Caracterização morfológica detalhada da Infecção por vírus Hendra de diferentes tipos de células utilizando super-resolução e imagem convencional

Resumo

Introdução: Vírus Hendra (HeV) é um vírus pleomorfico pertencente à família Paramixovírus. O nosso objetivo a longo prazo é compreender o processo de montagem de virions HeV. Como um primeiro passo, procurou-se determinar a célula mais apropriada em um sistema de cultura para estudar este processo, e, em seguida, utilizar este modelo para determinar a morfologia do vírus e identificar o local da montagem por imaginologia das principais proteínas de vírus codificado em células infectadas.

Métodos: Uma série de células primárias e linhas de células imortalizadas foram infectadas com HeV, fixado em vários pontos temporais pós-infecção, marcado para as proteínas HeV e fotografada por confocal, super-resolução e microscopia eletrônica de transmissão.

Resultados: Foram observadas diferenças significativas na distribuição da proteína viral, dependendo do tipo de célula infectada. As 8 hpi da proteína G do HEV foi detectada no retículo endoplasmático e a proteína M foi observada predominantemente no núcleo em todas as célulastestadas. Aos 18 hpi, células Vero HEV infectados mostraram proteínas M e G em toda a célula e em seções de microscopia eletronica de transmissão(TEM), em estruturas semelhantes a vírus pleomórficos. Em HEV infectando células MDBK, A549 e HeLa, proteína M do HEVfoi observada predominantemente no núcleo com proteína G na membrana. Em células primárias endoteliais da aorta de bovinos e suínos infectadas com HEV e duas linhas de células derivadas de bastão, a proteína M do HEV não foi observada a níveis tão elevados no núcleo emqualquer ponto de tempo testado (8,12, 18, 24, 48 hpi), mas observou-se predominantemente na superfície da célula em um padrão ponteadaco-localizada com proteína G. Estas estruturas positivas HEV M e G foram confirmados como HEV virions redondos por TEM esuper-resolução (SR) microscopia. Imagiologia SR demonstrarram pela primeira vez imagem de proteínas sub-virion de paramixovíruse a respectiva localização de HEV G, proteínas M e N dentro de virions.Conclusão: Esses resultados fornecem novas perspectivas sobre a estrutura

de HEV e mostram que para estudos de HEV por imaginologia aescolha de células de cultura de tecidos pode afetar os resultados experimentais. Os resultados também indicam que HEV deve ser considerado um vírus predominantemente redondo com um diâmetro médio de aproximadamente 280 nm por TEM e 310 nm por imagem SR.Palavras-chave: vírus Hendra, paramixovírus, microscopia confocal, microscopia, Super-resolução, a proteína M, proteína G.

Introdução:

Vírus Hendra (HEV), Nipah vírus (NIV) e Cedar vírus (CedPV) estão estreitamente relacionados, juntos formam o gênero Henipavirus da família Paramyxoviridae. Os morcegos são o reservatório dos henipavirus e tem sido a fonte de umnúmero de eventos spill-over. Surtos HEV tem-se restringido até agoraao norte da Austrália [1], mas surtos por NIV ter ocorrido em Bangladesh, Malásia/ Singapura e Índia[2]. Nestes eventos spill over, animais domésticos e seres humanos são infectadas com taxas de mortalidade significativas que, para VNIem particular, variam de 40-100% de [3].

Replicação do paramyxovirus ocorre dentro do citoplasma da célula hospedeira e partículas de vírus surgem a partir da superfície da célula, incorporando uma parte da membrana da célula hospedeira como o envelope viral. No entanto, os mecanismos precisos envolvidos no tráfico da proteína intra-celular e montagem da partícula infecciosanão são claras para muitos vírus [4], incluindo paramyxovírus.

Os códigos do genoma do HEV para 6 principais proteínas. A nucleoproteína(N), fosfoproteína (P) e proteína polimerase interagem com o genoma de RNA para formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP). Além dea proteína P, o gene P também codifica várias proteínas menores[6]. Localização sub-celular destas proteínas V, W e Cfoi demonstrada em células infectadas com proteínas C e Vpresentes por todo o citoplasma e proteínas W presente no núcleo (mas não o nucléolo). Todas as três proteínastambém foram detectados em virions purificados [7]. Proteínas V, W e Cdo HEV estão presentes em relativamente pouca quantidade e suasfunções permanecem pouco claras, embora tenham sido mostradaspara inibir a transcrição e a replicação [8].

