Hemoglobin a hemoglobinpatie

Průša Richard, Srbová Martina

Hemoproteiny

Obsahují hem

– cyklický tetrapyrol

– koordinačně vázané Fe2+

– systém konjugovaných dvojných vazeb

methinový můstek

pyrolový kruh

Hemoproteiny

Hemoglobin (transport O2 krví)

Myoglobin (zásoba O2 ve svalech)

Cytochromy (přenašeče e- v dých. řetězci)

Kataláza + peroxidáza (rozklad peroxidů)

Cytochrom P-450 (hydroxylace)

Desaturasy MK (desaturace MK)

Redoxní stav železa Fe 2+ Fe 3+

Redoxní stav železa Fe 2+

Struktura hemoglobinu

• R. 1849, 1937-1959-1968 (Kendrew, Perutz)

• 4 polypetidové podjednotky (globiny)

• Hb A (adults) heterotetramer 2α a 2β

• Každá podjednotka obsahuje 1 hem

• 8 helikálních úseků (A-H) β podjednotky

• 7 helikálních úseků α podjednotky

• Hydrofobní kapsa (hem chráněn před oxidací)

• Vazba hemu na globin – koordinační vazba Fe 2+ na proximální histidin F8

• Vazba O2 – vodíková vazba mezi distálním histidinem E7

a kyslíkem

Struktura hemoglobinu

• Kvarterní struktura

Interakce mezi podjednotkami 1) hydrofobní ( mezi α-β)

2) elektrostatické mezi α-α; β-β nebo i mezi α-β

– po vazbě O2 narušeny

Struktura hemoglobinu

α1

α2

β1 β2

α1

α2

β1 β2

• 1 polypeptidový řetězec (153 AMK)

• 1 hem

• terciární struktura velmi podobná s podjednotkami α a β hemoglobinu

• v srdečním a kosterním svalu

Struktura myoglobinu (1959)

Vazba kyslíku (oxygenace)

• Oxygenace – změna elektronového stavu hemu

• Vazba první molekuly O2 na Hb usnadní vazbu dalších molekul O2

• Afinita Hb ke kyslíku stoupá s rostoucím pO2

• Sigmoidální saturační křivka

• Hyperbolická saturační křivka pro Mb – není kooperace

Kooperativní vazba kyslíku na hemoglobin

Preanalytická fáze

• Teplota – 37 st. C

• Hemoglobin – 150 g/l

• FiO2 (21 %)

• Kooxymetrie: metHb, sulfHb, karbonylHb

• karbonylhemoglobin: 0 – 0,020 rel.j. (podíl z celkového hemoglobinu)

• methemoglobin: 0 – 0,015 rel.j. (podíl z celkového hemoglobinu)

Sa

tura

tio

n O

2

Sa

tura

tio

n O

2

Satu

rati

on

O2

Vliv barometrického tlaku

• Barometrický tlak

• Nadmořská výška:

0 m, 19,9 kPa 20,9 %

610 m, 18,4 kPa 19,4 %

1830 m, 15,7 kPa 16,6 %

2440 m, 14,4 kPa 15,1 %

3050 m, 13,3 kPa 14,0 %

Saturace frakční a funkční

• Frakční saturace je podíl oxygenovaného Hb vzhledem ke všem přítomným Hb (k celkovému Hb)

• Funkční saturace je podíl oxygenovaného Hb na Hb, který je schopen vazby kyslíku

• ctO2 = množství O2, které je krev schpona transportovat ve formě vázané na Hb a ve formě rozpuštěné

• P50 = tenze kyslíku při saturaci Hb kyslíkem 50% - ukazatel afinity Hb ke kyslíku

Vazba kyslíku na Hb

• Pohyb Fe2+ do roviny hemu spouští konformační posun T→ R

Konformační posun T→R

T forma (tense)

R forma (relaxed)

Navázání O2 vede k přerušení elektrostatických interakcí mezi podjednotkami

Alosterické efektory

• CO2

• H+

• 2,3-bisfosfoglycerát

Snižují afinitu Hb k O2

Ovlivňují rovnováhu mezi T-formou a R-formou

2,3 - bisfosfoglycerát odklonění glykolýzy (nevzniká ATP)

váže se na deoxyhemoglobin stabilizuje T formu usnadnění uvolňování kyslíku v tkáních

