i metodi sperimentali classici per la risoluzione della struttura tridimensionale di una proteina sono:

• la cristallografia a raggi X

• la spettroscopia a risonanza magnetica e nucleare (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)

Come si può studiare la struttura di una proteina

cellula batterica

plasmide

DNA esogeno

moltiplicazione del clone

formazione di cristalli

purificazionedella proteina

diffrazioneai raggi X

NMR

Il pattern di diffrazione viene usato per ricostruire le coordinate dei singoli atomi che compongono la macromolecola e quindi la sua struttura 3D.

I raggi X interagiscono quasi esclusivamente con gli elettroni presenti nella materia e non con i nuclei.

Una struttura ai raggi X è quindi un’immagine della densità elettronica dell’oggetto in analisi

Cristallografia a raggi XLa proteina, cristallizzata, viene bombardata con un raggio di fotoni collimati ad alta energia. I fotoni vengono diffratti in modo differente a seconda del tipo di atomo che colpiscono. I raggi diffratti vengono raccolti formando un quadro (pattern) di diffrazione

Limiti del metodo:

• Cristallizzare proteine e` difficile

• Ricavare la struttura dal pattern di diffrazione e` computazionalmente complesso

• L’informazione che si ottiene e` statica, mentre la conforomazione di una proteina in soluzione varia nel tempo

• B factor (fattore di temperatura): indice “indiretto” di flessibilita’ strutturale

Cristallografia a raggi XRisoluzione ottenibile su piccole molecole organiche 1Å. In generale proteine cristallizate hanno grado di organizzazione più basso che limitano la risoluzione (2-3.5Å). Questo è dovuto anche all’alta idratazione dei cristalli (40-60% di acqua).Una tale risoluzione non è sufficiente per rivelare la posizione dei singoli atomi, ma è sufficiente per tracciare l’andamento e la disposizione dello scheletro covalente della proteina. Occorre quindi conoscere la sequenza primaria in modo da adattare la mappa della densità elettronica alla sequanza aminoacidica.

In un cristallo di proteine, in ogni cella (sitoreticolare) si trova una proteina = somma didensità elettroniche dovute ai singoli atomi

Il risultato sperimentale diretto di un’ analisi cristallografica è una mappa di densità elettronica e non il modello atomico che voi state osservando!!!Se vi sono errori nelle strutture cristallografiche questi sono dovuti all’interpretazione (soggettiva) delle mappe elettroniche da parte del cristallografo!!

PARAMETRI X VALUTAZIONE DELL’INFORMAZIONE CONTENUTA NELLA STRUTTURA X-RAY:Risoluzione (R) della mappa di densità elettronica (tra 3 e 1.5 Å). Strutture con R > 2.5 Å dettagli solo sul backbone, R < 2 Å dettagli su atomi catene laterali

R-value e R-free: parametri associati al livello di “discordanza” tra modello atomico e mappa di densita’ elettronica (devono essere R-value < 20% e R-free < 30%). Forniscono, in ultima istanza, indicazioni su quanto differiscono tra loro mappa di densita’ elettronica osservata (sperimentale) e mappa di densita’ elettronica calcolata dal modello della struttura finale.

Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR)

Permette di ottenere informazioni sulla struttura di una molecola attraverso l’interazione con una radiazione elettromagnetica. Si basa sullo stesso principio della risonanza magnetica usata in medicina, usa onde radio.

È possibile rilevare quando i momenti magnetici dei vari nuclei (che continuano a ruotare) si inclinano completamente sul piano perpendicolare rispetto al campo magnetico applicato grazie ad un'antenna che capta le onde radio che questi generano ed è collocata perpendicolarmente al campo magnetico applicato.

I nuclei atomici (elettricamente carichi) ruotano, con una velocità angolare quantizzata, creando un momento magnetico

Immersi in un campo magnetico omogeneo esterno i momenti magnetici si allineano (“traballando” a causa del rumore termico).

I nuceli vengono irradiati da onde radio (RF), l’effetto è di “disallineare” (tanto da farli “ribaltare”).

Spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR)

Caratteristiche:• studio delle proteine in soluzione (non occorre cristallizzarle)• alta risoluzione temporale (millisecondi)• informazioni sulle distanze interprotoniche non precise• la “proton signature” limita il metodo allanalsi di molecole “piccole” (<30 KD <250 residui)• informazioni su strutture di complessi proteici deducibili solo con il ricorso a metodi di modellistica guidati dai dati sperimentali

Ogni nucleo mostra le sue caratteristiche perchè ruota a velocità differente a seconda della sua posizione nella molecola e all'ambiente che gli atomi vicini gli fanno sentire e quindi risuona a frequenze radio diverse. Nuclei diversi risuonano a frequenze diverse. Ciò significa innanzitutto che un atomo di carbonio deve essere colpito da un'onda radio con frequenza diversa da quella necessaria ad un atomo di idrogeno per “ribaltarsi” di 90°, ma anche che atomi simili in ambienti diversi, come un atomo di idrogeno legato ad un atomo di ossigeno ed un atomo di idrogeno legato ad un atomo di carbonio si ribaltano a frequenze diverse. Questo è dovuto alla “schermatura” degli elettroni vicini

HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3

Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)

[…]

http://www.pdb.org

PDB: banca dati di strutture (Protein Data Bank) – ridondante – strutture ottenute sperimentalmente via X-ray o NMR

ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N

ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C

ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C

ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O

ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C

ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C

ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C

ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N

ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C

ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C

ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O

ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C

ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C

ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C

ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C

ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N

ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C

ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C

ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O

ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C

ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O

…

X Y Z

coordinatetipo diatomo

tipo diamminoacido

Come nel confronto di sequenze e’ necessario allinearle, nel confronto di strutture 3D e’ necessario sovrapporle come corpi rigidi scegliendo una regola di corrispondenza tra coppie di atomi o di residui nelle due strutture. La prima difficoltà consiste nel fatto che le due proteine molto spesso non hanno lo stesso numero di residui. Per la sovrapposizione si possono utilizzare le catene dei carboni alfa appartenenti agli elementi di struttura secondaria perche’ in genere le inserzioni e delezioni si accumulano nei loop che possono semplicemente venire esclusi dalla sovrapposizione. I metodi di confronto 3D utilizzano l’ allineamento delle sequenze per decidere la regola di corrispondenza alla base della sovrapposizione strutturale

CONFRONTO STRUTTURE 3D DI PROTEINE – ALLINEAMENTO STRUTTURALE

Un allineamento strutturale può essere valutato in base alla deviazione quadratica media (root mean square deviation o r.m.s.d.), al numero di atomi che sono stati accoppiati nella sovrapposizione e alla valutazione della similarità dei residui sovrapposti.

L’r.m.s.d. o r.m.s. di una sovrapposizione tridimensionale è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato

r.m.s.d Di2 N

i1

N

D = distanza tra coppie di atomi appaiatiN = numero di coppie considerate

RMSD

• Root-mean-square deviation – Deviazione quadratica media– Serve per paragonare strutture identiche, eccetto rotazioni e

traslazioni

rai e rbi sono le posizioni dell´ atomo i nelle strutture a e b,

n è il numero di atomi nelle strutture.

r.m.s.d. di una sovrapposizione 3D è la distanza media tra gli atomi di tutte le coppie che hanno partecipato all’allineamento strutturale, per cui tanto più bassa è l’r.m.s. tanto migliore sarà l’allineamento strutturale calcolato

EVOLUZIONE DELLE PROTEINE

RELAZIONE ESISTENTE TRA SIMILARITA’ di sequenza e struttura in omologhi

Studio di un campione di strutture note di proteine omologhe (Chothia, Lesk, 1982)

Similarità strutturale misurata in termini di RMSD

CALCOLO RMS Confronto di due strutture mediante SOVRAPPOSIZIONE Determinazione di aa che si corrispondono nelle due strutture Identificazione degli atomi che si vogliono confrontare (Cα o backbone) RMSD=

n

d 2 n = numero residui

d = distanza tra atomi corrispondenti

un altro criterio di valutazione di un allineamento strutturale è rappresentato dal numero di atomi o di residui che sono stati accoppiati

si cerca di massimizzare il numero di atomi accoppiati e di minimizzare la corrispondente r.m.s.

a parità di numero di residui accoppiati, il migliore allineamento strutturale sarà quello con minore r.m.s.

a parità di r.m.s. verrà considerato migliore l’allineamento strutturale operato con un maggior numero di atomi accoppiati

valutazione dell’allineamento strutturale

oltre a questi due valori tipici delle sovrapposizioni tridimensionali, si può anche considerare il punteggio di similarità dei residui accoppiati

DIVERGENZA DI SEQUENZA E STRUTTURA

Se si valuta la relazione esistente tra divergenza strutturale (misurata in termini di RMSD) e

divergenza di sequenza si osserva che esse si corrispondono in MODO ESPONENZIALE (valutato

dal confronto di strutture note)

(RMSD< 2 Å) possono avere seq molto differenti (degenerazione del codice strutturale-struttura più conservata della seq)

RMSD (A)

