identificação de pneumocystis jirovecii através de métodos...
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CRISTINA RODRIGUES DOS SANTOS
Identificação de Pneumocystis jirovecii através de métodos
moleculares em amostras de pacientes do Hospital de Clínicas da
UNICAMP
CAMPINAS
2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Médicas
CRISTINA RODRIGUES DOS SANTOS
Identificação de Pneumocystis jirovecii através de métodos
moleculares em amostras de pacientes do Hospital de Clínicas da
UNICAMP
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas
da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos
exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências, área de
concentração Clínica Médica.
Orientador: Profª. Dr. Francisco Hideo Aoki
Coorientadora: Dra. Ângela Maria de Assis
Este exemplar corresponde à versão
final da dissertação de mestrado defendida pela
aluna Cristina Rodrigues dos Santos e orientada pelo
Prof. Dr. Francisco Hideo Aoki
CAMPINAS
2015
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RESUMO
O Pneumocystis jirovecii é um fungo ascomiceto que pode causar pneumonia
(PPC) em indivíduos imunossuprimidos e eventualmente em imunocompetentes.
Os métodos laboratoriais de baixo custo para detecção ainda é a coloração em
lâmina. Os métodos moleculares são considerados mais eficientes e tem oferecido
alternativas para o entendimento da biologia e da doença causada por esse
microrganismo. O objetivo desse estudo foi detectar a presença de Pneumocystis
jirovecii em pacientes com doença pulmonar. O método adotado foi a técnica de
coloração de lâmina com azul de toluidina para detecção de cistos, PCR para
detecção do fragmento mitocondrial pAZ102-H/E, Nested PCR com primers
internos pAZ102-X/Y e sequenciamento pelo método de Sanger para detecção de
alterações moleculares na região genômica estudada. Foram coletadas 139
amostras, sendo 102 de lavado broncoalveolar (LBA), 7 de escarro, 10 amostras
de sangue periférico (fracionadas em hemácias/leucócitos e plasma) e 10
amostras de soro. Nos resultados da coloração pela técnica de azul de toluidina, 2
amostras de escarro e 1 de LBA foram positivas. Através dos métodos
moleculares, 6 amostras foram positivas na primeira PCR e 91 amostras foram
positivas pela Nested PCR. Os fragmentos pAZ102-X de 51 amostras foram
sequenciadas, 18 amostras apresentaram mutação nos seguintes códon/posição
4406/13217, 4419/13257, 4431/13294, 4439/13316, 4440/13321, 4446/13338,
4452/13357, 4456/13367 e 4457/13371. Os pacientes que apresentaram essas
alterações tinham um perfil com doenças pulmonares ou fatores de risco
associados à infecção por P. jirovecii. Como a detecção de P. jirovecii, diagnóstico
e prevenção de PPC são ligadas a história clínica do paciente, os avanços
moleculares podem ser um caminho para diagnóstico de PPC, diferenciando essa
pneumonia dos casos de colonização por esse fungo.
Palavras-chaves: Pneumocystis jirovecii, Infecções oportunistas, Reação em
cadeia da polimerase.
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ABSTRACT
Pneumocystis jirovecii is an ascomycete fungus that can cause pneumonia (PCP)
in immunocompromised individuals and possibly in immunocompetent. The low
cost of laboratory methods for detection is with conventional staining methods.
Molecular methods are considered more efficient and have offered alternatives to
the understanding of biology and disease caused by this organism. The aim of this
study was to detect the target DNA fragment (mtLSUrRNA) of P. jirovecii in
patients with lung disease. We compared the staining technique with molecular
methods using toluidine blue for microscopy and "in house" DNA extraction, PCR
and Nested PCR for molecular detection and sequencing by the Sanger method to
detect molecular alterations in the genomic region studied. It was analyzed 139
samples, such as, 102 bronchoalveolar lavage (BAL), 7 sputum, 10 samples of
peripheral blood (fractionated in red blood cells / leukocytes and plasma) and 10
serum samples. The results of the toluidine blue staining technique, two sputum
samples and 1 BAL were positive. Through molecular methods, 6 samples were
positive in the first PCR and 91 samples were positive by Nested PCR. The
pAZ102-X fragments of 51 samples were sequenced, 18 samples had mutations in
codon/position 4406/13217, 4419/13257, 4431/13294, 4439/13316, 4440/13321,
4446/13338, 4452/13357, 4456 / 13367 and 4457/13371. Patients who presented
these alterations had a profile with lung diseases or risk factors associated with
infection by P. jirovecii. As the detection of P. jirovecii, diagnosis and prevention of
PCP are linked to clinical history, molecular advances can be a way for diagnosis
of PCP, differentiating this pneumonia cases of colonization by the fungus.
Keywords: Pneumocystis jirovecii, Opportunistic infections, Polymerase chain
reaction.
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SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................ vii
ABSTRACT ............................................................................................................. ix
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
1.1 Histórico...................................................................................................... 1
1.2 Taxonomia .................................................................................................. 5
1.3 Epidemiologia ............................................................................................. 7
1.3.1 Organismo e microbiologia .................................................................... 7
1.3.2 Ciclo de vida......................................................................................... 9
1.3.3 Transmissão, prevalência e incidência ................................................ 11
1.3.4 Distribuição geográfica ....................................................................... 14
1.4 Manifestações clínicas ............................................................................... 15
1.5 Tratamento e profilaxia .............................................................................. 19
1.6 Métodos de diagnóstico laboratoriais ......................................................... 20
1.6.1 Métodos de coloração para pesquisa de P. jirovecii ............................. 20
1.6.2 Métodos moleculares para detecção e estudo de DNA de P. jirovecii ... 24
2. OBJETIVOS..................................................................................................... 33
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 35
3.1 Local, pacientes e período. ........................................................................ 35
3.2 Critérios para inclusão dos pacientes no estudo ......................................... 35
3.3 Métodos .................................................................................................... 36
3.3.1 Coleta de amostras............................................................................. 37
3.3.2 Processamento de amostras de escarro e LBA .................................... 38
xii
3.3.3 Preparo das lâminas para coloração com azul de toluidina ................... 38
3.3.4 Leitura das lâminas............................................................................. 40
3.3.5 Protocolos para detecção molecular de P. jirovecii ............................... 40
3.4 Aspectos éticos ......................................................................................... 48
3.5 Metodologia estatística .............................................................................. 49
4. RESULTADOS................................................................................................. 51
4.1 Amostras processadas .............................................................................. 53
4.2 Coloração de lâminas com azul de toluidina ............................................... 53
4.3 Extração e quantificação de DNA ............................................................... 57
4.3.1 Controle com a beta globina ................................................................... 58
4.4 Amplificação gênica pela PCR e Nested PCR ............................................ 59
4.5 Análise da região mtLSU rRNA por sequenciamento direto ......................... 62
4.6 Perfil dos pacientes do estudo ................................................................... 66
5. DISCUSSÃO.................................................................................................... 73
6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 83
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 85
8. ANEXOS ......................................................................................................... 93
xiii
DEDICO ESTE TRABALHO...
...à minha família querida, avozinha Rita que já partiu e para
minha mãe amada, Maria José.
xiv
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a todos que contribuíram diretamente e indiretamente com a realização
desse trabalho, em especial:
À minha família querida, avozinha Rita que já partiu, deixando sua lição de amor
para toda minha vida, amo você minha avozinha. Agradeço todos os dias da
minha vida, pela minha mãe guerreira e amada, Maria José, incentivadora, sempre
ao meu lado, dando conselhos e apoiando.
Aos meus irmãos Raquel e Edivaldo, firmes na batalha, sempre. Carlão, padrasto,
sempre presente. Aos meus sobrinhos lindos, Dani, Mateus e Murilo, enchendo o
coração da tia de alegria para os dias difíceis da caminhada.
Ao meu companheiro Diego Muraca, por todo apoio emocional, moral e didático.
Ao Professor Doutor Francisco Hideo Aoki pela orientação nessa tese,
compreensão e transferência de conhecimentos.
À Dra. Ângela Maria de Assis pela coorientação, transferência de conhecimentos,
incentivo, compreensão, disposição e amizade.
À UNICAMP, corpo docente e colaboradores pela oportunidade e o privilegio que
tive em fazer este Mestrado.
À equipe do laboratório de Micologia, Profª. Dra. Angélica Zaninelli Schreiber,
Luzia Lira e o biólogo Edson A. Luz, muito obrigada pela assistência no
desenvolvimento das técnicas de coloração.
xvi
Ao Prof. Dr. Ivan Felizardo Contrera Toro e sua equipe do serviço de
Broncoscopia, que se dispuseram à coleta de amostras.
À equipe do Laboratório de Pesquisa em AIDS e do LPE- CAISM Elizabeth e
Denise, pela disponibilização do espaço para desenvolvimento do trabalho.
À minha amiga Eliana, que me ajudou em dias de tempestade, sempre presente.
Obrigada a todos, de coração!
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EPÍGRAFE
“Ninguém caminha sem aprender a caminhar, sem aprender a fazer o caminho
caminhando, refazendo e retocando o sonho pelo qual se pôs a caminhar”.
Paulo Freire.
xviii
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Imagem de microscopia eletrônica das formas do ciclo de vida do Pneumocystis (A) Fase trófica, com 1 a 4 µm de diâmetro e com uma membrana plasmática simples, com projeções filopodiais. (B) Fase cística com 8 a 10 µm de diâmetro e se caracterizam rígida parede de b-glucano, os cistos tem até 8 corpos intracísticos, que geram outras forma tróficas. (Krajicek, et al., 2009). ........................................................................ 9
Figura 2: (A) Fase assexuada: 1- formas tróficas, 2- célula haploide e 3- divisão por mitose. (B) Fase sexuada: 1- células haplóides se conjugam, formam um pré-cisto, ou zigoto (fase diplóide), inicio da divisão meiótica; 2- cisto primário com até 8 núcleos e organelas; 3- maturação, cisto maduro com 8 esporocistos; 4 – cistos tardios, com excistamento dos esporocistos gerando a forma trófica (Ruffolo, 1994)..................... 11
Figura 3: Coloração de Giemsa, à esquerda forma cística com 8 núcleos. À direita forma trófica (aumento de 400x). Imagem: Martha L. Warnock, 1999.................................. 22
Figura 4: Cistos de P. jirovecii, coloração: de azul de toluidina modificada (460x). Fonte: Gosey. 1985. .......................................................................................................... 23
Figura 5: Leitura da concentração de DNA em espectrofotômetro Nanodrop. ............ 42
Figura 6: Porcentagem das amostras processadas para detecção de P. jirovecii através de PCR, Nested PCR e/ou coloração com a azul de toluidina. .................................. 53
Figura 7: Amostras coradas com azul de toluidina, todas as amostras positivas são de pacientes com HIV/AIDS ......................................................................................... 54
Figura 8: C. albicans coradas com azul de toluidina O, com coloração de rósea (aumento de 400x). ................................................................................................................ 54
Figura 9: Lâmina negativa de LBA após coloração com azul de toluidina. ................. 55
Figura 10: Lâmina de escarro negativa após coloração com azul de toluidina. No detalhe da seta em amarelo, leveduras com brotamento, estrutura para diferenciação com cistos de P. jirovecii (aumento de 400x). ............................................................................ 55
Figura 11: Lâmina de escarro positiva, cistos de P. jirovecii, o detalhe na seta é um cisto com a parede na coloração lavanda (aumento de 1000x). ........................................ 56
Figura 12: Lâmina positiva de LBA corada com azul de toluidina. Figura A com 2 agrupamentos de cistos, 1 agrupamento com cistos nítidos com pouco muco e outro agrupamento com cistos imersos em muco com difícil definição (aumento de 400x). Figura B, Cistos, com intensa coloração lavanda, típica de P. jirovecii (aumento de 1000x). . 56
Figura 13: Histograma das concentrações de DNA encontradas nas amostras, em nanograma por microlitro (ng/µL). ............................................................................ 57
xx
Figura 14: Box plot dos valores obtidos na quantificação de DNA (representação da dispersão de dados). Primeiro quartil 39,5, mediana 71,8 e terceiro quartil 169,78. Valor mínimo 5,29 e máximo 357,64, os valores acima do máximo são considerados extremos. .............................................................................................................................. 58
Figura 15: Gel de agarose 1,5%, controle da qualidade do DNA com o fragmento genético da beta globina. Na coluna L marcador de 100pb , colunas de A-R amostras positivas para o fragmento de 268pb da beta globina. ............................................................ 59
Figura 16: PCR e Nested PCR positivas para P. jirovecii das amostras de pacientes HIV/AIDS. ............................................................................................................... 60
Figura 17: Eletroforese em gel de agarose 1,5%. L: marcador de 100pb; Colunas 1 - 4 amostras de PCR convencional para P. jirovecii. CN: controle negativo e CP: controle positivo. .................................................................................................................. 62
Figura 18: Eletroforese em gel de agarose 1,5%. L: marcador de 100pb; Colunas 1 - 9 amostras positivas de Nested PCR para P. jirovecii. CN: controle negativo e CP: controle positivo com 260pb. ................................................................................................ 62
Figura 19: Alinhamento das sequencias de P. jirovecii, primer pAZ102-X. A linha 1 de cada seção é a cepa selvagem. As linhas 20 até 95 são cepas do estudo. As setas indicam a posição do nucleotídeo substituído. Seta 1 - posição 13217 (A → C), Seta 2- 13257 (G → A), Seta 3- 13294 (T → A), Seta 4- heterozigose em 13316 (G ou A), Seta 5 -13321 (T → A), Seta 6 – 13338 (A→ G), Seta 7- 13357 (C → A), Seta 8 – 13367 (A → C) e Seta 9- 13371 (A → C). ........................................................................................ 63
Figura 20: Eletroferograma da amostra de escarro com heterozigoze na posição 13316 “R” (G ou A) ............................................................................................................ 64
Figura 21: Eletroferograma da amostra de soro sequenciada, primer pAZ-102X. Detalhe da mutação de ponto no códon 4406 “CAA”, posição 13217 (A → C). ....................... 64
Figura 22: Eletroferograma da amostra de sangue sequenciada, primer pAZ-102X. Detalhe da ausência de mutação de ponto no códon 4406 “AAA”, igual ao genótipo selvagem. ............................................................................................................... 65
Figura 23: Sintomas dos pacientes e positividade de P. jirovecii pela técnica de Nested PCR. ...................................................................................................................... 70
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Espécies de Pneumocystis e seus respectivos hospedeiros: ....................... 4
Tabela 2: Sequencia de primers que flanqueiam uma região conservada do gene da β-Globina Humana utilizados na PCR. ........................................................................ 43
Tabela 3: Sequências dos primers utilizados na PCR e Nested PCR, P. jirovecii locus mtLSU RNAr. .......................................................................................................... 46
Tabela 4: Análises realizadas .................................................................................. 52
Tabela 5: Resultado da PCR e Nested PCR para detecção do fragmento mitocondrial de P. jirovecii. .............................................................................................................. 61
Tabela 6: Mutações de P. jirovecii identificados com o primer pAZ102-X................... 66
Tabela 7: Categorias dos pacientes, perfil, comparação com a Nested PCR e coloração com azul de toluidina............................................................................................... 67
Tabela 8: Relação das doenças pulmonares dos pacientes e positividade da Nested PCR para P. jirovecii. ...................................................................................................... 68
Tabela 9: Relação dos fatores de risco dos pacientes e positividade da Nested PCR para P. jirovecii. .............................................................................................................. 69
Tabela 10: Relação das amostras sequenciadas alteradas e perfil dos pacientes. ..... 71
xxii
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS/ SIDA Síndrome da imunodeficiência adquirida
ATB Antibiótico
BAL/ LBA Lavado broncoalveolar
DHFR Diidrofolato redutase
DHPS Diidropteroato sintetase
DNA Ácido desoxirribonucleico
HAART Terapia antirretroviral de alta eficácia
HIV Vírus da imunodeficiência humana
IBCN International Code of Botanical Nomenclature
ITS Espaçador transcrito interno
LDH Lactato desidrogenase
MSG Glicoproteína maior de superfície
mtLSUrRNA Subunidade maior do RNA ribossômico
mitocondrial
mtSSUrRNA Subunidade menor do RNA ribossômico
mitocondrial
pb pares de base
PCP Pneumocystis carinii pneumonia
PCR Reação em cadeia da polimerase
PPC Pneumonia por Pneumocystis carinii
RNA Ácido ribonucleico
rpm Rotações por minuto
SAM s-adenosil metionina
SDS Dodecil sulfato de sódio
xxiv
SOD Superóxido dismutase
TMP-SMX Sulfametoxazol + trimetoprima
tRNA RNA transportador
TS timidilato sintase
UCS Upstream conserved sequence
β-tub beta tubulina
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
O Pneumocystis jirovecii (P. jirovecii), antigamente denominado
Pneumocystis carinii f. sp. hominis, é um fungo ascomiceto atípico e oportunista
que causa pneumonia grave em indivíduos com uma variedade de condições
clínicas de debilitação, principalmente em pacientes com função imunológica
comprometida. Geralmente é letal a pacientes com pneumonias associadas o
vírus da imunodeficiência humana (HIV), mas também pode acometer outros
pacientes com outros tipos de imunossupressão como sistema imune
comprometido hematologicamente, tumores malignos, receptores de órgãos
transplantados e aqueles que utilizam terapia crônica imunossupressora (1-3).