2,3 - bisfosfoglycerát

Klinické aspekty:

zvýšená produkce při adaptaci na vysokou nadmořskou výšku a u jedinců s poruchami oxygenace krve

fetální hemoglobin (HbF α2γ2), má nízkou afinitu vůči BFG

větší afinita ke kyslíku, předávání kyslíku plodu přes placentu

Bohrův efekt

• pH snižuje afinitu Hb k O2

• ↑pH odstranění H+ z Hb stimuluje vazbu O2 na Hb

• Usnadňuje transport O2

HCO3-

Cl- Cl-

Bohrův efekt

HCO3-

Cl- Cl-

Deriváty hemoglobinu

Deoxyhemoglobin – Hb bez O2

Oxyhemoglobin – Hb s O2

Karbaminohemoglobin – Hb s CO2

– 15% CO2 je transportováno krví ve vazbě na Hb

Karbonylhemoglobin – Hb s CO

– CO se váže na Fe2+ pevněji než O2

– otrava CO, kuřáci

Hodnoty HbCO v % Příznaky

10 dušnost při námaze

20-40 bolest hlavy, dušnost, únava, zvracení

40-60 hyperventilace, tachykardie, křeče

>60 kóma, smrt

Methemoglobin – (metHb) obsahuje Fe3+ místo Fe2+

Autooxidace hemoglobinu

3% hemoglobinu se každý den oxiduje

Hem – Fe2+- O2 Hem - Fe3+ + O2•-

Methemoglobinreduktáza

Redukce methemoglobinu

FAD, cytochrom b5 a NADH

Methemoglobinemie

1. Dědičná: deficit methemoglobinreduktázy (AR)

2. Abnormální hemoglobin HbM (mutace hemoglobinu, náchylný k oxidaci)

3. Vyvolaná požitím léčiv či chemikálií (sulfonamidy, anilin)

Klinika: cyanóza (10% Hb ve formě metHb) léčba podání redukčních činidel (methylenová modř, kyselina askorbová)

Glykovaný hemoglobin (HbA1c)

Neenzymová glykace na terminální NH2 skupině (Val) β-řetězce

Glykovaná frakce asi 5% celkového množství hemoglobinu (úměrná koncentraci glukózy v krvi)

Měřením hladiny HbA1c lze získat informace o průběhu diabetes mellitus (odráží hladinu glukózy za posledních několik týdnů)

Glykovaný hemoglobin, 1968 • HBA, HBA2 , HBF

• HBA1 – glykace valinu v N-terminální části beta řetězce: aldimin (24 h), ketoamin

• HBA1a1 – fruktosa 1,6-bifosfát

• HBA1a2 – glukosa-6-fosfát

• HBA1b – kyselina pyrohroznová

• HBA1c – D-glukosa – tvoří cca 80 % HBA1

• HBA2c – D-glukosa

• Jiná glykace Hb – lysin alfa řetězců atd.

Glykovaný hemoglobin

• Imunochemické stanovení x HPLC

• Abnormální Hb (více než 400) interferují

• Nelze použít u dětí do 9 m, přítomnost HbF

• Chronická hemolýza – faleš negativní hodnota

• Soudobá ztráta krve – falešně negativní hodnota

• Hypochr mikrocyt anemie – faleš pozitiv hodnota

• Karbamylovaný Hb (uremie), acetylovaný Hb

• Hodnota glykovaného Hb nad 20 %

znamená přítomnost abnormálního Hb

HPLC – TOSOH G7

Deglykace: fruktosamin 3-kináza

• AGE, reparační deglykační protektivní enzym

• Monomer, 309 amk, gen 17q25.3

• Vyšší aktivita v tkáních s proteiny s dlouhým T1/2: erytrocyty, oční čočka, mozek

• Hladovění a d.m. nezvyšují aktivitu FN3K

• Aktivita nízká v ery u kuřat a vepře

• Aktivita enzymu – polymorfismy FN3K genu

• Kompetitivní inhibitor deoxymorpholinofruktosa DMF

35

Deglykace: fruktosamin 3-kináza

• Alfa Lys139, Lys16…Lys61…beta Val1

• Fosforyluje fruktosamin na třetím uhlíku, destabilizace a uvolnění z proteinu

• FL3P (FV3P) – Lys (Val) + fosfát + 3-deoxyglucoson – 3-deoxyfruktosa nebo 2-deoxy-3-ketoglukonová k.

