PRACTICA No

MICROBIOLOGIA

PRACTICA No. 5Aislamiento e identificacin microscpica de HongosOBJETIVO: Aislar e identificar hongos filamentosos o mohos y levaduras (hongos unicelulares) por medio de su aislamiento, cultivo y microcultivo para el estudio de sus caractersticas morfolgicas y de reproduccin.

MARCO TERICO:

EXAMEN MORFOLGICO DE LOS MOHOS (HONGOS FILAMENTOSOS)Para el aislamiento y cultivo de los mohos (hongos filamentosos), se utilizan medios de cultivo especficos que favorezcan su desarrollo, por el tipo de nutrientes que contienen, (Agar papa dextrosa, Agar sabouraud dextrosa, Agar extracto de malta) generalmente con elevadas concentraciones de azcar, pH cido, condiciones aerobias y temperatura entre 20 y 30C. Se pueden utilizar placas o tubos con agar inclinado para su cultivo. Puesto que la identificacin de los hongos depende en gran parte de sus caractersticas morfolgicas, como el tipo de agrupacin de las esporas, deben de tomar precauciones al hacer preparaciones para el examen microscpico. En general. Los cultivos lquidos no se utilizan para este propsito. En los cultivos en medios slidos en placa se observan las caractersticas fsicas del cultivo y las esporas como: Color del micelio.

Color de las esporas

Aspecto (terroso, hmedo, cremoso.

Bajo estas condiciones no es posible realizar preparaciones microscpicas ya que la manipulacin rompe y desorganiza las estructuras y caractersticas del micelio, que determinan su identificacin y clasificacin con base a su tipo de reproduccin.

Los hongos se estudian y clasifican a travs de las diferencias en su morfologa y tipos de reproduccin. Las colonias o talo difieren en tamao, aspecto y color. Su desarrollo puede ser en colonias aisladas o desarrollo extensivo sobre toda la superficie del medio de cultivo, limitado solo por los bordes o paredes de la caja o tubo. El color caracterstico de los mohos se debe al color de masas de esporas asexuales. Otra caracterstica til es el tipo de hifas que constituyen el micelio vegetativo, las cuales pueden ser septadas (con paredes transversales) o cenocticas (sin paredes transversales)Un mtodo para examinar los hongos filamentosos o mohos es el microcultivo o tcnica de cultivo en portaobjetos, ya que permite manejar y observar la especie sin modificar su desarrollo, el arreglo y acomodo de sus estructuras de manera que permanezcan intactas.

MORFOLOGA Y REPRODUCCIN DE LAS LEVADURAS.

La mayora de las levaduras se reproducen, principalmente, mediante el proceso asexual de gemacin. Para ello, la clula madre forma una zona de crecimiento hacia el exterior, la cual finalmente se separa como una clula hija. La reproduccin sexual en las levaduras que producen esporas sexuales se lleva a cabo por la conjugacin de dos ascosporas, formando una clula vegetativa diploide. Luego el ncleo se divide en cuatro o menos ncleos, que maduraran en cuatro ascosporas. Las ascosporas son retenidas en la clula madre, posteriormente el asca (saco) se rompe y libera las ascosporas, para repetir el ciclo.

PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS.1. Esterilizar el rea de trabajo con una solucin de yodoforo.

2. Organizar el material y medios de cultivo dentro del rea de esterilidad del mechero de Bunzen encendido.3. Preparar cajas de Petri o tubos con agar inclinado conteniendo el medio de cultivo para el desarrollo de hongos (Agar papa dextrosa, Agar sabouraud dextrosa, Agar extracto de malta,).

4. A partir de la muestra problema, inocular las cajas o placas de Petri y/o los tubos con agar inclinado selectivo para el desarrollo de hongos de la siguiente manera.5. Tomar el asa de cultivo y esterilizarla a la flama llevndola hasta la incandescencia, enfriarla inmediatamente sobre la superficie del agar.

6. Con el asa tomar una pequea porcin de la muestra problema y sembrar por estria sobre la superficie del medio de cultivo en las cajas de Petri o en los tubos con agar inclinado.

7. Incubar las cajas de Petri y/o tubos con agar inclinado a temperatura ambiente por 3 a 5 das.

8. Identificar las siguientes caractersticas de cultivo. Color del micelio. Aspecto del cultivo (terroso, hmedo, aterciopelado, rugoso)

Tipo de desarrollo (extensivo, en colonias).