O gênero Pneumocystis representa um grande grupo de espécies de
fungos atípicos com distribuição universal e tropismo pulmonar, e cada espécie
tem uma resistência específica para um hospedeiro. Por ter características, tanto
de fungos quanto de protozoários, no decorrer de um século de sua descoberta,
houve diferentes definições, classificações, tratamento, posição taxonômica e
nomenclatura para esse organismo (1, 4).
O primeiro registro do microrganismo foi em 1909 no Brasil, em Minas
Gerais, por Carlos Chagas. Durante estudos da tripanossomíase, Chagas incubou
em cobaias, amostras pulmonares de crianças com suspeita da doença. Formas
císticas foram observadas durante as análises e Chagas conclui que se tratava de
um estágio do ciclo do tripanosoma. Por essa razão, a primeira denominação do
2
Pneumocystis foi como um cisto das fases do ciclo do Trypanosoma cruzi, um
esquizogonia (5, 6).
Logo em 1910, Antonio Carini, na época diretor do Instituto Pasteur (São
Paulo – Brasil), encontrou cistos semelhantes em pulmões de ratos infectados por
Trypanosoma lewisi. Carini enviou as amostras para o Instituto Pasteur de Paris,
onde, Alphonse Laveran e Delanoë observaram as mesmas formas císticas em
ratos não colonizados pelo tripanosoma. Eles concluíram que as formas císticas
relatadas por Chagas e Carini eram, de fato, uma nova entidade biológica
relacionada com os tripanosomas, em potencial com protozoários coccídios. Os
pesquisadores sugeriram o nome Pneumocystis carinii. “Pneumo” pelo tropismo
do parasita pelo pulmão, “cystis” por sua apresentação cística e “carinii” em
homenagem a Antonio Carini (7).
Os primeiros registros de Pneumocystis em humanos foram em 1938, na
Europa. A conclusão foi de Otto Jiroveci e sua equipe, que estudou os
microrganismos que provocaram pneumonia intersticial em prematuros e crianças
desnutridas. O mesmo tipo de agente causou uma epidemia na Europa Central
durante a Segunda Guerra Mundial. Jiroveci concluiu que o patógeno dessas
pneumonias era o Pneumocystis carinii (7).
Delanoë descreveu a estrutura do cisto através de microscopia óptica e
acreditou-se por quase 3 décadas que essa era a única forma do Pneumocystis.
Em 1942, Van der Meer e Brug publicaram as primeiras fotografias de microscopia
de luz das formas císticas como também formas tróficas, demonstrando que a
3
espécie possuía ciclo e diferentes fases de vida, semelhante aos protozoários.
Assim sendo, a primeira classificação taxonômica do Pneumocystis foi como um
protozoário (7, 8).
Com o avanço da microscopia, em 1970, Vavra e Kucera, sugeriram a
natureza fúngica do Pneumocystis a partir de análises da ultraestrutura de sua
célula. Eles evidenciaram que a formação do cisto é semelhante à formação de
um asco, como nos fungos (9). No entanto, havia muitas controvérsias a respeito
da classificação definitiva como fungo ou protozoário. Os critérios que ainda o
classificava como protozoário eram aceitos, pois, havia plena similaridade entre a
morfologia microbiana e a doença no hospedeiro, ausência de características
fenotípicas específicas de fungos, presença de estruturas morfológicas sugestivas
de protozoários, resistência às drogas antifúngicas e sensibilidade às drogas
antiprotozoários (10).
Em 1988, Edmam et al, publicou um estudo filogenético, baseado nas
subunidades menores do RNA ribossômico do Pneumocystis. Essas subunidades
foram escolhidas porque tem as mesmas funções em todos os organismos e
contém informações suficientes para determinar as relações evolutivas de
proximidade ou distancia. O estudo concluiu que o Pneumocystis tem
características moleculares lineares aos fungos e diferente em vários aspectos
dos protozoários (11).
Até o início do ano 2000, vários estudos evidenciaram que a espécie que
causa pneumonias em humanos, é diferente da que causa doença em outros
4
animais. Para diferenciá-las, a espécie de ocorrência em humanos foi renomeada
para Pneumocystis jiroveci (nomenclatura com apenas um “i” no final de “jiroveci”),
por Frankeel, em homenagem a Otto Jiroveci que foi um dos primeiros a observar
as formas císticas de amostras pulmonares humana (10). A Tabela 1 apresenta as
diferentes espécies e seus respectivos hospedeiros, segundo um e Deuroiche
(2009) e Wissimann (2010) (12, 13).
Tabela 1: Espécies de Pneumocystis e seus respectivos hospedeiros:
ESPÉCIE HOSPEDEIRO
Pneumocystis carinii Ratazana – Rattus norvegicus
Pneumocystis wakefieldiae Ratazana – Rattus norvegicus
Pneumocystis murina Camundongo – Mus musculus
Pneumocystis oryctolagi Coelho – Oryctolagus cuniculus
Pneumocystis jirovecii Homem – Homo sapiens
Pneumocystis de primatas não humanos Macacos de diversas espécies
Pneumocystis de furão Furão - Mustela putorius furo
Pneumocystis de cavalos Cavalo - Equus caballus
Pneumocystis de suínos Porco - Sus scrofa domesticus
Pneumocystis de morcegos Diversas espécies de morcegos
Pneumocystis de cães Cachorro – Canis familiaris
Como havia pelo menos três formas de grafia do mesmo organismo, o
Código Internacional de Nomenclatura Botânica (International Code of Botanical
Nomenclature – IBCN), convencionou em 2008 uma nova nomenclatura, sendo
agora, Pneumocystis jirovecii e sinônimos Pneumocystis jiroveci, Pneumocystis
carinii f. sp. hominis e Pneumocystis carinii hominis. A doença causada por esse
fungo em humanos, é a Pneumocistose ou, do inglês, Pneumocystis pneumonia
5
com a sigla PCP, “P” Pneumo, “C” cystis e “P” Pneumonia. No Brasil a sigla
utilizada é PPC, pneumonia por Pneumocystis carinii (10, 14).
A pneumonia por Pneumocystis jirovecii, até meados da década de 80
ainda era incomum, associada a estados clínicos de imunossupressão causando
epidemias em hospitais e asilos. Foi nessa década, junto ao início epidemia de
AIDS, que PPC foi considerada como uma coinfecção conclusiva para auxiliar no
diagnóstico da AIDS (15-17).
Atualmente, a PPC ainda é a doença oportunista mais frequente em HIV
infectados, embora o tratamento com antiretrovirais de alta atividade (HAART)
tenham diminuído o índice da PPC nesses casos (15, 17). A pneumocistose
também tem aumentado significativamente em indivíduos imunossuprimidos não
HIV, principalmente em pacientes recém transplantados, submetidos a terapias
imunossupressivas, quimioterapias e doença pulmonar obstrutiva crônica (3, 18-
20).
1.2 Taxonomia
Estudos moleculares foram essenciais para a classificação taxonômica do
gênero Pneumocystis. Embora alguns investigadores tenham descoberto
semelhanças na ultra-estrutura do P. jirovecii com os fungos a sua classificação
como protozoário permaneceu até 1988. Análises moleculares da subunidade
menor do ácido ribonucleico ribossomal (rRNA) , compararam Pneumocystis com
o fungo Saccharomyces cerevisiae. Os resultados obtidos demonstraram que a
sequência do gene codificador do 16S rRNA era mais semelhante à sequência de
6
outros fungos do que as sequências dos protozoários comparados. Outros
estudos moleculares, publicados em 1992, permitiram estabelecer uma ligação
filogenética com o reino dos fungos (7, 16).
A classificação filogenética baseada na sequência do gene 16S rRNA
define que o P. jirovecii represente uma linhagem divergente do reino dos fungos,
está no sub-reino Dikarya (fungos que produzem dicários – dois núcleos oriundos
de uma única hifa produzida por fusão), entre a bifurcação dos Basidiomycetes e
Ascomycetes. A análise dos outros genes DHFR, TS, β-tubulina e actina
colocaram os organismos Pneumocystis próximos aos Ascomycetes (fungos que
possuem asco, uma estrutura produtora de esporos). A conclusão dessas análises
propôs a criação de uma nova família taxonômica, Pneumocystidaceae, e uma
nova ordem, Pneumocystidales, na classe dos Ascomycota (2, 7, 21).
Em 2002 o National Center of Biotechnology Information estabeleceu a
classificação taxonômica, propôs a sua inclusão no reino dos Fungos, filo
Ascomycotina, sub-filo Ascomycota. Atualmente, os Ascomycotas são subdividos
em três taxa, os Pneumocystis estão inclusos no táxon Taphrinomycotina
(Archiascomycota), um grupo monofilético – inserido nesse grupo por comparação
com proteínas nucleares; seguindo na classe Pneumocystidomycetes, ordem
Pneumocystidales e família Pneumocystidaceae (22, 23).
As espécies de Pneumocystis possuem hospedeiros específicos, portanto,
podem assim ser diferenciadas. No entanto, com a análise molecular da
sequência dos genes mitocondriais, de cepas provenientes de várias espécies, foi
7
possível definir com precisão as espécies, além de alinhar um comparativo
genômico dessas semelhanças (4).
1.3 Epidemiologia
1.3.1 Organismo e microbiologia
Os Pneumocystis são organismos eucariotos, unicelulares, pertencem ao
reino dos fungos, na fase de cistos são semelhantes a leveduras e incultiváveis in
vitro (24). Vários meios de cultura foram desenvolvidos para mantê-lo, dentre os
que obtiveram melhor desempenho foram os que simulam o epitélio pulmonar, no
entanto, o crescimento é relativamente baixo (2, 24).
Geralmente, os microrganismos são cultivados a partir de uma pequena
quantidade de células e ao decorrer do tempo há proliferação de novas gerações,
esse mesmo método não é aplicado com eficiência para o Pneumocystis.
Acontece que, além da dificuldade em manter vivas as células iniciais, esse
organismo é extremamente exigente na quantidade de nutrientes o que
impossibilita manter um meio de cultura viável para as próximas gerações,
levando a morte do cultivo em pouco tempo. Por essa razão, é considerado um
microrganismo fastidioso, ou seja, necessita de ambiente, nutrientes e
temperatura extremamente similares a sua vida natural para cultivo (10).
A dificuldade em manter o Pneumocystis in vitro retardou o entendimento
da biologia e sua história natural, principalmente ciclo patogênico e origem. As
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informações de sua estrutura e vida foram baseadas em técnicas de coloração em
lâminas, análise de microscopia eletrônica e análises moleculares (25).
O Pneumocystis apresenta duas formas principais, segundo análises
microscópicas, a trófica e a cística. A forma trófica se reproduz assexuadamente
por fissão binária. A segunda forma, cística, é proveniente da fusão de tipos
compatíveis para acasalamento e resulta um cisto esférico ou caixa de esporos
(ascos), a qual, na maturidade contém oito esporos (5, 26).
De acordo com sua ultraestrutura, as formas se caracterizam:
1- Trofozoítos:
São pleomórficos e medem de 2 até 4µm. Imagens de microscopia
eletrônica revelam estrutura unicelular, com uma fina parede, com 2 ou mais
núcleos (9, 16).
2- Cistos:
Os cistos são as formas mais comuns encontradas nas colorações, durante
o diagnóstico. Em microscopia de luz, os cistos são esféricos. Medem de 4 até
8µm de diâmetro. Alguns cistos são vazios com colapso das paredes, outros
contém corpos pretos ou pontos em coloração de prata, visualizados na parede.
Esses pontos são espessamentos focais e dependendo do ângulo de visualização,
adquirem diferentes formas, possuem pequenos poros utilizados pelos
esporozoítos como passagem para o ambiente externo do cisto.
9
O cisto pode conter até 8 esporocistos (corpos intracísticos) e variam de
forma, de acordo com a presença ou ausência desses esporocistos.
Quando contem esporocistos, a estrutura é esférica, com uma película (70
– 140nm) com 3 camadas, a interior plasmalema, a média de elétrons brilhantes e
a externa um densa camada de elétrons (9, 16).
Figura 1: Imagem de microscopia eletrônica das formas do ciclo de vida do Pneumocystis (A) Fase
trófica, com 1 a 4 µm de diâmetro e com uma membrana plasmática simples, com projeções filopodiais. (B) Fase cística com 8 a 10 µm de diâmetro e se caracterizam rígida parede de b-glucano, os cistos tem até 8 corpos intracísticos, que geram outras forma tróficas. (Krajicek, et al., 2009).
1.3.2 Ciclo de vida
Os estágios de vida foram identificados em pulmões de mamíferos
infectados e hospedeiros imunossuprimidos. Vários autores propuseram ciclos
ligeiramente diferentes para o Pneumocystis, geralmente, todos descrevem as
fases alternadas entre sexuada e assexuada, observadas in vivo. Com a falta de
meios de cultivo in vitro que mantenham a reprodução para observação detalhada
10
dos estágios de vida, não foi comprovado empiricamente o ciclo de vida do
Pneumocystis, desde a entrada do microrganismo no hospedeiro até seu processo
patogênico (2, 5, 7, 26).
As formas tróficas, esporocistos e cistos maduros são as três principais
formas consideradas pela maioria dos pesquisadores. As formas tróficas são as
mais abundantes em todo ciclo de vida do Pneumocystis, representando de 90-
95% de toda a população em pulmões de hospedeiros com pneumocistose. As
formas tróficas se conjugam, através de receptores de feromônios. Essa fusão de
células é considerada o esporocisto primário e início do processo de divisão
meiótica. Imagens de microscopia eletrônica registraram a presença de complexos
sinaptonêmicos, da fase zigóteno da meiose, em esporocistos de Pneumocystis
(5).
A próxima etapa é a replicação mitótica, resultando em oito núcleos, já em
estágio de esporocisto tardio. A fase madura do cisto contém oito esporos
individuais que quando rompem o cisto, formam a fase trófica (2, 9).
O ciclo a seguir, segundo Ruffolo (1994), representa também a replicação
na fase trófica, assexuada, por divisão mitótica, gerando células haploides. A outra
fase, sexuada, inclui a denominação pré-cisto para a célula que após a
conjugação torna-se diploide, dando início à meiose.
