Genetischer Modellorganismus

S. cerevisiae

Literatur •  Fred Sherman (2002): Getting started with yeast. Meth. Enzymol. 350,

3-41.#•  Fred Sherman: An Introduction to the Genetics and Molecular Biology of the

Yeast Saccharomyces cerevisiae. (2001) http://dbb.urmc.rochester.edu/labs/sherman_f/yeast/index.html#

•  Budding yeast for budding geneticists: A primer on the# Saccharomyces cerevisiae model system. Duina AA, # Miller ME, Keeney JB (2014). Genetics 197, 33-48#- Saccharomyces Genome Database (SGD): #

http://www.yeastgenome.org/#- Overview of diverse genome-wide technologies: Yeast-based functional genomics and proteomics technologies: the first 15 years and beyond. B. Suter, D. Auerbach and I. Stagler, Biotechniques 40: 625-642 (2006).

Teil I: Grundlagen der

Hefegenetik & -molekularbiologie

Hefe: Grösse & Zellform # # Haploid cell #Diploid cell#

Volume (mm3) # #70 # 120#Diameter (mm) # # 4 # 5-6#

Wieso benutzen wir Hefe als Modellorganismus?

•  nicht pathogen #•  schnelles Wachstum#•  wachsen als Einzelzellen; erleichtert Replika-Plattierung

und Isolation von Mutanten#•  hochflexibles DNA Transformationssystem#•  stabile haploide & diploide Zellen erleichtern genetische

Analyse#•  kleines Genom (1.2 x 107 Basenpaare), nur ~3.5x > E.coli!•  sehr aktive homologe Rekombination#•  2-Hybrid, YACs machen Hefe zu einem wertvollen

Werkzeug, um Gene/Proteine/Funktionen aus anderen Organismen zu untersuchen

einfache Kultivierung - wie Bakterien!

Wachstumsmedien für Hefe:#Vollmedium

Wachstumsmedien für Hefe:#Minimalmedium

Wachstumsmedien für Hefe:#Supplemente für Minimalmedium

Hefe-Lebenszyklus

Haploide Hefen existieren in zwei Mating-Typen: #

MATa oder MATα. # “Wilde” Hefen (aus der

Natur) sind homothallisch, d.h. sie wechseln in der haploiden Phase schnell den Mating-Typ und verschmelzen zu Diploiden.#

D.h. nur die diploide Phase im natürlichen Lebenszyklus ist stabil.#

Hefelebenszyklus (cont.)#

Laborstämme sind heterothallisch durch eine Mutation im Gen für HO Recombinase. #

Diese Stämme sind sowohl als Haploide als auch als Diploide stabil. #

Der stabile haploide Zustand ist essentiell dafür, dass Hefe als Modellorganismus für Genetikexperimente

dienen kann.

Änderung des Mating-Typs in Hefe HMLα HMRa

Mating Type (MAT) Locus

α

Transposition mediated by HO recombinase

HMLα HMRa a

Cassette Replaced

(Silent)

(Silent) (Silent)

(Silent)

•  Homothallische Wildtyp-Hefen können schnell den Mating-Typ wechseln, führt zu schnellem Mating und Bildung diploider Zellen (SCHLECHT für genetische Experimente!)#

•  In heterothallischen Hefen ist die HO Recombinase defekt. Das verhindert den Mating-Typ Wechsel, so dass die Zellen im jeweiligen Mating-Typ als Haploide stabil sind (GUT für genetische Experimente!)#

Hefe Wachstum & Mating

Sporulationsmedium für Hefe:

Dissektionsmikroskop #für Tetraden

Tetraden-Dissektion Zellwand des Ascus muss verdaut werden, #so dass die Sporen wie bei einem Kleeblatt#nebeinanderlieger, aber nicht auseinander#fallen

