UNIVERSITE PARIS-SUD 11 U.F.R. SCIENTIFIQUE DORSAY

THESE

prsente pour obtenir le grade de

DOCTEUR ES SCIENCES

DE LUNIVERSITE PARIS-SUD 11

Par

Guillaume Ne

Soutenue le 15 dcembre 2011

Etude de fonctions non-photosynthtiques pour les

thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana JURY : Pr S. Nessler Prsidente du jury

Pr P. Geigenberger Examinateur

Dr F. Montrichard Rapporteur

Dr J.P. Reichheld Rapporteur

Dr E. Issakidis-Bourguet Responsable de la thse

Figure 70: Principle BIAcore sensor chips building with of strep tag II fusion protein. Strep Mab-Immo antibody can be covalently attached on CM-5 sensor chip. Then strep tagged protein can be immobilized by the recognition and the binding of strep tag II at the surface of the sensor chips for real time SPR analysis

Remerciements, Je tiens tout d'abord remercier en premier lieu Didier Peltier de l'universit d'Angers qui, il y a 6 ans, m'a permis de faire ma premire exprience de recherche en m'accueillant dans son laboratoire. A l'poque, j'tais jardinier et ne savais mme pas ce que signifiait PCR. Tu m'as fais confiance malgr mes trs maigres connaissances en biologie cellulaire et tu m'as dmontr que les jardiniers aussi pouvaient amplifier de l'ADN. La vue d'un amplicon fluorescent sur un gel d'agarose a t pour moi "la" rvlation, et j'ai compris cet instant que ma vie s'panouirait dans un laboratoire bien plus vite que sous une serre. Ces quelques semaines de stage ont suffi pour me faire reprendre de faon dtermine les tudes universitaires. Par la suite, j'ai rencontr l'universit Franoise Montrichard qui m'a donn le got de la biochimie et surtout la passion pour cette famille de protines que sont les thioredoxines. Merci Franoise d'avoir partag avec moi ta passion, et de m'avoir form la biochimie. L'indpendance, l'autonomie, la tnacit et l'efficacit sont aujourd'hui mes principes fondamentaux et je te dois cet hritage. Merci galement de m'avoir introduit au sein du laboratoire de signalisation redox o j'ai effectu mon stage de M2, puis ma thse. Voila maintenant le moment de remercier tous ceux qui m'ont accompagn au cours de ces trois annes de thse et en premier lieu "ma chef ", Emmanuelle Issakidiss. Merci de m'avoir donn ma chance dans ton labo il y a quatre ans, et de m'avoir form. Tu m'as galement laiss beaucoup de libert, ce qui m'a permis de donner une direction trs personnelle ma thse. La confiance que tu as porte en moi et en mes hypothses (parfois farfelues) ont t un facteur dterminant de ma russite. Merci aussi Stphane Lemaire, avec qui j'ai beaucoup chang lors de ma premire anne de thse. Les discussions scientifiques avec toi ont t trs stimulantes. Merci aussi Myroslwa Miginiac-Maslow : vous reprsentez pour moi la quintescence du chercheur accompli, votre gentillesse, vos connaissances de la thmatique et de la biologie en gnral m'impressionnent normment. Approcher (mme de loin) votre niveau est devenu ma qute du Graal et j'ai pleinement conscience que cet objectif est la frontire de l'impossible, mais votre exemple est une source de motivation inpuisable. Merci galement Hlne Vanacker. Nos discussions scientifiques ont t trs stimulantes, et je n'oublierai pas que tu m'as beaucoup aid pour mes enseignements, aussi bien d'un point de vue pdagogique qu'administratif. Tu connais toutes les ficelles du milieu, et, sans ton soutien et ton exprience d'enseignant-chercheur, j'aurais eu beaucoup plus de mal grer ces deux activits. Merci galement Mariette, Anne-Sophie, Xing Huang, Mirko, Gilles et Daniel. Avoir partag des moments avec vous au labo et en dehors font de vous des ami(e)s que je suis fier d'avoir. Merci Nathalie, Chantal, Franoise, Martine, Laurine et Pierre. Vous avez t des collgues formidables en qui j'ai pleine confiance, et qui m'avez normment soutenu. Je vous dois beaucoup, et je ne serai jamais comment vous remercier la hauteur de ce que vous m'avez donn. Merci aussi Mr Jean pour sa joie, son enthousiasme, et sa culture (sans limite: Mr Jean est une vraie encyclopdie vivante). Merci mon Thom Thom : sans ton aide, c'tait foutu; je n'y serais pas arriv, tu m'as nourri quand j'tais trop dbord ou dprim pour penser m'alimenter, ton sens humain m'a souvent laisser pantois! Merci aussi Laure, ta future femme qui en plus d'tre une source de bonne humeur, m'a toujours prt son homme sans jamais se plaindre (jusqu' parfois pas d'heure), quand face l'informatique capricieuse je ne suis souvent retrouv bien dmuni.

Et merci tous ceux de l'Institut que j'aurais pu oublier et qui m'ont aid (parfois beaucoup), je pense notamment Maryelle, Jean Paul, Eric, Gilles Meeriam et Hoang. Merci mes trois brillantes stagiaires Fanny, Sverine, et Roxane. Vous tes toutes trois trs travailleuses et trs intelligentes, j'ai souvent t impressionn par la pertinence de vos remarques et par votre assiduit au travail, mme pour des tches pnibles (les innombrables semis agencs de graines d'Arabidopsis...). Je suis profondment persuad que vous irez loin. Votre prsence et votre soutien sans faille mes cots ont t des bouffes d'oxygne sans lesquelles je me serais srement asphyxi. Je tiens galement remercier toutes les personnes qui m'ont accueilli dans leur laboratoire et qui ont pass du temps partager leur comptence pour faire avancer mes travaux. Marielle Valerio Lepiniec, Magali Aumont, vous m'avez initi la micro calorimtrie et vous avez toujours gard espoir en mes manips, l o, moi-mme, je perdais parfois confiance. Sylvie Nessler, comment te remercier de m'avoir accueilli au LEBS, d'avoir pass beaucoup de temps m'couter, m'aider pour faire avancer mon sujet ainsi que d'avoir investi financirement dans mes manips. Grce toi j'ai dcouvert le monde des structuralistes, et j'ai pu aller jusqu' l'obtention de petits cristaux, et je n'en suis pas peu fier ! Christophe Bailly et Patrice Meimoun, je vous dois une grosse partie de mon travail sur la caractrisation de la physiologie de la germination, L aussi vous avez cru en moi et en mes convictions. Je tiens finir en remerciant mes amis, et surtout mes parents et ma soeur qui m'ont toujours soutenu sans faille et normment aid pour les corrections orthographiques de ce manuscrit. Vous avez toujours t l pour moi, malgr mon comportement parfois la limite du manque de patience. Il est temps de rendre Csar ce qui lui appartient, Maman, Papa cette thse est aussi est la vtre!

TABLE DES MATIERES

ABREVIATIONS ......................................................................... 1 INTRODUCTION ........................................................................ 3 Les thiordoxines (TRX) ................................................................. 4

Systme de rduction des TRX ........................................................................................................... 5 Le systme NADP Thiordoxine rductase .................................................................................................... 5 Le systme ferrdoxine thiordoxine des organismes photosynthtiques ...................................................... 6 Rduction des thiordoxines dans les plastes non photosynthtiques ............................................................ 7

Systme doxydation des TRX ........................................................................................................... 8 Les thiordoxines et leurs homologues structuraux des plastes dArabidopsis thaliana .................... 9

TRX du type f ................................................................................................................................................. 9 TRX du type m ............................................................................................................................................... 9 TRX du type y .............................................................................................................................................. 10 TRX du type x .............................................................................................................................................. 10 TRX du type z .............................................................................................................................................. 10 Les glutardoxines (GRX) ............................................................................................................................ 11

Expression de thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana ..................................................... 11 Les cibles des thiordoxines ............................................................................................................. 11

Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme photosynthtique ..................................... 12 Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme non photosynthtique .............................. 12

Spcificits des TRX pour leurs cibles ............................................................................................. 13 Nature de la spcificit TRX cible .................................................................................................... 14 Phnotype des mutants pertes de fonction pour les TRX.................................................................. 15 Les TRX dans la physiologie des semences ..................................................................................... 16 Germination et formes actives de l'oxygne ..................................................................................... 16

Le cycle oxydatif des pentoses phosphate .......................................... 18 La glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PDH) ......................................................................... 19

