hongos y levaduras manual

CENTRO ESCOLAR

BENEMÉRITO DE LAS AMÉRICAS

Con estudios incorporados a la S.E.P. Clave: EMS-3/368 Acuerdo No. 980008del 19 de agosto de 1998

GUÍA DE ESTUDIO PARA PRESENTAR EL EXAMEN EXTRAORDINARIO DE LA MATERIA

APLICAR TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN PARA

HONGOS Y LEVADURAS

(SEXTO SEMESTRE)

VIGENCIA JUNIO 2013

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JUSTIFICACIÓN DEL MÓDULO. En todo laboratorio de análisis industrial es importante contar con el apoyo de un auxiliar que analice cualitativa y cuantitativamente los componentes de una muestra, y en los que se requiera de análisis Microbiológicos, que identifique microorganismos mediante técnicas específicas, aplicando los estándares y herramientas estadísticas con un alto sentido de honestidad, responsabilidad, seguridad, orden y limpieza. Dada la importancia de estas actividades en el mercado laboral, este segundo módulo, permite el desarrollo de competencias a través de tres submódulos; en el primero el alumno adquiere la habilidad de identificar microorganismos a través del análisis microbiológico, en el segundo submódulo desarrolla las competencias necesarias para analizar cualitativa y cuantitativamente los componentes de una muestra y finalmente en el tercer submódulo el alumno desarrolla la habilidad y destreza para aplicar los estándares y herramientas estadísticas en los análisis químicos y microbiológicos, todo ello bajo los criterios y normas de seguridad e higiene, contribuyendo al cuidado del medio ambiente.

ESQUEMA DE LA MATERIA

APLICAR TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN PARA HONGOS Y LEVADURAS. ANALIZAR CUALITATIVAMENTE LOS COMPONENTES

DE UNA MUESTRA A TRAVÉS DE LA APLICACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS.

1. Aplicar técnicas de identificación para hongos y levaduras utilizando métodos de reproducción, crecimiento, tinción y pruebas bioquímicas.

2. Aplicar los principios básicos del análisis químico para la separación e identificación de los componentes de una muestra.

1. Aplicar técnicas de identificación para hongos y levaduras utilizando métodos de reproducción, crecimiento, tinción y pruebas bioquímicas. 1.1 Aplicar métodos para la reproducción y crecimiento de hongos y levaduras. 1.2 Aplicar técnicas de tinción para morfología y estructura anatómica de hongos y levaduras. 1.3 Operar técnicas de identificación de hongos y levaduras de acuerdo a su metabolismo.

2. Aplicar los principios básicos del análisis químico para la separación e identificación de los componentes de una muestra. 2.1 Aplicar los principios generales sobre los fundamentos de los análisis

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RESULTADO DE APRENDIZAJE DEL MÓDULO. Realizar análisis químicos y microbiológicos generales bajo los criterios y normas de seguridad e higiene, contribuyendo al cuidado del medio ambiente con un alto sentido de honestidad, responsabilidad, seguridad, orden y limpieza.

1. Aplicar técnicas de identificación para hongos y levaduras utilizando métodos de

reproducción, crecimiento, tinción y pruebas bioquímicas. TEMAS. 1. Aplicar técnicas de identificación para hongos y levaduras utilizando métodos de reproducción, crecimiento, tinción y pruebas bioquímicas. 1.1 Aplicar métodos para la reproducción y crecimiento de hongos y levaduras. 1.2 Aplicar técnicas de tinción para morfología y estructura anatómica de hongos y levaduras. 1.3 Operar técnicas de identificación de hongos y levaduras de acuerdo a su metabolismo.

2. Aplicar los principios básicos del análisis químico para la separación e identificación de los

componentes de una muestra.

TEMAS 2. Aplicar los principios básicos del análisis químico para la separación e identificación de los componentes de una muestra. 2.1 Aplicar los principios generales sobre los fundamentos de los análisis

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ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE

1. Aplicar técnicas de identificación para hongos y levaduras utilizando métodos de

reproducción, crecimiento, tinción y pruebas bioquímicas.

1. Elabora un mapa conceptual que clasifique a los microorganismos con sus principales

características, resaltando la presencia de los hongos y su división en mohos y levaduras.

2. Representa a través de esquemas las principales estructuras que conforman a un hongo y describe brevemente la función que tienen en este microorganismo: micelio, hifa, septo, espora, esporangio, conidio, etc.

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3. Esquematiza y explica el proceso de reproducción de un moho.

6

4. Esquematiza y explica el proceso de reproducción de una levadura.

5. En el siguiente cuadro escribe las principales características de los mohos presentes en los alimentos: Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium.

GÉNERO CARACTERÍSTICAS PRINCIPALES

Mucor

Rhizopus

Aspergillus

Penicillium

6. En el siguiente cuadro escribe las principales características de las levaduras presentes en los alimentos: Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Candida, Trichosporon.

GÉNERO CARACTERÍSTICAS PRINCIPALES

Schizosaccharomyces,

7

Saccharomyces

Zygosaccharomyces

Candida

Trichosporon

7. Escribe la composición de los medios de cultivo: a) Agar papa dextrosa, b) Agar dextrosa Saboraud y c) Agar Micosel, señalando en cada uno de ellos cuál es el componente responsable de la inhibición del crecimiento de bacterias en estos medios.

AGAR PAPA DEXTROSA AGAR DEXTROSA SABORAUD

AGAR MICOSEL

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8. Elabora un diagrama de flujo que muestre la técnica utilizada en laboratorio para aislar hongos del aire (véase manual de prácticas).

9. Elabora un diagrama de flujo que muestre la técnica utilizada para aislar hongos del suelo (véase manual de prácticas).

9

10. Elabora un diagrama de flujo explicando la técnica adecuada para teñir a los hongos aislados del aire o del suelo (véase manual de prácticas).

11. Describe la prueba bioquímica de la catalasa usada en levaduras (véase manual de prácticas).

12. Elabora un diagrama de flujo del procedimiento experimental señalado en la norma oficial NOM-111-SSA1-1994 para la determinación de hongos y levaduras en alimentos.

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13. Escribe y explica los métodos analíticos comunes utilizados en los análisis cualitativos.

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14. Explica el concepto de equilibrio químico a través de su ecuación general.

15. Explica qué es una marcha analítica.

16. Elabora un diagrama de flujo detallado de la marcha analítica del grupo I, señalando cómo se identifica a cada uno de los cationes involucrados.

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17. Elabora un diagrama de flujo de la marcha analítica del grupo II señalando cómo se identifica a cada uno de los cationes involucrados.

