genome-wide association study of root anatomical traits in rice...

กลมศนยวจยขาวภาคตะวนออกเฉยงเหนอ 23

การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนมของลกษณะทางกายวภาคของรากขาวGenome-wide Association Study of Root Anatomical Traits in Rice (Oryza sativa L.) พณณชตา เวชสาร1) Meredith Hanlon2) Susan McCouch4) Jonathan Lynch3) Kathleen Brown3)

Phanchita Vejchasarn1) Meredith Hanlon2) Susan McCouch4) Jonathan Lynch3) Kathleen Brown3)

Abstract Root anatomical traits, which include cortical area, aerenchyma area, and xylem

features, influence the absorption and translocation of water and nutrients, oxygen transport and the mechanical strength of the root system. While a number of studies have shown promising functional benefits of anatomical root traits in conferring resource acquisition efficiency, very little is known about the genetic mechanisms underlying natural phenotypic variation of these traits. In this study, we evaluated 336 Oryza sativa accessions selected from the rice diversity panel for 4 root anatomical traits including, root cross-section area, aerenchyma, and xylem features in well-controlled greenhouse environment. Considerable phenotypic variation was observed in all root traits measured among accessions and sub-populations. Broad-sense heritability estimates were relatively high for all traits, suggesting that these traits are under strong genetic control. Genome wide association (GWA) analysis was performed using a set of 44,100 single nucleotide polymorphisms (SNPs) to identify significant loci controlling root anatomical traits. A total of 13 loci significantly associated with anatomical root traits were identified. These identified loci for anatomical root traits may be useful for improving resource acquisition efficiency of rice by marker assisted selection (MAS).

Keywords: rice, root anatomical traits, genome-wide association study

บทคดยอ ลกษณะทางกายวภาคของราก ไดแก พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA)

พนทแอเรงคมา (Aerenchyma Area, AA) จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV)

1) ศนยวจยขาวอบลราชธาน ต ปณ.65 อ.เมอง จ.อบลราชธาน 34000 โทรศพท 0-4534-4104 Ubon Ratchathani Rice Research Center, P.O.BOX 65, Mueang, Ubon Ratchathani 34000 Tel. 0-4534-4104

2) Plant Biology, Pennsylvania State University, University Park, USA. 3) Plant Science, Pennsylvania State University, University Park, USA 4) Plant Breeding and Genetics, Cornell University, Ithaca, USA.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent

เอกสารประกอบการประชมวชาการ ขาวและธญพชเมองหนาว ประจำาป 255824

และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) พบวามความสมพนธโดยตรงกบ ความสามารถในการลาเลยงนาและธาตอาหาร การสงผานออกซเจน และความแขงแรงของราก เมอไมนานมาน มการรายงานผลการวจยเกยวกบความหลากหลายทางพนธกรรมและความสาคญของลกษณะทางกายวภาคของรากขาวในการเพมประสทธภาพการลาเลยงนาและธาตอาหาร อยางไรกตามงานวจยทเกยวของและรายงานการคนพบยนหรอกลไกทางพนธกรรมทควบคมลกษณะเหลานยงมอยนอยมาก งานวจยนไดประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาวทสาคญ 4 ลกษณะ ไดแก พนทตดขวางของราก พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนา โดยใชกลมประชากรขาว ทเปนตวแทนความหลากหลายทางพนธกรรมของขาวปลก (Oryza sativa L.) จานวนทงสน 336 พนธ ผลการทดลองแสดงใหเหนวาขาวปลก มความหลากหลายทางพนธกรรมของลกษณะทางกายวภาคของรากสง คาอตราพนธกรรมอยางกวาง (Broad-sense Heritability, hB

2) อยในเกณฑสง โดยมคาอยระหวางรอยละ 70-90 แสดงใหเหนวาลกษณะเหลานไดรบอทธพลจากยนโดยตรง การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนมโดยใชฐานขอมลสนป จานวน 44,100 ตาแหนง พบวาสนปจานวนทงสน 13 ตาแหนง มความสมพนธกบความผนแปรของลกษณะทางกายวภาคของรากขาว ความสาเรจของงานวจยนจะนาไปสการพฒนาชดเครองหมายดเอนเอเพอใชเปนเครองมอชวยในการคดเลอกพนธ (Marker-assisted Selection, MAS) ตอไป