Localisation subcellulaire des G6PDH dArabidopsis thaliana ................................................................... 19 Importance des G6PDH dans la physiologie des vgtaux .......................................................................... 20 Rgulation enzymatique des G6PDH ........................................................................................................... 20 Origine volutive de la rgulation redox des G6PDH .................................................................................. 21 Mcanisme catalytique des G6PDH ............................................................................................................. 22

La 6-phosphogluconate dshydrognase (6PGDH) .......................................................................... 23 Localisation subcellulaire des 6PGDH dArabidopsis thaliana ................................................................... 23 Mcanisme catalytique des 6PGDH ............................................................................................................. 24 Structure tridimensionnelle et sites catalytiques de 6PGDH ........................................................................ 24 Modifications post traductionnelles des 6PDGH de plantes suprieures ..................................................... 25

Objectif de mon travail de thse ..................................................... 26 RESULTATS ............................................................................. 27 Premire partie .......................................................................... 28

Caractrisation biochimique de la rgulation post traductionnelle des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses phosphate ................... 28

Etude biochimique des modifications post traductionnelles dune 6-phosphogluconate dshydrognase chloroplastique dA. thaliana ........... 29

Production et purification dune 6PGDH recombinante dArabidopsis ........................................... 29 Les modifications post-traductionnelles de la 6PGDH1 ................................................................... 29

Mise en vidence dune modification redox de lenzyme ............................................................................ 29 Mise en vidence de la phosphorylation de lenzyme .................................................................................. 30 Analyse des squences primaires des 6PGDH dArabidopsis et modlisation 3D de la 6PGDH1 .............. 31 Recherche de sites dadressage aux organites .............................................................................................. 31 Identification de cystines candidates pour la modification redox ............................................................... 32 Recherche de sites de phosphorylation ......................................................................................................... 33

Etude de leffet des modifications post traductionnelles sur lactivit de la 6PDH1 ........................ 33 Effet de la modification redox sur lactivit de la 6PGDH........................................................................... 33 Effet de la phosphorylation de la 6PGDH sur lactivit dshydrognase et interconnexion entre rgulation redox et phosphorylation .............................................................................................................................. 34

Conclusion prliminaire sur la caractrisation biochimique de lenzyme ........................................ 35 Rgulation redox des glucose-6-phosphate dshydrognases plastidiales .. 37

Analyse des squences primaires des 4 G6PDH plastidiales dArabidopsis .................................... 37 Production et purification des G6PDH de type P1 (G6PDH1) et P2 (G6PDH2 et 3) ....................... 37 Toxicit de l'isoforme G6PDH4 dArabidopsis dans la bactrie E. coli ........................................... 39 Quantification des thiols libres sur G6PDH1 native ......................................................................... 40 Caractrisation de la rgulation redox de l'activit des G6PDH plastidiales .................................... 40 Validation des rsidus cystine rgulatrices par mutagne dirige ................................................... 40 Spcificits de rgulation redox des G6PDH plastidiales de type P1 et P2 ...................................... 41 Rgulation de G6PDH1 par dautres rdoxines plastidiales et par les mtabolites redox ................ 43

Dterminisme de la spcificit TRX / G6PDH .................................... 45 Potentiel redox des isoformes de G6PDH de type P1 et P2 .............................................................. 45 tude par calorimtrie diffrentiel balayage (DSC) de linteraction G6PDH1 / TRX ................... 46 Analyse des spcificits dinteraction TRX / G6PDH par titration en microcalorimtrie isotherme (ITC) ................................................................................................................................................. 47 Etude de linteraction TRX / G6PDH en rsonance plasmonique de surface (RPS) BIAcore ......... 48

Etude des effets de la rgulation redox sur les proprits de la G6PDH1 .. 51 Alignement des squences primaires des G6PDH dArabidopsis avec les isoformes de structure connue et modlisation structurale de G6PDH1 ............................................................................... 51 Effet de la rgulation redox sur la structure quaternaire de la G6PDH1 ........................................... 53 Dtermination de la composition en structures secondaires des formes oxydes et rduites de G6PDH1 ............................................................................................................................................ 54 Dtermination de constantes catalytiques pour les formes oxydes et rduites ................................ 54 Mesure du coefficient daffinit (Kd) pour le NADP des formes sauvage oxyde et mutante de la G6PDH1 par Calorimtrie de Titration Isotherme (ITC) .................................................................. 55 Etude de laccessibilit des substrats au site actif ............................................................................. 56 Essai de cristallisation de la G6PDH1 et perspectives dtudes structurales .................................... 57 Rgulation TRX-dpendante de la G6PDH1 dans un systme Fd/TRX

reconstitu in vitro ....................................................................... 58 Deuxime partie ......................................................................... 60 Caractrisation de mutants perte de fonction pour les TRX du type y .... 60

Profils dexpression des gnes des TRX plastidiales et des G6PDH dans le contexte des mutants de TRX y ................................................................................................................................................ 61

Validation de la perte de fonction des gnes muts par RT-PCR semi-quantitative et quantitative ............. 61 Analyse de lexpression des autres TRX plastidiales ................................................................................... 62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana ..................................................................................... 62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana dans un contexte TRX y mutant .................................. 63

Etude in situ de lactivit G6PDH racinaire chez les doubles mutants TRX y ................................. 64 Physiologie de la germination des graines mutantes pour les TRX du type y .................................. 65

Caractrisation de la qualit germinative des graines sauvages et mutantes pour les TRX du type y .......... 66 Caractrisation de la dormance chez Arabidopsis thaliana cotype Columbia ............................................ 67 Caractrisation de la dormance des graines mutantes pour les TRX du type y ............................................ 68 Caractrisation de la tolrance un stress thermique des graines mutantes pour les TRX du type y .......... 69

Dosage et localisation in situ des formes actives de loxygne dans les graines des mutants des TRX du type y ............................................................................................................................................ 70

Production-diffusion du peroxyde dhydrogne et leve de dormance ........................................................ 70 Dosage et localisation in situ de la production danion superoxyde dans les graines des mutants de TRX y ...................................................................................................................................................................... 71

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ............................. 73

Rgulation redox des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses phosphate ................................................................................. 74

Mise en vidence de nouvelles fonctions pour les TRX des types f et y et pour lisoforme m3 ...... 74 Coordination des cycles rducteur (Calvin) et oxydatif des pentoses phosphate par les TRX f ....... 75 Impact de la rgulation redox sur les proprits catalytiques de la G6PDH1 ................................... 76 Rgulation post-traductionnelle dune 6PGDH chloroplastique ....................................................... 77 Nature des spcificits TRX / cible dans la rgulation redox des G6PDH plastidiales .................... 79 Mcanisme doxydation des TRX ..................................................................................................... 81

Etude in planta de fonctions pour les TRX y ...................................... 83 Impact de la perte de fonction des TRX y sur lactivit G6PDH racinaire ....................................... 84 Rle des TRX y dans les processus physiologiques de la germination ............................................ 84 Conclusion sur lanalyse fonctionnelle in planta des TRX plastidiales dArabidopsis .................... 85

MATERIELS ET METHODES ..................................................... 86 Matriel vgtal et conditions de culture .......................................... 87

Pisum sativum var. Nain merveille de Kelvedon .............................................................................. 87 Arabidopsis thaliana ......................................................................................................................... 87 Production des lots de graines dArabidopsis ................................................................................... 87 Culture in vitro .................................................................................................................................. 88 Les souches bactriennes dEscherichia coli .................................................................................... 88

La souche DH5F ....................................................................................................................................... 88 La souche BL21 (DE3)................................................................................................................................. 88 Conditions de culture ................................................................................................................................... 88

Les plasmides ............................................................................. 89 Le vecteur pRARE 2 (Novagen) ....................................................................................................... 89 Les vecteurs pASK-G6PDH ............................................................................................................. 89 le vecteur pGENI .............................................................................................................................. 89

Mthodes relatives aux acides nucliques ......................................... 90 Mthodes gnrales relatives lADN ............................................................................................. 90

Amplification de lADN par PCR ................................................................................................................ 90 Dosage des acides nucliques ....................................................................................................................... 90 Electrophorse en gel dagarose ................................................................................................................... 91 Squenage ................................................................................................................................................... 91

Mthodes lies lARN ................................................................ 91 Extraction dARN totaux dorganes vgtaux .................................................................................. 91 Transcription inverse......................................................................................................................... 92 PCR semi quantitative ....................................................................................................................... 92 PCR quantitative en temps rel ......................................................................................................... 92

Techniques relatives aux clonages ................................................... 93 Restriction de lADN ........................................................................................................................ 93 Purification des produits de restriction ............................................................................................. 93 Ligature ............................................................................................................................................. 93 Transformation dE. coli par lectroporation .................................................................................... 94

Prparation des cellules ................................................................................................................................ 94 Electroporation ............................................................................................................................................. 94