13

18. Elabora un diagrama de flujo de la marcha analítica del grupo III señalando cómo se identifica a cada uno de los cationes involucrados.

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AUTOEVALUACIÓN

1. Los hongos son microorganismos ___________________ debido a que presentan núcleo

verdadero.

A) procariotes B) eucariotes C) protozooarios D) viroides

BLOQUE

2. El microorganismo mostrado a continuación pertenece al grupo

de:

A) bacterias

B) levaduras

C) priones

D) mohos

3. La estructura señalada en el esquema corresponde a:

A) esporangio B) conidio C) micelio D) hifa

4. ¿Qué función tiene la estructura señalada?

A) Perpetuar la especie.

B) Contener a las esporas.

C) Absorber los nutrientes.

D) Fijar los filamentos.

FIN DE BLOQUE

5. De las siguientes características, selecciona las que correspondan a un moho:

I. Producen coloniales filamentosas multicelulares.

II. Se reproducen por gemación.

III. Producen colonias blandas, opacas y de color cremoso.

IV. Producen esporas para incrementar su supervivencia.

V. Se pueden reproducir sexualmente.

A) I, IV, V B) II, III C) I, II, V D) III, IV

6. Las levaduras son hongos _______________ y su principal forma de reproducción es

___________________.

A) macroscópicos/ esporulación

B) unicelulares/ gemación

C) multicelulares/ sexual

D) microscópicos/ sexual

7. Selecciona el género que corresponda a una levadura:

A) Mucor B) Penicillium C) Aspergillus D) Saccharomyces

8. El siguiente género de hongo contiene a una especie causante de infecciones vaginales:

A) Candida B) Saccharomyces C) Trichosporon D)

Schizosaccharomyces

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9. El medio de cultivo utilizado en el laboratorio para promover el crecimiento de hongos fue:

A) Sabouraud dextrosa B) Agar nutritivo C) Sal y manitol

D) Micosel

10. ¿Qué característica presentan los medios de cultivo destinados para el crecimiento de hongos,

que hacen posible la inhibición del crecimiento de bacterias?

A) Alta concentración de sales

B) Bajo pH

C) Alto pH

D) Baja concentración de nutrientes

BLOQUE

11. En la técnica para aislar hongos del aire utilizada en el laboratorio, ¿cuánto tiempo debe

mantenerse destapada la caja de Petri para captar a estos microorganismos?

A) 10 min B) 15 min C) 20 min D) 30 min

12. ¿Cuál fue la temperatura a la que se incubó la caja de Petri después de su tiempo de exposición

al aire?

A) Temperatura ambiente B) 25 °C C) 37 °C D) 40 °C

13. ¿Cuánto tiempo debe incubar la caja de petri para observar crecimiento?

A) 24 horas B) 48-72 horas C) 1 semana D) 3 semanas

14. En la observación de las estructuras de los mohos que crecieron en el medio de cultivo se utilizó

el/los objetivo(s):

A) 10X y 40X B) 10X, 40X, inmersión C) Solo 40X D) Solo

inmersión

15. ¿Para qué sirve un microcultivo?

A) Distinguir las esporas

B) Identificar la especie del moho

C) Observar la estructura completa del moho

D) Aislar metabolitos del moho

16. En el aislamiento de hongos del suelo, ¿cuál fue el objetivo de hacer las dilusiones?

A) Obtener solo levaduras del suelo

B) Obtener colonias aisladas

C) Purificar la muestra del suelo

D) Aislar a las bacterias presentes en el suelo

FIN DE BLOQUE

17. ¿Cuál fue el colorante utilizado en la tinción de hongos?

A) Azul de metileno B) Cristal violeta C) Safranina D) Azul de algodón lactofenol

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18. Ordena los pasos que se siguieron para la tinción de hongos en el laboratorio:

I. Dilacerar el fragmento de la colonia con la misma asa

II. Con el asa tomar un pequeño fragmento de colonia y depositarlo en el portaobjetos

III. Colocar sobre la preparación un cubreobjetos evitando formar burbujas

IV. Observar al microscopio

V. Sobre el portaobjetos depositar una gota de colorante

A) V, II, I, III, IV B) I, II, V, III, IV C) II, I, V, III, IV D) I, II, III, V, IV

19. Se concluye que una prueba bioquímica de la catalasa es positiva en levaduras cuando:

A) Se tiñe de morado al término de la aplicación de todos los reactivos

B) Se tiñe de azul al término de la aplicación de los reactivos

C) Aparece un precipitado negro

D) Aparecen burbujas después de agregar el reactivo

20. El reactivo utilizado en la prueba de la catalasa fue:

A) Agua oxigenada B) Azul de metileno C) Cristal violeta D) Lugol

BLOQUE

21. La NOM-111SSA1-1994 cuyo objetivo es el conteo de hongos en alimentos, señala que el

medio de cultivo a utilizar es:

A) Agar Sabouraud dextrosa

B) Agar Micosel

C) Agar papa dextrosa

D) Agar sal manitol

22. ¿Cuál es el valor del pH que adquiere el medio de cultivo después de la preparación con los

reactivos correspondientes?

A) 1 B) 3.5 C) 5.6 D) 7.2

FIN DE BLOQUE

23. ¿Qué diferencia un análisis cualitativo de uno cuantitativo?

A) El análisis cualitativo muestra solo cuáles son los componentes de la muestra

B) El análisis cualitativo utiliza métodos volumétricos y gravimétricos

C) El análisis cualitativo permite conocer la concentración de las sustancias que conforman la

muestra

D) El análisis cuantitativo utiliza exclusivamente el método de precipitación

24. El equilibrio químico se alcanza cuando:

A) Las velocidades de reacción inversa y directa se igualan

B) Las concentraciones de reactivos y productos se igualan

C) Se forman algunas moléculas de producto

D) Desaparece el precipitado de los productos

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25. Si una reacción química se representa por la siguiente ecuación

aA + bB cC + dD

¿cuál sería la expresión de su constante de equilibrio?

A)

B)

C)

26. Si en un experimento se lleva a cabo una reacción química y ésta alcanza el equilibrio, ¿qué

ocurrirá si se le adiciona una mayor cantidad de reactivo?