%identity

30% id.seq

SOGLIA di significatività per la SIMILARITA’ STRUTTURALE

.confronto a coppie di struttura e seq di proteine 3D note, quantificato usando come parametri: lunghezza allineamento, % id seq, sim.struttura a confronto in un grafico: lunghezza allin vs id seq (e in terza dimensione sim.strutturale)

Sim. Strut.parametrizzata come uguale/diverso (pallino/quadrato): 2 str. Uguali se > 70% della struttura sec è in comune (rmsd bassa).

al di sotto della soglia rumore di fondo elevato 25% (x allin 80 aa) al di sopra del quale chiara similarità strutturale – soglia lunghezza dipendente possibile che proteine con identità < 25% abbiano strutture simili ma anche che non siano correlate strutturalmente (twilight zone)

%id seq

Length alignment

30

0

100

0 150

Sec str identity < 70%

Sec str identity > 70%

Dalla sequenza al modello

Raw model

Loop modeling

Side chain placement

Refinement

HOMOLOGY MODELLING

•OMOLOGO 3D (PDB)

•ALLINEAMENTO

RICERCA DEL TEMPLATO

Blast-FastA -CRITERI IDENTITA’/SIMILARITA’

-CONOSCENZA FUNZ.-STR.-BIOCHIM.

ALLINEAMENTO

GUIDA LA COSTRUZIONE DEL MODELLO

CORRISPONDENZA aa target aa templato

ricerca ALLINEAMENTO OTTIMALE

CORRISPONDENZA DI aa FUNZ. IMPORTANTI

CORRISPONDENZA DELLA STRUTTURA SECONDARIA TRA TEMPLATO E QUERY

VALUTAZIONE DEI GAP loop

USO TEMPLATI MULTIPLI loc.similarità

ALLINEAMENTO

1. Generazione di allineamenti a coppie diversi con diversi programmi (nel caso di un solo templato)

2. Allineamenti multipli di omologhi per avere informazioni maggiori

3. Ricerca di informazioni biologico-biochimiche sugli aa conservati

4. Predizione di struttura secondaria per il target

5. Correzione dell’allineamento sulla base delle informazioni ai punti 2. 3. e 4.

CREAZIONE DEL MODELLO

identificazione SCR (structural conserved regions)

SCR scaffold del modello

______________

______________ x-ray

SCRs

No SCRs (loops ?)

Raw model

Loop modeling

Side chain placement

Refinement

Costruzione del pre-modello

• La struttura del templato viene utilizzata come “stampo“ per costruire il modello seguendo l‘allineamento.

• Le coordinate 3D dei residui strutturalmente conservati si possono copiare direttamente.

• Le regioni variabili della struttura (generalmente loop) non si possono copiare.

flexible

conserved

Catene laterali• Problema: Applicando le coordinate del templato sulla

sequenza del target cambiano tipo, dimensione e posizione delle catene laterali.

• L‘RMSD cambia relativamente poco, però possono cambiare le conformazioni di residui importanti (p.es. del sito attivo)

• Dove possibile è meglio mantenere le conformazioni delle catene laterali del templato.

• Esistono metodi standard per risolvere questo problema.

Raw model

Loop modeling

Side chain placement

Refinement

PREDIZIONE DELLE CATENE LATERALI

AUSILIO DI LIBRERIE DI ROTAMERI

Contengono i possibili conformeri delle catene laterali a fronte di specifiche conformazioni del backbone

OTTIMIZZAZIONE ENERGETICA DELLE STRUTTURA rimozione di clash

Loop modeling• Al pre-modello possono mancare interi

frammenti di catena principale– non conservati nella famiglia proteica– Inserzioni– Delezioni

• Descrizione del problema:– Si cerca un fold che colleghi il frammento N-

terminale (pre-loop) con quello C-terminale (post-loop) tramite k residui

– (f,y) sono gli unici parametri liberi

loop

post-loop

pre-loop

Raw model

Loop modeling

Side chain placement

Refinement

PREDIZIONE DEI LOOP

REGIONI VARIABILI – pressione selettiva

DUE STRATEGIE PREDITTIVE:

criterio geometrico testando diverse conformazioni

ricerca in PDB di frammenti simili nelle proteine a struttura nota INFLUENZA DELL’INTORNO

REFINEMENT CRITICO OTTIMIZZAZIONE MEC. E DIN. MOL.

CRITICITA’ nella predizione quando i LOOP rivestono ruolo funzionale o di interazione.

5. Ottimizzazione del modello

Minimizzazione energetica

Regolarizzazione di legami, angoli e torsioni

Eliminazioni di clash strutturali