คาสาคญ: ขาว ลกษณะทางกายวภาค การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม

คานา รากเปนอวยวะหลกและมบทบาทสาคญตอการเจรญเตบโตของพช เพราะทาหนาทในการดดซม

นาและแรธาตทอยในดนเพอนาไปใชเปนวตถดบในการสงเคราะหแสงของพชซงชวยใหพชมการเจรญเตบโตและพฒนาไดเปนปกต นอกเหนอจากนรากยงทาหนาทยดเกาะดนเพอชวยพยงคาจนลาตน สะสมอาหาร และขยายพนธไดในพชบางชนด และเปนแหลงสาคญในการผลตฮอรโมนพชหลายชนด เชน ไซโทไคนนและจบเบอเรลลน ซงจะถกลาเลยงไปใชเพอการเจรญพฒนาสวนของลาตน สวนยอด และสวนอน ๆ ของพช อยางไรกตาม การศกษาวจยระบบรากและองคความรเรองรากนนยงมอยนอยมากเมอเปรยบเทยบกบการศกษาลกษณะอน ๆ ในพช ทงนเนองจากรากเปนสวนของพชทยากตอการศกษาเพราะเปนสวนทอยใตดนทาใหการศกษาระบบรากนนมความซบซอน และเปนงานทตองใชแรงงานเพอขดแยกรากและลางทาความสะอาดกอนทจะนามาทาการวเคราะห นอกจากนการศกษาลกษณะบางอยางของรากทไมสามารถมองเหนดวยตาเปลา เชน การศกษาลกษณะทางกายวภาค ตองอาศยการใชเครองมอพเศษตาง ๆ เขามาเกยวของ อกทงยงใชเวลานานกวาจะไดขอมลมาวเคราะห ลกษณะรากบางลกษณะมคาอตราพนธกรรมตา (heritability) กลาวคอเปนลกษณะทผนแปรตามอทธพลของสภาพแวดลอมในดน ดวยเหตน

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


จงทาใหการพฒนาองคความรของระบบรากและการนามาใชประโยชนเพอการปรบปรงพนธ มอยอยางจากด

ขาวจดเปนธญพชชนดหนง ทมความหลากหลาย (genetic diversity) และแปรผน (genetic variation) ทางพนธกรรมสง ความหลากหลายทางพนธกรรมบงชวาลกษณะทแตกตางเหลานสงผลใหขาวตางพนธหรอชนดยอย (subspecies) มความสามารถในการเจรญเตบโตและปรบตวภายใตอทธพลของสภาวะแวดลอมไดแตกตางกนไป ดวยเหตนจงมแนวความคดทจะนาเอานาความรเบองตนเหลานมาใชในการกาหนดและคดเลอกลกษณะ เพอใชในการพฒนาและปรบปรงขาวพนธ ใหมใหสอดคลองกบสภาพแวดลอมไดอยางมประสทธภาพ ในชวงทศวรรษทผานมา ผลของการศกษาวจยความหลากหลายทางพนธกรรม ของระบบรากในขาวพบวา มความแตกตางทงในดานของลกษณะทางกายวภาคและสณฐาน (Courtois et al., 2013; Uga et al., 2009; Uga et al., 2008; Lafitte et al., 2001; Kondo et al., 2000) ลกษณะทางกายวภาคของรากทสาคญ ไดแก พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA) พนทแอเรงคมา (Aerenchyma Area, AA) จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV) และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) (Fig. 1) เปนตน ซงลกษณะทางกายวภาคดงกลาว สมพนธโดยตรงกบความแขงแรงของราก ความสามารถในการชอนไช ประสทธภาพในการลาเลยงนาและธาตอาหารเพอนาไปเลยงสวนตาง ๆ ของพช นอกจากน การพฒนาเนอเยอแอเรงคมาหรอชองอากาศในชนคอรเทกซของราก ชวยใหการหมนเวยนและเคลอนทของออกซเจนสะดวกยงขน เมอตองเผชญกบสภาวะกงขาดออกซเจน (hypoxia) หรอขาดออกซเจน (anoxia) เชน ในภาวะนาทวมขง อยางไรกตามงานวจยทเกยวของ และรายงานการคนพบยนหรอกลไกทางพนธกรรมทควบคมลกษณะเหลานยงมอยนอยมาก และขอมลยงไมเพยงพอทจะนาไปใชในงานปรบปรงพนธขาว

