313/80 DC-Bestimmung des Morphins 337

5 6 7

8 9

10 11 12 13 14

15 16 17 18 19

W. L. Smith und W. E. M. Lands, J. Biol. Chem. 246, 6700 (1971). P. J. OBrien und F. J. Hawco, Biochem. SOC. Trans. 6, 1169 (1978). J. Baumann, F. v. Bruchhausen, G. Wurm und R. Hansel, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmakol. 302, R 26 (1978). J. Baumann und F. v. Bruchhausen, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmakol. 306,85 (1979). J. Baumann, F. v. Bruchhausen und G. Wurm, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmakol. 307,73 (1979). G. Arturson und C. E. Jonsson, Prostaglandins 10, 941 (1975). Y. Yanagi und T. Komatsu, Biochem. Pharmacol. 25, 937 (1976). I. Ahnfelt-R@nne, Prostaglandins 16, 711 (1978).

M. Nishikimi, N. A. Rao und K. Yagi, Biochem. Biophys. Res. Commun. 46,849 (1972). T. F. Slater und M. N. Eakins, New Trends in the Therapy of Liver Diseases (A. Bertelli, Ed.), S. 84, Karger, Basel, 1975. J. Berstein, C. Fraschina und St. v. Kostanecki, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 38, 2177 (1905). G. Woker, St. v. Kostanecki und J. Tambor, Ber. Dtsch. Chem. Ges. 36,4242 (1903). H. Loth und H. Kohne, Arch. Pharm. (Weinheim) 306, 101 (1973). H. Loth und G. Wurm, Arch. Pharm. (Weinheim) 301,897 (1968). St. v. Kostanecki und J . Tambor, Ber. Dtsch. Chem. Ges. :?5, 1867 (1902).

[Ph 1411

Arch. Pharm. (Weinheim) 373, 337-343 (1980)

Haltbarkeitsspezifische diinnschichtchromatographische Bestimmungen des Morphins und seiner Abbauprodukte

Siegfried Ebel* und Dieter Rost

Fachbereich Pharmazie und Lebensmittelchemie der Philipps-Universitat Marburg, Marbacher Weg 6, D 355 Marburg/Lahn, und Chemische Untersuchungsstelle der Bundeswehr IV, Koblenz Eingegangen am 9. Juli 1979

Es wird eine Methode zur Bestimmung des Morphins und seiner Neben- bzw. Abbauprodukte Codein, Thebain, Pseudomorphin und Morphin-N-oxid beschrieben. Die Messung erfolgt nach diinnschichtchromatographischer Trennung iiber eine Remissionsmessung direkt auf der Platte. Der gefundene Gehalt an Codein und Pseudomorphin betragt biszu 0.3 %. Thebain konnte nur in Spuren, Morphin-N-oxid konnte auch nach langerer Lagerung nicht nachgewiesen werden. Die Genauigkeit der Morphin-Bestimmung liegt bei 1.8 70, die der Nebenprodukte bei 2 4 %.

Determination of Morphine and its Degradation Products in Dmgs by n C .

The determination of morphine and some of its degradation products is described. The evaluation is done by TLC with in situ measurement of reflectance. The content of codeine and pseudomorphine is

03654233 /80 /04044337 $02.50/0

0 Verlag Chemie, GmbH, Weinheim 1YXO

338 Ebel und Rost Arch. Pharm.

about 0.3 '36. Thehaine is present only in traces. Morphine N-oxide was absent even after prolonged storage. The reproducibility is about 1.8 70 (morphine) and 2 4 70 (degradation products).

Morphin hat bis heutc seine Bcdeutung in dcr Medizin behalten. Indiziert bei allen schmerzhaften Zustanden, bei denen mit anderen schrnerzstillenden Mitteln nicht auszukommen ist, insbesondere bei Wundschrnerz und zur ~era t ion~vorbere i tung , wird Morphin auch in gr6Reren Mengen fiir den Verteidigungavorrat der Streitkrafte sowie des Zivilschutzes eingelagert. RoutinernaRige Untersu- chungen dieser Bcstande sind zu Beginn als auch im Verlauf der Lagerung unahdingbar. Neben der Bestimmung des eigentlichen Morphingehaltes interessiert bei diesen Untersuchungen auch die quantitative Erfassung herstellungsbedingter Nehenprodukte und lagerungsbedingter Abbaupro- dukte.