Transformation dE. coli par le DMSO ............................................................................................. 94 Traitement de comptence des cellules ........................................................................................................ 94 Transformation ............................................................................................................................................. 95

Criblage des transformants par PCR ................................................................................................. 95 Extraction et purification de lADN plasmidique bactrien.............................................................. 95 Construction du vecteur pGENI ........................................................................................................ 95 Prparation de lADNc de 6PGDH1 ................................................................................................. 96 Clonage de la 6PGDH1 dans pGENI ................................................................................................ 97 Mutagense dirige ........................................................................................................................... 97

Technique lie la caractrisation phnotypique des mutants dinsertion 98 Test de germination ........................................................................................................................... 98 Dosage de la production diffusion du peroxyde dhydrogne sur graines ........................................ 98 Coloration in situ des anions superoxydes (O2.-) par le NBT ............................................................ 99 Dtection de lactivit G6PDH in situ .............................................................................................. 99

Techniques lies a lanalyse des protines ........................................ 100 Mthodes biochimiques .................................................................................................................. 100

Dosage des protines .................................................................................................................................. 100 Electrophorse en conditions dnaturantes (SDS-PAGE) .......................................................................... 100 Transfert des protines sur membrane ........................................................................................................ 101 Western-blot ............................................................................................................................................... 101 Production des protines recombinantes .................................................................................................... 101 Extraction des protines recombinantes ..................................................................................................... 102 Purification des protines recombinantes ................................................................................................... 102 Test de phosphorylation in vitro ................................................................................................................. 103 Mesure de lactivit G6PDH ...................................................................................................................... 103 Mesure de lactivit 6PGDH ...................................................................................................................... 103 Traitement doxydation et de rduction des protines recombinantes ........................................................ 104 Concentration de demi-activation de G6PDH1 .......................................................................................... 105 Inactivation des G6PDH par la DEPC ........................................................................................................ 105 Drivation au DTNB .................................................................................................................................. 106 Drivation chimique des thiols avec lacide 4-acetamido-4-maleimidylstilbene-2,2-disulfonique (AMS) .................................................................................................................................................................... 106 Dtermination des masses apparentes de G6PDH1 rduite et oxyde par gel filtration ............................. 106 Dtermination du potentiel redox du pont disulfure rgulateur .................................................................. 106 Systme Fd/ TRX reconstitu ..................................................................................................................... 107

Mthodes Biophysiques .................................................................................................................. 108 Calorimtrie diffrentiel balayage (DSC) ................................................................................................ 108 Calorimtrie de titration isotherme (ITC) ................................................................................................... 108 Dichrosme circulaire (DC) ........................................................................................................................ 109 Mesure dinteraction en rsonance plasmonique de surface (SPR) ............................................................ 109

Cristallisation de G6PDH1 .............................................................................................................. 110 PUBLICATION ........................................................................ 112 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ......................................... 119 ANNEXES ............................................................................... 131

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THESE

prsente pour obtenir le grade de

DOCTEUR ES SCIENCES

DE LUNIVERSITE PARIS-SUD 11

Par

Guillaume Ne

Soutenue le 15 dcembre 2011

Etude de fonctions non-photosynthtiques pour les

thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana JURY : Pr S. Nessler Prsidente du jury

Pr P. Geigenberger Examinateur

Dr F. Montrichard Rapporteur

Dr J.P. Reichheld Rapporteur

Dr E. Issakidis-Bourguet Responsable de la thse

Remerciements, Je tiens tout d'abord remercier en premier lieu Didier Peltier de l'universit d'Angers qui, il y a 6 ans, m'a permis de faire ma premire exprience de recherche en m'accueillant dans son laboratoire. A l'poque, j'tais jardinier et ne savais mme pas ce que signifiait PCR. Tu m'as fais confiance malgr mes trs maigres connaissances en biologie cellulaire et tu m'as dmontr que les jardiniers aussi pouvaient amplifier de l'ADN. La vue d'un amplicon fluorescent sur un gel d'agarose a t pour moi "la" rvlation, et j'ai compris cet instant que ma vie s'panouirait dans un laboratoire bien plus vite que sous une serre. Ces quelques semaines de stage ont suffi pour me faire reprendre de faon dtermine les tudes universitaires. Par la suite, j'ai rencontr l'universit Franoise Montrichard qui m'a donn le got de la biochimie et surtout la passion pour cette famille de protines que sont les thioredoxines. Merci Franoise d'avoir partag avec moi ta passion, et de m'avoir form la biochimie. L'indpendance, l'autonomie, la tnacit et l'efficacit sont aujourd'hui mes principes fondamentaux et je te dois cet hritage. Merci galement de m'avoir introduit au sein du laboratoire de signalisation redox o j'ai effectu mon stage de M2, puis ma thse. Voila maintenant le moment de remercier tous ceux qui m'ont accompagn au cours de ces trois annes de thse et en premier lieu "ma chef ", Emmanuelle Issakidiss. Merci de m'avoir donn ma chance dans ton labo il y a quatre ans, et de m'avoir form. Tu m'as galement laiss beaucoup de libert, ce qui m'a permis de donner une direction trs personnelle ma thse. La confiance que tu as porte en moi et en mes hypothses (parfois farfelues) ont t un facteur dterminant de ma russite. Merci aussi Stphane Lemaire, avec qui j'ai beaucoup chang lors de ma premire anne de thse. Les discussions scientifiques avec toi ont t trs stimulantes. Merci aussi Myroslwa Miginiac-Maslow : vous reprsentez pour moi la quintescence du chercheur accompli, votre gentillesse, vos connaissances de la thmatique et de la biologie en gnral m'impressionnent normment. Approcher (mme de loin) votre niveau est devenu ma qute du Graal et j'ai pleinement conscience que cet objectif est la frontire de l'impossible, mais votre exemple est une source de motivation inpuisable. Merci galement Hlne Vanacker. Nos discussions scientifiques ont t trs stimulantes, et je n'oublierai pas que tu m'as beaucoup aid pour mes enseignements, aussi bien d'un point de vue pdagogique qu'administratif. Tu connais toutes les ficelles du milieu, et, sans ton soutien et ton exprience d'enseignant-chercheur, j'aurais eu beaucoup plus de mal grer ces deux activits. Merci galement Mariette, Anne-Sophie, Xing Huang, Mirko et Daniel. Avoir partag des moments avec vous au labo et en dehors font de vous des ami(e)s que je suis fier d'avoir. Merci Nathalie, Chantal, Franoise, Martine, Laurine et Pierre. Vous avez t des collgues formidables en qui j'ai pleine confiance, et qui m'avez normment soutenu. Je vous dois beaucoup, et je ne serai jamais comment vous remercier la hauteur de ce que vous m'avez donn. Merci aussi Mr Jean pour sa joie, son enthousiasme, et sa culture (sans limite: Mr Jean est une vraie encyclopdie vivante). Merci mon Thom Thom : sans ton aide, c'tait foutu; je n'y serais pas arriv, tu m'as nourri quand j'tais trop dbord ou dprim pour penser m'alimenter, ton sens humain m'a souvent laisser pantois! Merci aussi Laure, ta future femme qui en plus d'tre une source de bonne humeur, m'a toujours prt son homme sans jamais se plaindre (jusqu' parfois pas d'heure), quand face l'informatique capricieuse je ne suis souvent retrouv bien dmuni. Et merci tous ceux de l'Institut que j'aurais pu oublier et qui m'ont aid (parfois beaucoup), je pense notamment Maryelle, Jean Paul, Eric, Meeriam et Hoang.

Merci mes trois brillantes stagiaires Fanny, Sverine, et Roxane. Vous tes toutes trois trs travailleuses et trs intelligentes, j'ai souvent t impressionn par la pertinence de vos remarques et par votre assiduit au travail, mme pour des tches pnibles (les innombrables semis agencs de graines d'Arabidopsis...). Je suis profondment persuad que vous irez loin. Votre prsence et votre soutien sans faille mes cots ont t des bouffes d'oxygne sans lesquelles je me serais srement asphyxi. Je tiens galement remercier toutes les personnes qui m'ont accueilli dans leur laboratoire et qui ont pass du temps partager leur comptence pour faire avancer mes travaux. Marielle Valerio Lepiniec, Magali Aumont, vous m'avez initi la micro calorimtrie et vous avez toujours gard espoir en mes manips, l o, moi-mme, je perdais parfois confiance. Sylvie Nessler, comment te remercier de m'avoir accueilli au LEBS, d'avoir pass beaucoup de temps m'couter, m'aider pour faire avancer mon sujet ainsi que d'avoir investi financirement dans mes manips. Grce toi j'ai dcouvert le monde des structuralistes, et j'ai pu aller jusqu' l'obtention de petits cristaux, et je n'en suis pas peu fier ! Christophe Bailly et Patrice Meimoun, je vous dois une grosse partie de mon travail sur la caractrisation de la physiologie de la germination, L aussi vous avez cru en moi et en mes convictions. Je tiens finir en remerciant mes amis, et surtout mes parents et ma soeur qui m'ont toujours soutenu sans faille et normment aid pour les corrections orthographiques de ce manuscrit. Vous avez toujours t l pour moi, malgr mon comportement parfois la limite du manque de patience. Il est temps de rendre Csar ce qui lui appartient, Maman, Papa cette thse est aussi est la vtre!