ปจจบนความกาวหนาและวทยาการทางดานจโนมกส (genomics) และอณพนธศาสตร (molecular genetics) ถกนามาใชเพอจาแนกความหลากหลายและแปรผนทางพนธกรรมของขาว จากความแตกตางของลาดบนวคลโอไทดเพยงตาแหนงเดยว หรอทเรยกวา “สนป” (Single Nucleotide Polymorphism, SNP) กลมประชากรขาวซงประกอบไปดวย ขาวพนธดเดนและพนธพนเมอง ทรวบรวมมาจาก 82 ประเทศทวโลก จานวน 413 พนธ ถกนามาถอดรหสหรอจโนไทปและสรางเปนฐานขอมลความแปรผนของลาดบนวคลโอไทดทวทงจโนมเปนจานวนทงสน 44,100 ตาแหนง โดยระยะหางเฉลยของแตละ SNP บนจโนม ประมาณ 10 Kb ฐานขอมลนยงถกนามาใชในการศกษาโครงสรางประชากร ของขาวชนด Oryza sativa L. เพอใชเปนเกณฑในการจดจาแนกขาวได 5 กลมประชากรยอย (sub-population) ไดแก aromatic, tropical japonica, temperate japonica, aus และ indica โดยท aromatic, tropical japonica, temperate japonica จดเปนขาวกลม japonica สวน aus และ indica จดเปนขาวกลม Indica (Zhao et al., 2011) เนองจากฐานขอมลชดนเปนฐานขอมลสาธารณะ อนเปนประโยชนอยางมหาศาลในการศกษาววฒนาการ ความหลายทางพนธกรรม และสบคนหายนอยางเปนระบบจากความสมพนธ

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


ระหวางลกษณะทสนใจกบขอมลจโนม โดยใชวธทมชอวา “Genome-wide Association Study (GWAS)” หรอ การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม ขอไดเปรยบของ GWAS คอ มความละเอยดและแมนยาสง (high resolution map) อกทงชวยรนระยะเวลาและเพมโอกาสในการคนหาและระบตาแหนงยนเปาหมาย เมอเปรยบเทยบกบการสรางแผนทพนธกรรมแบบดงเดม (traditional linkage mapping) งานวจยนจงมวตถประสงคเพอประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาว และจดทาแผนทพนธกรรมความเชอมโยงในจโนมเพอคนหาตาแหนงสนปหรอยนทคาดวาเกยวของกบลกษณะดงกลาว ความสาเรจของงานวจยนจะนาไปสการพฒนาชดเครองหมายดเอนเอเพอใชในการคดเลอกพนธในระดบจโนม (Genomic Selection, GS) และเปนแนวทางในการปรบปรงพนธขาวไดอยางมประสทธภาพตอไป

อปกรณและวธการ พนธขาว

กลมประชากรขาวทใชในการทดลองนประกอบดวย ขาวพนธพนเมอง (landrace cultivars) และขาวพนธดเดน (elite cultivars) จานวน 336 พนธ ประกอบดวย aromatic 11 พนธ tropical japonica 80 พนธ temperate japonica 76 พนธ aus 52 พนธ indica 67 พนธ และ admixed 50 พนธ ซงถกคดเลอกมาจาก 82 ประเทศทวโลก โดยครอบคลมทกนเวศการปลกขาว กลมประชากรนจดวาเปนตวแทนความหลากหลายทางพนธกรรมของขาว Oryza sativa L. วธปลก

