HistoquímicaDr. Giovanni Arnoldo Molina Paredes

Residente de Primer Año de PatologíaAgosto 2012

Introducción. Las imágenes producidas por absorción, en

preparaciones coloreadas, son mucho más fáciles de interpretar que las imágenes de difracciones dada por preparaciones no coloreadas.

Los diversos elementos de los tejidos poseen más o menos el mismo índice de refracción, lo que hace que el reconocimiento sea una tarea difícil.

Estos dos argumentos hacen comprender la necesidad de las coloraciones para el estudio morfológico de células y tejidos.

Introducción. Coloración: es el proceso mediante el

cual un cuerpo es teñido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solución colorante.

Introducción. Colorantes: reciben esta denominación las

sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos. poseen tres componentes importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales: uno que aporta el color, denominado cromóforo, y otro que posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo. Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se denomina cromógeno.

Introducción.

Introducción. Las coloraciones pueden ser:

Ortocromáticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solución colorante empleada.

Metacromáticas: una sustancia o un componente celular se tiñe con un color diferente al del colorante empleado.

Introducción. Métodos de coloración:

Coloración directa: existe verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.

Coloración indirecta: requiere intervención de intermediarios o mordientes.

Coloración progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.

Coloración regresiva: se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto del colorante por medio de diferenciadores.

Coloración simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado.

Coloración combinada: se tiñen elementos nucleares y citoplasmáticos.

Coloración panóptica: coloración combinada realizada sucesivamente por colorantes neutros.

Coloración pancrómica: en un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros que se necesiten.

Batería de coloración H-E. Desparafinar los cortes con dos

baños de xileno de 10 a 15 min. c/u. Eliminar el solvente por sucesivos

baños en alcohol de 100°, 96°, 70° de 1 a 2 min. c/u.

Hidratar en agua destilada durante 1 a 2 min.

Tinción nuclear en hematoxilina durante 2 a 12 min. de acuerdo a la formula utilizada.

Viraje de la hematoxilina en agua corriente hasta desprendimiento total del color (3 a 5 min.).

Coloración citoplasmática con eosina durante 15 a 30 seg.

Lavado en agua destilada. Deshidratar, aclarar y montar. Los pasos de la deshidratación

pueden ser suplidos dejando secar el corte en estufa a 37° por 15 a 20 min.

Colorantes y reacciones histológicas comunes. Hematoxilina: Núcleo y regiones ácidas. Eosina: Regiones básicas y colágena. Tinciones argénticas: Fibras reticulares. Hematoxilina férrica: Músculo, eritrocitos. Ácido peryódico de Schiff: Moléculas ricas en

carbohidratos y glucógeno. Colorantes de Wright y Giemsa: Eritrocitos y

gránulos de eosinófilos; Núcleos de leucocitos y gránulos de basófilos; Citoplasma de monocitos y linfocitos.

Tricrómica de Masson: Núcleos; Músculo, queratina y citoplasma; Mucinógeno, colágena.

Tinciones histoquímicas. Suponen una reacción química en la que

intervienen moléculas pertenecientes al propio tejido.

Su objetivo es poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección histológica y estudiar su distribución tisular "in situ". Estas moléculas son difícilmente discernibles con colorantes generales.

Tinciones histoquímicas. Durante el procesamiento del tejido previo a la

reacción histoquímica, como la fijación o la inclusión, hay que evitar dañar a la molécula que se quiere detectar porque de otra manera resultaría en falsos negativos, es decir, no tener tinción cuando en realidad la molécula de interés sí está presente en el tejido, aunque deteriorada.

Tinciones histoquímicas. Periodic acid–Schiff (PAS).

Es una técnica extremadamente útil y agradable estéticamente. Las sustancias que contienen grupos glicol o sus derivados amino o alquilaminos son oxidados por el ácido periódico para formar dialdehídos, que se combinan con el reactivo de Schiff para formar un compuesto insoluble de color magenta.

Demuestra el glucógeno y mucosustancias neutrales, esboza las membranas basales, y pone en evidencia la mayoría de los tipos de hongos y parásitos.

Como curiosidad, cabe añadir que también es útil para la demostración de los cristales intracitoplasmáticos en el sarcoma alveolar de partes blandas.

Tinciones histoquímicas. Tinciones para microorganismos.

Incluyen técnicas para las bacterias gram-positivas y gram-negativas, micobacterias ácido-resistentes, hongos y parásitos.

La tinción de Gram permite la separación de las bacterias en aquellas que retienen el complejo violeta-yodo (gram positivos) y aquellas que se decoloran por tratamiento del alcohol o acetona y son teñidas por safranina o fucsina.

Depende del alta contenido lipídico (ácidos micólicos y çacidos grasos de cadena larga) en las paredes celulares de las micobacterias, que confieren a la célula la capacidad de formar complejos colorantes básicos (tales como carbolfucsina) y para retenerlos tras la fuerte decoloración con alcohol ácido.