A maioria dos trabalhos sobre as proteínas henipavirus em células infectadas centrou-se sobre as glicoproteínas F e G encontrados do lado de forados virions como eles são a chave para o anexo eprocessos de internalização do vírus. A glicoproteína G do HEVliga-se a sua superfície celular os receptores B2 e efrina B3 [9-11], que são mais altamente expressos em neurônios,arterial endotelial e células do músculo liso [12-14].O F (fusão) sofre uma glicoproteína conformacionalmudar quando G liga-se a uma célula hospedeira e conduz à fusãodo virion com a membrana da célula hospedeira [15] para iniciaro processo de replicação de vírus. As proteínas F de ambosos vírus NIV e HEV demonstraram ser sintetizados de forma inativa e precisa de ativação por cathepsins (imagino ser catepsinas) que sejam susceptíveisa ter lugar dentro do compartimento do endosomal [16,17].A proteína da matriz HEV (M), por analogia com outrosparamixovírus, é crucial para a morfogênese e virionjuntamente com a RNP constitui o conteúdo de virions. Opapel preciso que a proteína M executa na morfogênese viral éclaro, embora expressão, de proteína Niv M em tecidocélulas de cultura leva à formação de partículas semelhantes a vírus[18] e em E. coli, a formação de partículas redondas de tamanhoentre 20 e 50 nm [19]. Patch et al. [20] identificou umapequena sequência de proteína Niv M que foi fundamental para a brotaçãopartículas de viral-like. Proteína M do Niv, juntamente com outrasProteínas M de um pequeno número de outros paramixovírus[21-24] é encontrado no núcleo das células infectadas, masa razão precisa (s) para este fato não são claras. Em seus estudos,[25] Wang et al. Observou a proteína M do Niv primeiro no núcleoe em seguida, depois da infecção, dentro do citoplasmana membrana plasmática. Além disso, este trânsitoo através do núcleo parece ser essencial para a corretobrotamento viral. Esses autores também demonstraram que o surgimentoda proteína M do VNI ocorre dentro do núcleo,e que este parece ser importante para o vírusbrotação. Em células infectadas com o vírus sincicial respiratório(RSV), houve uma redução na transcrição da célula hospedeira levantando a possibilidade de que este possa ser uma função da energia nuclear da proteína M localizada [21].Uma compreensão da estrutura virion é uma etapa chave noo processo para desvendar a montagem do henipavirus. Usamosconfocal e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para comparar proteína HEV e produção de virion em diferenteslinhas celulares. Além disso, os dois sistemas de super-resolução(SR) de imagem foram usados para determinar se a resolução sub-virion

de proteínas paramixovírus era viável. Estas observaçõeslevou a conclusões importantes a respeito damorfologia do vírus da HEV e a adequação de várioslinhas de células como modelos in vitro da replicação do HEV.

Resultados

Proteína M e proteína G em células Vero infectadas com HEV

Postulamos que a co-localização das duas proteínas HEVM e G como mostrado por microscopia confocal indicariaou o local de montagem do vírus ou a presença individual departículas virais em culturas de células infectadas. As células Vero foraminfectadas a uma MOI de 8 então fixado em 8, 18 e 24 horasapós a infecção (IPH) e marcadas com anticorpos para HEV N,M e G. Na 8 hpi, HEV proteína G foi localizado no interior docitoplasma em um retículo endoplasmático (ER) padrão. Co-marcação com anticorpos contra uma enzima encontrada noa isomerase dissulfeto de ER, proteína (PDI), mostrou que quaseco-localização completa com a proteína G confirmandoa síntese de proteínas no RE (Figura 1a, b). Em contraste,HEV M foi localizada dentro de núcleos de células infectadas, principalmenteno nucléolo (Figura 1c). As proteínas M e G do HEVnão foram co-localizados no momento. Até 18 de HPI haviaum grande número de sincicios em toda a cultura com grandeexpressão de ambas as proteínas M e G ao longono citoplasma da célula e na membrana celular (Figura 1d).Proteína N foi distribuído por todo o citoplasmaem pequenas manchas puntiformes em 8 HPI (Figura 1e) e por 18 hpi,estava presente em grandes quantidades em todo o citoplasma da célulae em pequena 'lagos' (Figura 1-F). A Figura 2a mostra uma típicaárea de infecção na maior ampliação ilustrando proteínas HEV Me proteínas G (a 18 hpi) aparentemente associada bleblike,estruturas sobre a superfície da célula. Não é claroqual das estruturas na imagem são virions.As Figuras 2b e 2c mostram uma região semelhante, como mostrado porTEM. Estruturas ligadas à membrana de formas variáveise tamanhos contém um grande número de pequenos complexos de ribonucleoproteína tubular (RNP) (Figura seta 2B). Énão está claro se essas estruturas são partículas infecciosas HEVou extrusões de membrana das células infectadas.Apesar de não haver identificação óbvia de doenças infecciosasem partículas de células Vero infectadas com HEV eles são rotineiramenteusado para produzir stocks de vírus infecciosos. Amorfologia de partículas semelhantes a vírus presentes nestas preparaçõesfoi investigado usando eletrônica de contraste negativomicroscopia. A maioria das estruturas intactas observadasusando esta técnica foram redondas com um diâmetro médiode aproximadamente 242 nm (n = 15, SD 43) (Figura 2d).