TABLE DES MATIERES

ABREVIATIONS ......................................................................... 1 INTRODUCTION ........................................................................ 3 Les thiordoxines (TRX) ................................................................. 4

Systme de rduction des TRX ........................................................................................................... 5 Le systme NADP Thiordoxine rductase .................................................................................................... 5 Le systme ferrdoxine thiordoxine des organismes photosynthtiques ...................................................... 6 Rduction des thiordoxines dans les plastes non photosynthtiques ............................................................ 7

Systme doxydation des TRX ........................................................................................................... 8 Les thiordoxines et leurs homologues structuraux des plastes dArabidopsis thaliana .................... 9

TRX du type f ................................................................................................................................................. 9 TRX du type m ............................................................................................................................................... 9 TRX du type y .............................................................................................................................................. 10 TRX du type x .............................................................................................................................................. 10 TRX du type z .............................................................................................................................................. 10 Les glutardoxines (GRX) ............................................................................................................................ 11

Expression de thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana ..................................................... 11 Les cibles des thiordoxines ............................................................................................................. 11

Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme photosynthtique ..................................... 12 Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme non photosynthtique .............................. 12

Spcificits des TRX pour leurs cibles ............................................................................................. 13 Nature de la spcificit TRX cible .................................................................................................... 14 Phnotype des mutants pertes de fonction pour les TRX.................................................................. 15 Les TRX dans la physiologie des semences ..................................................................................... 16 Germination et formes actives de l'oxygne ..................................................................................... 16

Le cycle oxydatif des pentoses phosphate .......................................... 18 La glucose-6-phosphate dshydrognase (G6PDH) ......................................................................... 19

Localisation subcellulaire des G6PDH dArabidopsis thaliana ................................................................... 19 Importance des G6PDH dans la physiologie des vgtaux .......................................................................... 20 Rgulation enzymatique des G6PDH ........................................................................................................... 20 Origine volutive de la rgulation redox des G6PDH .................................................................................. 21 Mcanisme catalytique des G6PDH ............................................................................................................. 22

La 6-phosphogluconate dshydrognase (6PGDH) .......................................................................... 23 Localisation subcellulaire des 6PGDH dArabidopsis thaliana ................................................................... 23 Mcanisme catalytique des 6PGDH ............................................................................................................. 24 Structure tridimensionnelle et sites catalytiques de 6PGDH ........................................................................ 24 Modifications post traductionnelles des 6PDGH de plantes suprieures ..................................................... 25

Objectif de mon travail de thse ..................................................... 26 RESULTATS ............................................................................. 27 Premire partie .......................................................................... 28

Caractrisation biochimique de la rgulation post traductionnelle des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses phosphate ................... 28

Etude biochimique des modifications post traductionnelles dune 6-phosphogluconate dshydrognase chloroplastique dA. thaliana ........... 29

Production et purification dune 6PGDH recombinante dArabidopsis ........................................... 29 Les modifications post-traductionnelles de la 6PGDH1 ................................................................... 29

Mise en vidence dune modification redox de lenzyme ............................................................................ 29 Mise en vidence de la phosphorylation de lenzyme .................................................................................. 30 Analyse des squences primaires des 6PGDH dArabidopsis et modlisation 3D de la 6PGDH1 .............. 31 Recherche de sites dadressage aux organites .............................................................................................. 31 Identification de cystines candidates pour la modification redox ............................................................... 32 Recherche de sites de phosphorylation ......................................................................................................... 33

Etude de leffet des modifications post traductionnelles sur lactivit de la 6PDH1 ........................ 33 Effet de la modification redox sur lactivit de la 6PGDH........................................................................... 33 Effet de la phosphorylation de la 6PGDH sur lactivit dshydrognase et interconnexion entre rgulation redox et phosphorylation .............................................................................................................................. 34

Conclusion prliminaire sur la caractrisation biochimique de lenzyme ........................................ 35 Rgulation redox des glucose-6-phosphate dshydrognases plastidiales .. 37

Analyse des squences primaires des 4 G6PDH plastidiales dArabidopsis .................................... 37 Production et purification des G6PDH de type P1 (G6PDH1) et P2 (G6PDH2 et 3) ....................... 37 Toxicit de l'isoforme G6PDH4 dArabidopsis dans la bactrie E. coli ........................................... 39 Quantification des thiols libres sur G6PDH1 native ......................................................................... 40 Caractrisation de la rgulation redox de l'activit des G6PDH plastidiales .................................... 40 Validation des rsidus cystine rgulatrices par mutagne dirige ................................................... 40 Spcificits de rgulation redox des G6PDH plastidiales de type P1 et P2 ...................................... 41 Rgulation de G6PDH1 par dautres rdoxines plastidiales et par les mtabolites redox ................ 43

Dterminisme de la spcificit TRX / G6PDH .................................... 45 Potentiel redox des isoformes de G6PDH de type P1 et P2 .............................................................. 45 tude par calorimtrie diffrentiel balayage (DSC) de linteraction G6PDH1 / TRX ................... 46 Analyse des spcificits dinteraction TRX / G6PDH par titration en microcalorimtrie isotherme (ITC) ................................................................................................................................................. 47 Etude de linteraction TRX / G6PDH en rsonance plasmonique de surface (RPS) BIAcore ......... 48

Etude des effets de la rgulation redox sur les proprits de la G6PDH1 .. 51 Alignement des squences primaires des G6PDH dArabidopsis avec les isoformes de structure connue et modlisation structurale de G6PDH1 ............................................................................... 51 Effet de la rgulation redox sur la structure quaternaire de la G6PDH1 ........................................... 53 Dtermination de la composition en structures secondaires des formes oxydes et rduites de G6PDH1 ............................................................................................................................................ 54 Dtermination de constantes catalytiques pour les formes oxydes et rduites ................................ 54 Mesure du coefficient daffinit (Kd) pour le NADP des formes sauvage oxyde et mutante de la G6PDH1 par Calorimtrie de Titration Isotherme (ITC) .................................................................. 55 Etude de laccessibilit des substrats au site actif ............................................................................. 56 Essai de cristallisation de la G6PDH1 et perspectives dtudes structurales .................................... 57 Rgulation TRX-dpendante de la G6PDH1 dans un systme Fd/TRX

reconstitu in vitro ....................................................................... 58 Deuxime partie ......................................................................... 60 Caractrisation de mutants perte de fonction pour les TRX du type y .... 60

Profils dexpression des gnes des TRX plastidiales et des G6PDH dans le contexte des mutants de TRX y ................................................................................................................................................ 61

Validation de la perte de fonction des gnes muts par RT-PCR semi-quantitative et quantitative ............. 61 Analyse de lexpression des autres TRX plastidiales ................................................................................... 62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana ..................................................................................... 62 Expression des G6PDH chez Arabidopsis thaliana dans un contexte TRX y mutant .................................. 63

Etude in situ de lactivit G6PDH racinaire chez les doubles mutants TRX y ................................. 64 Physiologie de la germination des graines mutantes pour les TRX du type y .................................. 65

Caractrisation de la qualit germinative des graines sauvages et mutantes pour les TRX du type y .......... 66 Caractrisation de la dormance chez Arabidopsis thaliana cotype Columbia ............................................ 67 Caractrisation de la dormance des graines mutantes pour les TRX du type y ............................................ 68 Caractrisation de la tolrance un stress thermique des graines mutantes pour les TRX du type y .......... 69

Dosage et localisation in situ des formes actives de loxygne dans les graines des mutants des TRX du type y ............................................................................................................................................ 70

Production-diffusion du peroxyde dhydrogne et leve de dormance ........................................................ 70 Dosage et localisation in situ de la production danion superoxyde dans les graines des mutants de TRX y ...................................................................................................................................................................... 71

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ............................. 73

Rgulation redox des dshydrognases du cycle oxydatif des pentoses phosphate ................................................................................. 74