11
Figura 2: (A) Fase assexuada: 1- formas tróficas, 2- célula haploide e 3- divisão por mitose. (B)
Fase sexuada: 1- células haplóides se conjugam, formam um pré-cisto, ou zigoto (fase diplóide), inicio da divisão meiótica; 2- cisto primário com até 8 núcleos e organelas; 3- maturação, cisto maduro com 8 esporocistos; 4 – cistos tardios, com excistamento dos esporocistos gerando a forma trófica (Ruffolo, 1994).
1.3.3 Transmissão, prevalência e incidência
Até o momento, as espécies de Pneumocystis só foram encontradas em
mamíferos. Cada espécie tem seu hospedeiro específico, sendo assim, essa
característica foi utilizada para diferenciar as espécies. Isso sugeriu, portanto, que
a pneumocistose pelo P. jirovecii não é uma zoonose e sim uma antroponose, ou
seja, doença no qual ser humano é o único reservatório susceptível e hospedeiro
específico. Esses microrganismos são adquiridos durante a vida, possivelmente
na infância, através da transmissão horizontal (vias aéreas) e vertical (via
transplacentária) (13, 27).
Cerca de 80% das crianças com menos de 4 anos possuem anticorpos para
o organismo, sugerindo uma colonização durante as primeiras fases da vida (28).
12
Entretanto, estudos dos genótipos de Pneumocystis sugerem que uma série de
casos clínicos de PPC também é proveniente de microrganismos adquiridos
recentemente e não somente de infecções latentes da infância (27, 29).
Desse modo, a pneumocistose humana é classificada como uma infecção
adquirida, e seu reservatório natural ou fonte de infecção ainda é indeterminado. O
DNA do Pneumocystis já foi encontrado na água, mas não foi possível comprovar
se essa é a fonte de contaminação, pois, poderia ser proveniente de algum outro
hospedeiro. Atualmente, são consideradas fontes de transmissão doentes com
pneumocistose ou pessoas portadoras assintomáticas do P. jirovecii (13).
A colonização acontece, após a inalação de formas infectantes do
patógeno. O Pneumocystis penetra pelas vias aéreas e adere às células
alveolares de superfície tipo I, podendo permanecer em estado quiescente até o
desenvolvimento da pneumonia. A manifestação da doença ocorre em estados de
imunodepressão medicamentosa ou orgânica do hospedeiro (30).
A infecção tem início com a ocupação dos espaços aéreos alveolares por
um exsudado rico em trofozoítos, ocorrendo o espessamento da membrana
alveolar e a inflamação do parênquima, com consequente edema e fibrose. O
processo evolui para a replicação assexuada e a adesão às células alveolares de
superfície tipo I. A aderência é mediada pela glicoproteína de superfície (MSG) a
qual, estando presente na superfície da parede celular do microrganismo, é a
responsável pela ligação específica que se estabelece com os macrófagos do
hospedeiro (31, 32).
13
A capacidade de crescimento do fungo aumenta significativamente em
casos de deficiência da resposta imunológica, celular e humoral, do hospedeiro.
Quando inalados, as formas tróficas afetam os alvéolos, e o sistema imunológico
deficiente do hospedeiro não consegue controlar a replicação do Pneumocystis e
consequentemente o desenvolvimento da doença (5).
Um dos principais fatores é a falta de linfócitos T-CD4, abaixo de 200
células por mililitro cúbico de sangue, relacionados à deficiência de imunidade
celular. A atividade alveolar dos macrófagos ficam inativadas na ausência de
linfócitos T-CD4, desse modo, os macrófagos ficam incapazes de fagocitar e
erradicar os Pneumocystis (33).
Dessa forma, os casos de pneumocistose são mais frequentes em
indivíduos com os linfócitos T-CD4 reduzidos. Esse fato explica a alta incidência
em pacientes com AIDS e com pneumonia por P. jirovecii, principalmente na
década de 80. Sendo assim, a PPC era uma infecção definidora de AIDS no inicio
da epidemia (19).
Por outro lado, a incidência de PPC em imunocomprometidos HIV
negativos, tem aumentado nas últimas décadas, principalmente em pacientes
submetidos a terapia crônica imunossupressora (corticóides ou agentes
quimioterápicos), pessoas com sistema imune comprometido hematologicamente,
casos de tumores malignos, receptores de órgãos transplantados, e pessoas com
desnutrição severa (18).
14
1.3.4 Distribuição geográfica
As espécies de Pneumocystis estão distribuídas mundialmente, já foi
encontrada em todos os continentes, exceto na Antártida. Desde o seu
descobrimento no início do século 20 até início da década de 80, esse
microrganismo não apresentava impactos ou importância clínica (1, 7).
Com o advento da AIDS houve uma importante pandemia de PPC e sua
incidência era de 80% em pacientes submetidos a transplante de pulmão e em
HIV de 70%, foi um dos maiores problemas de saúde pública, principalmente em
países subdesenvolvidos (1, 34, 35).
O entendimento da transmissão, tratamento e profilaxia colaboraram para
um significante declínio de PPC em pacientes imunocomprometidos HIV e HIV
negativos. Outro fator importante para o declínio da PPC em HIV foi o uso da
terapia com antirretrovirais de alta atividade (HAART). Embora esses avanços do
século 21 colaborarem para o declínio da PPC, em países subdesenvolvidos,
pobre em recursos para controle e com alto índice de HIV, a PPC permanece
incontrolada (36).
Na África, 80% das crianças com HIV/AIDS tem pneumonia provocada por
P. jirovecii. A maioria dos pacientes com pneumocistose também tem tuberculose,
e além, a pneumocistose na maioria dos casos é concomitante a quadros severos
de desnutrição, ausência de condições sanitárias, ausência de diagnóstico
precoce e pobreza generalizada (37).
15
Segundo estudos, as regiões tropicais são mais propícias para proliferação
do microrganismo (35). Ponce (2010) e seu grupo no Chile encontraram 65% de
positividade de P. jirovecii na população estudada, a partir de biópsias pulmonares
(38).
1.4 Manifestações clínicas
As manifestações clínicas da PPC são distintas entre imunocomprometidos
pelo HIV e se infecção pelo HIV. Fisiologicamente, a pneumonia por P. jirovecii se
caracteriza por uma inflamação neutrofílica do pulmão, o que pode resultar em
intenso dano alveolar com dificuldade de trocas gasosas, culminando em
insuficiência respiratória (18, 39).
Os doentes com HIV/AIDS desenvolvem dispneia progressiva subaguda,
tosse produtiva, mal estar, expectoração e febre baixa. Esses sintomas podem se
desenvolver ao longo de semanas. Os sintomas mais agudos são tosse com
escarro purulento similar às pneumonias bacterianas, como a tuberculose (2, 18,
40, 41).
A tensão de oxigênio arterial apresenta características diferentes entre
casos de PPC em pacientes imunossuprimidos pelo HIV e sem infecção pelo HIV.
Quando associada ao HIV, nos quadros de PPC, a tensão de oxigênio arterial
apresenta um menor comprometimento da oxigenação celular do que os outros
imunocomprometidos, ou seja, em imunocomprometidos HIV negativos, a
oxigenação fica comprometida, agravando o estado clínico do paciente (2, 40).
16
Os pacientes que são imunocomprometidos HIV negativos frequentemente
apresentam insuficiência respiratória fulminante associada com febre, tosse seca
e geralmente necessitam de ventilação mecânica. A falência respiratória ocorre
em 43% desses pacientes e a mortalidade abrange cerca de 40% (18, 42, 43).
Os sintomas nesses imunocomprometidos HIV negativos são
significativamente coincidentes com o aumento de medicamentos
imunossupressores, como os corticóides e medicamentos citotóxicos
(antineoplásicos). Evidências sugerem que 90% dos pacientes submentidos a
tratamentos com corticoides por, no mínimo, um mês, em doses de 16 miligramas
ou mais ao longo de 8 semanas, desenvolveram a PPC (2).
Geralmente, 95% dos doentes de PPC tem dispneia progressiva ao esforço
e tosse seca, a febre pode acontecer em cerca de 80% dos casos, desconforto
torácico, perda de peso, calafrios e em casos mais raros hemoptise (41).
A radiografia de tórax demonstra características típicas de PPC, mesmo
entre imunocomprometidos com HIV e HIV negativos. Infiltrados intersticiais
envolvendo as áreas peri hilar1 são bilaterais e simétricos. Os padrões mais
comuns de radiografias de tórax em PPC incluem solitárias ou múltiplas
opacidades nodulares (geralmente calvitar), infiltrado lobar, pneumatoceles e
pneumotórax (2, 39, 41, 44).
1 A região do hilo localiza-se na face mediastino de cada pulmão sendo formado pelas estruturas que
chegam e saem dele, onde temos: os brônquios principais, artérias pulmonares, veias pulmonares, artérias e veias bronquiais e vasos linfáticos (Netter, 2000).
17
No exame físico as características não são específicas, os doentes podem
apresentar taquipneia, febre e taquicardia. No exame pulmonar são comuns leves
crepitações e roncos, mas metade dos pacientes com PPC podem também ter um
exame pulmonar normal. Em crianças com um quadro de doença mais severa, os
sintomas incluem cianose, batimento de asa de nariz e retrações intercostais (41).
Os exames laboratoriais geralmente não são conclusivos no diagnóstico de
PPC, pois, se refletem nas alterações que a infecção causa no organismo do
hospedeiro. Estudos demonstram que os valores séricos de lactato
desidrogenase (LDH) em soros de pacientes com PPC apresentam-se elevados,
mas esse nível pode ser alterado por outras patologias, como também um
paciente com PPC pode apresentar taxas normais de LDH (44).
O cofator enzimático s-adenosilcistína (SAM) pode ser um marcador na
infecção. Estudos realizados de plasma de pacientes doentes observaram um
declínio importante nos níveis de SAM, associado com estágios avançados da
PPC (45, 46).
Outro marcador sorológico utilizado é o KL-6, uma mucina2 humana MUC-1,
expressada principalmente pelos pneumócitos tipo II (constituinte do tecido
pulmonar). Elevado índices plasmáticos de KL-6 estão associados aos danos
pulmonares ocasionados pela PPC (7)
O 1-3 ß-D-glucano é o principal componente da parede celular dos fungos e
está presente em Pneumocystis sp. Frequentemente esse marcador é utilizado no
2 A mucina é uma glicoproteína que constitui o muco.
18
diagnóstico de infecções fúngicas como a candidíase e aspergilose, mas também
pode ser empregada nas pneumonias por P. jirovecii. Há uma relação importante
entre os níveis de 1-3 ß-D-glucano e a resposta ao tratamento com antibióticos
(ATB), quanto mais eficaz o ATB menor são os níveis de 1-3 ß-D-glucano. Os
baixos níveis de 1-3 ß-D-glucano também podem ser associados a estágios de
colonização e níveis elevados associados à infecção fúngica (7, 21, 30, 33).
A proteína C reativa pode apresentar-se elevada em estágios muito
avançados da infecção, devido ao estado inflamatório presente nos tecidos
pulmonares, principalmente em casos de HIV/AIDS (7, 33).
Os níveis baixos de linfócitos T CD4 são considerados um dos principais
fatores de risco para desenvolvimento de uma doença infecciosa. Uma vez
colonizado, o paciente que tem uma deficiência dos linfócitos T CD4, abaixo de
200 células por mililitro apresentam um fator altíssimo de risco de infecções, como
por P. jirovecii (44).
Embora, uma das principais características da infecção por P. jirovecii ser o
acometimento pulmonar, existem registros da ocorrência de manifestações
extrapulmonares, principalmente em doentes com AIDS. Os principais sistemas ou
órgãos que podem ser afetados são os linfonodos (linfadenopatias), ossos, baço,
pulmão, medula óssea, olhos (retina com manchas algodonosas), trato
gastrointestinal e tireoide (aumento da massa da tireoide).
19
1.5 Tratamento e profilaxia
Diferente da maioria dos fungos, o gênero Pneumocystis não contém
ergosterol em sua membrana plasmática, sendo então, insensível aos fármacos
disponíveis que atuam sobre a biossíntese desse lipídio. As drogas alvo utilizadas
são antibióticos que agem inibindo a síntese de enzimas vitais no metabolismo do
organismo (36).
O tratamento e profilaxia para o P. jirovecii geralmente é realizado com
sulfametoxazol + trimetoprim (TMP/SMX). O efeito das duas drogas é sinérgico,
pois atuam em passos diferentes da síntese do ácido tetra-hidrofólico (folínico),
necessária para a síntese dos ácidos nucleicos. O sulfametoxazol inibe um passo
intermediário da reação e o trimetoprim a formação do metabólito ativo do ácido
tetra-hidrofólico no final do processo (36, 47, 48).
A terapia é realisada de acordo com os sintomas e acometimento pulmonar,
sendo considerada PPC leve, moderada ou severa. O TMP/SMX apresenta maior
eficácia no tratamento do que a pentamidina endovenosa e outras drogas
alternativas já utilizadas no tratamento de PPC, como Dapsona. A Clindamicina é
utilizada em caso de resistência do P. jirovecii ao TMP/SMX ou sensibilidade do
paciente.
Em 2006, segundo a American Thoracic Society, para pacientes
imunocomprometidos que recebem terapia com corticosteroides ou outras terapias
imunossupressoras é aconselhável que recebam tratamento profilático contra o
Pneumocystis (44).
20
A profilaxia, geralmente, é indicada em casos de imunossupressão no qual
a contagem de linfócitos T CD4 está abaixo de 200 células por mililitro de sangue
(2, 49).
1.6 Métodos de diagnóstico laboratoriais
O diagnóstico de PPC geralmente é realizado através do exame clínico
(sinais e sintomas) e confirmado por métodos laboratoriais. Como mencionado nas
manifestações clínicas, os sintomas de PPC são semelhantes a uma série de
doenças pulmonares, como Síndrome da Angústia Respiratória Aguda,
Citomegalovírus, Pneumonia Intersticial Linfocítica, Infecções por Micoplasma,
Pneumonia Viral, Embolismo Pulmonar, Legioneloses, Aspergiloses e
Tuberculoses. Sendo assim, o diagnóstico laboratorial diferencial pode ser
indispensável nesses casos (50-52).
1.6.1 Métodos de coloração para pesquisa de P. jirovecii
Geralmente, o diagnóstico laboratorial desse fungo é realizado através da
microscopia óptica. Durante décadas, o padrão ouro para análises microscópicas,
foi a pesquisa do Pneumocystis em lavado broncoalveolar ou escarro induzido,
pelos métodos de coloração por Giemsa, metenamina de prata ou
imunofluorescência indireta. No entanto, esses métodos dependem da qualidade
da amostra, quantidade do microrganismo e de técnica realizada com qualidade
(2, 36).
21
As formas tróficas ou cistos obtidos de escarro induzido, lavado
broncoalveolar (LBA) ou biópsia de pulmão podem ser visualizados com vários
tipos de coloração histoquímicas. As formas tróficas podem ser visualizadas
utilizando Papanicolau, Gram-Weigert ou Wright Giemsa modificado (Diff- Quik)
Os cistos podem ser corados com metenamina de prata Grocott-Gromori (GMS),
cresil violeta, azul de toluidina O ou com calcofluor (CW) (2).
Na coloração de Giemsa é possível evidenciar as formas trofozoítas, com
dimensões entre 1-5 µm, pleomórficos3 e contém um apenas um núcleo. Os cistos
geralmente possuem parede espessa, arredondados e com aproximadamente 5-8
µm, contêm até oito corpos intracísticos. Os pré-cistos são esféricos, com 4-7 µm
de diâmetro e sem corpos intracísticos, mas podem conter mais de um núcleo.
Essas formas são encontradas em tecidos pulmonares e extrapulmonares,
principalmente em indivíduos imunossuprimidos (53). O método de coloração de
Giemsa pode ser utilizado para identificação rápida de formas tróficas, de LBA ou
escarro induzido, mas requer um alto número de microrganismos para detecção
(2).