Morphin wird zum uberwiegenden TeiI direkt aus Papaver somniferum isoliert. In einigen Fallen wird auch Thebain zu Morphin aufgearbeitet, hierbei kann Codein als Nebenprodukt anfallen. I n Iiinger gelagerten Morphin-Zubereitungen konnen als Oxida- tionsprodukt Morphin-N-oxid und Pseudomorphin (Oxidimorphin) auftreten. Die Stabili- tiit von Morphin in Losung ist bereits mehrfach Gegenstand wissenschaftlicher Arbeiten g e ~ e s e n ' - ~ ) . Fur die spezielle Problematik der haltbarkeitsspezifischen Analytik von Morphin-Zubereitungen kommen die meisten analytischen Methoden (Literatur vgl. 4))

wegen ihrer zu geringen Spezifitat nicht in Frage, lediglich chromatographische Methoden wie D C und HPLC ermoglichen Trennung und quantitative Erfassung der in diesem Zusammenhang interessierenden Substanzen. Die Bestimmung von Opiumalkaloiden in Arzneimitteln oder in Opiumextrakten etc. nach DC-Trennung mit Anfarbung'-'), durch direkte Remissionsmessung9-") oder uber eine chemisch erzeugte Fluoreszenz"") ist in der Literatur beschrieben. Einen dunnschichtchromatographischen Grenztest auf Pseudo- morphin beschreiben Hammersting! und R e i ~ h ' ~ ) . Zur Vermeidung der Oxidation des Morphins wird verschiedentlich Sulfit zugesetzt, doch entsteht in diesem Falle 7.8-Dihy- dromorphin-6,8-disulfonsaure, die von Trapmann und liammerstir~gl'~) uber in situ-Re- mission quantitativ bestimmt wurde. In der hier vorliegenden Veroffentlichung sol1 die direkte DC-Bestimmung des Morphins und der moglichen Neben- bzw. Abbauprodukte Thebain, Codein bzw. Pseudomorphin und Morphin-N-oxid beschrieben werden.

Chromatugraphie

Fur die dunnschichtchromatogrdphische Trennung der in Frage kommenden Substanzen eignete sich nach zahlreichen Vorversuchen aufgrund von Literat~rstudien~) das FlieRrnittel Benzol/Aceton/ 70proZ. Ethanol/2Sproz. NH, 30 + 3.5 + 35 + 2,s (v/v). Die Rf-Bereiche lagen hicrhei furMorphin bei 0.53, Codein 0.61, Thebain 0.78, Pseudomorphin 0.29 und Morphin-N-Oxid 0.20. Dieses FlieRmittel wird mit geringfugigen Anderungen auch zur Bestirnmung von Methylcodein in Codein cingesetzt. Irn Hinblick auf einen gezielten Ndchweis oder cine gczielte Bestimmung einer bestimmten Verunreinigung sind dic gefundenen Rf-Werte fur einige dcr untersuchten FlieBmittel in Tab. 1 a k Anhaltspunkt angegcben. Abb. 1 zeigt die Remissions-Grad-Ortskurve von Morphin rnit zugesetzten potentiellen Vcrunreinigungen. In einigen Morphin-Mustem wurde eine weitere bislang nicht identifizierte Verunreinigung in geringen Mengen ( 4 . 1 96) gefunden (Abb. 1).

3 13/80 DC-Bestimmung des Morphins 339

Tab. 1: Rf- Werte be; der DC von Morphin und moglichen Verunreinigungen

Benzol 35 Benzol 25 Chloroform 80 Chloroform 20 Substanz Aceton 32,5 Aceton 40 Diethylamin 20 Ethanol 20

NH3 25prOz. 2,5 NH3 25prO.z. 2.5 NJ33 25proz. 1 Ethanol 70proz. 35 Ethanol 7Oproz. 35 Aceton 5

Morphin 0.41 Codein 0.53 Thebain 0.81 Pseudomorphin 0.05 Morphin-N-oxid 0.06

0.45 0.50 0.66 0.20 0.15

0.63 039 0.90 0.15 0.0

0.54 0.69 0.90 0.04 0.22

Abb. 1: Remissionsgrad-Ortskurve bei 285 nm 1 Morphin-N-oxid, 2 Pseudomorphin, 3 nicht identifizierte Ver- unreinigung im Morphin. 4 Morphin, 5 Codein, 6 Thebain

c

t

(Y Y FlieBmittel: BenzollAceton/70proz. Ethanol/25proz. NH, (30 + 35 + 35 + 2.5 v/vj

