt an Position 9, 10. Zu zeigen, ob 4,5 Didehydroxy-Jasmonat für die
wiedererlangte Fertilität in Suppressor 10 verantwortlich ist, wäre möglich, indem man die
Akkumulation von OPDA in der Pflanze verhindert. Dies wird zukünftig mit Hilfe einer
Kreuzung dieses Suppressors mit einer aos/opr3-Doppelmutante getestet werden, in welcher
der Octadecanoid-Pathway nach der 13-Hydroperoxylinolensäure unterbrochen ist.
Vermutet man die Anwesenheit von 4,5 Didehydrojasmonat in Suppressor 10, so ist es pro-
blematisch, daß dieser Suppressor einen rezessiven Phänotyp hat und man würde erwarten,
daß eine Veränderung in der „Proteinspezifität“ zu einer dominanten Mutation führt. Eine
Möglichkeit, die Anwesenheit von 4,5 Didehydrojasmonat mit einem rezessiven Suppressor
in Einklang zu bringen, wäre die Vorstellung einer Inaktivierung eines negativen Regulators,
der den Transport von OPDA zum Peroxisom einschränkt.
Die OPDA-Abhängigkeit der wiedererlangten Fertilität in den Suppressoren kann auch
getestet werden, indem man die Expression von molekularen Markern überprüft, die spezi-
fisch von OPDA hochreguliert werden. OPR1 ist einer davon und wird COI1-unabhängig von
OPDA spezifisch induziert, aber nicht von Jasmonsäure. Unser nicht gelungenes RT-PCR-
Experiment mit dem OPR1-Marker erlaubte uns allerdings nicht, in dieser Hinsicht
irgendwelche Schlüsse zu ziehen.
4 Diskussion 77 __________________________________________________________________________
Wie im Kapitel Resultate gezeigt wurde, haben wir auch erfolgreich auf die Akkumulation
des jasmonsäureabhängigen (aber nicht OPDA-abhängigen) Markers VSP2 getestet. Dieses
Gen wurde in allen dominanten Suppressoren, die wir charakterisiert haben, konstitutiv
exprimiert (bei Suppressor 24 allerdings mit einem sehr niedrigen Expressionslevel); bei den
rezessiven Suppressoren dagegen nicht.
Wie bereits zuvor erwähnt, könnte ein dominanter Suppressor durch eine qualitative Verän-
derung eines Proteins zustande kommen, oder durch eine konstitutive Expression eines
positiven Regulators in einer Signalkaskade. Wir bevorzugen im Falle unseres dominanten
Suppressors die letztere Hypothese, weil die konstitutive Expression von VSP gewebe-
spezifisch ist (Expression in Blüten, nicht in Blättern). Und wir nehmen nicht an, daß eine
qualitative Veränderung (beim Transport oder bei der β-Oxidation) in einer blüten-
spezifischen Expression von VSP2 resultieren würde.
Außer von Jasmonsäure weiß man noch von Ethylen, daß es VSP2 induziert (x) und in die
Entwicklung von Antheren und Pollen involviert ist (x). Und wie bereits in der Einleitung
erwähnt wurde, sind Signalkaskaden keine linearen „Autobahnen“, die eine Antwort auf ein
spezifisches Input liefern, sondern es existieren Verknüpfungen der Signalkaskaden
untereinander, die man gerade erst zu verstehen beginnt. Es hat sich herausgestellt, daß die
lineare, zweidimensionale Darstellung von Signalkaskaden häufig unzureichend ist. Zwischen
den unzähligen Komponenten, die im Hormonsystem der Pflanze vertreten sind, gibt es so
viele Interaktionen, daß man sich dieses System eher wie ein Netz im dreidimensionalen
Raum vorstellen sollte, bei dem jede Substanz die Möglichkeit hat, mit verschiedenen anderen
Substanzen in Kontakt zu treten. Durch dieses Netz könnten Informationen eventuell in alle
Richtungen weitergegeben werden (Gazzarrini und McCourt, 2003).
4 Diskussion 78 __________________________________________________________________________
Wir können nur hoffen, daß es uns in der Zukunft gelingen wird, Modelle zu entwickeln, die
diesen Vorgängen gerecht werden. Möglicherweise könnten einige der Suppressoren eine
Veränderung an einem kritischen Knotenpunkt zwischen den Signalkaskaden aufweisen.
„Positional cloning“ der in den Suppressoren betroffenen Gene wird uns zu weiteren
interessanten Schlußfolgerungen verhelfen.
5 Literaturverzeichnis 79 __________________________________________________________________________
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Danksagung Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Professor Schaller für die Vergabe eines interessanten Themas und für die Möglichkeit, meine Arbeit unter den hervorragenden Bedingungen durchführen zu können, die mir im Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen zur Verfügung gestellt wurden. Meiner Betreuerin Annick Stintzi möchte ich für Vermittlung weitreichender fachlicher Erkenntnisse danken sowie für ihre Bemühungen, mir stets hilfreich zur Seite zu stehen. Desweiteren gilt mein Dank allen anderen Mitarbeitern des Instituts für die vielen hilfreichen Tips und Anregungen, Hilfestellungen und die interessanten Fachgespräche. Den Mitarbeiterinnen des Gewächshauses danke ich für die gute, oft zeitaufwändige Pflege meiner vielen, vielen Pflanzen und für ihre Gastfreundschaft. Vielen Dank auch an diejenigen Familienmitglieder und Freunde, die mir mit moralischer und sonstiger Unterstützung oft sehr viel Rückhalt geboten haben, besonders an meine Tochter Vlora, die sich in einer entbehrungsreichen Zeit rücksichtsvoll und selbständig verhalten hat und so mein Studium mitgetragen hat.