Mise en vidence de nouvelles fonctions pour les TRX des types f et y et pour lisoforme m3 ...... 74 Coordination des cycles rducteur (Calvin) et oxydatif des pentoses phosphate par les TRX f ....... 75 Impact de la rgulation redox sur les proprits catalytiques de la G6PDH1 ................................... 76 Rgulation post-traductionnelle dune 6PGDH chloroplastique ....................................................... 77 Nature des spcificits TRX / cible dans la rgulation redox des G6PDH plastidiales .................... 79 Mcanisme doxydation des TRX ..................................................................................................... 81

Etude in planta de fonctions pour les TRX y ...................................... 83 Impact de la perte de fonction des TRX y sur lactivit G6PDH racinaire ....................................... 84 Rle des TRX y dans les processus physiologiques de la germination ............................................ 84 Conclusion sur lanalyse fonctionnelle in planta des TRX plastidiales dArabidopsis .................... 85

MATERIELS ET METHODES ..................................................... 86 Matriel vgtal et conditions de culture .......................................... 87

Pisum sativum var. Nain merveille de Kelvedon .............................................................................. 87 Arabidopsis thaliana ......................................................................................................................... 87 Production des lots de graines dArabidopsis ................................................................................... 87 Culture in vitro .................................................................................................................................. 88 Les souches bactriennes dEscherichia coli .................................................................................... 88

La souche DH5F ....................................................................................................................................... 88 La souche BL21 (DE3)................................................................................................................................. 88 Conditions de culture ................................................................................................................................... 88

Les plasmides ............................................................................. 89 Le vecteur pRARE 2 (Novagen) ....................................................................................................... 89 Les vecteurs pASK-G6PDH ............................................................................................................. 89 le vecteur pGENI .............................................................................................................................. 89

Mthodes relatives aux acides nucliques ......................................... 90 Mthodes gnrales relatives lADN ............................................................................................. 90

Amplification de lADN par PCR ................................................................................................................ 90 Dosage des acides nucliques ....................................................................................................................... 90 Electrophorse en gel dagarose ................................................................................................................... 91 Squenage ................................................................................................................................................... 91

Mthodes lies lARN ................................................................ 91 Extraction dARN totaux dorganes vgtaux .................................................................................. 91 Transcription inverse......................................................................................................................... 92 PCR semi quantitative ....................................................................................................................... 92 PCR quantitative en temps rel ......................................................................................................... 92

Techniques relatives aux clonages ................................................... 93 Restriction de lADN ........................................................................................................................ 93 Purification des produits de restriction ............................................................................................. 93 Ligature ............................................................................................................................................. 93 Transformation dE. coli par lectroporation .................................................................................... 94

Prparation des cellules ................................................................................................................................ 94 Electroporation ............................................................................................................................................. 94

Transformation dE. coli par le DMSO ............................................................................................. 94 Traitement de comptence des cellules ........................................................................................................ 94 Transformation ............................................................................................................................................. 95

Criblage des transformants par PCR ................................................................................................. 95 Extraction et purification de lADN plasmidique bactrien.............................................................. 95 Construction du vecteur pGENI ........................................................................................................ 95 Prparation de lADNc de 6PGDH1 ................................................................................................. 96 Clonage de la 6PGDH1 dans pGENI ................................................................................................ 97 Mutagense dirige ........................................................................................................................... 97

Technique lie la caractrisation phnotypique des mutants dinsertion 98 Test de germination ........................................................................................................................... 98 Dosage de la production diffusion du peroxyde dhydrogne sur graines ........................................ 98 Coloration in situ des anions superoxydes (O2.-) par le NBT ............................................................ 99 Dtection de lactivit G6PDH in situ .............................................................................................. 99

Techniques lies a lanalyse des protines ........................................ 100 Mthodes biochimiques .................................................................................................................. 100

Dosage des protines .................................................................................................................................. 100 Electrophorse en conditions dnaturantes (SDS-PAGE) .......................................................................... 100 Transfert des protines sur membrane ........................................................................................................ 101 Western-blot ............................................................................................................................................... 101 Production des protines recombinantes .................................................................................................... 101 Extraction des protines recombinantes ..................................................................................................... 102 Purification des protines recombinantes ................................................................................................... 102 Test de phosphorylation in vitro ................................................................................................................. 103 Mesure de lactivit G6PDH ...................................................................................................................... 103 Mesure de lactivit 6PGDH ...................................................................................................................... 103 Traitement doxydation et de rduction des protines recombinantes ........................................................ 104 Concentration de demi-activation de G6PDH1 .......................................................................................... 105 Inactivation des G6PDH par la DEPC ........................................................................................................ 105 Drivation au DTNB .................................................................................................................................. 106 Drivation chimique des thiols avec lacide 4-acetamido-4-maleimidylstilbene-2,2-disulfonique (AMS) .................................................................................................................................................................... 106 Dtermination des masses apparentes de G6PDH1 rduite et oxyde par gel filtration ............................. 106 Dtermination du potentiel redox du pont disulfure rgulateur .................................................................. 106 Systme Fd/ TRX reconstitu ..................................................................................................................... 107

Mthodes Biophysiques .................................................................................................................. 108 Calorimtrie diffrentiel balayage (DSC) ................................................................................................ 108 Calorimtrie de titration isotherme (ITC) ................................................................................................... 108 Dichrosme circulaire (DC) ........................................................................................................................ 109 Mesure dinteraction en rsonance plasmonique de surface (SPR) ............................................................ 109

Cristallisation de G6PDH1 .............................................................................................................. 110 PUBLICATION ........................................................................ 112 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ......................................... 119 ANNEXES ............................................................................... 131

1

ABREVIATIONS

A ADN acide dsoxyribonuclique ADNc ADN complmentaire Amp ampicilline APS ammonium persulfate ARN acide ribonuclique ARNm ARN messager ATP Adnosine TriPhosphate B BCA acide bicinchoninique BET bromure dthydium BSA albumine de srum bovin D DMSO dimthyl sulfoxide DO densit optique DTNB acide 5,5 dithiobis-(2-nitrobenzoque) DTT dithiothritol E ECL Enhanced ChemiLuminescence EDTA acide thylnediaminottraactique F FBPase fructose-1,6-bisphosphate phosphatase Fd ferrdoxine FNR ferrdoxine-NADP rductase FTR ferrdoxine-thiordoxine rductase G GAPDH glycraldhyde-3-phosphate

dshydrognase GPX glutathion peroxydase GR glutathion rductase GRX glutardoxine GSH glutathion rduit GSSG glutathion oxyd GST glutathion S-transfrase I IPTG isopropyl--D-thiogalactopyranoside L LB Luria Bertani M MSR Mthionine Sulfoxide Rductase

N NADP Nicotinamide Adenine

Dinucleotide Phosphate NADP-MDH NADP malate dshydrognase NTR NADPH-Thiordoxine Rductase NTS NADPH-Thiordoxine Systme P p/v poids/volume PCD Programmed Cell Death/mort

cellulaire programme PCR Polymerase Chain

Reaction/raction de polymrisation en chane

PDI Protine Disulfure Isomrase PGM PhosphoGluconMutase PKA Protine Kinase A PRK phosphoribulokinase PRX peroxyrdoxine PSI photosystme I PVDF PolyVinyliDne Fluorure R RNAse ribonuclase RNR ribonuclotide rductase ROS Reactive Oxygen Species/espces

ractives de loxygne RT-PCR Reverse Transcription - PCR RU Response Unit S SBPase sdoheptulose-1,7-bisphosphate

phosphatase SDS Sodium Dodcyl Sulfate SDS-PAGE SDS - polyacrylamide gel

electrophoresis T TAE Tris Acetate EDTA TCA acide trichloroactique TE Tris EDTA TEMED N,N,N',N'-

ttramthylthylnediamine Tris tris (hydroxymthyl)-

aminomthane TRX thiordoxine V v/v volume /volume

2

Note pralable la lecture de ce manuscrit

Pour la simplicit de lecture, les molcules : oxygne molculaire, oxygne singulet, anion superoxyde, radical hydroxyle ainsi que les peroxydes varies (peroxyde dhydrogne, peroxyde lipidique) sont mentionnes dans ce manuscrit sous le terme gnrique de formes actives de loxygne en utilisant lacronyme anglais ROS pour Reactive Oxygen Species

3

INTRODUCTION

Figure 8: Expression of plastidial TRXs in Arabidopsis tissues. RT-qPCR analyses were performed in leaves, flowers, young and mature siliques, seedlings, roots and seeds. Data were normalized to the housekeeping protein phosphatase 2A gene (PP2A) and represented using the level of the TRX f1 transcripts in leaves as reference. Means SD of triplicates experiments are shown. Reproduced from V. Massot thesis manuscript.