• Polymorfismy v promotoru a v exonech, např. c.900 CC – nízký HbA1c

• Interindividuální variabilita FN3K: HbA1c nekoreluje s průměrnou glykemií, různé HbA1c u shodných AG

36

Typy hemoglobinu

Volný hemoglobin Dospělý HbA: 2α a 2β podjednotky (98%HbA) Dospělý HbA2: 2α a 2δ podjednotky Fetální HbF: 2α a 2γ váže kyslík při nižším pO2 než HbA ( může vázat O2 z HbA matky) Embryonální: 2and 2 2 and 2 2 and 2 vyšší afinita ke kyslíku než HbA

Přepínání globinů

V průběhu vývoje dochází ke změnám v expresi jednotlivých genů

Hemoglobinpatie

mutace → abnormální struktury hemoglobinu

tvorba srpků, změna afinity ke kyslíku, ztráta hemu či disociace tetrameru

hemoglobin M a S, thalasemie

1. Hemoglobin M

• náhrada His E7α za Tyr (Hb Boston) nebo

• náhrada Val E11β za Glu (Hb Milwaukee)

• stabilizuje železo ve formě Fe3+ (methemoglobin)

• methemoglobin neváže kyslík

2. Thalassemie

• Mutace vedou k poklesu syntézy α nebo β řetězců

• Heterozygoti thalasemie jsou odolnější vůči malárii

α- thalassemie – úplná delece genů

4 α globinové geny :

ztráta 1 genu: bez příznaků

ztráta 2 genů: červené krvinky jsou mikrocytární, hypochromní, jedinci netrpí anemií

ztráta 3 genů: středně těžká mikrocytární, hypochromní anémie, splenomegalie

ztráta 4 genů: hydrops fetalis: fatal in utero

Nadbytek β řetězců - homotetramer HbH, vysoká afinita ke kyslíku – není schopen kyslík uvolnit

• β+ – globin částečně syntetizován

• β0 – globin není vůbec syntetizován

Heterozygoti: mikrocytární, hypochromní lehká anémie

Homozygoti β0 β0 : těžká anemie, splenomegalie, hyperplazie kostní dřeně

Nadbytek α řetězců - precipitují v erythroidních buňkách – ty se rozpadají - neefektivní erythropoesa

β- thalassemie

3. Hemoglobin S (srpkovitá anémie)

•Hb S záměna Glu A3(6)β za Val na povrchu hemoglobinu • agregace HbS („lepkavý úsek“) vnik vláknitého precipitátu

Srpkovitá anémie erytrocyty zkrouceny do tvaru srpků → blokují kapiláry, způsobují zánět a bolest fragilní erytrocyty → anemie v tropech (koincidence s malárií): heterozygotní forma hemoglobinu S - výhoda při nákaze malárií, rozpad erytrocytů přeruší parazitární cyklus

• HbA1c 18,0 mmol/mol

• věk 10 let

• Fe 27 umol/l, haptoglobin 0,7 g/l

• ↑bilirubin, ↑LD

• HbAS, DM1

• HbA1c 62 – 96 – 110 mmol/mol

• Horečka, hypoxie, hyperosmolární stavy (dehydratace, hyperglykemie)

44

45

G7 x G8

Schémata použitá v prezentaci:

• Marks´ Basic Medical Biochemistry, A Clinical Approach, third edition, 2009 (M. Lieberman, A.D. Marks)

• Principles of Biochemistry, 2008, (Voet D, Voet J.G., and Pratt C.W)

• Color Atlas of Biochemistry, second edition, 2005 (J. Koolman and K.H. Roehm)