HEV proteína M e G em A549, células MDBK e HeLa

Para determinar se os padrões de HEV M e proteína Gvisto em células Vero foram típico de células infectadas por HEV em geral, A549, MDBK e linhas de células HeLa foram infectadase fixados em 8 e 18 hpi. Enquanto foram pequenas diferençasentre estas linhas de células, em células infectadas com HEVfixado em 18 hpi o padrão global observado consistiuproteína G do HEV na membrana celular e a maioria das proteína M no núcleo com alguns difusamentelocalizado no citoplasma. Nas células A549, a maioria dasProteína L não foi co-localizada com a proteína H, emborahouve um pequeno número de co-localizada pontos na membrana celularque provavelmente representam virions (figura 3a, b). Em células MDBK a proteína M do HEV foi vista em altaníveis, tanto no núcleo como no citoplasma (Figura 3c,d) mas novamente muito pouca proteína M foi observada nomembrana celular. HEV proteína G esteve presente na célulamembrana, mas apenas uma pequena proporção parecia serem associação com a proteína H. Em células HeLa, como mostradona Figura 3e, f, enquanto que a infecção tinha progredido significativamentepara formar um grande contendo cerca de sincício15 núcleos no centro da imagem, o nível de HEV Ma expressão da proteína foi baixa, com a maioria localizada dentro do núcleo. Pequenas quantidades de proteína H eramvisto na membrana celular num padrão pontuada. Amaioria da proteína G HEV foi localizado na membrana da célula, com muito pouco presentes dentro do citoplasma.

Proteína M e G em células aórticas endoteliais de bovino (BAEC) e porcino (PAEC)

Como uma das principais metas para henipaviruses in vivo sãocélulas endoteliais [26], as culturas primárias de ambos de porcino e bovino.As células endoteliais aórticas de porcino (PAEC) e bovino (BAEC) erampreparadas e infectadas com HEV. Estas espécies foram inicialmenteseleccionadas com base na sua sensibilidade tanto para HEV quanto NIV [27]. Eles foram fixados em 8, 18,24 e 48 hpi e marcadas com anticorpos individuaisespecíficos para as proteínas M e G do HEV. Não houve significativadiferenças observadas na expressão de proteína M do HEV.

As proteínas G porcina e entre as células endoteliais de bovino.Em ambos os tipos de células, às 8 hpi, HEV G foi visto em um ERlikeníveis de padrão e baixa de M rotulagem foram vistos em alguns núcleos (dados não mostrados). No entanto, a 18 hpi láhouve uma diferença significativa na expressão M e G emCélulas PAEC e BAEC quando comparadas com células Vero(Figuras 1 e 4). Nas células endoteliais, a proteína G era HEV presente em um padrão ER, mas também como pontos nasuperfície celular (Figura 4a). A proteína M de HEV era predominantementevisto em pontos sobre a superfície celular e os baixosníveis em alguns dos núcleos (Figura 4b). Os padrões de rotulagem individuais para HEV M e G co-localizada nospontos na superfície celular (Figura 4C). Interessantemente, em célulasonde houve um número significativo de pontos sobre a superfície da célulaparecia haver um menor nível de rotulagemM no núcleo. É importante ressaltar que, em nenhum momento foi testado o padrão de proteínas M e G do HEV visto.As linhas celulares imortalizadas (ver acima) observadas em HeV infectandocélulas endoteliais primárias.