4

Quils soient procaryotes ou eucaryotes, autotrophes ou htrotrophes, les organismes

vivants sont soumis diffrentes contraintes environnementales et doivent sadapter. Au

niveau cellulaire, ladaptation du mtabolisme des stimuli environnementaux fait intervenir

des cascades de signalisation, dont les mieux connues sont les cascades de phosphorylation.

La signalisation redox est une autre voie de signalisation qui est base sur loxydorduction

de cystines structurales ou catalytiques de protines ou polypeptides. Les principales

protines impliques dans cette voie de signalisation sont les protines disulfures isomrases,

les thiordoxines, les glutardoxines et les glutathion-S-transfrases. Parmi ces protines, les

thiordoxines sont les plus anciennement dcouvertes et les mieux caractrises.

Les thiordoxines (TRX)

La premire thiordoxine (TRX) a initialement t identifie chez la bactrie

Escherichia coli comme tant l'enzyme responsable de la rduction de la ribonuclide

rductase (Laurent et al., 1964). Depuis, la prsence de ces protines a t mise en vidence

chez tous les organismes vivants libres (Holmgren, 1989).

Les thiordoxines (TRX) sont de petites protines d'environ 12 kDa qui possdent une

activit d'oxydorductase de pont disulfure sur leurs protines cibles (Cf. figure 1). Le site

actif des TRX est compos de cinq rsidus formant la squence WCG/PPC. Cette squence a

t conserve au cours de l'volution pour toutes les isoformes de TRX. Elle est considre

comme la signature des TRX. Les TRX sont capables de rduire, par une raction

squentielle, les ponts disulfure de leurs protines dites cibles . L'activit d'oxydorductase

de ces protines est lie aux deux rsidus cystine vicinaux prsents dans la squence de leur

site actif. La premire cystine de ce site actif est responsable de lattaque nuclophile

primaire du pont disulfure de la cible. Un pont disulfure intermolculaire transitoire est form

entre la TRX et sa cible. Le complexe est ensuite dissoci grce lattaque du disulfure mixte

par la deuxime cystine du site actif. Suite cette raction la cible est rduite et la TRX est

oxyde (Cf. figure 2). Deux fonctions lies lactivit oxydorductase de ces protines ont t

mises en vidence. La premire consiste servir de substrat de rduction pour des

peroxydases thiols. Lautre fonction des TRX est de rguler lactivit enzymatique de leurs

cibles.

Figure 3: Phylogenic tree of Arabidopsis thaliana Trx members. Red dashes show different sub cellular compartments.

Figure 4: The NADP dependent thioredoxin system (NTS). The reduction of thioredoxin disulfide is achieved by the NADP thioredoxin reductase (NTR) that uses NADPH as electron donor.

Trx f

Trx m

Trx x

Trx h

Trx y

AtTRXm3

AtTRXm4

AtTRXm1

AtTRXm2

AtTRXx

AtTRXy2AtTRXy1

AtTRXf1

AtTRXf2

AtTRXh1AtTRXh4

AtTRXh3

AtTRXh5AtTRXh2

AtTRXh7

AtTRXh8

AtTRXh9

Trx oAtTRXo1

AtTRXo2

MitochondriaCytosol

AtTRXz

Plastids

Trx f

Trx m

Trx x

Trx h

Trx y

AtTRXm3

AtTRXm4

AtTRXm1

AtTRXm2

AtTRXx

AtTRXy2AtTRXy1

AtTRXf1

AtTRXf2

AtTRXh1AtTRXh4

AtTRXh3

AtTRXh5AtTRXh2

AtTRXh7

AtTRXh8

AtTRXh9

Trx oAtTRXo1

AtTRXo2

MitochondriaCytosol

AtTRXz

Plastids

5

Chez les organismes photosynthtiques, les TRX ont t initialement identifies

comme des activateurs la lumire denzymes du cycle de Calvin (Buchanan et Wolosiuk,

1976 ; Homlgren et al., 1976).

Le squenage complet du gnome d'Arabidopsis thaliana, a permis de mettre en

vidence de nombreuses isoformes de TRX vgtales, ce qui nest pas le cas chez les

mammifres o deux isoformes seulement sont prsentes. Chez les vgtaux, les TRX sont

codes par le gnome nuclaire et peuvent tre regroupes en 7 types selon leur homologie de

squence et la structure des gnes qui les codent (Cf. figure 3). Deux isoformes sont localises

dans les mitochondries (TRX du type o), 8 dans le cytosol (TRX du type h) et 10 dans les

plastes (TRX du type m : 4 isoformes, du type f : 2 isoformes, du type y : 2 isoformes du type

x : 1 isoforme, du type z : 1 isoforme). La prsence dune multitude disoformes de TRX chez

les vgtaux suprieurs soulve la question dune spcialisation ou dune redondance

fonctionnelle pour cette famille de protines pour ce taxon. En plus de leur activit

doxydorductase, les TRX possdent galement une activit chaperon (Kern et al., 2003). Ce

type dactivit a souvent t relat pour des protines de type disulfure isomrase (PDI) qui

sont des protines proches des TRX (Quan et al., 1995). Une activit chaperon a galement

t mise en vidence pour les TRX plastidiales du type f et m (Ruth Sanz-Barrio et al., 2011).

Systme de rduction des TRX

Le premier systme de rduction a avoir t dcouvert est le systme

NADPH/Thiordoxine (NTS). Il s'agit du systme de rduction des TRX des procaryotes, des

eucaryotes non photosynthtiques et du cytoplasme (cytosol et mitochondries) des cellules

vgtales (Cf. figure 4). Au sein de ce systme de rduction, une enzyme, la NADPH-

thiordoxine-rductase (NTR), peut transfrer le pouvoir rducteur du NADPH aux TRX. La

NTR est une flavoprotine homodimrique dont chaque sous-unit a un domaine FAD, un

domaine de liaison au NADPH et un domaine portant un pont disulfure redox actif. Trois

types de NTR ont t distingus ce jour.

Le systme NADP Thiordoxine rductase

Le premier type est une NTR dite de faible poids molculaire avec une masse de

35kDa. Ce type de NTR est prsent chez les procaryotes, les archaebactries et les eucaryotes

infrieurs. Lorsque le NADPH interagit avec son site de fixation, ce dernier effectue un

Figure 5: The ferredoxin thioredoxin system (Fd/Trx). Continuous electron flow provided by photosystem I allows the reduction of ferredoxin. Once reduced, ferredoxin can transfer electrons to ferredoxin thioredoxin reductase that in a final step allows the reduction of thioredoxin.

Target enzymesTarget enzymes

6

mouvement pour le rapprocher du domaine FAD et permettre la rduction de ce cofacteur.

Ce mouvement a galement pour consquence dexposer une boucle portant le site redox actif

permettant ainsi la fixation et la rduction de la TRX (Lennon et al., 2000).

Le deuxime type de NTR possde une masse molculaire denviron 55 kDa par sous-unit et

est prsent dans le cytosol et les mitochondries des eucaryotes suprieurs. En plus des trois

domaines dcrits ci-dessus, ce type de NTR possde un autre site redox actif contenant 2

cystines (lune pouvant tre une slnocystine) vicinales. Ce deuxime site redox actif

reoit les lectrons du premier, puis est extrioris pour permettre la rduction de la TRX

(Williams et al., 2000).

Enfin, il a t identifi plus rcemment, un troisime type de NTR spcifique des

chloroplastes de plantes suprieures, nomm NTRC. Cette NTR atypique correspond une

protine avec un domaine NTR de haut poids molculaire fusionn une TRX (Serrato et al.,

2002). Cette protine correspond donc une TRX avec un systme de rduction de type NTR

intgr. Il a t montr que la NTRC tait un systme de rduction efficace pour la

peroxyrdoxine 2 cystines plastidiale (2Cys-PRX) et que celle-ci tait implique dans les

mcanismes de rponse au stress oxydatif (Perez-Ruiz et al., 2006 ; Moon et al., 2006 ;

Spinola et al., 2008 ; Stenbaek et al., 2008).

Chez les organismes photosynthtiques, un autre systme de rduction des TRX est

prsent. Il sagit du systme ferrdoxine thiordoxine (Fd/TRX). Ce systme est prsent chez

les cyanobactries et les chloroplastes des vgtaux. Il utilise comme source de pouvoir

rducteur les lectrons de la chane de transfert photosynthtique (Cf. figure 5). Le pouvoir

rducteur de cette chaine de transfert est transmis du photosystme I (PSI) la ferrdoxine.

Cette dernire transmet le pouvoir rducteur aux TRX grce la ferrdoxine TRX rductase

(FTR).