3 Pleomófico/ pleomorfismo: capacidade de um organismo apresentar mais de uma forma estrutural
durante um ciclo de vida, no caso do Pneumocystis, as duas formas são tróficas e císticas. (Lacaz, et al., 2009).
22
Figura 3: Coloração de Giemsa, à esquerda forma cística com 8 núcleos. À direita forma trófica
(aumento de 400x). Imagem: Martha L. Warnock, 1999.
Na coloração com hematoxilina eosina (H&E) é possível visualizar os cistos,
mas como coram intensamente de preto, não é possível visualizar os corpos
intracísticos, o que pode gerar um diagnóstico inconclusivo. As formas císticas em
LBA também podem ser coradas com metenamina de prata, as paredes dos cistos
e corpos intracísticos ficam evidentes. A coloração com calcofluor pode ser
utilizada para confirmação rápida da presença das formas císticas. Já a
imunofluorescência é mais sensível e com alta especificidade (54).
Apesar da imunofluorescência ser altamente sensível, tem altos custos,
devido ao material utilizado ser produzido e comercializado em conjuntos fechados
para desenvolver a técnica. Entre as técnicas de coloração a metenamina de prata
e azul de toluidina são mais sensíveis que a Giemsa na pesquisa dos cistos (28,
54, 55).
O corante azul de toluidina, também conhecido como cloreto de tolônio, é
um corante metacromático acidófilo, ou seja, é um corante básico que pode
23
conferir uma cor diferente da própria cor à estrutura corada. Tem alta afinidade por
ácidos nucleicos, portanto, cora intensamente estruturas como DNA ou RNA,
nesse caso, o DNA fica azul e o RNA na cor rosa. Foi descoberto em 1856, por
William Henry Perkin, e tem ampla aplicação na saúde. A toluidina, também
conhecida como metilanalina ou aminotolueno, tem basicamente 3 formas: orto-
toluidina, para-toluidina e meta-toluidina (56).
Para aplicação na coloração de Pneumocystis a forma utilizada é a orto
toluidina, portanto, a denominação de azul de toluidina O. A técnica com azul de
toluidina foi modificada, por Gosey em 1985, para diminuir o uso de reagentes e
facilitar a visualização dos cistos (28, 55).
Na coloração de azul de toluidina é possível visualizar pequenos
agrupamentos de cistos, na cor lavanda. Há casos em que um único cisto é
visualizado isoladamente, nesse caso, é recomendado que um agrupamento de
cistos sejam encontrados na lâmina, para diferenciar o Pneumocystis de leveduras
(55).
Figura 4: Cistos de P. jirovecii, coloração: de azul de toluidina modificada (460x). Fonte: Gosey.
1985.
24
Uma das principais vantagens da coloração com azul de toluidina é a
eliminação dos elementos de segundo plano da lâmina, sendo que o método
modificado demonstra mais eficiência na remoção do segundo plano. A remoção
do segundo plano é realizada pelo reagente de sulfatação que extrai muco e
debris sem afetar as formas fúngicas (55).
O resultado da coloração, em casos de amostras com abundância de
cistos, é de grande qualidade e especificidade, no entanto, não cora as formas
trofozoíticas que é considerada a forma em maior número em uma pneumocistose
(57).
1.6.2 Métodos moleculares para detecção e estudo de DNA
de P. jirovecii
Por ser um microrganismo incultivável, as técnicas de microbiologia não
resultam em um diagnóstico preciso. Por outro lado, as técnicas de biologia
molecular, baseadas na reação em cadeia da polimerase (PCR) geraram grandes
avanços no diagnóstico e tratamento do Pneumocystis jirovecii. A PCR é
altamente sensível, permitindo detectar menos que 1 micrograma de DNA alvo em
uma amostra. Caso que, nas técnicas de coloração histoquímicas e
imunofluorescência, geralmente seriam resultados falsos negativos (58-61).
A PCR consiste na realização de repetidos ciclos de síntese de DNA por
meio de dois iniciadores (primers) com orientações opostas, com sequências
complementares às duas extremidades do fragmento alvo, e levadas a efeito por
reação enzimática mediada por uma polimerase, com atividade em altas
25
temperaturas (Taq DNA polimerase). Cada ciclo da reação é constituído por três
fases: separação das hélices de DNA a ser amplificado; ligação complementar
entre os primers e o DNA e síntese do DNA pela Taq polimerase. A orientação dos
primers faz com que a síntese de DNA ocorra na região interna entre eles. Assim,
o produto da extensão de um primer é utilizado como substrato para o outro, o que
resulta em cada ciclo, na duplicação de quantidade de DNA sintetizada pelo ciclo
precedente. O número de cópias do fragmento alvo terá um aumento exponencial,
o que faculta no final de vários ciclos aumentando o número na ordem de cópias,
partindo de uma única molécula (1, 62).
Os primeiros estudos publicados baseados na PCR de Pneumocystis, de
amostras clínicas, foram de Wakefield e sua equipe em 1990. Desde então, mais
de 17 regiões do DNA do Pneumocystis codificados e não codificados são
utilizados com finalidade de detecção, diagnóstico, estudos de genotipagem,
sequenciamento, biodiversidade e seus polimorfismos (7, 63).
A análise das sequências de DNA dos genes timidilato sintetase (TS),
superóxido dismutase (SOD), EPSP (um gene aromático multifuncional) e a
subunidade menor do RNA ribossômico mitocondrial (mtSSU rRNA) tem sido
utilizadas para distinguir as espécies de Pneumocystis em seus respectivos
hospedeiros, até hoje encontrado somente em mamíferos (29).
Para estudos de polimorfismos, geralmente, é utilizado o gene mitocondrial
ribossômico (mt26S), conhecido também como subunidade maior do RNA
ribossômico mitocondrial (mtLSU rRNA). Outros genes que podem ser utilizados
26
para tipagem, como o espaçador transcrito interno (ITS1 e ITS2), ß-tubulina (ß-
tub), subunidade menor do rRNA mitocondrial (mtSSU rRNA), SOD, citocromo-b
(CYB), 5.8S rRNA, AROM, TRR1, upstream conserved sequence (UCS) ,
glicoproteína maior de superfície (MSG), KEX1, diidrofolato redutase (DHFR) e
diidropteroato sintase (DHPS) (18, 63).
A detecção em amostras clínicas tem sido realizada com diferentes regiões
do DNA do Pneumocystis e diferentes técnicas de PCR. Os genes incluem o
DHPS, DHFR, TS, ß-tub, cdc2 gene, ITS, 5S rRNA, 18S rRNA, MSG, mtLSU
rRNA, e mtSSU rRNA (64). Além da PCR, houve um aumento da especificidade e
sensibilidade com a Nested PCR, onde o produto da primeira PCR, amplificado
com um par de primers, é submetido à nova reação de amplificação utilizando um
par de primers internos ao primeiro, sendo o produto então detectado por
eletroforese em gel de agarose e visualizados sob luz ultravioleta (65-67).
Wakefield utilizou o locus gênico mitocondrial mtLSU rRNA, região
altamente conservada, para desenvolver uma PCR simples, com primers, que
designou por pAZ102-H e pAZ102-E, que amplificaram esta região, gerando
fragmentos de aproximadamente 346 pb (58). Posteriormente, desenvolveu um
Nested PCR que se revelou igualmente importante na avaliação da diversidade
das amostras, aumentando a sensibilidade e especificidade para as espécies de
Pneumocystis, pois não se verificam reações cruzadas com outros fungos (59,
68).
27
O método desenvolvido por Wakefield é altamente sensível e de fácil
reprodutibilidade para demonstrar a presença de DNA do Pneumocystis em
amostras biológicas do trato respiratório, biópsias de peças infectadas, assim
como amostras ambientais, mas não são aplicáveis para diferenciar as espécies
de Pneumocystis. Além de diagnóstico, a região mtLSU rRNA é muito utilizada
para aplicações de tipagem, transmissibilidade, infecções latentes bem como ao
nível dos estudos sobre a eventual reativação da infecção latente, existência de
portadores subclínicos e do potencial para emergirem outras doenças (58, 68).
O segundo lócus gênico utilizado, também mitocondrial, foi o mtSSU rRNA.
Esse lócus distingue as espécies de Pneumocystis, como também poder ser
utilizado para diagnóstico. No entanto, sua especificidade é inferior para aplicação
de tipagem e diagnóstico. Estudos demonstraram que a Nested PCR com o
mtLSU rRNA é mais sensível do que a PCR da mtSSU rRNA. A relativa ausência
de polimorfismos observada neste local, até o momento, sugere uma limitada
contribuição na identificação de subtipos (54, 58, 68).
A região ITS, presente no RNA ribossomal nuclear dos fungos em geral,
tem sido muito utilizada para tipagem de Pneumocystis, aplicações moleculares
epidemiológicas, estudos filogenéticos, para a análise de casos agrupados e para
investigações sobre transmissão, severidade da doença e incidência potencial
(29). Entre as massas ribossomais estão presentes duas porções da ITS,
denominadas ITS 1 e ITS 2. Estudos comparando a genotipagem das regiões de
ITS, com outros locais (mtLSU rRNA, mtSSU rRNA e DHPS), evidenciaram mais
polimorfismos na ITS do que nas outras regiões do gene do Pneumocystis. Foram
28
descritos mais de 20 genótipos diferentes utilizando as regiões ITS 1 e ITS 2. No
entanto, a PCR utilizando a ITS não distingue espécies de Pneumocystis, para
isso deve ser aplicado um sequenciamento no fragmento amplificado.
As regiões que codificam a DHPS e DHFR são aplicadas em estudos
moleculares de resistência do P. jirovecii aos antibióticos. A DHPS e DHFR são
enzimas alvo dos antibióticos, como as sulfonamidas e trimethoprim (trimethoprim-
sulfametoxazol), que são as drogas para tratamento ou profilaxia de
pneumocistose (29, 69). Para detecção desses fragmentos, foram desenvolvidas
PCR seguida de Nested PCR. As mutações detectadas nessas regiões,
especificamente na posição 55 e 57 do gene DHPS, indicam possível resistência
do P. jirovecii às sulfonamidas, o que pode levar à falência do tratamento com a
droga sulfametoxazol-trimethoprim (69).
Para estudo da interação parasita hospedeiro, o lócus gênico utilizado é o
gene que codifica a glicoproteína maior de superfície (MSG). O MSG está
presente na superfície celular de todos os Pneumocystis, parecendo desempenhar
uma função na aderência do microrganismo às células epiteliais alveolares (29).
A sensibilidade intrínseca de amplificação de DNA por PCR tem liderado o
desenvolvimento de vários protocolos para a detecção de P. jirovecii. Em alguns
casos relatados, os espécimes que não são detectadas por microscopia, têm sido
encontrados por PCR de fluídos da LBA de pacientes imunocomprometidos sem
pneumonia por P. jirovecii, o que supõem casos de colonização por P. jirovecii (60,
66).
29
Os casos de colonização têm sido descritos e ocorridos principalmente em
pacientes imunocomprometidos e com menos frequência em pacientes
imunocompetentes. Casos de colonização pulmonar com P. jirovecii são
frequentemente omitidos já que ensaios de PCR não são usualmente utilizados
para detecção de rotina de espécies pulmonares. Dados documentados de São
Francisco revelam que 2/3 dos pacientes com HIV, que não apresentam
microscopia evidenciada por P. jirovecii, evidenciam a colonização por este agente
quando realizada a PCR (21, 57, 70).
A detecção por Nested PCR pode ser realizada em amostras de LBA,
escarro e, menos frequente, em sangue. Em casos de infecções extrapulmonares,
pouco se sabe se a disseminação é linfática ou hematogênica e quais suas formas
circulante (trofozoíto ou cisto). Além do mais, é importante saber que a
disseminação de P. jirovecii está relacionada com doenças pulmonares, sem
sinais clínicos de infecção extrapulmonar. Mas há um interesse na detecção de P.
jirovecii em amostras de sangue, já que este método seria menos invasivo para
pacientes com suspeita de pneumonia por este agente (71).
Para realisar a técnica de Nested PCR de diferentes amostras clínicas,
geralmente são utilizados os primers desenhados na região mtLSU rRNA, mtSSU
rRNA e nas regiões ITS 1 e 2. Nos Estados Unidos, o gene mtLSU rRNA, tem sido
utilizado para o estudo genético da variação dos isolados de P. jirovecii de
pacientes infectados pelo HIV. O gene mtSSU RNAr também pode ser utilizado,
para assegurar a análise diagnóstica (52, 54, 59, 64).
30
O possível papel da técnica de PCR no diagnóstico laboratorial de rotina
para casos de pneumonia por P. jirovecii em pacientes com HIV ainda não possui
uma definição satisfatória. Há pouca informação sobre a correlação de resultados
positivos da PCR para P. jirovecii e manifestações clínicas de pneumonia (72).
Sabe-se, no entanto, que devido à alta sensibilidade dos métodos moleculares, o
DNA do P. jirovecii também tem sido detectado em amostras de pacientes sem
sintomas de pneumonia, provavelmente representado a colonização ou infecção
subclínica (21). Este resultado clínico não específico, mas em métodos
moleculares positivos na detecção do fungo, evidencia a baixa especificidade do
diagnóstico clínico e alta especificidade para os testes moleculares, por isso a
necessidade de incluir nos exames de rotina laboratorial métodos moleculares
para auxiliar no prognóstico do pacientes, principalmente com HIV/AIDS (64, 67)
Há poucos anos, foi desenvolvido um método de PCR em tempo real, que
quando aplicado na detecção do DNA de Pneumocystis, tem revelado, além de
grande sensibilidade e especificidade, um grande potencial de análise quantitativa,
auxiliando na diferenciação entre uma colonização e infecção, no entanto, ainda
possui um alto custo para reprodutibilidade diagnóstica (64, 73, 74).
A implantação de técnicas moleculares auxilia no diagnóstico específico e
sensível do P. jirovecii, já que a sensibilidade das técnicas de coloração e
microscopia, embora sejam aceitáveis, é de 70 a 92% para espécimes isolados de
LBA, sendo mais baixas em amostras de aspirados e indução de escarro que é de
35 a 78%. Nos últimos anos, com a introdução das técnicas de PCR, tem sido
considerado um aumento na sensibilidade da detecção de P. jirovecii, o qual é
31
agora de 86 a 100% em espécimes de LBA, aspirados e indução de escarro (51,
52, 64, 66).
Além de auxiliar no diagnóstico, as técnicas de sequenciamento e
genotipagem de P. jirovecii propuseram algumas respostas em relação ao
comportamento do fungo. Estudos utilizando vários lócus, concomitantemente,
para detecção e sequenciamento de P. jirovecii, denominado sequenciamento de
gene multilocus, revelou características importantes com uma grande diversidade
genética, aspectos epidemiológicos e parâmetros clínicos (63, 75, 76).
Essas mutações evidenciaram que o P. jirovecii não tem um
comportamento clonal em suas replicações, gerando uma alta diversidade
genética, podendo estar associado à severidade da doença. Ainda, com os genes
ITS e mtLSU rRNA, foi observado uma diversidade temporária durante diferentes
episódios de PPC. Genótipos observados na forma latente foram diferentes dos
genótipos em fase proliferativa, indicando que as variações podem ocorrer em
diferentes fases de vida do microrganismo (3, 76, 77).
Historicamente, o entendimento da biologia, infecção ou colonização por
Pneumocystis jirovecii obtiveram grandes avanços, principalmente com os
métodos moleculares, tanto para detecção em amostras clínicas e diferenciação
dos genótipos. Desse modo, os métodos moleculares são uma ferramenta
atualmente indispensável no manejo do Pneumocystis jirovecii.