Tetraden-Dissektion

Tetraden-Dissektion: Resultat

Isolation von temperatur-sensitiven (ts) Mutanten, um Funktion essentieller Gene zu

untersuchen#

Beispiel: #Genetische Analyse des sekretorischen Weges

in Hefe

Genetische Analyse des sekretorischen Weges in Hefe

Nobelpreis Randy Schekman, 2013

Klonierung durch Komplementation#

Gen/Protein-Nomenklatur in Hefe

•  Gen: YFG1 (Your Favorite Gene 1)#•  dominantes Allel: YFG1-1!•  recessives Allel: yfg1-2!•  Insertion: yfg1::LEU2!•  Deletion: yfg1∆1#•  Protein: Yfg1 or Yfg1p#•  systematischer Name: YBR142W

DNA Transformation & Rekombination

•  extrem effizient in Hefe (>104 Transformanten/µg DNA) #•  sowohl lineare als auch circuläre DNA kann eingeführt

und ins Genom rekombiniert werden#•  selbstreplizierende Plasmide können ebenfalls

eingeführt werden#•  es gibt mehrere Transformationsmöglichkeiten:## #Transformation von Spheroplasten## #Transformation mit Lithiumsalzen## #Transformation durch Elektroporation#

Gen knock out & Deletion (non-essentielle Gene)#

knock out: Transformation mit auxotrophem Markergen mit flankierendenRegionen homolog zum Zielgen Selektion gegen das URA3 Gen führt zur Deletion

5-FOA Selektion von Ura3- Zellen#

•  Das URA3 Gen ist ein häufig benutzter selektierbarer Marker auf Hefe-Plasmiden#•  Das URA3 Gen kodiert für Orotidine 5´- Phosphat

Decarboxylase (für Uracilbiosynthese).#•  5-fluoroorotic acid (5-FOA) wird in das toxische 5-

Fluorouracil umgesetzt durch Ura3 Protein.#•  Deshalb werden Ura+ Zellen durch 5-FOA getötet,

während Ura- Zellen 5-FOA resistent sind. #

5-FOA

Ura+ tot :-(

Ura- lebend :-)

Components of common yeast plasmid vectors

YIp YEp YCp

Plasmid features

E. coli genes or segments

     ori, bla; tet + + +

Yeast genes or segments

     URA3; HIS3; LEU2; TRP1; etc. + + +

2 µm-ori - + -

ARS1; ARS2; ARS3; etc. - - +

CEN3; CEN4; CEN11; etc. - - +

Host (yeast) markers

     ura3-52; his3-Δ1; leu2-Δ1; etc. + + +

Stability ++ + +

Hefe-Plasmide

Funktion von ARS & Centromer Sequenzen

Identifikation von Autonomous Replicating Sequences (ARS)#

Identifikation von Telomeren

Yeast Artificial Chromosomes (YACs)#

Vector Type # #Length of DNA (kb)#Plasmid # # #20#Phage λ # # #25#Cosmid # # #45#P1 vector # # #100#BAC # # # #200#YAC # # # #1000#

Maximum Capacity of Vectors#

ARS, CEN, und TEL Elemente ermöglichen die stabile Gegenwart extrem langer, linearer DNA Fragmente in Hefe. Diese Konstrukte heissen Yeast Artificial Chromosomes (YACs). DNA Fragmente bis 1 Million Basenpaare können als YACs propagiert werden.#

Teil II: Hefe-basierte funktionelle Genomik und Proteomik

Das Hefe-Genomprojekt#•  Hefegenom sequenziert in 1996 (1.2 x 107 bp)#•  16 Chromosomen (von 230k bp bis 2,352k bp)#•  ~6,400 ORFs #•  nur ~4% der Hefegene hat Introns (wenn, meist nur ein

kleines Intron zu Beginn der kodierenden Sequenz) #•  kompaktes Genom, Gene repräsentieren ~70% der

Gesamtsequenz#•  kaum repetitive DNA#

Hefe-Proteinfunktion

(2000)