Proteínas HEV M e G no rim morcego e morcego pulmão derivadolinhas celulares

Os morcegos são os hospedeiros reservatórios de HEV e NIV, ainda aparecemser resistente à doença induzida por vírus. Duas linhagens crivadas de morcego de rim e pulmão (Paki, Palu)[28] foram selecionadas. Elas estavam infectados com o HEV, fixada em8, 18 e 24 hpi e anticorpo marcado para detectar HEV Me proteínas G. Proteína do vírus Hendra M esteve presente nos s núcleos em níveis baixos em 8 hpi e, em seguida, predominantementena membrana celular em pequenos pontos a 18 hpi.

Proteína G vírus Hendra era difícil de detectar em 8 hpi, mas foipresente em um padrão de ER-like e em pontos na membrana celulara 18 hpi. A proteína M e proteína G marcados como pontos positivosna superfície da célula mostrou colocalização claradas duas proteínas (amarelo, Figura 4d), comoobservado nas culturas de células endoteliais.

Resolução de imagem Sub-virion de HEV NM e proteínas G

O limite de resolução em microscopia de luz é de cerca de250-300 nm, no plano xy, e ~ 500 nm na zplano, tornando-o difícil de definir os pontos vistas no microscópio confocal como partículas virais. Desenvolvimentos recentesem imaginologia SR melhoraram significativamente aresolução viável usando microscopia de luz. Baseadosobre os dados obtidos, a hipótese de que células endoteliais primárias seria um sistema modelo melhor que as linhas celulares imortalizadas, com base história de cultura tecidual, observou que a expressão da proteína HEVpadrão foi notavelmente semelhante em ambas as espécies decélulas endoteliais, bem como as células de rim derivadas de bastão.Escolhemos essas células, portanto, para novas experiências SR.As lamelas de células PAEC e células Paki foram infectados com HEV, fixada em 18 hpi e preparado para confocal edois diferentes sistemas de microscopia SR. As lamelas forammarcadas com anticorpos individuais que reconhece proteína L HEVe proteínas N, que foram detectadas com espécies- especificas de imunoglobulinas por imagem confocal. Estasproteínas foram selecionadas quanto à sua distribuição, tal como avaliadoa partir de outros paramixovírus, dentro do envelope de membrana viral (HEV N) e formando a glicoproteínano exterior virion (HEV G).Usando microscopia confocal convencional pequenas partículas positivas HEV de G(Figura 5a, b) e HEV N (Figura 5b)foram facilmente detectados na superfície das células PAKI. Enquantoos pequenos pontos mostraram co-localização das duas proteínas virais, não foi possível detectar qualquer estruturadentro dos pontos fluorescentes. Grandes áreas de rotulagem Nsão vistos na Figura 5b (seta) e estes correspondem aos'lagos' de proteínas observadas em células Vero infectada com HEV no citoplasma (Figura 1f).

Esgotamento de fase solo (GSD) microscopia de super-resoluçãolicenças de ~ 100 nm resolução lateral sem melhorana resolução do plano z. A Figura 5c ilustra umapequena região da superfície de uma célula que mostra o PAKIpartículas virais como estruturas redondas com G (verde) do lado de fora e N (vermelho) do lado de dentro. O diâmetro médio deas partículas era 314 nm (n = 20, DP 39).Iluminação Microscopia (SIM) permite Estruturado-3Dum aumento de duas vezes na resolução em todas as três dimensões.Figura 5d é uma imagem de uma secção de pastoreio da célulamembrana com partículas semelhantes a vírus claramente resolvido coma proteína G (verde) como círculos redondas com um significativodiâmetro de cerca de 300 nm (n = 40, DP 50). HEV

Proteína N (vermelho) foi detectada dentro das estruturas esféricasconfirmando que eles eram HEV partículas virais. Em imagensobtida com ambos os sistemas, havia regiões de HEV proteína G de rotulagem que parecia estar na superfícieda célula o que pode representar, quer acumulações deHEV proteína G antes da montagem do vírus ou partículas semelhantes a vírusfalta de proteína N sobre a membrana.(Figura 5d seta).

