hbv quantative real time pcr kit

HBV QUANTITATIVE REAL TIME PCR KIT


Bayerpaul Group Head Office:

Tel: +9821 66949644 Fax: +9821 66949643

www.BAYERPAUL.com

[email protected]

BP-HBV Real Time PCR Kit Detection and Quantification of

HBV Genome

For

ABI Series & RororGene

شرکت دانش بنیان بایرپل فناور واکسن، کیت هاي تشخیصی و فراورده هاي نانوبیوتکنولوژي

:و تولید سایت تحقیق

96تهران، پارك فناوري پردیس، خیابان نوآوري نهم، پالك

76250680: نمابر 021 -76250681 -4: تلفن

www.BAYERPAUL.com

[email protected]

:تولید کننده دانش بنیان بایرپل فناورشرکت

66949644: تلفن 96تهران، پارك فناوري پردیس، خیابان نوآوري نهم پالك 96WWW.BAYERPAUL.COM

کلیات

http://www.BAYERPAUL.com

mailto:[email protected]



http://www.BAYERPAUL.COM


ناشی از این ویروس مشکل عمده در عفونتیکی از عمده ترین عوامل بیماریزاي انسانی است که HBVویروس انتقال عفونت معموال از طریق خون و فراورده هاي خونی و یا ارتباط جنسی فرد . سالمت جهانی محسوب می شود

امروزه انتقال عفونت بین معتادین تزریقی که از . آلوده با فرد سالم و یا از مادر آلوده به جنین منتقل می شودبر اساس آمار هاي موجود . ده می کنند یکی از راههاي عمده انتشار محسوب می گرددسرنگ هاي مشترك استفا

عفونت مزمن مبتال بهمیلیون نفر 350میلیارد نفر در سراسر جهان به این ویروس آلوده هستند که بیش از 2حدود بیماري با عالئم التهاب نوع حاد این . عفونت مزمن معموال منجر به سیروز، سرطان کبد و مرگ می شود. هستند

.کبد، استفراغ، زردي همراه است و به ندرت سبب مرگ می شوداین امکان را فراهم می کند که عالوه PCR Real Time Quantitativeبا روش ملکولی Bکیت تشخیص هپاتیت

ز پالسما و یا سرم تعیین بر تشخیص ویروس در مقادیر بسیار کم قادر است تعداد ویروس را نیز در یک میلی لیتر ا . نماید

مشخصات محصول -1

در Bویروس هپاتیت DNAبه منظور تشخیص کمی PCR Real Timeبا روش ملکولی Bکیت تشخیص هپاتیت نمونه سرم و یا پالسماي انسان که براي استفاده در مراکز تشخیصی و آزمایشگاههاي تشخیص طبی تولید شده

کیت ها بر اساس تعداد آزمون قابل . را تشخیص می دهد) HBV )A..Hاین کیت تمام ژنوتایپ هاي ویروس . است . تایی طراحی شده است 100تایی و 50تایی ، 25انجام در هر کیت بصورت

و شرایط نگهداري آن نمونه -2

پالسماي بیمار است ضمن اینکه از سرم نیز می توان استفاده BK Virusنمونه مناسب جهت انجام آزمون کمی باشد که بعد از جداسازي آن بالفاصله نسبت EDTAنمونه پالسما باید در لوله استریل حاوي ماده ضد انعقاد . کرد

باید تا زمان ژنوم فراهم نباشد نمونه پالسما و یا سرم در صورتیکه امکان استخراج . ژنوم اقدام نمایید به استخراج میکرولیتر پالسما یا 200حداقل نمونه الزم براي انجام آزمون . نگهداري شود 20استخراج حتما در فریزر منهاي