Fortschritt in der Charakterisierung des Hefegenoms

Hefe-Proteinfunktion •  2014: 5076 verifizierte offene Leserahmen #•  # 745 nicht verifizierte (d.h. unklar, ob für Protein#

# # # # #kodieren)#ausserdem: ursprünglich wurden kleine Proteine # (weniger als 100aa) nicht berücksichtigt, #

# die scheinen aber durchaus eine Rolle zu spielen#

Genomweite Analyse von Hefe-Genfunktion •  Deletionsanalyse: ## #Knock out jedes nicht-essentiellen Hefegens## #Analyse der phänotypischen Konsequencen jedes #

k.o.s unter verschiedenen Wachstumsbedingungen## #komplettes k.o-Set (4800 for haploid set) # #

käuflich für $1500#•  Protein-Überexpression:## #Analyse der Überexpression jedes einzelnen Gens

im Hefegenom.#•  Genomweite Analyse der Genexpression:## #Microarrays ('Gen-Chips') um Transkriptionsregulation #

jedes Gens unter spezifischen Bedingungen zu # analysieren## #ß-galactosidase-Fusionen um Genexpression zu #

detektieren#

#Proteinlokalisierung:##Epitop-Markierungen und GFP-Fusionen zu jedem Hefeprotein im Genom um subzelluläre Lokalisation zu untersuchen #

#Hefeprotein-Interaktionen: ## 2-Hybrid-Analyse und Glutathion-S-Transferase (GST) Fusionen um die Interaktionspartner jedes einzelnen Proteins zu identifizieren#

##

Genomweite Analyse von Hefe-Genfunktion

Genomweite #GFP-

Fusionen #"Transposon hopping" in eine genomische Library von Hefe in E. coli

GFP-markierte Proteine in Hefe!

GFP-markierte Proteine in Hefe!

Genomeweite LacZ-Fusionen & Epitop- Markierungen

durch Transposon - Mutagenese#

Inaktivierung oder Deletion zweier Gene (rot und blau) in redundanten Funktionen führt zum Zelltod, Inaktivierung eines einzelnen Genes (rot oder blau) ist ohne Effekt.

Synthetische Lethalität

Ein haploider Stamm mit einer spezifischen Mutation (rot) wird kombiniert mit der Deletions-Kollektion mit dem passenden Mating Typ (blau). Nach dem Mating werden die Diploiden sporuliert und die haploiden Nachkommen analysiert.#

#

Im Falle einer synthetisch lethalen Interaktion ist die Doppelmutante nicht lebensfähig.

Synthetisch lethaler#Screen #

Genetisches Interaktionsnetzwerk, das synthetisch lethale Interaktionen zeigt, gefunden durch SGA analysis. 291 interactions & 204 genes shown [Science 294: 2364 (2001)].

Resultate eines Synthetic Genetic Array (SGA)

(A) Fänger: Fängerprotein X fusioniert an DNA Bindedomäne (DBD) eines Transkriptionsfaktors. When allein exprimiert, aktiviert der Fänger keine Transkription, denn ihm fehlt die Transkriptions-Aktivatordomäne (AD)

(B) Beute: ein zweites Protein Y fusioniert an die Transkriptions-Aktivatordomäne (AD). Die AD-Y Fusion alleine aktiviert keine Transkription, denn es fehlt die DNA Bindedomäne (DBD).

(C) Co-Expression der interagierenden DBD-X und AD-Y Fusionsproteine rekonstituiert einen funktionierenden Transkriptionsaktivator. Das Reportergen wird aktiviert, und Protein-Protein Interaktion zwischen X und Y wird gemessen an Aktivität des Reporters. Reportergene: auxotrophe Marker(HIS3, ADE2), Farbmarker lacZ.