A) No hay afectación en el equilibrio

B) El equilibrio se desplaza hacia la derecha

C) El equilibrio se desplaza hacia la izquierda

D) Se igualan las concentraciones de reactivos y productos

BLOQUE

27. Los siguientes son cationes que conforman al primer grupo analítico, Excepto:

A) plomo B) fierro C) mercurio D) plata

28. El reactivo que hace posible la precipitación de todos los cationes en el primer grupo analítico

es:

A) HCl B)HNO3 C) H2SO4 D) H2S

29. Al adicionar agua hirviendo a los precipitados retenidos por el papel filtro, esta agua disolverá

únicamente al precipitado de:

A) plomo B) mercurio C) fierro D) plata

30. Al adicionar el reactivo hidróxido de amonio, éste disolverá solamente al precipitado de:


31. Al agregar a un filtrado unas gotas de KI, el color amarillo que se presenta indica la presencia

de:


32. Al agregar a un filtrado unas gotas de ácido nítrico concentrado, la presencia de un precipitado

blanco nos indicará la existencia del catión:


33. Si al final del experimento aparece un residuo negro en el papel filtro, esto es prueba suficiente

de la presencia de:


FIN DEL BLOQUE

34. Los siguientes son cationes del grupo analítico II, excepto:

A) aluminio B) cromo C) sodio D) hierro

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35. El reactivo que precipita a los cationes en el grupo III es:

A) sulfuro de amonio

B) hidróxido de amonio

C) ácido sulfhídrico

D) ácido clorhídrico RESPUESTAS A LA AUTOEVALUACIÓN

1 B 2 D 3 B 4 B 5 A 6 B 7 D 8 A 9 A 10 B

11 D 12 A 13 B 14 A 15 C 16 B 17 D 18 A 19 D 20 A

21 C 22 B 23 A 24 A 25 C 26 B 27 B 28 A 29 A 30 D

31 A 32 D 33 B 34 C 35 A

BIBLIOGRAFÍA

Atlas, R. M., Microbiología, Fundamentos y Aplicaciones, 4ª. edición, Editorial CECSA, México, 1990. Batel, Janet S., Microbiología Médica, Edt. El manual moderno, México, 2002. Brumblya, Ray U., Análisis cualitativo, 17ª. edición, CECSA, México, 1979. Charlot, G., Análisis Cualitativo rápido de cationes y aniones, 2ª. edición, Alhambra, México, 1998. Collins, C. H., Lyne, Patricia M., Métodos microbiológicos, 3ª. Edición, Editorial Acribia, España, 1992. Freeman, Bob A., Microbiología de Burrows, 22ª. edición, Editorial Interamericana, México, 1989. Holkova Ludmila., Química analítica cualitativa, Teoría y práctica, 2ª. edición, Trillas, México, 1993. Konerman, Elmer W., Diagnóstico Microbiológico, 17ª edición, Editorial Panamericana, Argentina, 1999. Pelczar, Reid, Chan., Microbiología, 4ª edición, Mc Graw Hill, México, 1993. Stanier, Roger Y., Microbiología, 4ª edición, Repla, México, 1986. Urmeneta Begoña, Alonso., Microbiología, Editorial Masson, España, 1999

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ANEXO 1

MANUAL DE LABORATORIO

PRÁCTICA 1. AISLAMIENTO DE HONGOS Y LEVADURAS DEL AIRE Y SUELO

OBJETIVO: Aplica las técnicas para aislar hongos y levaduras del aire y del suelo para conocer sus características morfológicas y estructurales. INTRODUCCIÓN La mayoría de los hongos viven libres en el suelo o en el agua y obtienen su energía por respiración o fermentación de materiales orgánicos solubles presentes en estos ambientes. El aire no es un medio en el que pueden desarrollarse los microorganismos pero es el portador de aerosoles biológicos como polvo, gotitas de agua y otros, que pueden estar cargados de los diversos grupos de microorganismos. De las capas de aire se han encontrado esporas de hongos que proceden principalmente del suelo, de la vegetación y del mar. Algunos de los géneros más comúnmente aislados del aire son Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Mucor y Cladosporium, entre otros. Todos los hongos se reproducen por esporulación. Cuando la espora se encuentra en un medio nutritivo adecuado, se hincha y germina emitiendo uno o más tubos germinativos que se alargan distalmente hasta constituir filamentos delgados y largos que se denominan HIFAS, las cuales pueden ramificarse después. En algunas especies se forman septas a lo largo de la hifa, quedando entonces dividida en pequeños compartimentos como una caña de bambú llamándose entonces HIFA SEPTADA, otras veces no hay septación y el protoplasma fluye continuamente a lo largo de la hifa, describiéndose entonces como HIFA NO SEPTADA ó CENOCITICA. En la mayoría de los hongos las hifas son septadas. A medida que las hifas se siguen dividiendo se forma un crecimiento algodonoso o filamentoso de hifas entrelazadas llamado MICELIO. El conjunto de micelio se conoce como TALO. En algunas formas superiores las hifas se unen formando cuerpos fructíferos grandes y de estructura compleja como es el caso de las setas. La parte del micelio que penetra en el substrato y absorbe substancias nutritivas se llama MICELIO VEGETATIVO, la parte que se proyecta sobre la superficie del substrato origina el MICELIO AEREO, que a su vez da origen a esporas asexuales llamadas CONIDIAS, cuya misión es la de dispersar el hongo a nuevos hábitats. Algunos hongos también producen esporas sexuales formadas como resultado de la reproducción sexual. Las que están encerradas en una especie de saco (Asca) se llaman ASCOSPORAS y las que se forman en el extremo de una hifa o basidio se denominan BASIDIOSPORAS. Las propiedades de las esporas sexuales son un criterio importante en la clasificación e identificación de los hongos. Aunque los hongos constituyen un grupo grande y diverso, prácticamente hay tres grupos importantes: Los mohos, las levaduras y las setas. Los mohos son hongos filamentosos que están ampliamente distribuidos en la naturaleza y son habituales en pan viejo, queso o frutas. Presentan una gran variedad de formas y tamaños. Cada filamento crece fundamentalmente en el ápice, por extensión de la célula terminal. Las levaduras son hongos unicelulares y la mayoría son Ascomicetos. Normalmente tienen forma oval o cilíndrica y su principal forma de reproducción es la gemación, se desarrollan bien en hábitats con abundante azúcar tales como frutas, flores, e incluso la corteza de los árboles. Las levaduras tienen gran importancia biotecnológica en la industria cervecera y de la panificación y en la producción de proteína de origen unicelular (Biomasa). El principal agente de la fermentación alcohólica es Sacharomyces cerevisiae. Las setas son hongos filamentosos pertenecientes a los Basidiomycetes que forman cuerpos fructíferos denominados “setas” y que producen basidiosporas como esporas sexuales. Una actividad ecológica muy importante de los Basidiomycetes, es la descomposición de la madera, papel, ropa y otros derivados de productos naturales. Estos Basidiomycetes, por tanto, son capaces de producir Celulasas con actividades degradantes de lignina que utilizarán como fuente de carbono y energía. MATERIALES Y EQUIPO

Caja Petri conteniendo medio de Saboureaud dextrosa agar (SDA).