32
33
2. OBJETIVOS
I. Padronizar a técnica de PCR e Nested PCR para detecção de
Pneumocystis jirovecii;
II. Comparar os resultados da técnica de detecção por PCR e Nested PCR
com a técnica de coloração com azul de toluidina;
III. Estudar a frequência de detecção de Pneumocystis jirovecii em amostras
de LBA de pacientes submetidos à broncoscopia;
IV. Estudar a frequência de detecção de Pneumocystis jirovecii em amostras
de escarro, sangue, soro e plasma de pacientes HIV com suspeita de
pneumocistose;
V. Analise molecular através de sequenciamento do gene mtLSUrRNA das
amostras positivas para Pneumocystis jirovecii;
34
35
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Local, pacientes e período.
O estudo foi realizado no Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de
Campinas (HC/UNICAMP). A pesquisa foi realizada com dois grupos, um de
pacientes HIV positivos, com suspeita de PPC e outro com pacientes HIV
negativos, com doença pulmonar em investigação.
As amostras de pacientes HIV positivos com suspeita de PPC foram
provenientes da Enfermaria de Moléstias Infecciosas, que desde janeiro de 2012
haviam sido coletadas e armazenadas no banco para pesquisa de P. jirovecii.
As amostras de LBA foram coletadas pelo Serviço de Broncoscopia, no
período de fevereiro de 2013 até setembro de 2013.
Após análise molecular, foi realizado levantamento detalhado dos dados
dos pacientes, visando comparação das doenças correlacionadas como doenças
pulmonares, coinfecções, fatores de riscos associados à colonização/ infecção por
P. jirovecii, sinais e sintomas relacionados à presença/ ausência de P. jirovecii na
amostra.
Os pacientes foram devidamente informados sobre o estudo através do
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 1).
3.2 Critérios para inclusão dos pacientes no estudo
- Pacientes com doença pulmonar, internados ou em acompanhamento
36
ambulatorial no Hospital de Clínicas da UNICAMP;
- Pacientes com sinais e sintomas relacionados ao aparelho respiratório e
associados potencialmente a P. jirovecii;
- Pacientes sintomáticos do ponto de vista respiratório, com ou sem alterações
radiológicas pulmonares;
- Consentimento do paciente ou do responsável para a coleta de amostras
utilizadas neste estudo.
3.3 Métodos
Os métodos utilizados para a detecção do P. jirovecii foram: extração do
DNA das amostras, amplificação gênica pela reação em cadeia da polimerase
(PCR), sendo realizada a PCR e Nested PCR e posterior sequenciamento
genético automatizado, segundo a técnica descrita por Sanger.
O método para coloração foi realizado através da técnica com azul de
toluidina modificada, baseada na técnica de Linda L. Gosey (1985) e G. Aderaye
(2008).
Foram aceitos, de um mesmo paciente mais de um tipo de amostra,
portanto, houve mais amostras do que o número de pacientes do estudo. A
técnica de coloração foi realizada somente de amostras pulmonares. Na reação de
sequenciamento foram selecionadas as amostras com maior qualidade para
visualização dos fragmentos sequenciados.
37
Seguindo a análise genômica, foi realizado um levantamento detalhado dos
prontuários dos pacientes para possíveis associações com os resultados
moleculares e de coloração.
3.3.1 Coleta de amostras
As induções de escarro foram realizadas segundo Scheicher et al. (2003)
(78), sendo efetuada a inalação de uma solução salina hipertônica no paciente
com HIV/AIDS, sendo esta técnica rápida e de baixo custo para detecção de
pneumonia por P. jirovecii. Foi utilizado um nebulizador recomendado para a
indução de escarro, para evitar a bronquioconstrição excessiva durante a inalação
de solução salina. A indução de escarro requer um alto grau de cooperação
destes pacientes, pois estes produzem pouca secreção devido o seu estado. A
concentração de salina utilizada foi de 0,9 a 7%, onde a nebulização durou entre
15 a 20 minutos, dependendo da produção de escarro do paciente. Foi coletado
de 5 a 10 ml de escarro em tubo estéril de cada paciente a ser estudado.
Durante as broncoscopias foram coletados duas amostras de LBA, uma
para diagnóstico de rotina do hospital e a outra encaminha exclusivamente para
pesquisa de P. jirovecii por PCR e coloração em lâmina de azul de toluidina.
As amostras de sangue foram coletadas em tubos com anticoagulante
EDTA, cerca de 4 ml de sangue, em tubo estéril. Com essa amostra foi possível
separar o plasma do sangue através de centrifugação.
38
Para coleta de soro foi utilizado um tubo seco, sem anticoagulante, e
posteriormente centrifugado para obtenção do soro.
3.3.2 Processamento de amostras de escarro e LBA
Todas as amostras de indução de escarro e LBA foram enviadas ao
laboratório em frasco estéril, logo após a coleta, pois é recomendado que as
amostras fossem processadas o mais breve possível, ou até 2 horas, para
assegurar o diagnóstico. Após a recepção da amostra, este material foi transferido
para um tubo Falcon de 15 ml e acrescentado DTT 0,1% (ditiotreitol), na
proporção de uma vez do volume da amostra. O objetivo do uso do DTT foi como
agente mucolítico. Para evitar a inibição não específica da PCR, foi preparado
uma amostra sem DTT para a PCR. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm
por 10 minutos e o pellet ressuspendido em 1/10 do volume inicial.
Aproximadamente 200 μl do pellet foram armazenados em freezer a -20o C até
extração do DNA e amplificação. O pellet tratado com DTT foi usado para a
preparação do esfregaço para a coloração de Azul de Toluidina.
3.3.3 Preparo das lâminas para coloração com azul de
toluidina
As lâminas para coloração foram preparadas com 10µL do pellet tratado
com DTT, aplicado no centro da lâmina e deixado secar em capela de fluxo
laminar por aproximadamente 1hora.
39
Após secagem, as lâminas foram fixadas com uma solução mordente4 que
também auxilia na remoção do excesso de muco que pode interferir na
visualização dos cistos após a coloração. A solução mordente é composta por
75% de ácido acético e 25% de ácido sulfúrico. Para fixação, as lâminas foram
imersas na solução, em uma jarra de Coplin, por 10 minutos e depois realizado
enxague em fio d’água corrente por 3 minutos.
Para coloração, utilizamos uma solução composta com azul de toluidina O
0,3g, 140 mL de Álcool etílico e 2 mL de acido clorídrico. As lâminas foram
cobertas com essa solução corante e deixado agir por 4 minutos.
O enxágue do corante foi realizado com remoção gradativa, primeiro com
álcool etílico 96%, também imergindo as lâminas em jarra de Coplin, seguido de
álcool etílico 100% e fixação final com xilol.
Após secagem na capela de exaustão, foram realizadas as leituras em
microscópio óptico, todas as amostras positivas foram fotografadas para avaliação
e comparação.
Para controle do corante foram utilizadas células de Candida albicans em
todos os ensaios de coloração.
4Uma solução Mordente tem como função intensificar a coloração, aumentar a afinidade do corante com as
estruturas da célula, revestir a estrutura a ser corada deixando- a mais espessa e facilmente visível após a coloração.
40
3.3.4 Leitura das lâminas
As lâminas após coloração, foram analisadas em microscópio óptico, sob
aumento de 100 x para leitura panorâmica e posterior 400x para detalhamento das
células visualizadas. Todas as lâminas com alguma estrutura ovalada, leveduras
ou suspeita de Pneumocystis jirovecii foram analisadas por mais 1 biologista do
laboratório de Micologia do Laboratório de Patologia Clínica do HC/UNICAMP.
No microscópio óptico foram pesquisadas as seguintes células:
- Células positivas (P. jirovecii): coradas em azul; os cistos podem aparecer com
um pequeno halo entre 5 μm de diâmetro, trofozoítos podem aparecer por alguns
minutos por toda a coloração;
- Células negativas: núcleo azul e citoplasma róseo.
3.3.5 Protocolos para detecção molecular de P. jirovecii
3.3.5.1 Método de Extração de DNA “in house”
A extração do DNA genômico foi realizada com 200μl, da amostra
preparada anteriormente. Depois de armazenada a amostra foi homogeneizada e
o pellet colocado em um tubo estéril de microcentrífuga e centrifugado a 3000 rpm
por 5 minutos. Após isso, realizado a digestão do precipitado com proteinase K
(Boehringer Mannhein) com uma concentração final de 0,4 mg/ml na presença de
500 μl de proteinase K buffer (10 mM de Tris com pH 8,0, sendo que a solução
Tris com 0,5% de duodecil sulfato de sódio, 25 mM de EDTA, 0,1 M de NaCl)
aquecido a 55o C por 2 (duas) horas, seguido da inativação da proteinase K a 95o
41
C por 5 minutos. O DNA foi extraído em duas (2) alíquotas de cada amostra,
sendo realizada com fenol e clorofórmio, sendo este purificado e concentrado. O
DNA presente na fase aquosa foi precipitado com etanol e ácido acético 3M. O
controle negativo foi preparado ao mesmo tempo para monitorar possíveis
contaminações cruzadas. O precipitado após secagem foi ressuspendido com 10
μL – 20 μL de água destilada.
3.3.5.2 Quantificação do DNA extraído pelo método “in
house”
As amostras após extração foram quantificadas em espectrofotômetro
Nanodrop®, baseado em espectrometria segundo lei de Lambert-Beer. Nesse
equipamento, escolhemos a opção de análise de DNA de dupla fita, que analisa o
DNA de em uma absorbância a 260 nm, mas também analisa a presença de
proteínas a 280nm e outros contaminantes a 230nm.
Assim, fazendo as razões da absorbância 260/280 e 260/230 verificamos a
pureza da amostra. Quanto mais pura for amostra (ou seja, com menos
quantidade de proteínas ou solventes orgânicos utilizados aquando a sua
extração), maiores serão estas razões. Geralmente, utiliza-se como valor de
referência de pureza do DNA 1,8, ou seja, considera-se que amostra é pura
quando A260/A280≥1,8 e A260/230≥1,8.
Após a leitura, o equipamento, acoplado a um software em um computador,
processa as informações coletadas em gráficos e tabelas, com a concentração e
razões dos dados analisados (Figura 5).
42
Figura 5: Leitura da concentração de DNA em espectrofotômetro Nanodrop.
As concentrações de DNA maiores que 50ng/µL foram diluídas para seguir
com os protocolos moleculares. As amostras com DNA com concentração menor
que 50ng/µL, também foram utilizadas para as análises moleculares.
3.3.5.3 Controle de qualidade com o PCR do gene da β-
Globina
Todas as amostras foram primeiro submetidas à amplificação do gene da β-
globina humana. Utilizaram-se os iniciadores G73 e G74 (Tabela 2), que
amplificaram um segmento de 268 pares de bases (pb) do gene da β-globina
humana como um controle para a qualidade do DNA obtido na extração (79). A
PCR foi realizada usando um termociclador numa mistura reacional contendo os
seguintes componentes num volume final de 25µl: 1,5µl de tampão 10x, 3,0µl
25mM de MgCl2, 0,2µl de cada iniciador G73 e G74 (5pmol), 2,5µl, 10mM dNTP,
0,1µl de Taq plomerase a 5UI, 1µl de DNA e 7,5µl de H2O para cada amostra.
43
O programa para amplificação, do gene da beta globina, no termociclador
foi de 1 ciclo de 95ºC por 9 minutos seguido de 40 ciclos de 94ºC por 1 minuto,
56ºC por 1 minuto e 72ºC por um minuto, com extensão final de 72ºC por 7
minutos.
Tabela 2: Sequencia de primers que flanqueiam uma região conservada do gene
da β-Globina Humana utilizados na PCR.
Primers – 268 pb Sequência de nucleotídeos (5’—3’)
Sense – G73 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC
Antisense G74 CAACTTCATCCACGTTCACC
Após a PCR as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de
agarose a 1,5% com brometo de etídio para visualização do fragmento de DNA
sob luz ultravioleta.
Durante a execução da PCR, foram seguidas as normas de manipulação
em biologia molecular, a fim de evitar qualquer tipo de contaminação nas amostras
processadas:
a. O DNA a ser amplificado foi manipulado em sala separada (sala pré-PCR)
de onde a amplificação foi feita (sala pós-PCR);
b. Todos os reagentes e materiais pré-PCR e pós-PCR foram preparados e
utilizados em ambientes diferentes;
c. Antes da abertura de tubos tipo “eppendorf”, realizado rápida centrifugação
em microcentrífuga, para concentrar o líquido, contido no tubo, na região
44
inferior e evitar a dispersão do mesmo por aerossol;
d. Todo material plástico (ponteiras e tubos do tipo “eppendorf”) utilizado
foram descartáveis, estéreis e não reutilizados;
e. Jogo de pipetas para cada área;
f. Ponteiras com filtro para evitar contaminação via aerossol;
g. Uso de hipoclorito a 1% e etanol a 70% antes e após o uso da bancada;
3.3.5.4 Detecção de P. jirovecii pelo gene mtLSU rRNA –
PCR e Nested PCR
Para a PCR e a Nested PCR foram utilizados os primers desenhados no
lócus gênico mtLSU rRNA. Para a PCR convencional o par de primers utilizado foi
o pAZ102-H e pAZ102-E descritos por Wakefield (Tabela 3) (58). Um segundo par
de primers, internos aos primers pAZ102-H e pAZ102-E, foram utilizados para
reação de Nested PCR, denominados pAZ102-X e pAZ102-Y descrito por Tsolaki
(Tabela 3).
A PCR para P. jirovecii foi aplicada com algumas modificações, baseada no
método descrito por Tsolaki et al. (1998). Em um microtubo “eppendorf”, foi
adicionado o DNA a ser estudado com uma mistura equilibrada de cloreto de
potássio 50 mM, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,4), 3 mM de cloreto de magnésio
(MgCl2), 5 pmol de cada primer , 40 μM de cada desoxirribonucleose trifosfato -
dNTPs (dATP, dGTP, dCTP; dTTP) e 5.0 U de Taq DNA polimerase .
Os ciclos foram realizados automaticamente em equipamento apropriado,
termociclador. A reação foi conduzida inicialmente, por 1 ciclo a 94C durante 2
45
minutos, para inativação de qualquer atividade de protease que possa interferir
com a reação enzimática, e posteriormente por 30 ciclos de amplificação em
termociclador automático e cada ciclo sob as seguintes condições:
1) Separação das hélices de DNA por aquecimento em temperatura de 94C
durante 1minuto (desnaturação);
2) Ligação complementar entre os primers e o DNA em temperatura de 50C
durante 1 minuto (anelamento);
3) Síntese de DNA pela Taq DNA polimerase em temperatura de 72C durante
1 minuto;
4) Extensão final 72ºC por 7 minutos.
Utilizando uma alíquota de 2µL da reação de amplificação por PCR,
realizamos a Nested PCR com os primers internos e o mesmo protocolo de reação
da PCR convencional, substituindo a amostra de DNA pelos 2µL da reação de
PCR convencional.
O fragmento alvo de DNA, das amostras, amplificados pela PCR
convencional com os primers externos pAZ102-H e pAZ102-E, resulta em um
fragmento de 346pb e a amplificação com os primers internos pAZ102-X e
pAZ102-Y, deve resultar em um fragmento de 260 pb. Para visualização do
fragmento alvo, foi realizado eletroforese em gel de agarose 1,5% com brometo de
etídio para visualização do DNA sob luz ultravioleta.
46
Para controle positivo da reação, utilizamos amostras de pacientes
portadores do vírus da AIDS com desenvolvimento de pneumonia por P. jirovecii,
e como controle negativo, amostras de indivíduos com ausência de infecção por P.
jirovecii e água.
Tabela 3: Sequências dos primers utilizados na PCR e Nested PCR, P. jirovecii
locus mtLSU RNAr.