. سرم است

محتویات کیت - 3

محتویات کیت بر مبناي تعداد واکنش قابل انجام طبق جدول زیر آماده شده است

1جدول شماره

100 reaction

50 reaction

25 reaction

Contents Label

4×314µL 2×314µL 1×314µL Buffer Mix* B MIX 4×65µL 2×65µL 1×65µL HBV & IC

Primer Probe Mix **

HBV & IC Primer Probe

2×50µL 1×50µL 1×50µL 5.00E+007 IU/ml

*** HBV Standard 1

2×50µL 1×50µL 1×50µL 5.00E+006 IU/ml ***

HBV Standard 2

2×50µL 1×50µL 1×50µL 5.00E+005 IU/ml

*** HBV Standard 3

2×50µL 1×50µL 1×50µL 5.00E+004 IU/ml

*** HBV Standard 4

2×50µL 1×50µL 1×50µL 5.00E+003 IU/ml

*** HBV Standard 5

1 جدول

محلول بافر میکس */ و اینترنال کنترلCMVحاوي پروب و پرایمر ویروس * *

)کنترل هاي مثبت( براي تهیه منحنی استاندارد***

براي این کیت سازگار Real Time PCRدستگاه هاي -4

.می توان از دستگاه هاي زیر استفاده کرد 2 بر اساس نوع بافر میکس اشاره شده در جدولü الزام دیگر براي تمام دستگاهReal Time PCR داشتن کانالFAM وJOE است.

ü یتان هنگام سفارش این محصول نوع دستگاه خود را اعالم نماید تا مسترمیکس مخصوص دستگاه . در اختیار شما قرار گیرد

Roche Bio-Rad Qiagen/Corbett Life Technologies Buffer Mix

7700,7300,7900,7900HT همه مدل ها LOT: HR3111


7500,7500 Fast LOT: LR3111

,Rotor-Gene Q همه مدل ها 6000

LOT: WR3111

2 جدول

:احتیاط و هشدار ها - 5 ها الزامیست رعایت اقدامات ایمنی عمومی در هنگام کار با نمونه، محلول ها و ریجنت -اعتبار Applied Biosystemsاز کمپانی DX Real Time PCR 7500/ 7500 Fastاین کیت با دستگاه -

. دستگاه ها با کار شناسان شرکت بایر پل فناور مشورت نمائید سایر در صورت استفاده از. سنجی شده است

Real Timeا اصول و انجام روش مولکولی استفاده از کیت باید توسط افرادي انجام شود که آشنایی کامل ب -

PCR را دارند و نیز توانایی آنالیز و تفسیر داده ها را داشته باشند.

. انجام شود (GLP) مقررات کار با نمونه باید بر اساس رعایت اصول صحیح آزمایشگاهی -

هاي مجزا جهت انجام استفاده از مکان Carry over contamination)( آلودگی حین کار جهت جلوگیري از - . آماده سازي و نیز انجام واکنش ضروري است

قبل از انجام آزمون دستکش التکس بدون پودر پوشیده و با استفاده از یک گاز استریل آغشته به وایتکس -سطوح کاري را تمیز و ضد عفونی نمایید در پایان دستکش و گاز استریل را دور انداخته و دستکش جدیدي % 10سپس . سطوح کاري را کامال ضدعفونی نمایید 70%یده و با گاز استریل آغشته به آب دیونایز و مجددا با الکل پوش

. را روشن نمایید تا فضاي زیر آن کامال ضدعفونی گردد Work stationهود و یا UVدقیقه المپ 20به مدت

.واکنش ها و فرایند تکثیر استفاده کنید از سه مکان مجزا براي عملیاتی نظیر استخراج نمونه، آماده سازي -

بعد از اتمام آزمون فورا آنخها را از دستگاه ریل تام خارج نموده . هرگز درب ویال هاي تکثیر شده را باز نکنید -قرار دهید و نسبت به اتوکالو آن اقدام نموده و در فضایی خارج از %10و در ظرف محتوي هیپوکلریت سدیم

. آزمایشگاه معدوم نماید

از مخلوط کردن محلولها و موادي که شماره سریال . نگهداري نمائید 20 –کیت را تا زمان انقضاء در فریزر -(Lot Number) ي آن گذشته است استفاده نکنیدهایی که تاریخ انقضا متفاوت دارند خودداري نمایید و از کیت.