Hefe 2-Hybrid System

Anwendungen des 2-Hybrid Assays#

•  Test der Assoziation zweier Proteine, deren Interaktion aufgrund anderer Daten vermutet wird. #

•  Definition der Domänen oder Aminosäuren die kritisch sind für die Interaktion zweier Proteine. #

•  Screening von Libraries für Proteine, die mit einem spezifischen Protein interagieren.#

Grosse 2-Hybrid Screens in Hefe mit Proteinen anderer Organismen#

(A)  Fänger: DNA-Bindedomäne fusioniert an ein Protein, das ein kleines Molekül binden kann, z. B. Dihyrofolat-Reductase (DHFR). Zusätzlich exprimiert jede Zelle ein Beute-Protein einer DNA Library fusioniert an eine Aktivatordomäne (AD).

(B)  Ein Hybrid aus einem chemischen Molekül und Methotrexat wird zugegeben, welches die Plasmamembran durchdring und an DBD-DHFR über Methotrexat bindet. Der zweite Teil des Hybrids bleibt zugänglich.#

(C)  Wenn AD-Beuteprotein an den zweiten Teil des Hybrids binden kann, wird ein funktioneller Transkriptionsfaktor rekonstituiert, und das Reportergen aktiviert.

Variation1: 2-Hybrid Screen mit kleinen Molekülen#

(A) Fänger: Integrales Membranprotein X als Fusion zur C-terminalen Hälfte von Ubiquitin (C), gefolgt von einem Transkriptionsfaktor (L). Fusion des Transkriptionsfaktor an das Membranprotein verhindert dessen Transport in den Zellkern und Aktivierung des Reportergens. Beute: Interagierendes Protein Y fusioniert an die N-terminale Hälfte von Ubiquitin (N). #

(B) Wenn Beute & Fänger interagieren, reassoziieren die N- und C-terminalen Ubiquitinhälften und bilden Ubiquitin. Dieses wird von Ubiquitin-spezifischen Proteasen (UBP) im Zytosol erkannt und abgeschnitten. Dies setzt den Transkriptionsfaktor frei, der nun in den Zellkern wandern kann, und dort das Reportergen aktiviert.

Das 2-Hybridsystem für Membranproteine#

Resourcen zur Charakterisierung eines Gens in Hefe#

Teil III: Schlussbemerkungen

Erbmaterial, das nicht den Mendelschen Regeln folgt:#

•  Mitochondrien-Genom#–  Mitochondriale DNA ~76kbp#–  vererbt als zytoplasmatisches Element#–  Hefe Mito-Genom enthält 9 Gene#

•  Prionen#–  infektiöse Proteine, die als zytoplasmatische,

infektöse Elemente weitergegeben werden#–  In Hefe [PSI+] Faktor, eine veränderte Form des

Sup35 Proteins.#–  Prionen in Säugern: Mad Cow Disease, Creutzfeld-

Jacob disease, Kuru.

Hefe als Modellorganismus für fundamentale eukaryotische Prozesse

•  Zellzyklus ##Lee Hartwell, 2001 Nobelpreis für Physiologie & Medizin#

Zusammenbau der mitotischen Spindel hängt ab von beendeter DNA Synthese#–  START Konzept#–  Identifizierung von Cdc28, der ersten cyclin-abhängigen Kinase#–  weitere wesentliche Zellzykluskonzepte, Krebsentstehung, etc.#

•  Sekretorischer Weg für Proteine ##Randy Schekman, 2013 Nobelpreis#

–  Identifikation & Charakterisierung von Dutzenden von Genen involviert in Proteintransport durch den sekretorischen Weg#

•  DNA Synthese, Transkription, Translation, Splicing, Signaltransduktion, Autophagy, etc.#

Beispiele für Prozesse, die man nicht in Hefe untersuchen kann

•  MicroRNAs gibt es nicht in Hefe (auch keinen RISC Komplex), d.h. microRNA Funktion kann nicht in Hefe untersucht werden, und silencing RNAs (siRNAs) können in Hefe nicht benutzt werden.#

•  Hefe haben keine komplexen entwicklungsbiologischen Programme, und bilden keine komplexen Strukturen wie Organe