Primers Externos – PCR – 346pb Sequência de nucleotídeos (5’ -- 3’)
Sense – pAZ102-H GTGTACGTTGCAAAGTACTC
Antisense - pAZ102-E GATGGCTGTTTCCAAGCCCA
Primers Internos – Nested PCR – 260pb Sequência de nucleotídeos (5’ -- 3’)
Sense – pAZ102-X GTGAAATACAAATCGGACTAGG
Antisense - pAZ102-Y TCACTTAATATTAATTGGGGAGC
3.3.5.5 Reação de Sequenciamento
As amostras de P. jirovecii positivas na Nested PCR foram diretamente
sequenciadas usando o primer interno sense pAZ-102-X. O equipamento utilizado
foi o sequenciador ABI 3500XL da Life Technologies®, que utiliza o método
Sanger de sequenciamento, proposto por Frederick e Sanger na década de 70.
Este método consiste na adição de nucleotídeos modificados e marcados
com fluorescência, chamados dideoxirribonucleotídeos, além dos nucleotídeos
comuns. Durante a reação, os nucleotídeos não marcados iniciam a extensão e
quando um nucleotídeo modificado é incorporado aleatoriamente, os fragmentos
não são mais estendidos. Dessa forma, são gerados fragmentos de diversos
47
tamanhos, que são separados por eletroforese capilar e podemos verificar a
posição de cada nucleotídeo após a leitura no sequenciador ABI 3500xL Genetic
Analyzer. As reações de sequenciamento foram feitas utilizando o kit BigDye
Terminator versão 3.1 Cycle Sequencing Kit.
Na reação utilizamos: 1,0 μl de Big Dye; 0,5 μl de tampão; 0,6μl de primer
pAZ-102-X; 0,8µl da Nested PCR e água deionizada em quantidade suficiente
para completar 15μl de volume total de reação. As condições da reação, em
termociclador, ocorreram com desnaturação inicial a 95°C por 1 minuto e vinte e
cinco ciclos de: 95ºC por 10 segundos para a desnaturação do DNA; 50°C por 5
segundos para a hibridização do iniciador; 60ºC por 4 minutos para ação da
enzima Taq polimerase.
O produto da reação de sequenciamento foi purificado para que apenas o
fragmento amplificado seja revelado no sequenciador 3500xL Genetic Analyzer,
evitando interferentes na análise das sequencias. Para isso, foi adicionado 2,5μl
EDTA (125mM), 30µl de etanol absoluto, misturado em Vortex® e incubado por 15
minutos em temperatura ambiente (20 -25ºC). Em seguida, centrifugado a 4000
rpm por 30 minutos, descartado o sobrenadante e adicionado 30µl de etanol 70%,
centrifugado novamente por 15 minutos a 4000 rpm. Descartado o sobrenadante e
secado a 65º C por 3 minutos. Antes da análise, foi ressuspendido em 10μl de
formamida Hi-Di™ em seguida desnaturado a 95°C durante 5 minutos.
Finalmente o produto foi aplicado ao sequenciador ABI 3500 XL Life
Technologies®. Para a análise do eletroferograma utilizamos o software
48
Sequencing Analysis vs 5.4. O alinhamento de sequências foi obtido pelo
programa ClustalX® acoplado ao programa BioEdit® e a análise da sequência do
lócus pAZ102 X foi realizado utilizando os dados do "Gene Bank"
(www.ncbi.nlm.nih.gov).
3.4 Aspectos éticos
O procedimento de coleta foi efetuado com o consentimento do paciente ou
do responsável, através da assinatura do Termo de Consentimento Livre e
Esclarecido (TCLE), anexo 1, pós-informação, de como será realizado o presente
estudo.
O procedimento de coleta de escarro e realização de exames
complementares é rotineiramente efetuado em pacientes com suspeita de
Pneumocystis ou diagnóstico de doença pulmonar indefinida. Os pacientes foram
informados sobre os objetivos do estudo, sobre a utilização de seus dados clínicos
e laboratoriais no mesmo.
Todos os dados coletados e resultados serão monitorados através dos
procedimentos descritos, sendo confidenciais e utilizados para fins de ensino e
possíveis divulgações em livros, jornais ou revistas científicas brasileiras e/ou
estrangeiras.
49
Os nomes dos pacientes a serem incluídos no estudo serão mantidos em
absoluto sigilo, não sendo registrados em qualquer tipo de publicação ou tese no
qual esse projeto se destina.
3.5 Metodologia estatística
A análise estatística foi realizada com análise exploratória de dados, através das
medidas da estatística descritiva. Para análise comparativa dos dados categóricos
foi utilizado o teste do Qui-quadrado e, quando necessário o teste exato de Fisher.
O nível de significância adotado foi de 5% aplicados quando possível comparar
grupos categóricos como sexo, idade e sintomas.
50
51
4. RESULTADOS
Foram processadas 139 amostras, maior número do que a quantidade de
pacientes do estudo, 117. Os pacientes HIV positivos com suspeita de PPC foram
o grupo em menor número, 16 indivíduos, e a maioria dessas amostras, foram
provenientes do banco de amostras, armazenadas desde janeiro de 2012, sendo
escarro, sangue, soro e plasma.
O grupo de pacientes HIV negativos foi maioria nesse estudo, 101
indivíduos. Assim sendo, a maioria das amostras também foram de pacientes HIV
negativos e coletados em entre fevereiro até setembro de 2013.
Como realizamos coloração das amostras pulmonares, a quantidade de
amostras realizadas a PCR e Nested PCR são maiores que a coloração com azul
de toluidina. Em seguida a técnica de sequenciamento, com as amostras que
apresentaram desempenho excelente na reação, com 51 amostras sequenciadas.
O levantamento detalhado do perfil dos pacientes foi realizado de 51
indivíduos, visando comparação do resultado da detecção do P. jirovecii com
sinais e sintomas, coinfecções e fatores de risco.
A tabela a seguir, resume os dados analisados, pacientes do estudo e
quantidade:
52
Tabela 4: Análises realizadas
Descrição HIV positivos (quantidade)
HIV negativos (quantidade)
Total
Pacientes 16 101 117
Amostras
Sangue 10
139
Soro 10
Plasma 10
Escarro 7
LBA 1 101
Coloração com azul de toluidina
Escarro 7
109
LBA 1 101
PCR e Nested PCR
Sangue 10
139
Soro 10
Plasma 10
Escarro 7
LBA 1 101
Sequenciamento
Sangue 01
51 Soro 01
LBA 01 48
Análise de Prontuários 7 44 51
53
4.1 Amostras processadas
As amostras recebidas foram separadas e analisadas de acordo com os
protocolos descritos. Foram processadas 139 amostras, sendo 101 amostras de
LBA de pacientes HIV negativos e 38 amostras de pacientes HIV/ AIDS. Dos
pacientes HIV/AIDS processamos 10 amostras de soro, 10 amostras de sangue,
10 plasma, 7 amostras de escarro e 1 de LBA. As 102 amostras de LBA foram
coletadas pelo setor de Broncoscopia do HC/UNICAMP. As 38 amostras de
pacientes com HIV/AIDS foram provenientes da enfermaria de Moléstias
Infecciosas do HC/UNICAMP (Figura 6).
Figura 6: Porcentagem das amostras processadas para detecção de P. jirovecii através de PCR,
Nested PCR e/ou coloração com a azul de toluidina.
4.2 Coloração de lâminas com azul de toluidina
No total de 109 amostras pulmonares foram realizadas coloração com azul de
toluidina, sendo 7 amostras de escarro e 102 amostras de LBA. Duas amostras de
escarro foram positivas e apenas 1 LBA positivo para cistos de P. jirovecii. Todas
Pacientes com HIV Pacientes sem HIV
10 10 10 7 1
101
Amostras processadas
SANGUE PLASMA SORO ESCARRO LBA
26%
74%
54
as amostras positivas na coloração com azul de toluidina foram de pacientes com
HIV/AIDS (Figura 7).
Figura 7: Amostras coradas com azul de toluidina, todas as amostras positivas são de pacientes
com HIV/AIDS
Nas lâminas controle de C. albicans as células apresentaram coloração de
rosa a Pink (Figura 8).
Figura 8: C. albicans coradas com azul de toluidina O, com coloração de rósea (aumento de 400x).
LPC –UNICAMP/ Lab. Micologia.
As lâminas negativas de LBA apresentaram pouco muco e células (Figura
9).
2
1
5
101
Escarro
LBA
Negativo Positivo
55
Figura 9: Lâmina negativa de LBA após coloração com azul de toluidina. Foto: Santos, C.R.
Nas lâminas negativas de escarro, mesmo após tratamento, ainda
apresentavam grande quantidade de muco e geralmente leveduras eram
encontradas nas amostras (Figura 10).
Figura 10: Lâmina de escarro negativa após coloração com azul de toluidina. No detalhe da seta
em amarelo, leveduras com brotamento, estrutura para diferenciação com cistos de P. jirovecii (aumento de 400x). LPC –UNICAMP/ Lab. Micologia.
As amostras positivas de escarro apresentaram cistos com coloração
lavanda, no entanto, com difícil visualização pelo excesso de muco ainda restante
na amostra (Figura 11).
56
Figura 11: Lâmina de escarro positiva, cistos de P. jirovecii, o detalhe na seta é um cisto com a
parede na coloração lavanda (aumento de 1000x). Foto LPC –UNICAMP/ Lab. Micologia.
A amostra positiva de LBA apresentou grande quantidade de cistos na
lâmina, com pouco muco, cistos com a parede corada intensamente na cor
lavanda e agrupados, característico de P. jirovecii (Figura 12).
Figura 12: Lâmina positiva de LBA corada com azul de toluidina. Figura A com 2 agrupamentos de
cistos, 1 agrupamento com cistos nítidos com pouco muco e outro agrupamento com cistos imersos em muco com difícil definição (aumento de 400x). Figura B, Cistos, com intensa coloração lavanda, típica de P. jirovecii (aumento de 1000x). LPC –UNICAMP/ Lab. Micologia.
A B
57
4.3 Extração e quantificação de DNA
O método “in house”, a partir da técnica com fenol-clorofórmio teve bom
desempenho para extração do DNA, podendo ser verificado pela quantificação em
espectrofotômetro e PCR da beta globina.
A quantificação, em nano grama por microlitro (ng/µL) foi encontrada com
mínimo de 5,29 ng/µL, média de 71,88 ng/µL e máximo de 4308,4 ng/µL. O
histograma abaixo mostra a frequência dessa quantificação no espectrofotômetro.
Na maioria das amostras foram obtidos DNA entre 5,29 – 50 ng/µL, sendo que 8
amostras tiveram DNA abaixo de 10ng/µL e apresentaram bom desempenho na
PCR da beta globina e pAZ.
Para realizar a PCR, essas amostras com DNA acima de 50 ng/µL foram
diluídas com água destilada para atingir a concentração adequada para PCR, 50
ng/µL, evitando interferência do DNA quando em alta concentração.
Figura 13: Histograma das concentrações de DNA encontradas nas amostras, em nanograma por
microlitro (ng/µL).
44
22
10 4 2 2 3 2
14
50 100 150 200 250 300 350 400 Mais
ng/uL
Quantificação de DNA em ng/uL
58
A análise estatística, utilizando “Box plot”, demonstra uma alta dispersão
para os valores acima de 360 ng/µL. Segundo a análise, os valores mínimo e
máximo estão entre 5,29 – 357,64, os valores acima de 357, 64 foram raros e
considerados valores extremos aos dados analisados.
Figura 14: Box plot dos valores obtidos na quantificação de DNA (representação da dispersão de
dados). Primeiro quartil 39,5, mediana 71,8 e terceiro quartil 169,78. Valor mínimo 5,29 e máximo 357,64, os valores acima do máximo são considerados extremos.
4.3.1 Controle com a beta globina
De todos os DNAs extraídos foi realizada a PCR com o primer da beta
globina, 100% das amostras foram positivas, indicando boa qualidade do DNA
para aplicação de outras técnicas de PCR (Figura 15).
39,5 71,8
169,78
4308,4
5,29
357,64
59
Figura 15: Gel de agarose 1,5%, controle da qualidade do DNA com o fragmento genético da beta globina. Na coluna L marcador de 100pb , colunas de A-R amostras positivas para o fragmento de 268pb da beta globina.
4.4 Amplificação gênica pela PCR e Nested PCR
A PCR convencional foi aplicada para 139 amostras, sendo que, 6 amostras
foram positivas para fragmento pAZ102-H/E do DNA mitocondrial de P. jirovecii.
Dessas amostras positivas, 2 são LBA e 4 são amostras de escarro. As 10
amostras de sangue, soro e plasma de pacientes com HIV/AIDS foram negativas
na PCR convencional.
Os produtos da PCR convencional de todas as amostras (sangue, soro,
plasma, LBA e escarro), mesmo quando negativos, foram adicionados à reação de
Nested PCR, individualmente, conforme o protocolo.
A Nested PCR das 139 amostras resultou em uma intensificação da 1º
amplificação com 91 amostras positivas e 48 negativas para o fragmento do DNA
mitocondrial, pAZ102 X/Y, do P. jirovecii.
268 pb
G L A D H I J K M O N P B C F E L R Q
60
Nas amostras de LBA houve um aumento significativo na positividade com
a Nested PCR. Das 102 amostras, em 75 foi detectado o fragmento de DNA do P.
jirovecii e 27 amostras foram negativas (Tabela 5).
Nas amostras de pacientes com HIV/AIDS, com a Nested PCR, foi possível
detectar tanto o P. jirovecii pulmonar em amostras de escarro quanto em amostras
de sangue, soro e plasma. Nas amostras provenientes desses pacientes HIV, das
7 amostras de escarro 4 foram positivas e 3 negativas na detecção do fragmento
de DNA do P. jirovecii. Das amostras sanguíneas, 4 de 10 amostras de sangue
foram positivas, 6 de 10 plasmas positivos e 2 de 10 soros positivos, resultado que
não havia sido observado na PCR convencional (Figura 16).
Figura 16: Amostras de PCR e Nested PCR positivas para P. jirovecii de pacientes com HIV/AIDS.
Sangue; 4
Plasma; 6
Soro; 2
Escarro; 4
Escarro; 4
LBA; 1
LBA; 1
PCR Nested PCR
61
Tabela 5: Resultado da PCR e Nested PCR para detecção do fragmento
mitocondrial de P. jirovecii.
Amostra Qtd
PCR Nested PCR
Positivo Negativo Positivo Negativo
LBA 102 2 100 75 27
Escarro 7 4 3 4 3
Sangue 10 0 10 4 6
Soro 10 0 10 2 8
Plasma 10 0 10 6 4
Total 139 (100%) 6 (4,3%) 133 (95,7%) 91 (65,5%) 48 (34,5%)
A separação dos fragmentos de DNA realizada por eletroforese no gel de
agarose, para a PCR convencional, foi possível observar a presença do fragmento
com 346 pb , de acordo com o tamanho esperado para detecção do fragmento de
DNA do P. jirovecii com os primers PAZ H/E.
Na figura 17 é possível observar bandas de 346 pb nas colunas 2, 3 e 4, no
entanto, a intensidade de fluorescência são menores nas colunas 2 e 4
comparando com a 3. Nesse caso, isso demonstra maior quantidade do fragmento
de DNA amplificado.
62
Figura 17: Eletroforese em gel de agarose 1,5%. L: marcador de 100pb; Colunas 1 - 4 amostras de
PCR convencional para P. jirovecii. CN: controle negativo e CP: controle positivo.
Já na eletroforese da Nested PCR, o fragmento observado foi de 260pb,
portanto, positivos para P. jirovecii (Figura 18).
Figura 18: Eletroforese em gel de agarose 1,5%. L: marcador de 100pb; Colunas 1 - 9 amostras
positivas de Nested PCR para P. jirovecii. CN: controle negativo e CP: controle positivo com 260pb.