ดาเนนการทดลองในสภาพเรอนทดลอง ณ Pennsylvania State University ประเทศสหรฐอเมรกา (40º48’ N, -77º51’ W) วางแผนการทดลองแบบ Randomized Complete Block (RCB) จานวน 3 ซา ปลกขาวในกระถางขนาดบรรจ 10.5 ลตร ( เสนผาศนยกลาง 21 เซนตเมตร สง 40.6 เซนตเมตร) วสดปลกประกอบดวยทรายและเวอรมคไลท ในอตราสวน 4:1 ใหสารละลายธาตอาหารสตร Yoshida (Yoshida et al., 1976) ดวยระบบนาหยดวนละ 1 ครง เกบตวอยางรากเมอขาวมอายครบ 8 สปดาห การประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาว

ประเมนลกษณะทางกายวภาคทสาคญ ไดแก พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA) พนทแอเรงคมา (Aerenchyma Area, AA) จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV) และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) รากทนามาใชวเคราะหลกษณะทางกายวภาคเปนรากถาวร (nodal roots) โดยการศกษาลกษณะทางกายวภาคจะศกษาทตาแหนง 5 เซนตเมตรโดยวดจากฐานราก ซงในตาแหนงนเปนตาแหนงททอลาเลยงนามการพฒนาอยางเตมท ตวอยางรากจะเกบไวในสารละลายเอทลแอลกอฮอลความเขมขน 70 เปอรเซนต อยางนอย 1 เดอน เพอทาใหรากคงสภาพและงายตอการศกษา รากจะถกนามาตดขวางดวยใบมดโกน (free-hand

sectioning) ใหมความบางทพอเหมาะ จากนนนามาบนทกภาพตดขวางภายใตกลองจลทรรศนทกาลงขยาย 40 เทา ภาพตดขวางของรากจะนามาวเคราะหดวยโปรแกรม RiceRootAnalyzer การวเคราะหขอมลทางสถต

การวเคราะหขอมลทางสถตของลกษณะกายวภาคของรากขาวโดยใชการทดสอบทางสถตชนด Analysis of Variance (ANOVA) โดยขอมลทมคา P-value นอยกวา 0.05 จงถอวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต และการเปรยบเทยบคาเฉลยตามวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) กาหนดนยสาคญทระดบ 95% โดยใชโปรแกรม Minitab (Minitab Inc, University Park, USA) การประเมนคาอตราพนธกรรม

คาอตราพนธกรรมอยางกวาง (broad-sense heritability, hB2) คอ อตราสวนระหวาง ความผน

แปรทางพนธกรรมทเกดจากการแสดงผลของยนทกรปแบบ กบความผนแปรของลกษณะทปรากฏ ซงคานวณไดจากสมการ

hB2 = σ2

G/ σ2P = σ2

G/ (σ2G + σ2

E)

โดยท σ2G (genotypic variance) คอ ความผนแปรทางพนธกรรม σ2

P (phenotypic variance) คอ ความผนแปรของลกษณะทปรากฏ และ σ2

E (environmental variance) คอ ความผนแปรทเกดสภาพแวดลอม การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม (Genome-wide Association Study, GWAS)

ฐานขอมลความแปรผนของลาดบนวคลโอไทด จานวน 44,100 SNPs ซงเปนฐานขอมลสาธารณะ ถกนามาใชในการวเคราะหหาความเชอมโยงในจโนม เพอคนหาตาแหนงยนทเกยวของกบความยาวและความหนาแนนของขนราก โดยเลอกวเคราะหแบบ Mixed Linear Model (MLM) (Yu et al., 2006; Zhao et al., 2007; Kang et al., 2008) ดวย Genomic Association and Prediction Integrated Tool (GAPIT) package บนโปรแกรม R (Lipka et al., 2012) เพอระบ SNP ทคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจอยางมนยสาคญ (significant SNP) โดยดจากคา Logarithm of Significant Level [-log10(P)] ไมนอยกวา 4 การสบคนหายนคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจ (candidate genes) จะสบคนจากตาแหนงของ significant SNP และพจารณารวมกบคา linkage disequilibrium decay (LD decay) ซง LD decay ในขาวมคาอยระหวาง ประมาณ 50,000 – 100,000 Kb การสบคนหายน การแสดงออกของยน และการเปรยบเทยบหนาทของยนกบพชตนแบบ Arabidopsis (orthologous genes) สามารถสบคนไดจากฐานขอมล GrameneBiomart (www.gramene.com)