Asa bacteriológica.

2 Cajas Petri, conteniendo cada una un portaobjetos, un cubreobjetos y un trozo de papel filtro, estériles.

Caja Petri conteniendo medio de SDA en capa muy delgada.

Cajas de Petri vacías y estériles.

Pinzas de disección.

Agua destilada estéril.

Cinta para enmascarar.

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Mechero Bunsen.

Encendedor.

Microscopio.

1 gramo de tierra.

Medio Sabouraud dextrosa o Papa dextrosa.

Tubos con solución salina isotónica, o bien, agua estéril.

Pipetas de 1 mL estériles.

DESARROLLO DE ACTIVIDADES A. Aislamiento de hongos del aire. 1. Tomar una placa de medio de SDA. 2. Abrir la placa y exponerla al aire en cualquier sitio por espacio de media hora y colocar de nuevo la tapa en su sitio. 3. Incubar por 48-72 horas o más a temperatura ambiente. Nota: Los pasos anteriores del desarrollo experimental se realizan previa a la práctica de laboratorio para contar ya con el crecimiento de hongos. 4. Observar la presencia de colonias filamentosas de diversos tipos y colores. 5. Describir las observaciones hechas. 6. Anotar las características de las colonias seleccionadas para hacer los microcultivos, ya que esta información es un criterio importante para la identificación del moho. B. Observación de las estructuras de los hongos. Observación directa 1. De las colonias de hongos aislados, tomar nota de sus características: Forma, aspecto del micelio (algodonoso, aterciopelado u otro), pigmentación, elevación, consistencia, etc. (Hacer la descripción y esquema de tres colonias de hongos aisladas)

Forma: ___________________________ Aspecto del micelio: _________________ Pigmentación: ______________________ Elevación: _________________________ Consistencia: ______________________



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2. Seleccionar una de las colonias aisladas y con el asa bacteriológica con un pequeño ganchito en la punta, desprender una pequeña porción. 3. Extender el material obtenido en una gota de agua puesta sobre un portaobjetos y colocar con cuidado un cubreobjetos sobre éste. 4. Examinar al microscopio con objetivo seco débil buscando estructuras representativas. 5. Dibujar las observaciones hechas. 6. Cambiar al objetivo seco fuerte para observar mejor las estructuras seleccionadas, procurando que éstas presenten la arquitectura completa del hongo para facilitar su identificación. 7. Dibujar las observaciones hechas: Seco débil. Seco fuerte. Microcultivo 1. Tomar una caja Petri que contenga dentro un círculo de papel filtro del diámetro de la caja, un portaobjetos y un cubreobjetos estériles. 2. Con el asa estéril y en ángulo recto, cortar en cuadritos de aproximadamente 3 a 5 mm por lado el medio de SDA en capa delgada contenido en una caja Petri, tomar un cuadrito y colocarlo en condiciones asépticas en el centro del portaobjetos, levantando la tapa de la caja sólo lo suficiente. 3. En condiciones asépticas, tomar una pequeña porción del cultivo por estudiar con el asa bacteriológica en ángulo recto y depositarla cuidadosamente sobre el cuadrito de agar en el portaobjetos dentro de la caja Petri. 4. Levantando con la mano izquierda la tapa de la caja Petri y con unas pinzas ligeramente flameadas en la mano derecha, tomar el cubreobjetos y colocarlo sobre el cuadrito de agar inoculado, procurando que quede bien centrado y aprisionándolo ligeramente para que se adhiera. 5. Con un gotero que contenga agua estéril depositar las gotas necesarias sobre el papel filtro hasta lograr que éste se humedezca completamente. 6. Cerrar la caja y sellarla con un poco de cinta para enmascarar. 7. Incubar a temperatura ambiente durante 48 a 72 horas. Nota: El registro y observación del crecimiento del hongo se hará en la práctica 2. B. Aislamiento de hongos del suelo. 1. Preparar de 5 tubos con 9 ml de agua destilada, o bien, solución salina isotónica, esterilizar y numerar del 1 al 5. 2. Se suspende en el tubo 1, un gramo de muestra a analizar (tierra).

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3. Homogenizar perfectamente la prueba. 4. Con ayuda de una pipeta estéril, tomar 1 ml del tubo 1 y traspasarlo al tubo 2 y mezclar; con otra pipeta estéril, se toma una alícuota de 1 ml y se lleva al tubo 3; así sucesivamente hasta llegar al tubo 5. 5. De la última caja, tomar 1 ml y depositarla en la placa de Petri estéril y vacía. 6. Adicionar aproximadamente 20 ml del medio Papa dextrosa o Sabouraud Dextrosa estéril, fundido y enfriado a 45ºC. 7. Homogenizar por rotación de las placas sobre la mesa. 8. Dejar solidificar e incubar a 28ºC por 4 a 5 días. 9. Hacer observaciones cada 48 hrs. hasta la aparición de colonias características de hongos. Esquema de trabajo: CUESTIONARIO 1. Dibuja las estructuras de 3 hongos de diferente género (especificando el género al que pertenecen). Género: _________________________ Género: __________________________ Género: _______________________ 2. Describir otra técnica de aislamiento de hongos. _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1 g de tierra 9 ml de agua estéril

10-1 10-2 10-3

10-4 10-5

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___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Consultar en qué consiste el medio de Micosel y cuál es su utilidad. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4. Mencionar la importancia de los hongos en Microbiología Ambiental. _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Criterios para la evaluación de la práctica Valor Puntos

1. Calificación del examen previo. 3

2. Desinfectó correctamente el área de trabajo. 1

3. Trae su material completo (guantes, cubrebocas, muestras, etc.) 1

4. Registro de resultados completos. 5

5. Cuestionario completo y correcto. 6

6. Conclusiones concretas 3

7. Entrega el material limpio. 1

Calificación final. 20

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PRÁCTICA 2. TINCIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS

OBJETIVO: Aplica las técnicas para teñir hongos y levaduras con la finalidad de hacer una descripción morfológica microscópica de los mismos. INTRODUCCIÓN

En su mayor parte los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a simple vista: protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.