Imagem por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirma partículas redondas são típicas estruturas paramixovírus

A confirmação final das partículas redondas visto em microscopia SRcomo virions paramixovírus-like foi fornecida porprocessamento de HEV células infectadas PAEC e Paki paraImagem TEM. Secções de células infectadas mostraram a presença de grandes números de partículas redondas (Figura 6a)a maior ampliação (figura 6b) mostrou omorfologia típica de um paramixovírus com um revestimento distorcidoindicando a presença de glicoproteínas F e G emna parte externa do vírus, um envelope de membrana e RNPsdentro do vírus. O tamanho destes virions foi variávelcom um diâmetro médio de 284 nm (n = 20, DP 61). Estruturas não pleomórficos semelhantes às detectadas em HEVforam vistos em células Vero.

HEV M é proteína associado com a membrana ou RNP do vírus?

Para resolver esta questão, as células PAEC foram infectados como acimae co-rotulados para HEV proteínas G e M, G e N, N e M e analisada por imagiologia SR SIM. Os resultados indicamque a proteína G é constantemente rotulada em um anel em torno dosvirions, mas havia poucas imagens para mostrar a proteína Mformando um anel no interior da proteína G HEV (Figura 7, linhaa). Proteína HEV N formaram estruturas irregulares no anel de proteína G(Figura 7 linha b) e proteína HEV M pareciade se associar com a proteína N (Figura 7 fileira c).

DiscussãoO processo de replicação paramixovírus e montagem vírusmanteve-se mal definido, apesar da importância dosparamyxoviruses como caxumba e sarampo na saúde de humanos. Isto foi devido, em parte, às dificuldades inerentesrealização de análise estrutural de paramixovírus pleomórfico, partículas com proteínas contendo regiões desordenadasque os tornam difíceis de analisar. Assim, o primeiroda estrutura tridimensional de um paramixovírus (vírus Sendai)não foi obtido até 2009, quando a estrutura foi determinadapor meio de tomografia crio-elétron [29]. Nesta estrutura,o nucleocapsídeo estava livre dentro do virion e aproteína de matriz foi ligado ao interior da partícula.Dois anos mais tarde a estrutura 3-D de sarampo foi obtidoe demonstraram que as hélices proteína de matriz formadas revestindoo ribonucleocapsídeo em vez de a membrana interior dovírus [30]. Como generalizada qualquer uma destas configuraçõesentre os paramixovírus não é conhecida.Aqui utilizou-se uma série de técnicas diferentes para ajudarelucidar alguns aspectos da replicação de um relativamente novogrupo de paramixovírus, os henipaviruses. A infecção de uma variedade de linhas celulares, bem como células endoteliais primárias deramresultados surpreendentemente diferentes. Na fase inicial (8 IPH) de HEVinfecção de células Vero não havia nenhum sinal de formação de vírusna membrana celular, mas a 18 e 24 hpi o padrão devírus M e marcação da proteína G foi difícil de interpretar. Emcontraste, em A549, HeLa e células MDBK infectadas comHeVand fixada em 18 hpi a maioria da proteína M foi HEVno núcleo com alguma rotulagem no citoplasma. Hendraproteína G do vírus estava presente no ER e em níveis elevadosna membrana celular, mas com pouca co-localização com aProteína M. Nestas últimas três linhas celulares, apareceuser reduzido o tráfico de proteína M do HEV do núcleopara a membrana celular. Embora a resposta de interferon defeituosoem células Vero [31] pode complicar a interpretaçãodestas experiências, as razões para o acúmulo aparenteda proteína M do HEV no núcleo de A549, células MDBKe células HeLa continuam por resolver. Claramente, imortalizadalinhas de células são capazes de produzir partículas virais infecciosas, masos padrões de proteínas HEV M e G visto nestas linhagem de célulasnão foram observadas em células endoteliais de culturas infectadas por HEV em qualquer um dos pontos de tempo 8-48 horas (dados nãomostrados). Que papel pode desempenhar nos títulos de vírus infeccioso produzido em diferentes linhas de células permanece obscura.