ผลการทดลองและวจารณ ลกษณะทางกายวภาคของรากขาว

ผลการทดลองในขาวทง 336 พนธ พบวา พนทตดขวางของราก พนทคอรเทกซ พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนา เมอเปรยบเทยบระหวางพนธ (genotype) และกลม

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


sectioning) ใหมความบางทพอเหมาะ จากนนนามาบนทกภาพตดขวางภายใตกลองจลทรรศนทกาลงขยาย 40 เทา ภาพตดขวางของรากจะนามาวเคราะหดวยโปรแกรม RiceRootAnalyzer การวเคราะหขอมลทางสถต

การวเคราะหขอมลทางสถตของลกษณะกายวภาคของรากขาวโดยใชการทดสอบทางสถตชนด Analysis of Variance (ANOVA) โดยขอมลทมคา P-value นอยกวา 0.05 จงถอวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต และการเปรยบเทยบคาเฉลยตามวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) กาหนดนยสาคญทระดบ 95% โดยใชโปรแกรม Minitab (Minitab Inc, University Park, USA) การประเมนคาอตราพนธกรรม

คาอตราพนธกรรมอยางกวาง (broad-sense heritability, hB2) คอ อตราสวนระหวาง ความผน

แปรทางพนธกรรมทเกดจากการแสดงผลของยนทกรปแบบ กบความผนแปรของลกษณะทปรากฏ ซงคานวณไดจากสมการ

hB2 = σ2

G/ σ2P = σ2

G/ (σ2G + σ2

E)

โดยท σ2G (genotypic variance) คอ ความผนแปรทางพนธกรรม σ2

P (phenotypic variance) คอ ความผนแปรของลกษณะทปรากฏ และ σ2

E (environmental variance) คอ ความผนแปรทเกดสภาพแวดลอม การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม (Genome-wide Association Study, GWAS)

ฐานขอมลความแปรผนของลาดบนวคลโอไทด จานวน 44,100 SNPs ซงเปนฐานขอมลสาธารณะ ถกนามาใชในการวเคราะหหาความเชอมโยงในจโนม เพอคนหาตาแหนงยนทเกยวของกบความยาวและความหนาแนนของขนราก โดยเลอกวเคราะหแบบ Mixed Linear Model (MLM) (Yu et al., 2006; Zhao et al., 2007; Kang et al., 2008) ดวย Genomic Association and Prediction Integrated Tool (GAPIT) package บนโปรแกรม R (Lipka et al., 2012) เพอระบ SNP ทคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจอยางมนยสาคญ (significant SNP) โดยดจากคา Logarithm of Significant Level [-log10(P)] ไมนอยกวา 4 การสบคนหายนคาดวาสมพนธกบลกษณะทสนใจ (candidate genes) จะสบคนจากตาแหนงของ significant SNP และพจารณารวมกบคา linkage disequilibrium decay (LD decay) ซง LD decay ในขาวมคาอยระหวาง ประมาณ 50,000 – 100,000 Kb การสบคนหายน การแสดงออกของยน และการเปรยบเทยบหนาทของยนกบพชตนแบบ Arabidopsis (orthologous genes) สามารถสบคนไดจากฐานขอมล GrameneBiomart (www.gramene.com)

ผลการทดลองและวจารณ ลกษณะทางกายวภาคของรากขาว

ผลการทดลองในขาวทง 336 พนธ พบวา พนทตดขวางของราก พนทคอรเทกซ พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนา เมอเปรยบเทยบระหวางพนธ (genotype) และกลม

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


ประชากรยอย (sub-population) มความแตกตางทางสถตอยางมนยสาคญยง (P-value < 0.001) แตไมพบความแตกตางระหวางจานวนซา (replication) (Table 1, Fig. 2) ตารางท 2 (Table 2) แสดงคาเฉลยและคาเบยงมาตรฐานของขอมลลกษณะทางกายวภาคของรากขาวโดยจาแนกตามกลมประชากรยอย ไดแก aus, indica, tropical japonica, temperate japonica, aromatic และ admixted เมอเปรยบเทยบคาเฉลยตามวธ Duncan’s Multiple Range Test (DMRT) พบวา ขาว tropical japonica มคาเฉลยสงทสดในทกลกษณะททาการประเมน