Estos microorganismos difieren en características tales como forma de nutrición, estructura, tamaño, composición entre otros aspectos; cuando se compara a los hongos con las bacterias, en general éstos tienen requerimientos nutricionales muy simples pero su desarrollo es más lento, por lo que requieren mayor tiempo de incubación para su cultivo. La diversidad más notable la presentan en sus propiedades morfológicas y en sus ciclos sexuales siendo estas características los criterios que se emplean en la identificación y clasificación de este grupo. Las características estructurales incluyen: tipo de talo, morfología microscópica del micelio tanto aéreo como profundo, tipo de hifas, diferenciación y disposición o agrupación de las mismas, tipo de hifas reproductivas asexuales, estructura y modo de formación del cuerpo fructífero sexual, tipo de espora (forma, tamaño, aspecto externo, agrupación, tabicación, color, movilidad, tipo y número de flagelos).

Por lo regular, los hongos se examinan en preparaciones húmedas, para tomar una muestra del micelio a partir de un cultivo puro o de un tejido enfermo, se utilizan asas rígidas y ligeramente planas, se pueden emplear un trozo de cinta adhesiva transparente ligeramente adherida al asa o un buen par de pinzas, esta preparación debe hacerse con mucho cuidado para evitar que las esporas y otras estructuras se destruyan, lo que se evita tomando un trozo de agar con el desarrollo del hongo, la muestra se coloca en un portaobjetos, se calienta ligeramente para difundir el agar, se coloca una gota de azul de lactofenol y se tapa con un cubreobjetos, examinándose con los objetivos de 10x y 40x, la observación de hongos también se facilita agregando solución de hidróxido de potasio del 10 al 20 %, ésta tiene la propiedad de aclararlos haciéndose más transparentes, quizás las preparaciones más adecuadas resultan cuando a la potasa o a una solución salina se le agrega una pequeña cantidad de eosina diluida, el examen microscópico de las levaduras se facilita agregando yodo a la preparación húmeda, con lo que los gránulos de almidón se tiñen de azul.

En el aislamiento y cultivo de la mayoría de los hongos (patógenos o saprófitos) se aprovechan ciertas características especiales de los hongos, tales como, su tolerancia al pH ácido, su preferencia por medios de cultivo con gran cantidad de azúcar fermentable, su resistencia a la penicilina y estreptomicina permite usar estos antibióticos, los que al ser agregados a los medios de cultivo, reducen el número de bacterias contaminantes. En la preparación de medios de cultivos, los micólogos, utilizan mezclas de vegetales (agar-papa, agar-harina de maíz, etc.) y otras substancias naturales. Para estudiar a los hongos se dispone de dos tipos especiales de cultivos, el cultivo de portaobjetos o microcultivo y el cultivo en cajas de Petri. Los microcultivos se pueden observar directamente día a día, lo que permite hacer el seguimiento del desarrollo del hongo en estudio.

http://www.monografias.com/trabajos31/protozoos/protozoos.shtml

http://www.monografias.com/trabajos10/hongo/hongo.shtml

http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml

http://www.monografias.com/trabajos5/virus/virus.shtml

http://www.monografias.com/Salud/Nutricion/

http://www.monografias.com/trabajos15/todorov/todorov.shtml#INTRO

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Los cultivos en placa se obtienen sembrando por picadura, el centro de las cajas que contienen diferentes medios, a simple vista .el aspecto de las colonias es a veces tan característico, que permite identificar enseguida el tipo de hongo.

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MATERIAL

Colonias de hongos aisladas en la práctica anterior.

Tubos con medio PDA o SDA.

Colorante azul de algodón.

Porta y cubre objetos.

Mechero de Bunsen.

Microscopio.

Asa micológica.

DESARROLLO DE ACTIVIDADES A) Microcultivo. 1. De la práctica anterior, observa el crecimiento en el cuadrito de agar a simple vista (debe haber desarrollo visible fuera del cuadrito del

agar). Tener mucho cuidado, para evitar destruir la estructura del hongo. 2. Abrir la caja, sacar la preparación, secarla con gasa por debajo del portaobjetos si está húmedo, y observarlo al microscopio con objetivo seco débil y el condensador muy bajo para reducir la cantidad de luz. 3. Cambiar al objetivo seco fuerte para distinguir mejor la estructura del hongo. 4. Dibujar lo observado: Seco débil, Seco fuerte.

5. Comparar la estructura observada con las mostradas en dibujos y láminas para aproximarse a la identificación del microorganismo: ____________________________________________________________________________________________________________ B) Técnica de observación microscópica en fresco. 1. Observar el crecimiento de hongos desarrollado a partir de la muestra de suelo. 2. Seleccionar 3 diferentes hongos y describir su morfología.

Seco débil Seco fuerte

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3. Sobre un porta objetos depositar una gota de colorante azul de algodón lactofenol. 4. Con el asa micológica tomar un pequeño fragmento de la colonia y colocarlo sobre el porta objetos. 5. Agregar una gota de alcohol al 70% (esto es necesario solo en el caso de hongos con esporulación abundante). 6. Dilacerar el fragmento de la colonia con ayuda da agujas de disección o bien con la misma asa micológica. 7. Colocar sobre la preparación un cubre objeto evitando formar burbujas de aire. 8. Observar al microscopio a seco débil y seco fuerte, nunca usar aceite de inmersión. Nota: La tinción es para cada uno de los hongos observados. 9. Dibujar las estructuras observadas al microscopio para cada preparación:

Preparación 1 Preparación 2 Preparación 3

Seco débil (10x)

Seco fuerte (40x)

10. Señala sobre el esquema las estructuras observadas con su respectivo nombre. CUESTIONARIO 1. Defina el término hifa y micelio: _________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________




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2. Mencione la clasificación del micelio según: a. Función: ___________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ b. Diámetro: __________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ c. Continuidad: ________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ d. Coloración: _________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________ 3. Por la morfología macroscópica y microscópica, ¿puede identificarse el tipo de hongo? ¿por qué? ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 4. Mencione los parámetros utilizados en la lectura de morfología colonial de hongos: ________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________










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PRÁCTICA 3. METABOLISMO DE LEVADURAS: PRUEBAS BIOQUÍMICAS

OBJETIVO: Utilizar las pruebas bioquímicas en la identificación de procesos metabólicos de levaduras.