4.5 Análise da região mtLSU rRNA por sequenciamento direto
A região mtLSU rRNA foi amplificada e sequenciada com o primer interno
pAZ102-X (sense), correspondente à posição 13144 até 13396, contemplando,
portanto, 256 bases para estudo. Sequenciamos 51 amostras, sendo 1 amostra de
sangue, 1 de soro e 49 pulmonares, de diferentes pacientes e que foram positivas
na Nested PCR. Dessas 51 amostras sequenciadas 18 (36,28%) apresentaram
mutações e 33 (64,9%) mantiveram o genótipo selvagem.
L 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CN CP
260 pb
346 pb
L 4 2 CP 3 1 CN
63
As mutações foram encontradas em 9 pontos da região mtLSU rRNA
estudada. Houve substituição de 1 nucleotídeo em cada códon, sendo, códon
4406 posição 13217, “A” foi substituído por “C:” (A → C), códon 4419 posição
13257 (G → A), códon 4431 posição 13294 (T → A), códon 4439 posição 13316
(G ou A), códon 4440 posição 13321 (T → A),códon 4446 posição 13338 (A→ G),
códon 4452 posição 13357 (C → A), códon 4456 posição 13367 (A → C), códon
4457 posição 13371 (A → C) (Figura 19).
Figura 19: Alinhamento das sequencias de P. jirovecii, primer pAZ102-X. A linha 1 de cada seção
é a cepa selvagem. As linhas 20 até 95 são cepas do estudo. As setas indicam a posição do nucleotídeo substituído. Seta 1 - posição 13217 (A → C), Seta 2- 13257 (G → A), Seta 3- 13294 (T → A), Seta 4- heterozigose em 13316 (G ou A), Seta 5 -13321 (T → A), Seta 6 – 13338 (A→ G), Seta 7- 13357 (C → A), Seta 8 – 13367 (A → C) e Seta 9- 13371 (A → C).
As demais 33 amostras que mantiveram o genótipo selvagem, ou seja, não
foi encontrada nenhuma alteração na região estudada (Tabela 3). Uma cepa
apresentou heterozigose na posição 13316 “R” (G ou A), como citado acima,
também considerada uma mutação (Figura 20).
1
1
64
Figura 20: Eletroferograma da amostra de escarro com heterozigoze na posição 13316 “R” (G ou
A)
Observamos em duas amostras, uma de soro e uma de plasma, do mesmo
paciente, que o DNA do P. jirovecii do soro apresentou mutação no códon 4406
posição 13217, de “AAA” passou para “CAA” (Figura 21).
Figura 21: Eletroferograma da amostra de soro sequenciada, primer pAZ-102X. Detalhe da mutação de ponto no códon 4406 “CAA”, posição 13217 (A → C).
No entanto, o DNA do P. jirovecii sequenciado, da amostra de sangue
desse mesmo paciente, permaneceu igual ao genótipo selvagem, inclusive, no
mesmo códon 4406, “AAA”, permaneceu “AAA” (Figura 22).
65
Figura 22: Eletroferograma da amostra de sangue sequenciada, primer pAZ-102X. Detalhe da
ausência de mutação de ponto no códon 4406 “AAA”, igual ao genótipo selvagem.
As mutações de ponto foram encontradas com maior frequência no códon
4406 posição 13217 (A → C) com 21,3% (ocorrência em 10 cepas), seguida do
códon 4431 posição 13294 (T → A) com 12,8% (ocorrência em 6 cepas) e as
regiões restantes tiveram frequência de 2,1%. Os nucleotídeos substituídos
nesses códons geraram mudança do aminoácido a ser formado, em 4 casos, no
códon 4406 de Lisina passou a formar Glutamina, no códon 4440 de Tirosina
passou a ser códon de finalização, no códon 4456 de Isoleucina passou a ser
Leucina e no códon 4457 de Asparagina passou a ser Treonina (Tabela 6).
66
Tabela 6: Mutações de P. jirovecii identificados com o primer pAZ102-X
Códon/ Posição
Nucleotídeo de substituição
Aminoácido Qtd de cepas
Identificação das cepas afetadas
% (n=47)
4406/ 13217
(A → C) Lisina → Glutamina 10 429, 365, 394, 439, 361, 381, 292 e 433
21,3
4419/ 13257
(G → A) Códon de finalização → Codon de finalização
1 292 2,1
4431/ 13294
(T → A) Treonina → Treonina 6 381, 377, 445, 452, 359, 402
12,8
4439/ 13316
R ( G ou A) Asparagina ou Asparagina 1 292 2,1
4440/ 13321
(T → A) Tirosina → códon de finalização 1 406 2,1
4446/ 13338
(A→ G) Códon de finalização → Codon de finalização
1 292 2,1
4452/ 13357
(C → A) Prolina → Prolina 1 376 2,1
4456/ 13367
(A → C) Isoleucina → Leucina 1 445 2,1
4457/ 13371
(A → C) Asparagina → Treonina 1 402 2,1
- Nenhum Genótipo selvagem 33 0 64,7
4.6 Perfil dos pacientes do estudo
O perfil dos pacientes foi dividido em duas categorias, segundo o
diagnóstico para HIV, sendo pacientes “HIV positivos” com diagnóstico positivo
para HVI/AIDS e “HVI negativos” pacientes com diagnóstico negativo para
HIV/AIDS. Foram analisados os itens como idade, sexo e cor da pele para todos
os pacientes. Já para os pacientes HIV, foram também tabelados os dados de
carga viral e contagem de linfócitos T CD4. Os dois grupos foram comparados
67
com o resultado de PCR, Nested PCR e a coloração de lâmina com azul de
toluidina.
Os dois grupos de pacientes tiveram idade média entre 56 e 57 ± 14 anos,
os indivíduos do sexo masculino foram maioria em ambos os grupos, a cor
prevalente de pele foi branca. Os pacientes HIV apresentaram contagem de
linfócitos T CD4 com média de 243 células por mililitro de sangue e média da
carga viral de 77.435 cópias virais por mililitro de plasma (Tabela 7).
Tabela 7: Categorias dos pacientes, perfil, comparação com a Nested PCR e
coloração com azul de toluidina.
Característica HIV positivos n = 16 HIV negativos = 101
Idade 56 ± 14 57,35 ± 14
Masculino 70% 77%
Feminino 30% 23%
Contagem de células CD4/mL de sangue
243 não realizado
Carga viral - cópias/ mL de plasma 77.435 não aplicável
Nested PCR Positiva para P. jirovecii 9 (56,25%) 76 (74,5%)
Azul de Toluidina 3 (18,5%%) 0
Como o grupo de pacientes HIV negativos foi maior, estatisticamente mais
significante que o grupo HVI, foi analisado os fatores de risco e as doenças
pulmonares comparando com o resultado da Nested PCR (ρ>0,05).
Todos os pacientes apresentaram diagnóstico de uma ou mais doenças
pulmonares ou fatores de risco. Desse modo, a tabela 8 e 9 demonstram as
68
ocorrências no número de 51 pacientes, sendo que houve, em alguns casos mais
ocorrências do que o número de pacientes, por se tratar indivíduos com
coinfecções, fatores e doenças concomitantes.
As doenças pulmonares mais comuns foram as neoplasias de pulmão com
16 casos de metástase pulmonar, 15 casos de pneumonia, 12 de tuberculose e 4
de DPCO. A presença do P. jirovecii, detectada pela Nested PCR, estava em
100% das amostras de pacientes com DPOC, em 67% dos pacientes com
tuberculose, em 60% dos pacientes com pneumonia e 37,5% dos pacientes com
neoplasia (Tabela 8).
Nos 15 casos de pneumonia, foram encontrados diferentes patógenos, tais
como Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae
Paracoccidioides brasiliensis e Aspergillus niger. Os 7 casos restantes, o agente
da pneumonia não foi identificado, descrito como indefinido ou não especificado.
Tabela 8: Relação das doenças pulmonares dos pacientes e positividade da Nested PCR para P. jirovecii.
Diagnóstico Ocorrências P. jirovecii positivo (Nested PCR)
Neoplasias pulmonares 16 6
Pneumonia 15 9
Tuberculose 12 8
DPOC 4 4
Total 47 27 (57%)
69
Todos os pacientes tinham dados de imagem (radiológicos ou tomografias)
com alterações, as principais foram presença de nódulos pulmonares e
opacidades.
Os fatores de risco presentes nos pacientes HIV negativos desse estudo
foram HAS, etilismo e tabagismo, sendo que o tabagismo teve a maior frequência
nos diagnósticos (Tabela 9). O grupo de pacientes com etilismo apresentou
positividade de 83% para P. jirovecii, seguido pelo grupo de tabagistas com 79%,
Diabéticos 72% e HAS 71%.
Tabela 9: Relação dos fatores de risco dos pacientes e positividade da Nested PCR para P. jirovecii.
Diagnóstico Ocorrências P. jirovecii positivo (Nested PCR)
Tabagismo 28 22 (79%)
Etilismo 12 10 (83%)
HAS 14 10 (71%)
Diabetes 11 8 (72%)
Total 65 50 (76%)
Os sintomas mais frequentes foram tosse, dispneia, febre, dor torácica e
emagrecimento. Sendo que os pacientes apresentaram um ou mais sintomas e
até ausência de sintomas. Em 51 pacientes os dois sintomas que mais ocorreram
foram tosse e dispneia (Figura 23).
70
Figura 23: Sintomas dos pacientes e positividade de P. jirovecii pela técnica de Nested PCR.
Mesmo com diagnóstico laboratorial negativo, através da técnica com azul
de toluidina padrão utilizado no HC-UNICAMP, dos 117 pacientes deste estudo, 6
foram diagnosticados e tratados como Pneumocistose, pois, agregaram
clinicamente, sinais como tosse, dispneia, saturação de oxigênio menor que 92%
e radiografia com imagens de infiltrados intersticiais. Nesses 6 pacientes
diagnosticados clinicamente com Pneumocistose, na análise molecular, foram
detectados o fragmento alvo de P. jirovecii pela técnica de Nested PCR.
A análise de sequenciamento foi comparada com os dados clínicos dos
pacientes. De 51 casos sequenciados, 18 apresentaram mutação e 33 mantiveram
o genótipo selvagem. As mutações foram comparadas com o tipo de amostra,
paciente submetido à internação, antibioticoterapia, outras doenças e coinfecções
(Tabela 9).
No códon 4406 posição 13217 (A → C), os 3 pacientes que apresentavam
essa alteração de nucleotídeo foram submetidos à internação e apresentavam
24
9 9 11 5
13
6
18
6
3
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Tosse Febre Dispneia Dor torácica Assintomático
P. jirovecii x sintomas
Positivo Negativo
71
pelo menos 1 sintoma de PPC. Segundo os dados clínicos, 2 pacientes faziam
tratamento com antibiótico, 2 eram tabagistas e os 3 tinham mais um patógeno
coinfectante. Um desses pacientes era portador do HIV, coinfectado com P.
jirovecii e Streptococcus pneumoniae (Tabela 10)
As mutações de ponto encontradas nos códons 4431, 4452, e 4456 foram
encontradas em pacientes com fatores de risco como Diabetes e Tabagismo e
Etilismo.
Os 33 casos em que o DNA do P. jirovecii sequenciado manteve o genótipo
selvagem, os pacientes também apresentaram infecções bacterianas, assim como
também fatores de risco e outras doenças.
Tabela 10: Relação das amostras sequenciadas alteradas e perfil dos pacientes.
Paciente Nucleotídeos
alterados Amostra Internado Sintomas Uso de ATB
Outra doença
Coinfecção
365
13217
LBA sim sim SMZ+TMP Tabagismo Paracoccidioides
brasiliensis
429* Soro sim sim SMZ+TMP NI HIV
394 LBA não sim TTO TB Tabagismo,
Etilismo
Micobacterium tuberculosis
433 LBA sim sim
SMZ+TMP, Amoxicilina-Clavulanato, Azitromicina
e Ceftriaxone
PPC, Diabetes
HIV e Streptococcus pneumoniae
381
13294
LBA não sim não Tabagismo não
445 LBA não sim não Diabetes não
445 13367 LBA não sim não Diabetes não
429* Nenhum Sangue sim sim SMZ+TMP NI HIV
376 13357 não não sim não Tabagismo Não
72
*: amostras provenientes do mesmo paciente. ATB: antibiótico, SMZ+TMP: sulfametoxazol +
trimetoprima, TTO TB: tratamento para tuberculose.
73
5. DISCUSSÃO
Verificamos que houve uma alta discrepância entre os resultados de
pesquisa de P. jirovecii através da coloração com azul de toluidina e a técnica de
Nested PCR. A comparação da sensibilidade entre essas duas técnicas já foi
reportado em vários estudos evidenciando a alta sensibilidade e especificidade
das técnicas moleculares em relação à técnica com azul de toluidina (52, 57, 70).
Mesmo com baixa sensibilidade, as lâminas positivas da coradas com azul
de toluidina apresentaram desempenho satisfatório em relação à lâmina controle.
A coloração encontrada foi de acordo com o padrão esperado, apresentando
coloração azul-lavanda, típico da reação dos cistos de P. jirovecii ao azul de
toluidina (28). Nessas lâminas positivas, havia abundância de cistos, sendo de
fácil visualização em microscópio no aumento de 100x. Isso contribuiu até para
diferenciar os cistos de P. jirovecii agrupados, de leveduras isoladas (55). Uma
característica dessas amostras positivas, que provavelmente contribuiu para a
abundância de cistos nas lâminas, é que foram provenientes de pacientes com
HIV/AIDS e diagnóstico presuntivo de PPC clínico.
Entretanto, mais de 90% das amostras foram negativas para a coloração
com azul de toluidina. As causas mais prováveis seriam a própria técnica de
coloração adotada e a baixa sensibilidade da coloração em casos de colonização
(21, 38, 61, 80). Mesmo com a infecção ativa, PPC, a coloração com azul de
toluidina é limitada e específica para as formas císticas. Sendo assim, as formas
trofozoíticas, abundantes na fase proliferativa do P. jirovecii, não puderam ser
74
visualizadas por essa técnica, portanto, nas nossas lâminas negativas poderia
haver trofozoítos ocultados pela técnica adotada (28, 55).
Em casos de colonização, onde o paciente é portador do agente, a
população microbiana está em fase quiescente e reduzida, dificultando o
diagnóstico com coloração em lâmina (57, 72). Na coloração com azul de toluidina
a quantidade de cistos encontrados na amostra pode diferenciar colonização de
infecção ativa (73). Segundo Rohner (2009), uma lâmina de azul de toluidina
positiva auxilia na quantificação do fungo. Mesmo assim, ainda não é consensual
a padronização da quantidade de cistos na lâmina para diferenciar uma infecção
ativa de colonização. Acredita-se que uma lâmina com cistos em abundância é
indicativa de uma infecção ativa, mas a ausência de cistos não pode definir a
ausência do P. jirovecii (54). Provavelmente a maioria dos pacientes desse estudo
eram portadores do P. jirovecii em fase quiescente, sendo, portanto, casos de
colonização.
Desse modo, uma vez que a técnica de azul de toluidina é limitada na
identificação apenas da forma cística do fungo, para diagnosticar a PPC, é
recomendável para o clínico levar em consideração os sinais e sintomas do
paciente, exames radiológicos e laboratoriais, além do resultado da lâmina de zul
de toluidina (28, 55, 73).
Nas amostras, principalmente de LBA, foi detectado um alto índice de
positividade do fragmento mitocondrial do P. jirovecii. Temos aspectos
determinantes nessa alta positividade de 65,5%, tais como a qualidade da amostra
75
de LBA, a qualidade do DNA extraído, o grupo de pacientes estudado, a incidência
geográfica do P. jirovecii, transmissão nosocomial e a sensibilidade da técnica
molecular (43, 54, 60, 72).