. استفاده نمایید free RNase- DNase ماه یک بار کالیبره نماید و از سر سمپلر فیلتر دار 6سمپلر ها را هر -

دستورالعمل کیت را مطالعه نمایید و سپس با به دقت در صورت بروز هرگونه سوال در انجام آزمون ابتدا - .فناور مشورت نمائیدکارشناس فنی شرکت بایرپل

مواد و تجهیزات الزم - 6 Applied Biosystemsاز کمپانی Real Time PCR 7500/ Or 7500 Fastدستگاه •

).1دریافت بافر میکس ویزه دستگاه رجوع به جدول (سایر دستگاه هاي ریل تایم پی سی آر •

آن براي دستگاه capهمرا با ®FastReaction tube(8 tube strip) MicroAmpتیوب هاي •

ABI 7500 Fast و optical 8-tube strip( 0.2mL) MicroAm™ همرا باcap آن براي دستگاهABI 7500

. که از قبل در یخچال قرار گرفته و سرد باشند بلوك هاي آلومینیومی •

)µL 100-10و µL 10-0.5(سمپلر هاي متغیر •

DNase-RNase Freeسر سمپلر فیلتر دار •

دستگاه ورتکس مینی اسپین •

DNAکیت استخراج •

دستکش التکس بدون پودر •

محاسبه تیتر ویروس -7

یک میلی لیتر در IUواحد با کیت استانداردهاي. باشد می مشخص غلظت با کمی استاندارد 5 حاوي کیت (IU/mL) برا اساس آخرین پنل استاندارد سازي . اند شده مشخص)WHO NIBSC: 97/746 ( براي آزمون

بنابراین براي گزارش نتایج بر اساس . کپی از ویروس است 5برابر با HBVاز IUیک NATهاي Copies/mL ضرب کرد 5در عدد نتایج حاصل از آزمون را باید.

روش استخراج ژنوم -8

از کیت هاي استخراج استاندارد از برندهاي معتبر و یا از دستگاه هاي DNAتوصیه می شود براي استخراج .استخراج اتوماتیک از کمپانی هاي معتبر استفاده گردد

مربوط به JOEبراي دتکتور فاقد ویروس نمونه CTدر صورت استفاده از روشهاي دیگر باید دقت کرد که : نکته . فقط در اینصورت مرحله استخراج ژنوم معتبر است. دباش CT= 32± 3در محدوده ) IC( کنترل داخلی

اختصاصی DNAحضور توالی Real Time PCRویروس از نمونه بیمار و انجام واکنش DNAپس از استخراج توسط CTویروس در واکنش با افزایش میزان فلورسانس در هر سیکل از واکنش تشخیص داده می شود و به عنوان

با ترسیم غلظت مشخص شده ) Standards Curve( منحنی استاندارد . گزارش می گردد Real Timeدستگاه


نمونه بیمار در مقایسه با منحنی هاي CTسپس مقدار . رسم می گردد CTاستاندارد هاي کمی در برابر مقادیر . نمونه توسط دستگاه آنالیز و گزارش می شود Viral Loadاستاندارد محاسبه شده و میزان

سپس نمونه . نمونه پالسما و یا سرم بیمار را از فریزر خارج کرده و اجازه دهید تا در دماي اتاق ذوب شود -1- 8از µL 200سپس مقدار . نماید ثانیه ورتکس کرده و براي مدت کوتاهی سانتریفیوژ 30پالسما و یا سرم را به مدت

با استفاده از کیت و یا دستگاههاي استخراج ریخته mL 1.5سرم و یا پالسماي بیمار را در یک میکروتیوب . ویروس در نمونه را استخراج نمائیدDNA اتوماتیک

ü کیت استخراجQIAamp DNA Blood mini Kit )توصیه می شود) کیاژن . ü براي اطمینان از صحت نتایج منفی : توجه مهمViral Load بیماران ، عدم حضور ممانعت کننده هاي

از نمونه کنترل داخلی به مخلوط 5µLو اطمینان از کنترل استخراج در هنگام استخراج PCRواکنش . پالسما اضافه کنید/ بافر لیز کننده

ü هرگز نمونه کنترل داخلی را مستقیما به پالسما یا سرم اضافه نکنید .

تا زمان . باشد 50µLنهایی BufferElutionحجم . در هر آزمون یک نمونه کنترل منفی را هم استخراج کنید 7-2 . قرار داد 20-استخراج شده را در فریزر DNAمی توان انجام آزمایش

: توجه v اگر حجمElution Buffer را تغییر دادید حتما با کارشناس فنی شرکت تماس بگیرید نهایی . v v را هرگز استخراج نکنید) درب سبز(ویال هاي استاندارد .