Como as células endoteliais são um importante alvo para HEV eNiv in vivo [26] os resultados obtidos com a infecção deestas células foram vistos como de particular interesse no contextodo processo de montagem in vivo do vírus. Os relatórios anterioresenvolvendo Niv mostraram algumas diferenças nainfectividade de células endoteliais a partir de diferentes sitios [32]com células endoteliais de aorta refratários à infecção, a menosmodificada para expressar o receptor efrina B2. Isto está emcontraste com os resultados aqui apresentados em que duas espéciesde células endoteliais aórticas primárias foram facilmente infectadascom HEV. Resultados semelhantes foram obtidos com VNI(Dados não apresentados).Em um estudo recente de replicação de um número henipavirusde linhas celulares, Aljofan et al. [27] relataram que os níveis de proteína e títulos virais variou consideravelmente entretipos de células. Os maiores níveis de produção de vírusforam obtidos com células Vero, células HeLa são intermediáriase A549 produzir um título mais baixo do vírus. Os autoresnão abordaram a questão da distribuição subcelularde proteínas virais. Nossos dados são amplamente compatíveise resultados também podem indicar possíveis razões para adiferenças na produção de título do vírus observado que a partir dediferentes linhas celulares.proteína M de Niv foi relatado para o trânsito do núcleo[25], mas este é o primeiro relato de que isso ocorra em células HEV infectadas. A função do tráfico nuclear de henipavirusProteína M é clara, mas um relatório recente Wanget al. [25] mostraram que para Niv, a proteína M teve tantolocalização nuclear e motivos de exportação e foi ubiquitinated no núcleo. Prevenir este processo teve dramáticosefeitos negativos sobre o tráfico de proteína M dentro do citoplasma e brotamento viral. A localização nuclear de proteína Mtem sido relatado para outros paramixovírus, incluindoVírus Sendai [23], o vírus da doença de Newcastle [24] eRSV [22]. Proteína de M de RSV, enquanto presente no núcleo, éexcluída do nucléolo e sua exportação a partir do núcleobaseia-se no receptor exportador crm-1 [21]. Contudoos autores relataram que a proteína M foi então encontrada no citoplasma em contraste com as células infectadas por HEV, onde quasetoda a proteína M detectável aparece sob a forma de virionsna membrana celular. A função do processopermanece obscura, mas um papel na inibição de acolhimento transcrição celular tem sido proposto para a proteína M de RSV[21]. Uma observação inesperada neste estudo foi uma tendência

para as células com maior número de partículas de víruster o menor nível de proteína M no núcleo de HEV. Uma explicação possível é que em vez de uma síntese contínua e tráfico de HEV M atravésdo núcleo durante o processo de infecção, há uma ondasíntese de M; a proteína se move através do núcleomas não é continuamente substituída. O mecanismo efunção de um tal processo continua altamente especulativo.Muitas questões permanecem sobre o Acordo deas proteínas do vírus dentro da partícula viral e da estruturado local de montagem do vírus. O arranjo da proteína M foi recentemente estudado por vírus do sarampo etem sido sugerido que ele está estreitamente relacionado com o RNP, em vez de a face interna do envelope viral [30].Há muito poucos relatos do uso de microscopia para SRimagem estrutura viral, embora o valor da imagem latente SRrecentemente tem sido demonstrado para vírus vaccinia [33].Neste estudo, nós investigamos o valor de dois muito diferentesSR. Microscopia localização usando GSDIM /dSTORM se baseia na detecção de fluoróforos individuais,cuja posição pode ser determinada com precisão nanométrica.GSDIM / dSTORM torna a maioria dos fluoróforostransitoriamente não fluorescente através da realização de terrenodepleção estado e reversivelmente a transferência das moléculasa um "off-state" (Triplet- e Dark-estados). Devido à reversívelnatureza deste processo, quase todos os fluoróforos podeser trabalhada ao ser transitoriamente na sua fluorescente 'onstate'durante o tempo de aquisição. Com base na posiçãoinformações dos fluorophores detectados, um único SuperResolutionimagem é calculado [34,35]. Em contraste, 3DStructuredIluminação Microscopy (3D-SIM) funcionapara iluminar a amostra com um padrão conhecido (neste casoum padrão de grade). O padrão de grade produz alta frequênciainformações sob a forma de franjas onduladas que pode sermatematicamente extrapolados para resultar num aumento de duas vezesna resolução em X, Y e Z [36]. Apesar dediferenças significativas entre os dois sistemas de SR, ambosdeu imagens muito semelhantes de virions HEV e demonstrarampara a resolução de sub-partículas primeira vez de paramixovírusproteínas e a morfologia rodada de virions HEV. Imagemde virions co-etiquetado para a presença de proteina M do HEV, N e proteínas G fornecida uma primeira indicação de que a proteína Mparecia estar associada com a RNP, em vez de aenvelope viral.Globalmente, estes resultados indicaram que HEV deve ser descrito