Auswertung

Die Vermessung der DC-Platten wurde mit einem Zweistrahl-DC-Fotometer Kratos-Schoeffel SD 3000 durchgefuhrt. Bei der Venvendungeines Einstrahl-DC-Fotorneters (Zeiss, Camag) ist darauf zu achten, daB wegen des relativ hohen Rf-Wertes des Thebains Storungen durch die FlieBmittelfront auftreten konnen. Die Auswertung wurde teilweise iiber die integrierte Flache, teilweise auch lediglich uber die Peakhohe der Remissionsgrad-Ortskurve vorgenommen. Auf die Verwendung eines internen wurde in dieser Arbeit verzichtet, da bei einer manuellen Ausfuhrung mit einer Verbesserung der MeBgenauigkeit nicht zu rechnen

In der quantitativen DC wird die Auftragekonzentration einer Substanz durch die Faktoren der spezifischen Extinktion, der Ldslichkeit der zu messenden Substanz sowie der Auswertbarkeit der aufgezeichneten Remissionsgrad-Ortskurve, bedingt durch das SignaURausch-Verhaltnis, festgelegt. Sollen jedoch in einem Arbeitsgang Verunreinigungen, die in der Regel in wesentlich geringeren Mengen vorliegen, mitbestimmt werden, so kommt als vierter Faktor das Verhaltnis dieser Neben- und Abbauprodukte zur Hauptsubstanz hinzu. Da es gerade in der Stabilitatsanalytik darauf ankomrnt, Haupt- und Nebenprodukte nach Moglichkeit auf derselben Platte zu bestimmen, sollte im vorliegenden Falle die Eichfunktion fur Morphin-HCI in einem sehr hohen Bereich von 10 bis 50 c1.g erstellt werden. In diesem Bereich ergibt sich annahernd eine lineare Abhangigkeit des Quadrats der Hohe”) von der Konzentration (Abb. 2). Andererseits arbeitet man bei den Neben- und Abbauprodukten wegen der wesentlich geringeren Konzentration im Bereich der direkten linearen

1 9 ) ,

340 E M und Rost Arch. Pharm.

Abhangkeit des MeRsignals von der Auftragsmenge20-22). Einen prozentualen Anteil, berechnet auf den Gehalt an Morphin-HCI, von ca. 0.2 % fur Thebain, 0.3 96 fur Codein und Pseudomorphin und 0.1 70 fur Morphin-N-oxid voraussetzend, sollten die Eichgraden dementsprechend fur Thebain irn Bereich von 20 bis 100 ng, fur Codein von 50 bis 250 ng, fur Pseudomorphin von 25 bis 250 ng und fur Morphin-N-oxid von 10 bis 50 ng erstellt werden.

I,+/: : ;

m’pg 10 50 Abb. 2: Eichfunktion der Bestimmung von Morphin iiber das

Quadrat der Peakhohe, rn= 10-50 pg/Fleck

Restimmt man Morphin-HCI ohne Beriicksichtigung der Nebenprodukte, reicht eine wesentlich geringere Konzentration aus. Der optimale MeRbereich liegt bei 50 bis 250 ngiFleck, da hierbei fur Morphin eine direkte lineare Abhangigkeit der MeRsignale zur Auftragmenge (Abb. 3 ) besteht. Be- rcits bei Substanzmengen urn 1 pgiFleck treten Abweichungen vom linearcn Verhalten auf (Abb. 4).

50 50 250

Abb. 3: Eichfunktion der Bestimmung von Morphin uber die Flache bzw. die Peakhohe. rn = 50-250 ng/Fleck AM. 4: Eichfunktion der Bestimmung von Morphin uber die Peakhohe. m = 0.25-1.25 pg/Fleck.

313/80 DC-Bestimrnung des Morphins 341

Dariiberhinaus wurde venucht, die Nachweisgrenze durch Detektion rnit Dragendorff-Reagenszu verbessern. Als zusatzlicher Vorteil ergabe sich auch eine geringere Stiiranfalligkeit der Messung irn sichtbaren Spektralbereich. Es ergab sich jedoch, bedingt durch eine leichte Grundfarbung, eine Verschlechterung der Ernpfindlichkeit und gleichzeitig eine ganz charakteristische Verzerrung der Eichfunktion (Abb. 5 ) .