واکنش هاآماده سازي -9

تهیه مستر میکس -9-1

و Buffer Mix, Probe Prime, ICویال هاي کیت شامل . بر اساس تعداد واکنش هاي که می خواهید انجام دهیدرا از فریزر خارج کرده و اجازه دهید تا بر روي یخ خرد شده بتدریج ذوب ) QS1,QS2,QS3,QS4(استانداردها

شوند و پس از اطمینان از ذوب شدن آنها بطور مختصر آنها را ورتکس و سپس اسپین کنید و بر اساس جدوال زیر .به دو صورت انجام می شود تهیه مستر میکس. نسبت به تهیه مستر میکس اقدام کنید

v اطمینان از عدم حضور ممانعت کننده هاي جهت خلی اگر کنترل داPCR مسترمیکس را بکار می رود . زیر تهیه نماید 3 بر اساس جدول

محلول تست 1 تست 24300 µL 12.5 µL Buffer Mix 60 µL 2.5 µL Primer probe 12 µL 0.5 Internal Control

360 µL 15 µL Volume Master Mix

3 جدول

v حجم اضافه شدن کنترل داخلی لحاظ نمی شود و فقط به ازاي هر واکنش : توجهPCR 0.5مقدار µL از .ویال کنترل داخلی جهت تهیه مسترمیکس اضافه می شود

v روش استخراج و اطمینان از عدم حضور ممانعت کننده هاي کنترل اگر کنترل داخلی برايPCR

رل داخلی باید در هنگام استخراج اسید نوکلئیک به نمونه پالسما اضافه شده تنمونه کن بکار می رودزیر تهیه 4مسترمیکس را بر اساس جدول بنابراین ). توضیح داده شددفترچه 8 قسمت در قبال( باشد . نماید

محلول تست 1 تست 24300 µL 12.5 µL Buffer Mix 60 µL 2.5 µL Primer probe

360 µL 15 µL Volume Master Mix

4 جدول

. نماید) میکروسانتریفیوژ( مستر میکس تهیه شده را بطور مختصر ورتکس و سپس اسپین •

در هر میکروتیوب اضافه و هر یک از استاندارد ها ) براي بیماران ( استخراج شده DNAاز µL 10مقدار • .کنید

از مستر میکس تهیه شده به میکرو تیوب ها که بر روي بلوك آلومینیومی سرد شده قرار دارند µL 15مقدار •کنید تا محتویات هر میکروتیوب بطور کامل مخلوط بار پیپتاژ 10با کمک نوك سر سمپلر آنرا . اضافه نماید

.گردد


قرار دارد منتقل کنید و همانند طرح زیر Real Time PCRسپس بلوك آلومینیومی را به اتاقی که دستگاه • . قرار دهید ABI7500/ABI 7500 Fastداخل پلیت

ü به ترتیب نمونه هاي بیمار، کنترل منفی و براي جلوگیري از آلودگی حین کار : نکته مهمNTC نموده و را اماده . سپس نمونه هاي استاندارد را آماده نمایید

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 NTC NC S 6 S 5 S 4 S 3 S 2 S 1 A QS4 QS3 QS2 QS1 B

C D

E

F G

H S: Sample, NC: Negative Control, QS1, QS2, QS3, QS4: Standards

است DNAفاقد هرگونه ( NTCجهت اطمینان از عدم حضور هر گونه آلودگی در آزمون توصیه می شود نمونه : نکته .را هم در آزمون وارد نمایید) میکرولیتر آب مقطر اضافه شده است 10 و به جاي آن

:Thermo cyclerتنظیم برنامه دستگاه -10

. در انتخاب دتکتورها دقت کنید 10-1

:)HBV Virus( توالی هدف) Reporter( گزارشگربراي

. را انتخاب کنید Tآن ) Quencher( است و خاموش کننده FAMرنگ فلورسنس

:)IC( توالی کنترل داخلی) Reporter( گزارشگربراي

. را انتخاب کنید Quencher (TAMRA( است و خاموش کننده JOEرنگ فلورسنس

:کردن غلظت استاندارد ها در برنامه دستگاه ریل تام مانند جدول زیروارد 10-2

5.00E+007 IU/ml HBV Standard 1

5.00E+006 IU/ml HBV Standard 2 5.00E+005 IU/ml HBV Standard 3 5.00E+004 IU/ml HBV Standard 4 5.00E+003 IU/ml HBV Standard 5

ü 5.00براي مثالE+007 5برابر است با×

ü براي حفط : اختیاريBaseline در برخی از دستگاه هاي 15-3در محدوده سیکلReal Time مثلRotor Gene 6000 می توان از استاندارد اول صرف نظر کرد .