Le systme ferrdoxine thiordoxine des organismes photosynthtiques

La ferrdoxine (Fd)

La ferrdoxine des vgtaux suprieurs est une petite protine stromatique centre fer-

soufre 2Fe-2S. Ce centre fer-soufre est li la protine par lintermdiaire de 4 cystines trs

conserves chez toutes les espces de ce phylum. Cette protine accepte les lectrons du PSI

pour rduire ensuite un grand nombre de protines dont la ferrdoxine NADP rductase

(FNR), la nitrite rductase, la glutamate synthase ferrdoxine dpendante, la sulfite rductase,

et bien sr la FTR. Cette protine est considre comme un carrefour de redistribution des

7

lectrons partir du PSI. Chez la plante modle Arabidopsis thaliana, il existe 4 isoformes de

Fd. Les Fd 1 et 2 sont exprimes dans les feuilles tandis que les Fd 3 et 4 sont exprimes dans

les organes non photosynthtiques comme les racines.

La ferrdoxine thiordoxine rductase (FTR)

La ferrdoxine thiordoxine rductase, (FTR) est un htrodimre en forme de disque

compos dune sous-unit catalytique (sous-unit B), de 12-13 kDa (Chow et al., 1995) et

dune sous-unit rgulatrice (sous-unit A) de taille variable entre les espces (8-13 kDa)

(Iwadate et al., 1994). La sous-unit A est peu conserve, elle est indispensable pour la

stabilit de la sous-unit catalytique et la bonne interaction avec la ferrdoxine (Gaymard et al

2000 ; Hishiya et al., 2008). La sous-unit catalytique porte un centre fer-soufre 4Fe 4S et un

pont disulfure. Le centre fer-soufre est li par 4 cystines et localis sur une des faces du

disque tandis que le pont disulfure permettant la rduction des TRX est localis sur lautre

face (Glauser et al., 2004 ; Dai et al., 2007). Cette conformation confre la FTR la capacit

de recevoir les lectrons de la ferrdoxine et de les transfrer immdiatement aux TRX.

Importance du systme ferrdoxine thiordoxine pour la coordination lumineuse des mtabolismes chez les organismes photosynthtiques

Le systme Fd /TRX assure dans les chloroplastes la lumire une rduction efficace

des TRX. Cette rduction lumino-dpendante permet la rgulation de lactivit des

mtabolismes photosynthtiques en fonction de lintensit lumineuse via lactivation par

rduction denzymes redox rgules comme certaines enzymes du cycle de Calvin (Buchanan

et Wolosiuk, 1976 ; Holmgren et al., 1976).

Ce systme permet galement dassurer la transition mtabolique jour/nuit des plastes

photosynthtiques. En effet, contrairement aux enzymes du cycle de Calvin, la rduction

lumineuse des TRX conduit linactivation de la premire tape du cycle de pentoses

phosphate (Scheibe et Anderson, 1981) vitant ainsi le fonctionnement concomitant dune

voie de synthse (Cycle de Calvin) et de dgradation de squelettes carbons (Cycle oxydatif

des pentoses phosphate).

Initialement, le systme de rduction Fd/TRX tait considr comme uniquement

prsent dans les chloroplastes car dpendant de la fourniture en pouvoir rducteur du PSI.

Rduction des thiordoxines dans les plastes non photosynthtiques

Figure 6: Reduction of plastidial thioredoxins under non-photosynthetic condition. Sucrose from starch degradation or import from leaves by sink tissues is broken down to glucose-6-phosphate, generating NADPH via glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and 6 phosphogluconate dehydrogenase. The NADPH is used to reduce Trx via ferredoxin:NADP reductase (FNR), ferredoxin (Fd), and FTR, similar to the mechanism identified in cyanobacterial heterocysts. Once reduced, Trx activates target enzymes as in chloroplasts. Reproduced from Balmer et al., 2006.

8

Plus rcemment, des tudes protomiques ont mis en vidence la prsence disoformes de

FNR, de ferrdoxine et de FTR dans des amyloplastes dalbumen de bl permettant ainsi de

proposer un systme de rduction des TRX de type Fd/TRX dans des plastes non

photosynthtiques. Au sein de ce systme, la ferrdoxine est rduite dune faon alternative

la rduction par la lumire grce la production mtabolique de NADPH. Laugmentation du

ratio NADPH/NADP+ lie lactivit enzymatique de deux dshydrognases du cycle des

pentoses phosphate (la glucose 6-phosphate dshydrognase et la phosphogluconate

dshydrognase) permettrait la rduction de la ferrdoxine via la FNR. Une fois rduite, la

ferrdoxine permettrait le fonctionnement du systme Fd/FTR comme dans les chloroplastes,

aboutissant la rduction des TRX (Cf. figure 6).

Dans les chloroplastes lobscurit, loxydation des enzymes redox rgules du

mtabolisme photosynthtique conduit linhibition de leur activit (Schrmann et Buchanan,

2008). Cependant, les mcanismes par lesquels ces enzymes soxydent sont mal connus.

Systme doxydation des TRX

Des tudes ont montr que, mme en condition anarobie, le maintien de ltat rduit de

la ferrdoxine est critique pour conserver lactivit de la FBPase (Leegood et Walker, 1980).

Lajout doxydant ou lexposition du systme Fd/TRX loxygne ambiant conduit

galement une diminution de lactivit redox dpendante de cette cible (Schrmann et

Buchanan, 2008). Ces rsultats suggrent que le maintien constant ltat rduit de

lensemble des composants du systme Fd/TRX est essentiel pour conserver lactivit redox

dpendante des enzymes du cycle de Calvin. Lorsque la pression de rduction exerce par

le PSI sur les composants du systme Fd/TRX sarrte, les constituants du systme deviennent

particulirement sensibles loxydation. La sensibilit leve des enzymes centre fer-soufre

vis--vis des formes actives de loxygne a souvent t constate. Loxydation rapide du

centre fer-soufre de la ferrdoxine pourrait conduire un fonctionnement invers du systme

Fd/TRX, conduisant ainsi loxydation des TRX et de leurs cibles.

Par ailleurs, il est notoirement connu, daprs la littrature, que dans un tampon pH

physiologique et en labsence de rducteur chimique (par exemple le DTT), les prparations

de TRX recombinantes se trouvent dans un tat majoritairement oxyd. Cette constatation

suggre une oxydation spontane du site catalytique par loxygne dissous.

Figure 7: Schematic representation of hypothesis by which thioredoxin becomes oxidized. (1) When the PSI electron flow is stopped, the iron sulphur cluster enzymes become highly susceptible to ROS oxidation allowing the reversion of the electron flow within the Fd/Trx system. (2) ROS directly trigger Trx and/or target reactive cysteines and allow the formation of the intra molecular disulfide bond. (3) Reduced thioredoxins are oxidized by thiol specific peroxidases for ROS and peculiarly H2O2 scavenging. Numbers following the electron refer to the corresponding scenario. Question marks remind that the direct action of ROS on iron sulphur cluster enzymes and on targets or Trx exposed cysteines remain uncertain in vivo.

ROS

Fd FTR Trx

e - (1)

Oxidative regulation of

targets enzymes

PSI reductive pressure

e - (1;2;3) ROS

ROS H 2 O 2

H 2 O Thiols specific

peroxidase

(1)

(2)

(3)

e - (3) ?

?

?

?

ROS

Fd FTR Trx

e - (1)

Oxidative regulation of

target enzymes

PSI reductive pressure

e - (1;2;3) ROS

ROS H 2 O 2

H 2 O Thiol specific

peroxidase

(1)

(2)

(3)

e - (3) ?

?

?

?

9

Cependant, aucune donne prcise concernant une oxydation directe du site actif des TRX en

pont disulfure par les formes actives de loxygne nest disponible dans la littrature. Une

oxydation directe par les formes actives de loxygne de thiols ractifs et exposs la surface

a t rapporte pour de nombreuses protines cependant lorsque cette raction non catalyse

est possible, elle semble de faible efficacit compare la ractivit de thiol-peroxydases

avec le peroxyde hydrogne (Floh, 2010).

Ainsi in vivo, lhypothse la plus probable serait celle dun mcanisme li lactivit

de peroxydases chloroplastiques utilisant les TRX comme substrat de rduction. Ce

mcanisme permettrait de catalyser rapidement loxydation du site actif des TRX plastidiales,

et contribuerait au rajustement du mtabolisme redox rgul dans les plastes. Un schma

reprenant les diffrentes hypothses est propos en figure 7.