Abb. 5: Eichkurven der Morphinbestimmung +-+- UV-Rernissionsmessung

_ - - - - - A - - - - - -A - - - - - - Remissionsmessung nach Anfarben mit Dragendorff-Reagens.

Ergebnisse

Fur die Morphinbestimmung durch DC-Remissionsrnessung wurde eine Reproduzier- barkeit von 1.8 % bei der Auswertung uber die Peakhohe (als genaherte relative Standardabweichung) ermittelt. Bei einer Auswertung uber die Flache unter der Remissionsgrad-Ortskurve ergibt sich mit 2.3 % eine nicht signifikante Verschlechterung der Resultate. Fur die Nebenprodukte wurde eine Reproduzierbarkeit der Messung von etwa 2-3 % gefunden, lediglich beim Pseudomorphin ergaben sich etwas ungunstigere Werte.

Tab. 2 enthalt die Ergebnisse der Untersuchungen sechs verschiedener Chargen Morphin-Ampullen unterschiedlicher Lagerdauer verschiedener Hersteller. Angegeben ist der gefundene Gehalt an Morphin HCI (deklarierter Geha!t 20 mg/ml) sowie Pseudomorphin und Codein. Alle Chargen enthielten unabhangig vom Alter den deklarierten bzw. einen leicht uberhohten Gehalt an Wirkstoff. Pseudomorphin wurde in allen Chargen gefunden, der Gehalt, bezogen auf die Wirksubstanz, lag bei etwa 0.3 %. Lediglich eine Charge enthielt einen wesentlich hoheren Gehalt. Codein wurde nur in zwei Chargen gefunden, wahrend Thebain lediglich in einer Charge nachgewiesen werden konnte, wobei allerdings die gefundene Menge dicht an der Nachweisgrenze lag. Wahrend Pseudomorphin auch unmittelbar nach der Herstellung nachgewiesen werden kann, war Morphin-N-oxid weder nach Iangerer Lagerung, noch nach StreB-Versuchen nachweisbar. An der nach Freund und S ~ e y e ? ~ ) hergestellten Reinsubstanz konnte

342 Ebel und Rort Arch. Pharm.

Tab. 2: Ergebnisse der Bertirnmung von Morphin, Codein und Pseudornorphin in Morphinanipullen.

Charge Herstellungs- Morphin-HC1 Pseudornorphin Codein %*) jahr rngiml rng/rnI %*) mg/rnl

A welt vor 1970 20.65 B 1970 21 49 C 1974 21.49 D 1974**) 22.48

22.71 22.40 22.53

C 1973 22.34 22.30 22.02 22.22

1. unbekannt 22.71 (ca. 1969) 22 35

21.65 21.42 21.75 21.19 21 14 21.19 21 02 21.60

0.242 0.071 0.066 0.056 0.062 0.056 0.058 0.056 0.065 0.066 0.062 0.055 0.052 0.064 0.060 0.055 0.061 0.064 0.069 0.066 0.06 1

1.17 0.33 0.31 0.24 0.27 0.25 0.26 0.25 0.30 0.30 0.28 0.24 0.23 0.30 0.29 0.25 0.29 0.30 0.32 0.31 0.28

n.n. 0.066 n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. 0.070 0.070 0.066 0.054 0.060 0.065 0.061 0.062 0.069 0.064

0.30

..

-

0.31 0.31 0.32 0.25 0.27 0.31 0.29 0.29 0.33 0.30

n.n. nicht nachweisbar +' bcz. auf den Gehalt an Morphin ") Soweit hei einer Charge rnehrere Werte aufgefuhrt sind, handelt es sich urn unterachiedliche Lagerorte der gleichen Charge. Alle angegebenen Werte sind Mittelwerte aus 8 Einzelwerten.

festgestellt werden, dal3 Morphin-N-oxid in wal3riger Liisung zum uberwiegenden Teil unmittelbar in P\eudomorphin iibergeht. In der Praxis wird deshalb vor allem die Bestimmung des Pseudomorphins und der Disulfonsaure bei ,,stabilisierten" P r a ~ a r a t e n ' ~ ) von Redeutung sein, da hier ein echter Fdktor zur Qualitatsbeurteilung von Morphin-Am- pullen zu sehen irt.