พนทตดขวางของราก (Root Cross-section Area, RXSA) เปนตวบงชถงความสามารถในการหยงรากและการชอนไชของราก (Materechera et al., 1992; Ray et al., 1996; Cairns et al., 2009) และแปรผนโดยตรงกบความลกของดนทรากหยงได กลาวคอ รากทมขนาดใหญสามารถหยงลงดนไดลกกวา ลกษณะเชนน ถอวาเปนหนงในกลไกทสาคญในการเผชญกบสภาวะแลง จากผลการวเคราะหทางสถต พบวา ขาว tropical japonica มขนาดของรากใหญทสด สวนขาว indica มขนาดของรากเลกทสด (Table 2) ซงมความสอดคลองกบผลการทดลองของ Lafitte et al. (2001) ขาว tropical japonica เปนขาวทปลกในสภาพไรหรอทดอนทไมมนาขง การทขาวชนดนมขนาดรากทใหญโดยธรรมชาตนน อาจเปนกลไกการปรบตวภายใตสภาวะแวดลอมทมความเสยงตอการเกดภยแลง ในทางตรงกนขาม ขาว indica เปนขาวทปลกในพนทนานาฝนสวนใหญ เมอประสบปญหาฝนทงชวง หนาดนทแหงและแขง กอปรกบชนดนดาน (hardpan) ทเกดขน ขาว indica ซงมรากขนาดเลกกวาอาจจะมประสทธภาพในการชอนไชไดดกวา

การพฒนาของเนอเยอแอเรงคมาในรากขาว เรยกวา lysigenous aerenchyma formation ซงเกดจากการตาย (Programmed Cell Death, PCD) และสลายตวของเซลล (cell lysis) เกดเปนชองอากาศในชนคอรเทกซของราก (Kawai et al., 1998; Parlanti et al., 2011) การพฒนาของเนอเยอแอเรงคมาถอเปนกลไกพนฐานในการปรบตวภายใตสภาวะกงขาดออกซเจน (hypoxia) หรอขาดออกซเจน (anoxia) ซงแอเรงคมาจะชวยใหการผานเขา-ออกของออกซเจนสะดวกยงขน (Justin and Armstrong, 1987; Colmer, 2003; Suralta and Yamauchi, 2008) นอกจากนยงพบวาปจจยจากสภาวะเครยดอน ๆ เชน ปรมาณฟอสฟอรสและไนโตรเจนในดนตา อณหภมสง และสภาวะแลง ยงเปนตวกระตนใหเกดการพฒนาของเนอเยอแอเรงคมาไดอกดวย (Drew et al., 1989; Przywara and Stepniewski, 2000; Bouranis et al., 2003; Evans, 2003; Zhu et al., 2010; Lynch, 2011) จากผลการวเคราะหทางสถตพบวา ขาว tropical japonica มพนทของแอเรงคมามากทสด สวนขาว indica มพนทของแอเรงคมานอยทสด (Table 2) ซงจากผลการทดลองนสามารถอธบายไดวา เนองจากการพฒนาเนอเยอแอเรงคมาในขาวโดยธรรมชาต เกดจากการตายและสลายตวของเซลลแมไมไดรบการกระตนจากปจจยแวดลอมภายนอก ฉะนน ขาว tropical japonica ทมขนาดรากใหญกวา จงมแนวโนมทพนทของแอเรงคมาจะมากกวาดวย จานวนทอลาเลยงนา (Number of Meta-xylem Vessels, MXV) และขนาดของทอลาเลยงนา (Meta-xylem Vessels Area, MXA) สมพนธโดยตรงกบประสทธภาพในการลาเลยงนา (Kondo et al.,