Las técnicas de este grupo más utilizados son el de Brown y Brenn (B &B; como una modificación de la tinción de Gram), la tinción de Ziehl-Neelsen (de microorganismos ácido-alcohol resistentes), Grocott hexamina y plata (para los hongos y Pneumocystis), PAS (para los hongos, amebas y tricomonas), y Dieterle o una de sus modificaciones (para Helicobacter, Legionella y organismos de la sífilis y enfermedad de Lyme).

Tinciones histoquímicas. Tinciones argentafines y argirófilas.

La reacción argentafín depende de la presencia en el tejido de una sustancia, a menudo del grupo fenólico (tales como las catecolaminas o indolaminas), que reduce las sales de plata (y otros metales); por lo general se utiliza la técnica de Fontana-Masson en el material incluido en parafina.

En la reacción argirofílicas, es añadido un agente reductor tal como la hidroquinona o la formalina; generalmente se emplea la técnica de Grimelius no modificada.

Se utilizan principalmente para la identificación de las células neuroendocrinas y sus tumores, también para la demostración de fibras de reticulina, melanina y calcio.

Tinciones histoquímicas. Tinciones para amiloide.

La tinción llamada rojo Congo es considerada como la técnica más fiable y práctica para detectar amiloide.

Tinciones histoquímicas. Tinciones de retículo.

Demuestran tanto las fibras reticulares como materiales de la membrana basal. Consisten en fibras muy finas de colágeno tipo III, muy extendidas en el tejido conectivo. Las membranas basales se compone principalmente de colágeno tipo IV y laminina. En ambos casos, parece que la adsorción de la plata y su PAS positividad se deben a un revestimiento de proteoglicanos consolidados.

Tradicionalmente, sus principales aplicaciones (como Gomori, Wilder, y Gordon y Sweet) en la patología tumoral han sido para distinguir: neoplasias epiteliales de no epiteliales, diversas neoplasias mesenquimales de otras, y carcinoma in situ o invasor.

Tinciones histoquímicas. Tinciones tricrómicas.

En los métodos tricrómicos, tales como los elaborados por Masson, Van Gieson, y Mallory, ácido fosfotúngstico o fosfomolíbdico se utilizan en combinación con varios colorantes aniónicos.

El valor principal de este grupo de tinciones es en la evaluación del tipo y cantidad de material extracelular.

Las tres estructuras tisulares demostradas por los tres componentes de los tintes son los núcleos, el citoplasma, y el colágeno extracelular, respectivamente.

Tinciones histoquímicas. Tinciones de Perls, Fontana-Masson y von Kossa.

Las tinciones de hemosiderina (Perls), melanina (Masson-Fontana) y calcio (Von Kossa).

En la técnica de Perls, el ácido clorhídrico se separa de la proteína unida al hierro, permitiendo que el ferrocianuro de potasio pueda combinarse específicamente con el hierro férrico para formar ferrocianuro férrico (azul de Prusia).

En el método de Fontana-Masson para melanina, una solución de plata amoniacal se utiliza sin un baño de reducción. Solamente aquellas sustancias capaces de reducir las sales de plata directamente (es decir, argentafines), como la melanina, se demuestran.

En el método de von Kossa para el calcio, la plata es sustituida por sales de calcio; que luego es reducida a una plata metálica negra por el uso de la luz o un revelador fotográfico.

Tinciones histoquímicas. Tinciones para mucina.

La mucina es el término tradicional utilizado para un gran grupo de macromoléculas que contiene un grupo ácido, que se divide en dos categorías principales: las epiteliales O-glicoproteínas (unido a la membrana o secretado) compuesto de un núcleo de proteína y un ácido siálico que contiene resto de carbohidrato (si sulfatado o no) y los glicosaminoglicanos del estroma, que contienen ácido hialurónico y que también puede ser sulfatado.

Varias tinciones están disponibles para la demostración específica de mucinas altamente ácidas. Estos incluyen el azul de Alciano, hierro coloidal, de hierro de alta-diamina, y el clásico mucicarmín Mayer.

Se utilizan para clasificar a la metaplasia gástrica incompleta en subtipos (que contienen sialomucina y sulfomucina), que tienen un potencial maligno supuestamente diferente.

Tinciones histoquímicas. Tinción de Giemsa.

La técnica es muy útil para la demostración de varios elementos hematolinfoides (incluyendo los mastocitos) y microorganismos.

Los núcleos celulares se tornan de un violeta intenso, la granulación eosinófila de un pardo rojizo, el citoplasma de linfocitos de un azul definido y sus núcleos de violeta variable.

Tinciones histoquímicas. Tinción para fibras elásticas.

Las técnicas tipo Weigert son bastante específicas para la elastina, y son consideradas por muchos como el método de elección para la demostración de estas fibras extracelulares.

Sin embargo, la tinción de Gieson Verhoeff-van (VVG) es más popular porque es rápida y se esbozan las fibras elásticas con un fuerte color negro.

Ambas técnicas se suelen establecer en el contexto tricrómico proporcionado por la tinción de Van Gieson.

Como resultados, los núcleos celulares se tiñen de marrón a negro, la colágena de rosa a rojo y el músculo y citoplasmas de amarillo.

Bibliografía. Rosai and Ackerman's Surgical

Pathology, 10th Edition, By Juan Rosai. Laboratorio de Anatomía Patológica, 1a

edición, 1993.