como um vírus predominantemente redondo com um diâmetrode 280-310 nm, dependendo da método de imagem. Como oAs amostras permaneceram hidratado durante todo o rotulagem eprocesso de imagem de microscopia SR, um diâmetro de vírusde aproximadamente 300 nm, deve oferecer uma estimativa mais precisado vírus vivo em dimensão.Apesar da evidência sorológica clara de infecção pelo VHE, realisolamento do vírus a partir de morcegos não provou simplesmente [37].Um objetivo adicional deste trabalho foi identificar qualquer dife-conferências em localização de proteínas HEV M e G entre células de morcego e de não-morcego. Comparação do padrão de expressãoProteínas M e G em células endoteliais VHE-infectadas com quevisto em duas linhas de células derivadas de bastão indicaram que não houvediferença observável entre os dois tipos de células em respostaa infecção por henipavirus, mas houve diferença pronunciada en-tre estes dois tipos de células e de outras linhas de células contínuas.

ConclusãoEstes resultados fornecem novas perspectivas sobre a estruturade HEV. Eles destacaram os benefícios da imagem SRpara estudos de estrutura e mostrar paramixovírusque, em estudos de imagem para HEV a escolha de cultura de tecidoscélulas podem afetar os resultados experimentais. Os resultados obtidosusando várias abordagens de diferentes imagens indicamque HEV deve ser considerado um vírus predominantemente redondo com um diâmetro médio de aproximadamente280 nm por TEM e 310 nm por imagem SR.

Métodos

Preparação e cultura de células primáriasSeguindo a eutanásia, cerca de 3 cm pedaços deaorta foram coletadas assepticamente a partir de um porcos adultos 24 hre 14 dias de vitelo envelhecido e colocado em meio RPMI + FCS a 10%.Os tecidos foram lavados em PBS + antibióticos (Pen / Strep eFungizona) duas vezes, depois tratado com colagenase (SigmaAldrich) e incubadas a 37 ° C durante 15-20 min. As células foramrecuperadas por centrifugação a 1500 RPM durante 5 min, eo sedimento de células ressuspenso em 5 mL de meio de crescimento(EMEM, Gibco) e adicionado a uma cultura de tecidos de 25 centímetrosfrasco (Corning). As culturas de células endoteliais mostraramessencialmente a morfologia celular era homogénea quemantida durante até 10 passagens. Todas as experiências foramrealizado em culturas de menos de seis passagens.

Culturas primarias foram imunomarcadas para a presença dePECAM e eram> 90% positiva para este marcador de células(Dados não apresentados).

Cultura de linhas celulares

As linhas de células (Vero, ATCC CCL81; A549, ATCC CCL185;HeLa, ATCC CCL2; MDBK, ATCC CCL22) foram cultivadas em EMEM com 10% de soro de vitelo (EMEM-GM) e passadascomo necessário. Estes foram incubados a 37 ° C em 5%CO2. As duas linhas de células derivadas de morcego foram preparados comopreviamente descrito [28].

Células para a microscopia confocal e super-resoluçãoAs células foram infectadas em BSL-4 com uma baixa passagem de HendraRedlands vírus (vírus Hendra / Austrália / cavalo / 2008 / Redlands)[38]. As células cultivadas em placas de 24 poços contendo 13 milímetroslamelas de vidro foram infectadas a uma MOI de 8 e infecçõesforam parados no tempo apropriado, removendo EMEMGMe substituindo-o com 4% de paraformaldeído em PBS.

As células para microscopia de super-resolução foram cultivadas em 6 bemplacas contendo lamelas e foram infectadas como para confocalmicroscopia. As células fixadas foram removidos a partir do 4-BSLlaboratório e toda a rotulagem foi realizado em condições normaiscondições de laboratório.

Preparação do inoculo de vírus por coloração negativaUma alíquota de um inoculo preparado conforme descrito HEVanteriormente [39], foi fixado em um 1: (v / v) com uma relação de 8%paraformaldeído em PBS, para cumprir com a segurança biológicaprotocolos e armazenado a 4 ° C. Uma grade formvar revestido foiflutuava sobre uma gota de inoculo durante 5 minutos e transferidapara uma gota de Nanodrop (nanossondas) durante 1 min.A grade foi apagado e fotografada em um CM120 Philipsmicroscópio eletrônico.

Processamento de células infectadas para TEM

As células foram semeadas em lamelas thermanox (ProSci-Tech) e processados para microscopia eletrônica como anteriormentedescrito [40].