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


2000; Uga et al., 2008) และเสถยรภาพการใหผลผลตภายใตสภาวะแลง (Zimmermann, 1983; Tyree et al., 1994; Comas et al., 2013) ความสามารถในการลาเลยงนาและสภาพนานาของราก (root hydraulic conductivity) สามารถอธบายไดดวยทฤษฎ Poiseuille-Hagen กลาวคอ ความตานทานภายในทอลาเลยงนาแปรผกผนกบขนาดของทอลาเลยง ฉะนน ทอลาเลยงนาขนาดใหญจะมความตานทานในทอลาเลยงตา (low axial resistance) สามารถลาเลยงนาไดดกวาทอลาเลยงนาขนาดเลก (Fukai and Cooper, 1995; Uga et al., 2008) อยางไรกตาม ทอลาเลยงนาทมขนาดใหญนน มความเสยงในการเกดคาวเทชน (cavitation) หรอปรากฏการณการเกดโพรงอากาศ โดยเฉพาะอยางยงภายใตสภาวะแลง ซงโพรงอากาศเหลานจะไปขดขวางชองทางในการลาเลยงนา (Richards and Passioura, 1989; Sperry and Saliendra, 1994; Tyree et al., 1994; Alder et al., 1996; Gallardo et al., 1996; Comas et al., 2013) จากผลการวเคราะหทางสถต พบวา ขาว tropical japonica มจานวนทอลาเลยงนามากทสด และขนาดของทอลาเลยงนาใหญทสด (Table 2) การวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม

ผลการทดลอง พบวา พนทตดขวางของราก พนทคอรเทกซ พนทแอเรงคมา จานวนทอลาเลยงนา และขนาดของทอลาเลยงนามคาอตราพนธกรรมอยางกวาง อยในเกณฑสง โดยมคาอยระหวางรอยละ 70-90 (Table 3) คาอตราพนธกรรมเปนดชนชวดอทธพลของพนธกรรมตอลกษณะปรากฏ กลาวอกนยหนงคอ คาอตราพนธกรรมสงแสดงใหเหนวาลกษณะนนไดรบอทธพลจากยนมาก นอกจากน คาอตราพนธกรรมยงสามารถใชเปนแนวทางในการคดเลอกและปรบปรงพนธไดอกดวย การสรางแผนทพนธกรรมแสดงรปแบบความเชอมโยงในจโนม โดยใชฐานขอมลสนป จานวน 44,100 ตาแหนง เครองหมายสนปซงกระจายตวครอบคลมทง 12 โครโมโซมและกระจายทวทงจโนมขาว โดยระยะหางเฉลยของแตละสนปบนจโนม ประมาณ 10 Kb ซงถอวามความละเอยดสง จากผลการวเคราะหรปแบบความเชอมโยงในจโนม พบสนป จานวนทงสน 13 ตาแหนง ทคาดวาสมพนธกบลกษณะทางกายวภาคของรากขาวอยางมนยสาคญ (Table 3, Fig. 3-6) โดยพจารณาจากคา logarithm of significant level [-log10(P)] ไมนอยกวา 4 ซงสามารถแจกแจงตามลกษณะทศกษาไดดงน พนทตดขวางของรากจานวน 1 ตาแหนง บนโครโมโซม 1 พนทแอเรงคมาจานวน 4 ตาแหนง บนโครโมโซม 2 และ 9 จานวนทอลาเลยงนา จานวน 7 ตาแหนง บนโครโมโซม 2 4 10 และ 12 และขนาดของทอลาเลยงนาจานวน 1 ตาแหนง บนโครโมโซม 5

สรปผลการทดลอง การวจยนเปนครงแรกททาการประเมนลกษณะทางกายวภาคของรากขาวในเชงลก โดย

ทาการศกษาในกลมประชากรทมขนาดใหญ ซงถอเปนตวแทนความหลากหลายทางพนธกรรมของขาวปลก (Oryza sativa L.) จานวนทงสน 336 พนธ และไดนาเอาวธทมชอวา “Genome-wide Association Study (GWAS)” หรอ การศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม มาชวยในการสบคนและระบตาแหนงสนปทคาด