Apesar das amostras de LBA serem invasivas, por ser um material
proveniente direto do epitélio pulmonar, há uma diminuição da flora microbiana
que pode interferir no diagnóstico, aumentando a qualidade da amostra para
realizar os ensaios de coloração e moleculares (16, 80, 81). Dessa forma, quando
utilizamos amostra de LBA, aumentamos diretamente a sensibilidade dos ensaios
realizados.
Com uma amostra de qualidade, o método de extração “in house” adotado,
apresentou bom desempenho para os ensaios de moleculares. Exemplo disso
foram os resultados da beta-globina e positividade em amostras de baixa
concentração na PCR convencional para P. jirovecii. Verificamos que na extração
de DNA, há desde amostra com baixas concentrações de DNA até concentrações
extremamente elevadas em relação à media de extração (5 – 4308 ng/µL). A alta
concentração de DNA de algumas amostras pode ser devido às doenças
pulmonares bacterianas, nessas amostras haviam mais material genético
proveniente dos outros microrganismos causadores dessas doenças bacterianas.
Já as baixas concentrações, podem estar atribuídas às diluições da amostra com
soro fisiológico, do procedimento de coleta do LBA.
Além de amostras pulmonares positivas na PCR e Nested, encontramos
também P. jirovecii em amostras de sangue periférico. As amostras de soro,
76
sangue e plasma, de pacientes com HIV/AIDS, positivas na Nested PCR, indicam
que esse organismo é capaz de se deslocar do epitélio pulmonar, através da
circulação sanguínea, podendo migrar para outros órgãos (disseminação
hematogênica). A presença extrapulmonar do P. jirovecii foi relatada em pacientes
HIV/AIDS, também em amostras de sangue desde 1999, principalmente em
pacientes HIV/AIDS, os quais têm estágios de imunossupressão propensos à
multiplicação incontrolada do P. jirovecii (71). Zavascki e colaboradores em 2007
relatou pela primeira vez a ocorrência de P. jirovecii na tireoide, também
evidenciando a migração extrapulmonar desse microrganismo (82).
Os pacientes HIV negativos desse estudo são, na maioria, indivíduos com
fatores de risco para colonização e infecção ativa por P. jirovecii. As enfermidades
mais comuns foram tabagismo, etilismo, neoplasias, pneumonias e DPOC. Muitos
estudos já evidenciaram a coinfecção do P. jirovecii às essas doenças, segundo
Kim (2014) existe uma alta taxa de mortalidade para pacientes com HAS, Diabetes
ou outras doenças pulmonares que vieram a desenvolver a PPC, nesses casos (7,
19, 39, 61, 83, 84).
Segundo Pederiva (2012), pacientes com doenças pulmonares graves
apresentam um risco maior de coinfecção com outros patógenos de doenças
respiratórias como o P. jirovecii (30, 84, 85). Desse modo, como mais de 70% dos
indivíduos deste estudo tinham algum tipo de doença pulmonar, provavelmente,
esse perfil contribuiu nesse alto índice de positividade de P. jirovecii.
77
A maioria dos pacientes apresentaram sintomas de PPC, no entanto, não
foi possível concluir o diagnóstico de PPC a partir dos sintomas e Nested PCR
positiva. Como os sintomas de PPC são extremamente parecidos com outras
doenças, como a tuberculose, seriam necessários diagnósticos adicionais e
diferenciais para estas doenças, geralmente, baseado na exclusão da coinfecção
com outros patógenos (86, 87).
Outro fator contribuinte para o alto índice de positividade na Nested PCR
desse estudo pode ser a localização geográfica. As regiões tropicais como o
Brasil, tem uma maior incidência de infecção por esse microrganismo (35, 88). Um
estudo realizado no Chile demonstrou 65% de positividade na população
estudada, mesmo não sendo um grupo de risco como o de nosso estudo, o índice
de positividade foi quase idêntica, de 65,5% (38, 88).
Como a principal forma de transmissão ocorre através das vias aéreas, a
transmissão em ambiente hospitalar (nosocomial) pode ter sido um fator
importante na disseminação desse patógeno nesses pacientes (27, 39, 89).
Alguns pesquisadores demonstraram que pacientes com PPC podem transmitir o
patógeno a mais de um metro de seu leito, levando a um aumento significativo na
transmissão em ambientes hospitalares. Dessa forma, é muito provável que os
indivíduos que frequentam ambiente hospitalar ou permaneçam próximos de
doentes com PPC, possam ser infectados com o P. jirovecii (13, 21, 39).
De acordo com as recomendações da Organização Mundial de Saúde,
ainda não há uma preconização específica para isolamento respiratório, nesses
78
casos de PPC. Vários estudos ainda devem ser estabelecidos para avaliar a
necessidade potencial de realizar isolamento respiratório para estes pacientes
(49).
A sensibilidade da técnica molecular foi pouco notável na PCR
convencional. A baixa positividade pode ser explicada pela baixa sensibilidade da
técnica de visualização em gel de agarose. De fato, a PCR convencional é uma
técnica extremamente sensível, amplificando até menos que 1ng/µL de DNA de
uma amostra (62). No entanto, a sensibilidade do gel de agarose não é eficiente
nas concentrações muito baixas de DNA amplificado, o que já foi resolvido
utilizando PCR em tempo real (90, 91). Desse modo, para métodos de baixo custo
e “in house”, utilizar a Nested PCR como alternativa para visualizar os fragmentos
alvo de DNA amplificados pode resolver a baixa resolução do gel de agarose,
através de alta concentração de DNA amplificado, alternativa que foi utilizada em
nosso estudo.
Desse modo, a Nested PCR resultou em um aumento significativo na
sensibilidade, permitindo diagnosticar tanto pacientes com a PPC, com um grande
número de microrganismos, como também indivíduos colonizados, os quais
possuem pouca quantidade do fungo para extração de DNA (21, 52, 60, 70).
Sendo assim, já auxiliando no diagnóstico em casos de PPC, detectar a
colonização pode auxiliar na prescrição de tratamentos profiláticos para esses
pacientes quando aplicável, principalmente, em casos de imunossupressão ou
outras comorbidades que apresentem alto risco para proliferação do P. jirovecii
(21, 67, 70).
79
Em um estudo realizado, através da técnica de Nested PCR, com amostras
de lavado bronco alveolar de indivíduos imunocompetentes, demonstrou que 19%
desses indivíduos tem P. jirovecii sem ocasionar dano pulmonar aparente (60).
Nesse caso, o P. jirovecii pode estar no epitélio pulmonar sem causar pneumonias
ou outros danos, possivelmente como um agente colonizador na sua forma
latente, uma descoberta adicional além da sua forma patogênica que pode se
multiplicar levando a danos pulmonares letais (21, 34, 67, 77).
Os resultados negativos na PCR para P. jirovecii, nestes casos de infecção
pulmonar, podem, também, estar relacionados às terapias preventivas com
sulfamídicos que eliminam as formas do P. jirovecii, independente, se está em
fase quiescente ou ativa. Esses medicamentos geralmente são administrados na
profilaxia primária de P. jirovecii, mas são antibióticos comuns no tratamento de
outras doenças bacterianas (54). Uma vez que o paciente recebeu tratamento ou
não está colonizado, o resultado de uma Nested PCR provavelmente seria
negativo (21).
No Hospital das Clínicas da Universidade Estadual de Campinas –
UNICAMP, esse é o primeiro estudo com a PCR para diagnóstico de P. jirovecii,
portanto, não temos referência local para comparações. Entretanto, no Brasil,
estudos realizados com população sem infecção pelo HIV, porém, com doença
pulmonar, como fibrose cística, indicam a presença do P. jirovecii em 38,2%
desses indivíduos (84).
80
A técnica de sequenciamento direto auxiliou na compreensão geral de
alguns resultados desse estudo. A alta diversidade genética ficou evidenciada em
quase 40% das cepas sequenciadas. Comparando com outros estudos, o P.
jirovecii tem como característica uma alta taxa de variação genética,
provavelmente de um desvio na propagação clonal, gerando novas cepas da
mesma espécie, mas com genótipo diferente da sua geração anterior (76, 92).
Segundo alguns autores, esse desvio da propagação clonal pode levar a graus de
severidade da PPC (76, 77). Houve três casos em nosso estudo, os quais tinham
mutações nas cepas sequenciadas e PPC em estado grave.
Os fatores clínicos estão relacionados às possíveis mudanças nos
genótipos de P. jirovecii. Nesse estudo, encontramos 6 fatores que podem ser
considerados pertinentes à essa mudança. Sendo, paciente submetido à
internação, paciente com pelo menos 1 sintoma de PPC (tosse seca, febre ou
dispneia), resistência associado ao uso de antibióticos, doenças pulmonares como
DPOC, Diabetes, tabagismo e coinfecções (76, 77).
A diversidade genética do P. jirovecii também pode estar relacionada a
outros fatores como a localização geográfica, fatores intrínsecos epidemiológicos
que influenciam na circulação e transmissão de diferentes organismos, como as
cepas dissipadas em ambientes hospitalares, ou em determinadas regiões (92).
Houve uma frequência grande da mutação no códon 4406, o que pode sugerir um
genótipo da população local, polimorfismo, e a alta taxa de pacientes colonizados.
81
No entanto, as sequencias atualmente utilizadas para classificar os genótipos, não
foram contempladas com o uso do primer pAZ102-X, desse estudo (67, 93).
O genótipo selvagem, encontrado em 65% das amostras sequenciadas,
pode sugerir os casos de colonização. Estudos realizados com vários lócus ao
mesmo tempo, constataram diferenças genéticas entre as cepas de P. jirovecii
isoladas em diferentes episódios da PPC (94). No entanto, ainda não foi definido
se o genótipo selvagem pertence à forma cística ou trofozoítica, uma vez que a
forma cística provavelmente está na fase quiescente desse fungo, sugerindo
casos de colonização (5, 7, 21, 77).
Outro ponto a ser considerado na forma cística, é que nossa lâmina de
LBA, positiva com a coloração de azul de toluidina, foi sequenciada e detectada
mutação na posição 13217, indicando que as formas císticas podem apresentar
genótipo diferente da selvagem, mas nesse caso em específico, tratava-se de um
paciente com PPC grave.
Geralmente, os estudos de sequenciamento e genotipagem para P. jirovecii
são provenientes de pacientes com sintomas e desenvolvimento da PPC (77). Na
maioria dos casos, há alterações no genótipo, um caso do nosso estudo, no qual
um mesmo paciente, em amostras diferentes, 1 de soro e 1 de sangue apresentou
genótipos diferentes, um com mutação e outro selvagem, deixando em dúvida se
o genótipo selvagem é menos agressivo do que os mutantes. Ou, se as cepas
com mutações ou polimorfismos, podem ser agressivas somente em alguns
casos.
82
Assim como já evidenciado em outros estudos, os métodos moleculares
são uma ferramenta importante na detecção da infecção pelo P. jirovecii como
também no entendimento da biologia do microrganismo. Nosso estudo contribuiu a
evidenciar a presença do P. jirovecii e seus polimorfismos, perfil dos pacientes
associado aos fatores de risco e comorbidades. Como a detecção de P. jirovecii,
diagnóstico e prevenção de PPC são ligadas a história clínica do paciente, os
avanços moleculares podem ser o caminho para diagnóstico definitivo de PPC,
separando dos casos de colonização.
83
6. CONCLUSÕES
Os protocolos moleculares de PCR e Nested PCR, padronizados nesse
estudo, para detecção de P. jirovecii apresentaram desempenho satisfatório, com
alta sensibilidade e especificidade, principalmente quando comparado com a
coloração com azul de toluidina.
A especificidade da técnica de coloração em lâmina com azul de toluidina foi
satisfatória, mas com baixa sensibilidade, mesmo em casos de PPC positivos na
PCR convencional.
A pesquisa de P. jirovecii nas amostras de LBA demonstrou uma grande
quantidade de indivíduos colonizados, os quais, por seu estado clínico com
doenças e fatores de risco indicam uma pré-disposição para PPC.
A pesquisa de P. jirovecii em amostras de pacientes HIV positivos com
suspeita de PPC comprou a presença de P. jirovecii, inclusive em amostras
sanguíneas, sugerindo disseminação extrapulmonar, casos raros na literatura.
O sequenciamento genético das amostras positivas para P. jirovecii
demonstrou mutações que podem ser regionais, podendo ampliar a margem de
entendimento da biologia de P. jirovecii, relacionada à distribuição geográfica.
O perfil dos pacientes foi tendencioso para detecção de P. jirovecii, uma vez
que se tratava de 100% de coorte com comorbidades e fatores de risco, levando a
alta positividade.
84
Nem todos os indivíduos com PCR positiva para P. jirovecii podem ser
considerados com PPC. Uma lâmina de coloração mais uma PCR convencional,
positivas, podem ter grande peso diagnóstico, associados aos sintomas e estado
clínico geral do paciente. No entanto, a presença do fungo, sem causar infecção
aparente, pode ser considerada apenas como uma colonização. Portanto, ainda é
recomendável que os resultados moleculares sejam comparados com o estado
clínico e exames laboratoriais do paciente para definir um diagnóstico de PPC.
85
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8. ANEXOS
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
Eu, ________________________________________________ com RG n° _________________ residente e domiciliado à _________________________________________________________, n°_______Bairro:____________________Cidade:_________Estado:_______ CEP:____________ Telefone (_____)_______________, abaixo assinado, declaro, para todos os fins éticos e legais, que tenho pleno conhecimento que participarei da pesquisa "Identificação de Pneumocystis jirovecii através de métodos moleculares em amostras de pacientes do Hospital de Clínicas da UNICAMP", sob responsabilidade dos pesquisadores Dr. Francisco Hideo Aoki, com o objetivo de implantar e padronizar o método de Reação em cadeia da polimerase (PCR), para detecção do P. jirovecii, avaliado por indução de escarro e/ou lavagem broncoalveolar e sangue, sendo realizado no Hospital de Clínicas da UNICAMP, supervisionado pelo Prof. Dr. Francisco Hideo Aoki, infectologista do Laboratório de Pesquisa em AIDS. Serão realizadas técnicas de microscopia (Azul de Toluidina) e Biologia molecular (PCR e "Nested-PCR") nas amostras. Para eliminar ou incluir a hipótese de que as pneumonias são causadas principalmente por P. jirovecii nestes pacientes, e implantar no HC/UNICAMP a padronização de técnicas sensíveis e específicas para este agente que pode causar várias complicações nestes pacientes. Permito que sejam coletados sangues, escarro e/ou lavagem broncoalveolar, seguido de monitorização durante 120 dias após a primeira coleta. Fica claro que isso não causará nenhum risco e que as coletas não interferirão nos procedimentos de rotina. Tendo como benefício o acompanhamento do início de uma possível pneumonia, podendo identificar o seu agente, e iniciar o tratamento. E terei garantia de que todas as dúvidas geradas da metodologia no decorrer da pesquisa poderão ser esclarecidas pelos pesquisadores. Por este instrumento dou plena autorização para que resultados de exames e/ou qualquer informação obtida durante a pesquisa seja utilizado para fins de ensino e divulgação em livros, jornais e revistas científicas brasileiras e/ou de país estrangeiro, desde que seja reservado o sigilo absoluto da identidade. Estou ciente de que minha participação é voluntária e sem obrigação, podendo interrompê-la a qualquer momento sem penalidades. Declaro que recebi todos os esclarecimentos e dúvidas sobre a pesquisa, bem como sobre a utilização desta documentação para fins acadêmicos e científicos. Recebi uma cópia deste Termo.
CAMPINAS, _____de___________________de ________. Assinatura do Paciente ou Responsável Legal ____________________________ Prof. Dr. Franscisco Hideo Aoki - Tel.: (19) 9601-8161 - E-mail: [email protected] Comitê de Ética em Pesquisa da FCM/UNICAMP– Tel. : (19) 3521-8936