Les thiordoxines et leurs homologues structuraux des plastes dArabidopsis thaliana

Chez A. thaliana il existe deux isoformes de TRX f : f1 et f2. Ces thiordoxines ont

t les premires isoles chez les vgtaux avec les thiordoxines de type m. Elles possdent

dans leur partie C-terminale une troisime cystine (Cys 60). Il a t montr que la

glutathionylation (pont disulfure mixte entre une molcule de glutathion et une protine) de

cette troisime cystine, rduisait la capacit de ces isoformes tre rduites in vitro par leur

rductase en amont (Michelet et al., 2005 ; 2006). Ces thiordoxines de type f sont connues

pour rguler lactivit de certaines enzymes du cycle de Calvin, avec une spcificit stricte

pour certaines dentre elles (voir plus loin). Le pont disulfure du site actif de ce type de

thiordoxines du type f est denviron -351 mV pH 7,9 (Hirasawa et al., 1999).

TRX du type f

Chez A. thaliana, il existe quatre isoformes de TRX du type m (Meyer et al., 2005).

Elles ont une origine procaryote la diffrence des thiordoxines de type f. Ces thiordoxines

sont souvent considres comme thiordoxines de type bactrien cause de leur forte

homologie avec la thiordoxine dE. coli, ainsi que par leur possibilit de substituer cette

dernire dans des tests in vitro. Des analyses protomiques ont montr que ces isoformes

taient associes la surface des thylacodes au contact du stroma (Pelletier et Lucy, 2002 ;

Friso et al., 2004). Parmi ce type de TRX, lisoforme m3 se distingue des autres TRX m. Elle

TRX du type m

10

possde une cystine additionnelle dans sa rgion N-terminale et beaucoup de charges

positives proximit de son site actif (Collin et al., 2003). Aucune cible pour cette isoforme

na t mise en vidence avant le dbut de ma thse. Le potentiel redox du pont disulfure du

site actif pour les thiordoxines du type m est compris entre -368 et -357 mV pH 7,9 (Collin

et al., 2003).

Le type y a t plus rcemment identifi grce au squenage complet du gnome

dArabidopsis. Chez cette espce, il existe deux isoformes pour ce type de thiordoxines,

nommes y1 et y2. Ces thiordoxines semblent tre plus impliques dans la rponse au stress

oxydant que dans la rgulation de voies mtaboliques, contrairement au type m et f. Le

potentiel redox du pont disulfure du site actif pour ces thiordoxines, denviron -330 mV pH

7,9, est moins ngatif que celui des thiordoxines du type m et f (Collin et al., 2004).

Lisoforme y1 possde dans sa partie C-terminale une cystine additionnelle conserve,

comme la thiordoxine f. Par homologie avec lisoforme f1, cette cystine additionnelle est

suppose tre soumise des modifications post-traductionnelles de type glutathionylation.

TRX du type y

Le gnome dA. thaliana code pour une seule isoforme de thiordoxine de type x dont

les transcrits sont accumuls dans les organes verts (Mestres-Ortega et Meyer, 1999). Comme

pour le type y, cette thiordoxine est un rgulateur peu efficace denzymes du mtabolisme

carbon et semble plus implique dans la lutte contre les stress oxydants. A pH 7,9, le

potentiel redox du pont disulfure de son site actif est de -336 mV (Collin et al., 2003).

TRX du type x

Trs rcemment, un nouveau type de thiordoxine adress aux plastes, nomm type z,

a t identifi. Peu de choses sont connues sur les fonctions de ce nouveau type de

thiordoxine. Cependant, il semble que cette thiordoxine soit implique dans la rponse aux

attaques pathognes (Rivas et al., 2004) et dans la rgulation dune polymrase plastidiale, la

Plastid Encoded mRNA Polymerase (Arsova et al., 2010). A pH 7,9 le pont disulfure de cette

isoforme est de -310 mV (Chibani et al., 2011).

TRX du type z

Figure 8: Expression of plastidial TRXs in Arabidopsis tissues. RT-qPCR analyses were performed in leaves, flowers, young and mature siliques, seedlings, roots and seeds. Data were normalized to the housekeeping protein phosphatase 2A gene (PP2A) and represented using the level of the TRX f1 transcripts in leaves as reference. Means SD of triplicates experiments are shown. Reproduced from V. Massot thesis manuscript.

11

Les glutardoxines sont des homologues structuraux des thiordoxines identifies

initialement en tant que donneurs alternatifs dlectrons la ribonuclotide rductase dE. coli

(Holmgren, 1976). Chez Arabidopsis, il existe 31 isoformes de GRX, (rparties en 3 types :

CPYC ; CC et CGFS) dont 4 seraient potentiellement adresses aux plastes. Leur potentiel

redox est moins ngatif que celui des thiordoxines et est gnralement compris entre -250 et

-280 mV pH 7,9. Ces protines sont impliques dans la rduction de ponts disulfures ou

dans la dglutathionylation de leurs protines cibles. Chez les vgtaux, le type CC est connu

pour protger les cellules de dgt oxydatif (Hirschi et al., 2006) tandis que le type CGFS et

impliqu entre autre dans le transfert du centre fer souffre lapoferrdoxine (Bandyopadhyay

et al 2008) et le devellopement floral (Li et al., 2009)

Les glutardoxines (GRX)

Les informations disponibles dans les bases de donnes de puces ADN, ainsi que de

nombreuses autres tudes transcriptomiques, montrent que les TRX plastidiales sont

exprimes de manires diffrentes selon les tissus. Lexpression spcifique des diffrentes

TRX plastidiales a t tudie en dtail au laboratoire (Thse V. Massot). Les rsultats (Cf.

figure 8) montrent que la prsence de transcrits pour 9 isoformes plastidiales est dtecte dans

tous les organes de la plante. Globalement, les gnes codant les TRX du type m (

lexception de m3) et x sont les plus abondamment exprims dans les feuilles et les jeunes

plantules. En accord avec une prcdente tude (Mestres-Ortega et Meyer, 1999), lARN de la

thiordoxine m3 est faiblement exprim dans tous les organes, lexception des boutons

floraux. Ces rsultats prcisent galement la trs forte expression de lisoforme y1 par rapport

aux autres TRX plastidiales dans les graines (Collin et al., 2004).

Expression de thiordoxines plastidiales dArabidopsis thaliana

Parmi les nombreuses cibles des thiordoxines plastidiales mises en vidence au cours

des dcennies passes, plusieurs sont impliques dans le mtabolisme photosynthtique. Cest

dailleurs dans la fonction de rgulateur denzyme du cycle de Calvin que les TRX

plastidiales ont t la premire fois identifies (Buchanan et Wolosiuk, 1976 ; Homlgren et

al., 1977). Aujourd'hui, grce aux avances en gnomique et en protomique, plus de 300

nouvelles cibles potentielles de TRX ont t identifies (Buchanan et Balmer, 2005 ; Hisabori

et al., 2005 ; Michelet et al., 2006). La dcouverte de ces 300 cibles potentielles indique que

Les cibles des thiordoxines

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les TRX jouent un rle gnralis dans la rgulation du mtabolisme des organismes

vgtaux. Pour les TRX chloroplastiques, plus de 100 cibles potentielles ont t identifies

ce jour (Lemaire et al., 2007 ; Marchand et al., 2010).

Les premires cibles de TRX plastidiales ont t dcouvertes par des approches

biochimiques, il sagit de la fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) et de la glycraldhyde-3-

phosphate dshydrognase (GAPDH). Par la suite, des approches protomiques utilisant le

principe des colonnes daffinit de thiordoxines monocystiniques ont permis didentifier

dautres cibles, impliques dans le mtabolisme carbon photosynthtique, telles que la

sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (SBPase), la phosphoribulokinase (PRK) ou la rubisco

activase. Ces cibles de TRX sont actives la lumire par rduction via lactivation du

systme Fd/TRX.

Les cibles de TRX plastidiales impliques dans le mtabolisme photosynthtique

En plus de nombreuses enzymes du cycle de Calvin, dautres cibles des TRX ont t

identifies comme la sous-unit CF1 du complexe ATPase chloroplastique, la malate

dshydrognase (MDH) NADP qui permet lexport de pouvoir rducteur partir du

chloroplaste vers le cytosol sous forme de malate, ainsi que des protines impliques dans le

transfert photosynthtique dlectrons comme la sous-unit de lantenne collectrice LHCIIb

(Lemaire at al., 2007).

En plus des cibles de TRX impliques dans le mtabolisme photosynthtique, les

approches biochimiques et protomiques ont rvl des cibles plastidiales valides ou

putatives impliques dans des fonctions biologiques varies du mtabolisme primaire et

secondaire dont entre autres, le mtabolisme de lamidon, la biosynthse des lipides, et les

systmes antioxydants, notamment des peroxydases thiols. La fonc