INTRODUCCIÓN

El estudio de los microorganismos con base a la descripción de la morfología colonial y microscópica no es suficiente para hacer una identificación satisfactoria, es por ello que se tiene que recurrir al estudio de su comportamiento fisiológico, es decir, cómo utilizan los nutrimentos y qué sustancias producen. Para lograr esto existen un gran número de pruebas metabólicas que nos permiten llegar a la caracterización de un microorganismo dado. El metabolismo es la suma de todos los procesos químicos que ocurren dentro de un microorganismo y se dividen en: anabolismo y catabolismo. El primero se refiere a las reacciones bioquímicas que suceden en la célula para formar macromoléculas, y el segundo representa las reacciones que están involucradas en el rompimiento de los sustratos con el propósito de suplir la energía utilizada en el anabolismo. Las tres principales vías metabólicas que conducen a la formación de energía (ATP) son:

a) Fermentación b) Respiración c) Fotosíntesis

La fermentación es un proceso anaeróbico en el cual tanto los donadores como los aceptores de electrones son compuestos orgánicos. Estos compuestos incluyen carbohidratos, ácidos orgánicos, ácidos grasos y aminoácidos entre otros. La mayoría de los microorganismos prefieren a los carbohidratos y especialmente a la glucosa. En general, los productos de la fermentación de los carbohidratos son ácidos, alcoholes, cetonas y gas.

Se requiere una combinación de pruebas bioquímicas y morfológicas para identificar las levaduras. En las características morfológicas debe incluirse el color de las colonias, la medida y la forma de las células, la presencia de cápsula, la producción de hifas o pseudohifas, y la producción de clamidiosporas. Las pruebas bioquímicas incluyen la asimilación y fermentación de azúcares y la asimilación de nitrato.

MATERIAL

Cajas de petri con gelosa almidón

Tubos de ensaye de 13 x 100 mm

Asa micológica

Hisopo de algodón

Portaobjetos

Estufa

H2O2 al 30 %

Solución de lugol

Solución de rojo de metilo

Caldo rojo de metilo

Caldo Voges Proskauer

Solución de alfa naftol

Solución de KOH creatina

Gelosa almidón

Medio Kliegler

Urea deshidratado

Cloruro de benzalconio al 1 %

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DESARROLLO DE ACTIVIDADES De los cultivos previamente preparados, seleccionar una cepa de levadura y describir sus características macroscópicas y microscópicas (para esta última hacer la tinción). Esquema de la colonia de levaduras y descripción: Esquema de la observación microscópica y descripción. Con la cepa seleccionada, hacer cada una de las pruebas bioquímicas indicadas a continuación: A. Digestión de polisacáridos (almidón).

1. En una placa con gelosa almidón, sembrar por estría abierta la cepa seleccionada. 2. Incubar a 37 °C durante 24 horas. 3. Añadir unas gotas de solución de lugol alrededor del crecimiento y en una zona en donde no haya inoculado al

microorganismo. 4. El almidón intacto toma una coloración azul violácea con el lugol.

Digestión de almidón positiva: aparición de un halo claro alrededor de la estría. Digestión de almidón negativa: no se observa halo alrededor de la estría. Resultado: _________________________________________________________________________________________________ B. Fermentación de azúcares en medio de Kligler.

1. Inocular por picadura y en la superficie del tubo que contienen medio de Kliegler, la cepa seleccionada. 2. Incubar a 37 °C durante 24 horas. 3. Observar el resultado e interpretarlo como sigue:

Fermentación de glucosa = vire del rojo de fenol (indicador de pH) de rojo a amarillo en el fondo del tubo. Fermentación de lactosa = vire del indicador de rojo a amarillo en la superficie del medio de cultivo. Producción de H2S = presencia de un precipitado negro en el medio de cultivo.


______________________________

______________________________

______________________________

______________________________

______________________________

______________________________

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Resultados: ___________________________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________ C. Fermentación de azúcares. Prueba del rojo de metilo.

1. Inocular la cepa seleccionada en el tubo con caldo rojo de metilo (RM). 2. Incubar a 37 °C durante 24 horas. 3. Añadir al tubo 5 gotas de solución de rojo de metilo (indicador de pH). 4. Observar el resultado e interpretarlo como sigue:

Prueba de rojo de metilo positiva = presencia de color rojo en todo el cultivo o cuando el reactivo permanece de ese color en la superficie del medio.

Resultado: ___________________________________________________________________________________________________ D. Fermentación de azúcares. Prueba de Voges Proskauer.

1. Inocular la cepa seleccionada en el tubo que contienen caldo VP. 2. Incubar a 37 °C durante 24 horas. 3. Agregar los siguientes reactivos en el orden que se indica:

6 gotas de una solución de alfa naftol. 2 gotas de una solución de KOH creatina.

4. Agitar el tubo suavemente y dejarlo en reposo a 37 °C durante un tiempo de 20 a 30 minutos. 5. Observar el resultado e interpretarlo como sigue:

Prueba de VP positiva (producción de acetil metilcarbinol) = presencia de color rojo en la superficie del medio de cultivo. Resultado: ___________________________________________________________________________________________________ E. Prueba de la catalasa.

Método del portaobjetos. 1. Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio. 2. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. 3. Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo). 4. Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.

Resultado: ____________________________________________________________________________________________________

F. Prueba selectiva rápida para ureasa.

Se realiza según el siguiente procedimiento: 1. Pasar un hisopo de algodón impregnado de substrato con urea deshidratado sobre la superficie de dos o tres colonias, de

modo que la punta se cubra con el microorganismo. 2. Colocar el hisopo con la levadura dentro de un tubo que contenga 3 gotas de cloruro de benzalconio al 1% (pH 4,86 ±0,01) y

rotar con firmeza contra el fondo para poner en contacto los microorganismos con las fibras de algodón. 3. Tapar el tubo e incubar a 45 °C durante 30 minutos. 4. Examinar a los 10, 15, 20 y 30 minutos para detectar un cambio de color de amarillo a púrpura. Un color rojo a púrpura indica

producción de ureasa. Resultados: ___________________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

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CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son los valores de pH a los que viran los siguientes indicadores? Rojo de fenol: ________________________________________

Rojo de metilo: _______________________________________

2. Indica de qué compuesto proviene el acetil metil carbinol, así como la reacción que se lleva a cabo entre el mismo, el alfa naftol y el reactivo de KOH creatina. ________________________________________________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 3. Describe la levadura estudiada de acuerdo a sus características metabólicas. ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ CONCLUSIONES ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________










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PRÁCTICA 4. MÉTODO PARA LA CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

OBJETIVO: Realizar adecuadamente el conteo de mohos y levaduras viables presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano, mediante el método de cuenta en placa, de acuerdo a los lineamientos de la NOM-111-SSA1-1994.