Der Deutschen Forschungsgenieinschart und dern Fonds der Chemischen Industrie danken wir fur Sachheihilfen.

Experimenteller Teil

.Sub.stanzen: Morphin-N-oxid wurde nach Freundund S ~ e y e r ' ~ ) dargestellt. Die ldentitat der Suhstanz wurde rnassenspektroskopisch gesichert. DC-Platten:DC-Fertigplatten Kieselgel 60; E. Merck, Darmstadt, FlieBmittel: Benzol/Aceton/ 70proz. Ethanoli25proz. NH, (30 + 35 + 35 + 2,s; v/v). Auftragetechnik: 2 yl Microcap

313/80 DC-Bestimmune des Morphins 343

(Drummond Scientific; Vertrieb: Shandon Labortechnik, Frankfurt). DC-Fotometer: Kratos-Schoef- fel SD 3000. MeRwellenlange: ca. 285 nm; die Rernissionsmaxima der untersuchten Substanzen lagen zwischen 280 und 290 nm, fur Pseudomorphin bei 240 nm. MeRflache: 0.5 X 10 mm bnv. 1.0 X 10 mm .

Analysenlosungen

Morphin HCI (ohne Beriicksichtigung der Nebenprodukte): 1.00 ml Ampullenlosung (= 20 mg) werden ad 100,OO rnl mit Wasser aufgefullt, Auftragemenge: 1 pl. Vergleichslosungen: Stammlosun- gen in EthanoliWasser wurden so verdunnt, daR bei einem Auftragevolumen von 2 kl die Substanzmenge/Fleck bei 2&100 ng (Thebain), 50-250 ng (Codein), 25-250 ng (Pseudomorphin) bzw. 10-50 ng (Morphin-N-oxid) lag. Sollten die Mengen der Nebenprodukte den angegebenen Bereich uberschreiten, sind die Vergleichslosungen dem Bedarf entsprechend anzupassen.

Literatur

1 S. Yeh und J. L. Lach, J. Pharm. Sci. 50,30 (1961). 2 R. Lang und G. Reich, Wehrmed. Monatsschr. 13, 342 (1969). 3 H. Hammerstingl und H. Trapmann, Fresenius Z. Anal. Chem. 274, 30 (1975). 4 S. Ebel, Handbuch der Arzneirnittel-Analytik, Verlag Chemie, Weinheim 1977. 5 K. Genest und G. Belec, Can. J. Pharm. Sci. 1964,44; C. A. 67,102822 (1967). 6 V. E. Chichiro et al.. Farmatsiya (Moscow) 20, (6). 37 (1971); Zbl. Pharm. I f I , 63 1 (1972). 7 M. Paris, J. P. Gramond und P. R. Paris, Ann. Pharm. Fr.32, 97 (1974). 8 J. Sherma, M. F. Dobbins und J. C. Touchstone, J. Chromatogr. Sci. 12,300 (1974). 9 E. Eich, H. Geissler, E. Mutschler und W. Schunack, Arzneim. Forsch. 19, 1895 (1969). 10 K. Roeder, E. Eich und E. Mutschler, Arch. Pharrn. (Weinheirn) 304,297 (1971). 11 W. Schlernmer und E. Kammerl, J. Chromatogr. 82, 143 (1973). 12 R. Segure und A. M. Gotto, J. Chromatogr. 99,643 (1974). 13 H. Harnmerstingl und G. Reich, J. Chromatogr. 101, 408 (1974). 14 H. Traprnann und H. Hammerstingl, Pharrn. Ztg. 122,310 (1977). 15 S. Ebel und H. Rost, Arch. Pharm. (Weinheim) SI2. 100 (1979). I6 R. Klaus, J. Chromatogr. 40, 235 (1969); 62, 99 (1971). 17 S. Ebel und G. Herold, Chrornatographia 8, 35 (1975). 18 S. Ebel und G. Herold, Arch. Pharm. (Weinheirn) 308,839 (1975). 19 S. Ebel, E. Glaser und D. Rost, J. High Resolut. Chrornatogr. 1 , 249 (1978). 20 Dissertation H. KuBmaul, Marburg 1972. 21 A. Bethke und R. W. Frei, J. Chromatogr. 91,433 (1974). 22 S. Ebel, G. Herold und J. Hocke, Instrum. Forsch. 1976,42. 23 M. Freund und E. Speyer, Chem. Ber. 43,3310 (1910); 48,497 (1915).

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