: Real Time PCRبرنامه دمایی براي آزمون 10-3

1X 15 min 95℃ Initial denaturation and polymerase activation

45 X

15 sec* 95 ℃ denaturation 1 min1 60 ℃ Annealing and elongation

را انتخاب كرد sec 34مي توان ABI 7500در دستگاه • Stage 2@stape 2 Annealing and(را بر روي ) Florescence collection(جمع آوري داده ها •

elongation (تنظیم نمایید .

آنالیز آزمون -11

موجود × تاب کامپیوتر با زدن یل مربوط به آزمون را بر روي دسکبعداز اتمام آزمون دستگاه را خاموش کرده و فاحال نمونه هاي خود را انتخاب . مجدداً بر روي آن کلیک کنید آنالیز در گوشه باالي سمت راست ببندید و براي

. که در اختیار دارید آزمون را آنالیز نماید Real Time چه دستگاه کنید و مطابق دفتر

)Assay Validation(اعتبار سنجی ازمون - 12

. ثانیه را هم می توان انتخاب کرد 30زمان - 1


.را مطابق زیر رسم نمائید Thresholdخط

وجود منحنی ( اگر آلودگی مشاهده می شود. قرار گیرند Thresholdتمام کنترل منفی ها باید زیر خط 1 -12نتایج حاصل از آزمون قابل تفسیر نبوده و باید کل ران دوباره NTCدر نمونه ) "Amplifications plot "تکثیر

.شوند. تکرار شود

v باشند و فواصل اطمینان در آنها در ایده ) فاز تصاعدي(تمام نمونه هاي استاندارد باید داراي منحنی تکثیر . ال ترین حالت باشد

v قبل از اینکه منحنی هاي تکثیر را به عنوان تکثیر واقعی بپذیرید قسمت" Component " نرم افزار دستگاه را کنترل کنید

v همه نمونه هايICs باید داراي منحنی تکثیر باشند و دامنه CT کنترل هاي داخلی )ICs ( براي نمونه .باشد CT= 32± 3باید در محدوده HBVهاي فاقد ویروس

v در صورتی کهCT نمونه کنترل منفی براي دتکتورJOE مربوط به کنترل داخلی )IC ( در خارج از .باید به این نکته توجه داشت که مشکلی در استخراج وجود دارد. باشد CT= 32± 3محدوده

v نال یسگمربوطه همانند جدول زیر داري ) فیلتر(نمونه هاي کنترل بر اساس جدول زیر باید در کانال .باشند

: کنترل هاي یک آزمون معتبر باید بر اساس جدول زیر داراي منحنی تکثیر باشد 12-2

کنترل ها FAMکانال JOEکانال Positive Positive استاندارد هاي (کنترل هاي مثبت

)کیتNegative Negative کنترل منفی

v باید داراي ویژگی هاي زیر باشد) منحنی استاندارد( نتایج حاصل از آزمون هاي کمی:

شاخص هاي کنترلی مقادیر معتبر-3.1 /- 3.6 Slop2

90%-105% PCR Efficiency

شیب ٢

>0.98 R square (R2)

Standard Curve with 7500 Fast DX

:تفسیر نتایج - 13v نمونه هاي مثبت وQS هر نمونه که منحنی . ها یک منحنی تکثیر سیگموئیدي را نشان می دهند

. تکثیر را نشان بدهد به عنوان مثبت در نظر گرفته می شودv در صورتیکه نمونه بیمار داراي منحنی سیگموئیدي باشد وCT داشته باشد بدون در نظر گرفتن 40کمتر از

.لقی می شودنتیجه آن براي دتکتور کنترل داخلی مثبت ت

5.00E+005 IU/mLاز در نمونه بیمار بیشتر HBVدر این کیت معموال هنگامی که تعداد کپی ویروس : توجه!!!