INTRODUCCIÓN

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos, o la exposición del alimento a la irradiación. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lácteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacáridos, ácidos orgánicos, proteínas y lípidos. También pueden causar problemas a través de: (a) síntesis de metabolitos tóxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibióticos o irradiación y (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patógenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la decoloración de las superficies de alimentos. Mohos El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificación y clasificación de los mohos se basa en observaciones macroscópicas y microscópicas. En comparación con la mayoría de las levaduras y de las bacterias, la mayoría de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedirá o retardará mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podrían considerarse mesófilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura óptima de la mayoría se encuentra alrededor de los 25 a 30°C, aunque algunos son psicrótrofos y algunos son termófilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayoría crece mejor a pH ácido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos. Poseen enzimas hidrolíticas, y de aquí que algunos se utilicen para la producción industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas. Algunos géneros de mohos importantes en alimentos. Mucor. Intervienen en la alteración de algunos alimentos y se utilizan en la fabricación de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificación del almidón, para la maduración de quesos y para la fabricación de algunos alimentos orientales. Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy común e interviene en la alteración de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc. Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la producción industrial de ácido cítrico y glucónico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricación de ciertos alimentos orientales y en la obtención de enzimas. Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos tóxicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida principalmente por A. versicolor; el ácido ciclopiazónico producidas por A. flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y ácido penicílico también son producidas por especies de Aspergillus, las tóxinas tremorgénicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Penicillium. Es otro género de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas cítricas. Las especies P. camemberti, P. roqueforti se utilizan en la maduración de quesos. Se han reportado más de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la función hepática o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, ácido ciclopiazónico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y roquefortina y el ácido secalónico. De éstas la ocratoxina A es sin duda la más importante, es un carcinógeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o trigo, o a través de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por humanos. Levaduras

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El término levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemación o por fisión. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benéficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboración de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, también se utilizan en la obtención de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteración del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos. Los caracteres morfológicos de las levaduras se determinan mediante su observación microscópica. Su forma puede ser desde esférica a ovoide, alimonada, piriforme, cilíndrica, triangular e incluso alargada. La mayoría se reproducen asexualmente por gemación multicelular o por gemación polar. Unas pocas especies se reproducen por fisión. En los cultivos en placas de agar es difícil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observación microscópica de los microorganismos es la única forma segura de diferenciarlas. La mayoría de las colonias jóvenes de levaduras son húmedas y algo mucosas; la mayoría de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metabólica es a la vez de ambos tipos. La mayoría de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayoría de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayoría de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura óptima en torno a los 25 a 30°C y una temperatura máxima en torno a los 35 a 47°C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azúcares son la fuente energética más apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los ácidos orgánicos y el alcohol. Algunos géneros de importancia en alimentos son: Schizosaccharomyces. Levaduras de este género se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la miel. Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias, como en la fermentación del pan, fermentación de la cerveza, fermentación de los vinos, en la producción de alcohol, glicerol e invertasa. Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtención de productos lácteos por su capacidad de fermentar la lactosa. Zygosaccharomyces. Las levaduras de este género son importantes por su capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azúcar (osmófilas), intervienen en la alteración de la miel, jarabes y melazas, y también en la fermentación de la salsa de soya y de algunos vinos. Pichia. Crecen en la superficie de los líquidos formando una película. P. membranafaciens produce una película en la superficie de las cervezas y vinos. Debaromyces. Forman película en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la superficie de los quesos y de los embutidos. Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limón y crecen en los zumos de frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fábricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la lactosa, alterando productos lácteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos ácidos. Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtención de proteína unicelular para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lácteos. C. lipolytica produce alteración de la mantequilla y margarina. Brettanomyces. Producen grandes cantidades de ácido e intervienen en la fermentación de la cerveza belga de tipo “lambic”, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrándose en las fábricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada. Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en el sauerkraut. FUNDAMENTO El método se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo específico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacáridos que contiene el medio. La hidrólisis de estos compuestos se efectúa por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH ácidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. Así mismo, la acidificación permite la eliminación de la mayoría de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubación a una temperatura de 25 ± 1 ºC da como resultado el crecimiento de colonias características para este tipo de microorganismos. NOTA La Norma Oficial Mexicana utiliza únicamente el agar papa dextrosa para la detección y cuantificación de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la cuantificación de las levaduras, la utilización del agar extracto de malta acidificado ya que es un medio más rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano.

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MATERIAL

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 90.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al

0.1%, estéril.

3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%,

estériles con tapón de algodón.

4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa.

4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta.

Vaso de licuadora estéril.

Motor para licuadora.

Pipetas graduadas estériles de 1 mL con tapón de algodón.

Pipetas Pasteur estériles.

Propipeta.

Cajas de Petri estériles.

Utensilios estériles para la manipulación de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc.

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25±1°C.

Baño de agua con control de temperatura y circulación mecánica mantenida a 45±1°C.

Portaobjetos, cubreobjetos, diurex.

Microscopio óptico.

Asa bacteriológica y asa micológica.

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador.

Solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2.

Agua peptonada al 0.1 %.

Agar papa dextrosa.

Agar extracto de malta.

Solución colorante de lactofenol azul de algodón.

Colorantes para tinción de Gram.

Solución estéril de ácido tartárico al 10.0 %.

DESARROLLO DE ACTIVIDADES 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 ó agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar la muestra con la solución anterior en un vaso de licuadora estéril y homogeneizar durante 10.0 seg a velocidad mínima. Esta es la dilución primaria. 3. De la suspensión o solución anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operación tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una pipeta estéril para cada dilución. NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cúmulo de hifas. Debido a esto, el número de UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneización de la muestra (a mayor tiempo de homogeneización mayor será la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentarían las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneización citados en esta metodología son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano.

4. Colocar por duplicado en cajas Petri estériles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estéril. 5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estériles. Enfriarlos y mantenerlos a ±45°C. 6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de ácido tartárico al 10% esterilizado por filtración en membrana, o bien esterilizar la solución a 121°C±1°C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a ±45°C se le deberá adicionar 0.3 mL del ácido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaución de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo. 7. Después de la acidificación, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potenciómetro.

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8. En cada caja de Petri con inóculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a ±45°C. El tiempo transcurrido entre la preparación de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min. 9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrás hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejándolas reposar sobre una superficie horizontal fría. 10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verterá en una caja de Petri sin inóculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Después de la incubación estas cajas no deberán presentar desarrollo de colonias. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25±1°C. 12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5 días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificación de 4 días de incubación o incluso las de 3 días. En este caso, se informa el período de incubación en los resultados de los análisis. 13. Realizar una tinción húmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodón, para un examen microscópico y una posible identificación de los mohos que se hayan desarrollado. 14. Realizar una tinción de Gram para la observación microscópica de las levaduras obtenidas. 15. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 3, 4 y 5 días de incubación (a 26 ± 1ºC o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilución. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25±1°C durante 5 días. 18. Describir las características macroscópicas y microscópicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada. 19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difícil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 días de incubación y aún a los 3 días. En este caso se debe informar el periodo de incubación de 3 ó 4 días, en los resultados del análisis.

DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solución diluyente

10-1

10-2

10-3

10-4

1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Homogenizar

con 90 ml de

solución

Pesar 10 g de

muestra en

condiciones

de asepsia

Depositar por duplicado 1 ml de cada dilución en cajas de Petri

Adicionar de 15 a 20

ml de agar papa

dextrosa y/o agar

extracto de malta

acidificados con 0.3

ml de ácido tartárico

al 10 % enfriado a 45

°C en cada placa.

Contar aquellas placas que tengan entre 10 y 150 colonias de hongos y/o levaduras y reportar por separado como UFC/g o ml de muestra, indicando tiempo de incubación.

Incubar las cajas en

posición invertida 3,

4 o 5 días. Homogeneizar la

muestra con el

agar mediante

movimientos

rotatorios.

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RESULTADOS Seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadística). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el número de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado físico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el número de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilución correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el número obtenido de UFC indicando la dilución correspondiente. En el caso de no encontrar colonias características de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g ó bien menos de 10 UFC/mL. Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar el tiempo de incubación en el que se realizó la cuantificación. Para cualquiera de los casos citados se deberá reportar por separado el resultado de la cuantificación de hongos y de levaduras. Cálculos UFC/ml de hongos= ___________________ UFC/ml de levaduras = ________________________ Tiempo de incubación:_____________________ Tiempo de incubación = _______________________ Observaciones macroscópicas de los diferentes tipos de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis: Observación microscópica de los diferentes tipos de mohos y levaduras obtenidas durante el análisis (previa tinción):

I. II. III.

IV. V. VI.

38

CONCLUSIONES

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________









IV.

I. II. III.

V. VI.

39

PRÁCTICA 5. EQUILIBRIO QUÍMICO

OBJETIVO: Predecir en qué sentido avanzará una reacción cuando se altera la situación de equilibrio debido a un cambio en la concentración de alguna de las especies reactivas.

INTRODUCCIÓN

La mayoría de las reacciones químicas son reversibles, al menos en cierto grado. Al inicio de un proceso reversible, la reacción procede hacia la formación de productos. Tan pronto como se forman algunas moléculas de producto, comienza el proceso inverso: estas moléculas reaccionan y forman moléculas de reactivo. El equilibrio químico se alcanza cuando las velocidades de las reacciones directa e inversa se igualan y las concentraciones netas de reactivos y productos permanecen constantes. El equilibrio químico es, por tanto, un proceso dinámico. Los equilibrios químicos son importantes para explicar un gran número de fenómenos naturales, y desempeñan papeles importantes en muchos procesos industriales.

Para una reacción reversible de la forma:

aA + bB cC + dD a, b, c y d son los coeficientes estequiométricos de las especies reactivas A, B, C y D y la constante de equilibrio viene dada por la expresión:

Esta expresión se deduce de la ley de acción de masas que establece que para una reacción reversible en equilibrio, y a una temperatura constante, una relación determinada de concentraciones de reactivos y productos tiene un valor constante “K” llamado constante de equilibrio. Decimos que esta relación es la expresión de la constante de equilibrio. Los corchetes de la ecuación significan concentraciones molares. Es importante resaltar que aunque las concentraciones pueden variar, el valor de K para una reacción dada permanece constante, siempre y cuando la reacción esté en equilibrio y la temperatura no cambie. El equilibrio químico representa un balance entre las reacciones directa e inversa. Hay diversos factores experimentales que pueden alterar este balance y desplazar la posición del equilibrio para que se forme mayor o menor cantidad de un determinado producto. Las variables que se pueden controlar en forma experimental son: concentración de reactivos o productos, presión, volumen y temperatura. El principio de Le Châtelier establece que si un sistema en equilibrio se perturba por un cambio de temperatura, presión o concentración de uno de los componentes, el sistema desplaza su posición de equilibrio de modo que se contrarreste el efecto de la perturbación, hasta alcanzar un nuevo estado de equilibrio. En esta práctica vamos a aplicar el principio de Le Chatelier observando cómo afectan los cambios de concentración a la posición del equilibrio de una reacción química.

MATERIAL

1 vaso de precipitados de 250 mL.

1 gradilla.

5 tubos de ensayo.

1 pipeta.

1 varilla de vidrio.

Solución de NaOH 2 M.

Solución de HCl 0.1 M.

Solución de KSCN 0.1 M.

Solución de FeCl3 0.1 M.

40

DESARROLLO DE ACTIVIDADES

1. En un vaso de precipitados de 250 mL adicionar 1 mL de una disolución de FeCl3 0.1 M, 1 mL de KSCN 0.1 M y 50 mL de agua. El ión SCN- y el ión Fe+3 reaccionan inmediatamente dando lugar al ión tiocianato de fierro (III), de color rojo, estableciéndose el siguiente equilibrio:

La intensidad del color rojo nos indicará, de manera cualitativa, la cantidad de dicho ión en la mezcla en equilibrio. 2. La disolución preparada se dividirá en cuatro partes iguales, aproximadamente, que se colocarán en cuatro tubos de ensayo: - El primero de estos tubos de ensayo se deja como muestra de referencia. - Al segundo tubo se le añadirá, gota a gota, una disolución de cloruro de hierro (III). - Al tercero se le añade, también gota a gota, una disolución de KSCN. - Al cuarto se le añade, gota a gota, una disolución de NaOH 2 M. Realice un esquema de lo ocurrido en cada tubo de ensaye:

CUESTIONARIO

1. Escribe la expresión de la constante de equilibrio correspondiente a la formación del [Fe(SCN)6]-3. 2. Explicar, según el principio de Le Chatelier y en función del cociente de reacción, los cambios cualitativos que se producen en la composición de la mezcla en equilibrio al añadir los diferentes reactivos.

Adición de FeCl3(ac): ___________________________________________________________________________________

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Adición de KSCN(ac): ___________________________________________________________________________________

Referencia Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

41

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Adición de NaOH(ac): ___________________________________________________________________________________

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3. Explicar y escribir qué reacción tiene lugar al añadir la disolución de NaOH(ac) 2 M: ________________________________________

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CONCLUSIONES

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2. Preparación adecuada de reactivos. 3

3. Utiliza correctamente el material de laboratorio. 3

4. Registro de resultados y cuestionario completos. 5




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