PROCEDIMIENTO PARA EL MICROCULTIVO.1. Esterilizar rea de trabajo con una solucin de yodoforo.2. Organizar el material y medios de cultivo dentro del rea de esterilidad del mechero de Bunzen encendido.3. Preparar cajas de Petri conteniendo el medio de cultivo para el desarrollo de hongos (Agar papa dextrosa, Agar sabouraud dextrosa, Agar extracto de malta,).4. Cuadricular las cajas con un exacto, de manera de poder extraer bloques del agar.

5. Esterilizar cajas de Petri conteniendo un portaobjeto y cubreobjetos.

6. Abrir la caja dentro del rea de esterilidad y colocar con pinzas esteriles un bloque del agar cuadriculado.7. A partir de la muestra problema conteniendo mohos en desarrollo, inocular o sembrar por picadura el bloque de agar en las cuatro caras del bloque.

8. Incubar los microcultivos a temperatura ambiente por 3 a 5 das.

9. Supervisar el desarrollo de los hongos cada 24 horas.

10. Identificar al microscopio la especie de hongo desarrollado, colocando el portaobjeto en la platina y enfocar con el objetivo de seco dbil (10X) y seco fuerte (40X).11. Identificar caractersticas de cultivo y morfolgicas:Caractersticas de cultivo.

Color del micelio.

Aspecto del cultivo (terroso, hmedo, aterciopelado, rugoso)

Tipo de desarrollo (extensivo, en colonias).

Caractersticas morfolgicas.

Tipo de hifas (tabicadas o cenocticas)

Tipo de esporas (artrosporas, conidiosporas, clamidosporas, esporangiosporas, blastospora o blastoconidia) Morfologa o estructura de desarrollo..

12. Incluir fotografa de la identificacin microscpica en el reporte.

PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE LEVADURAS:

1. A partir de un cultivo de 24 h. en caldo nutritivo de la levadura Sacharomyces se inoculan placas de Petri conteniendo el medio de cultivo para el desarrollo del microorganismo.

2. Sembrar por estria en tres planos sobre la superficie del medio de cultivo, para obtener colonias aisladas.

3. Incubar a temperatura ambiente por 3 a 5 das.

4. Identificar las siguientes caractersticas de cultivo:

Forma de las colonias.

Color de las colonias.

Aspecto (cremosas, brillantes, opacas, rugosas).

Tamao.

Borde (liso, rugoso).

PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACIN MICROSCPICA.

1. A partir del cultivo de 24 h de Sacharomyces hacer preparaciones hmedas.

2. Esterilizar una asa de cultivo y enfriarla, colocar una asada del cultivo de 24 h de Sacharomyces sobre un portaobjetos limpio y adicionar una gota de lugol.

3. Colocar un cubreobjetos sobre la preparacin.

4. Colocar la preparacin hmeda sobre la platina del microscopio y observar con los objetivos en seco, seco dbil 10X y seco fuerte 40X.

5. Identificar las caractersticas morfolgicas por medio de una fotografa e incluirlo en el reporte de laboratorio.

IDENTIFICAR

CULTIVO DE MOHOS:

1. Color de micelio2. Aspecto (polvoso hmedo, aterciopelado, filamentoso, seco)MICROCULTIVO: 1. Hifas. Tabicadas o cenocticas2. Tipo de esporas asexuales (artrosporas, clamidosporas, esporangiosporas o blastosporas)3. Tomar una fotografa de cada una de las estructuras identificadas (hifas y esporas)CULTIVO DE LEVADURAS:Las 5 caractersticas de cultivo (macroscpicas) a identificar son:

Tamao (~ < 1mm, de 1 mm o > 1 mm de dimetro)

Aspecto (cremoso, brillante, opaco, rugoso, planas, secas, cncavas o convexas )

Caractersticas de cultivo Microscpicas1. Forma2. Proceso de gemacin3. Fotografiar imgenes EN EL REPORTE DE LABORATORIO INCLUIR:1. EL CUESTIONARIO DE LA PRACTICA CORRESPONDIENTE (numerar pregunta y respuesta)

2. EL REPORTE DE LABORATORIO INCLUYE:

1) Nmero de practica

2) Nombre de la practica

3) Objetivo

4) Tcnicas utilizadas5) Medio de cultivo

6) Tiempo y temperatura de incubacin

7) Caractersticas indicadas en el punto anterior8) Incluir fotografa de la identificacin microscpica en el reporte.3.

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