Processamento de células para imagem confocal e SRAs células foram semeadas em lamelas de vidro 13 milímetros em 24 poçosplacas (Nunc) de imagem confocal e SIM e 18 milímetroslamelas quadrados para SR imaging GSD. Eles foram incubadosdurante a noite, e infectadas com HEV num MOI de 8 como

descrito anteriormente. Fixaram-se em 18 hpi em 4% (w / v)paraformaldeído em tampão fosfato salino e removidoa partir da área de contenção. Elas foram armazenadas a 4 ° Cem PBS.

Imunomarcaçao por Fluorescência

As células fixadas foram permeabilizadas com 0,1% (v / v) de Triton X-100 em PBS durante 10 min e lavadas em PBS. Específica não-rotulagem foi bloqueada com uma incubação de 30 min em 0,5%albumina de soro bovino em PBS (PBS / BSA) e todos os anticorposforam diluídos em PBS / BSA. Os anticorpos primários estavamincubadas durante 60 min e depois foram detectadas 3 × 5 min lavagenscom imunoglobulinas específicas da espécie fluorescente conjugadosdiluído a 1: 200 em PBS / BSA (Life Technologies).Depois de 3 × 5 min lavagens com PBS e uma lavagem dH20, núcleosforam coradas com uma diluição de 1: DAPI (Sigma) em 4000 dH20.

As lamelas foram montadas em Vectashield (VectorLaboratories) e selado com verniz para as unhas.Os anticorpos primários e conjugados fluorescentesAnti-Hendra anticorpos: coelho anti-HEV G 1: 2000 (AAHLlevantadas contra a proteína G Niv recombinante expresso emCélulas CHO), humana G (mAb m102.4-HEV anti generosamentepresenteado por Broder CC) 1: 1000 [41] coelho anti-HEV N1: 2000 (AAHL, levantou contra a proteína N recombinante Nivexpresso em células CHO), anticorpo monoclonal anti-M HEV01:10 (AAHL, [42]), Proteína dissulfureto isomerase de 1: 1000(Quantum Scientific), PECAM 01:50 (Santa-Cruz). SpeciesspecificOs anticorpos secundários eram da Life Technologiese conjugado com Alexa 488, 568, 543 ou 647 (1: 200).

Os anticorpos primários e conjugados fluorescentes

Anti-Hendra anticorpos: coelho anti-HEV G 1: 2000 (AAHLlevantadas contra a proteína G Niv recombinante expresso emCélulas CHO), humana G (mAb m102.4-HEV anti generosamentepresenteado por Broder CC) 1: 1000 [41] coelho anti-HEV N1: 2000 (AAHL, levantou contra a proteína N recombinante Nivexpresso em células CHO), anticorpo monoclonal anti-M HEV01:10 (AAHL, [42]), Proteína dissulfureto isomerase de 1: 1000(Quantum Scientific), PECAM 01:50 (Santa-Cruz). de espéciesanticorpos secundários específicos eram da Life Technologiese conjugado com Alexa 488, 568, 543 ou 647 (1: 200).

Imagiologia por fluorescência

Para confocal convencional imagiologia as lamelas marcadasforam fotografadas com um microscópio confocal Leica SP5. Dadoscoleção estava usando Leica LAS AF. Iluminação Estruturado-3DMicroscopia foi realizada num OMX V4 3DSIMsistema equipado com um (1,42 NA) objetiva 60x (GESaúde / Applied Precision). Reconstrução da imagem eracom softWoRx (GE Healthcare / Precision Aplicada).

Para super-resolução GSDIM-imaging com o SR LeicaGSD, 18 milímetros lamelas foram armazenados em PBS após imunomarcaçãoa 4 ° C. As lamelas foram montadas sobre uma únicacorrediça depressão (76 mm x 26 mm) e a cavidadepreenchido com aprox. 100 ul de PBS contendo 50 mM de β-Mercaptoetilamina (Sigma-Aldrich, # 30070) ajustado parapH 7,4 como tampão de imagem. A imagiologia foi realizadacom um sistema GSD Leica SR usando um 100 × (NA 1,47) objetivoe uma ampliação pós 1,6x (160 × no total). Odois fluoróforos foram gravadas sequencialmente e imagemaquisição, análise única molécula e reconstrução de imagemfoi realizada com Leica LAS AF 2.6.1.Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6 foram preparadas usando o AdobePhotoshop e Figura 7 foi preparado utilizando Fiji (NIH).