.منحنی تکثیر کنترل داخلی دیده نمی شودv در صورتیکه نمونه بیمار فاقد منحنی تکثیر براي ویروسHBV بوده و لی داراي منحنی تکثیر براي

. این نمونه منفی در نظر گرفته می شود 35تا 29بین CTکنترل داخلی باشد و

v در صورتیکه نمونه بیمار فاقد منحنی تکثیر براي ویروسHBV آزمون باید تکرار . و کنترل داخلی باشد . شود


Amplification Curve of ICs

)Troubleshooting(عیب یابی 14v در صورتیکه هیچ سیگنالی با نمونه هاي کنترل مثبت ایجاد نشود. برنامه دادن نادرست به دستگاه ترموسایکلر •

.مقایسه کنید SOPپرفایل دماي داده شده را با : راه حل نامناسب بودن فاصله منحنی هاي تکثیر براي استاندارد ها •

نمونه هاي استانداردمیکس نکردن و یا میکس ناکافی : علت کالیبره نبودن سمپلر ها

. سمپلرها را کالیبر کنید: راه حل

PCRانجام نادرست واکنش •

را دو PCRمراحل کاري را کنترل کرده و عمل پیپت کردن را خوب انجام داده و در صورت امکان واکنش : راه حلشرایط ذخیره سازي براي یکی یا بیشتر اجزاء کیت رعایت نشده است و یا اینکه کیت تشخیص . تکرار کنید باره

HBV تاریخ گذشته است.

و در صورت لزوم از ریجنت هاي جدید استفاده . شرایط ذخیره سازي و تاریخ انقضاي کیت را کنترل نمائید: راه حل . کنید

الی براي نمونه استاندارد ها در کانال فلورسنتیدریافت سیگنال ضعیف و یا بدون هیچ گونه سیگن • .با پروتکل منطبق نیست PCRشرایط

.را با تنظیمات درست انجام دهید PCRرا کنترل نمائید و در صورت لزوم واکنش PCRشرایط : راه حل .اضافه نشده است Templateهیچگونه

. به واکنش اضافه شده باشد ید که روش استخراج شما درست باشد و الگودقت کن: راه حل )HBV(براي توالی هدف NCو NTCدریافت منحنی تکثیر در نمونه •

.آلودگی اتفاق افتاده است PCRدر طی مراحل آماده سازي

.را با ریجنت هاي جدید آغاز نمائید PCRواکنش : راه حل .کنترل کنید که فضاي کاري شما در فواصل منظم رفع آلودگی شود: راه حل

):(Kit Performance کارایی کیت - 14 ):Dynamic Range Kit( دامنه خطی کیت 1 - 14

IU/mL 25تا 5.00E+007 IU/mLخطی بودن آزمون با آنالیز سریال رقت با اختالف ده برابر بصورت لگاریتمی از

25تا 5.00E+007 IU/mLدامنه خطی کیت از . تکرار از هر غلظت استاندارد انجام شد 3بصورت ران در یک

IU/mL از غلظت الگو خطی است .


:حسایت تسخیصی کیت 2- 14

بار تکرار از کمترین تیتر از ویروس معادل 16براي BP-HBV Real Time PCR Kitکیت یکمترین حد تشخیص25IU/ml )5 شودمی تشخیص داده % 100بود که با اطمینان ) کپی از ویروس در واکنش .

Sensitivity: 25 IU/mL

):Reproducibility(تکرارپذیري 3- 14

.لگاریتم از غلظت استاندارد ها باالترین تکرار پذیري را نشان داد 3بار تکرار از 24نتایج حاصل از

Best Reproducibility

Liner Range: 5.00E+007-25 IU/mL


همکار گرامی

بر اساس دستگاه ھاي Viral Loadشركت بایر پل فناور براي تعیین میزان BP-Real Time PCRكیت ھاي . راه اندازي و اعتبار سنجي شده است Applied Biosystemsاز شركت ) IVD )7500 Fast DXداراي مجور

تا در بگیرید تماس شرکت فنی کارشناس با آزمون، انجام خصوص در سئوال هرگونه وجود صورت در لطفا . اسرع وقت به سواالت شما پاسخ داده شود

دانش بنیان بایرپل فناور شرکت

[email protected] 021-76250681-4 :تلفن

Manufactured in: I.R. IRAN:

By:

Bayerpaul Group Head Office:

Tel: +9821 66949644 Fax: +9821 66949643

www.BAYERPAUL.com

[email protected]




hbv quantative real time pcr kit

Documents