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


วาสมพนธกบลกษณะทางกายวภาคของราก ผลการทดลองชใหเหนถงความแตกตางอยางชดเจนของลกษณะทางกายวภาคของราก ซงถอเปนลกษณะเฉพาะตามฐานพนธกรรม ยกตวอยางเชน ขาว tropical japonica หรอ ขาวไร มกมรากขนาดใหญ แอเรงคมามาก มทอลาเลยงนาจานวนมากและขนาดของทอลาเลยงนาใหญกวาขาวในกลม indica ขอมลทไดจะเปนประโยชนอยางยงตอนกปรบปรงพนธ เพอชวยในการคดเลอกพอและแมพนธ ทมลกษณะทตองการ และชใหเหนความสาคญของการใชฐานพนธกรรมทหลากหลาย เพอใหงานปรบปรงพนธมประสทธภาพยงขน จากการศกษารปแบบความเชอมโยงในจโนม คนพบสนปทคาดวาเกยวของกบความผนแปรของลกษณะทางกายวภาค จานวนทงสน 13 ตาแหนง องคความรทไดนจะนาไปสการพฒนาชดเครองหมายดเอนเอเพอใชในการคดเลอกพนธ ในระดบจโนม (Genomic Selection, GS) และเปนแนวทางในการปรบปรงพนธขาวไดอยางรวดเรวและมประสทธภาพตอไป

เอกสารอางอง Alder, N., J. Sperry and W. Pockman. 1996. Root and stem xylem embolism, stomatal conductance, and leaf

turgor in Acer grandidentatum populations along a soil moisture gradient. Oecologia. 105: 293-301. Bouranis D., S. Chorianopoulou, V. Siyiannis, V. Protonotarios and M. Hawkesford. 2003. Aerenchyma

formation in roots of maize during sulphate starvation. Planta. 217:382-391. Cairns J.E., A. Audebert, C.E. Mullins and A.H. Price. 2009. Mapping quantitative trait loci associated with

root growth in upland rice (Oryza sativa L.) exposed to soil water-deficit in fields with contrasting soil properties. Field Crop. Res. 114:108-118.

Colmer T. 2003. Long‐distance transport of gases in plants: a perspective on internal aeration and radial oxygen loss from roots. Plant, Cell & Environment 26:17-36.

Comas L.H., S.R. Becker, V.M. Cruz, P.F. Byrne and Dierig D.A. 2013. Root traits contributing to plant productivity under drought. Front Plant Sci 4:442. DOI: 10.3389/fpls.2013.00442.

Courtois B., A. Audebert, A. Dardou, S. Roques, T. Ghneim-Herrera, G. Droc, J. Frouin, L. Rouan, E. Goze, A. Kilian, N. Ahmadi and M. Dingkuhn. 2013. Genome-wide association mapping of root traits in a japonica rice panel. PLoS One 8:e78037. DOI: 10.1371/journal.pone.0078037.

Drew M.C., C.J. He and P.W. Morgan. 1989. Decreased ethylene biosynthesis, and induction of aerenchyma, by nitrogen-or phosphate-starvation in adventitious roots of Zea mays L. Plant Physiology 91:266-271.

Evans D.E. 2003. Aerenchyma formation. New Phytologist 161:35-49. Fukai S. and M. Cooper. 1995. Development of drought-resistant cultivars using physiomorphological traits in

rice. Field Crops Research 40:67-86. Gallardo M., J. Eastham, P. Gregory and N. Turner. 1996. A comparison of plant hydraulic conductances in

wheat and lupins. Journal of experimental botany 47:233-239.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Justin S. and W. Armstrong. 1987. The anatomical characteristics of roots and plant response to soil flooding. New Phytologist:465-495.

Kang H.M., N.A. Zaitlen, C.M. Wade, A. Kirby, D. Heckerman, M.J. Daly and E. Eskin. 2008. Efficient control of population structure in model organism association mapping. Genetics 178:1709-1723.

Kawai M., P. Samarajeewa, R. Barrero, M. Nishiguchi and H. Uchimiya. 1998. Cellular dissection of the degradation pattern of cortical cell death during aerenchyma formation of rice roots. Planta 204:277-287.

Kondo M., A. Aguilar, J. Abe and S. Morita. 2000. Anatomy of nodal roots in tropical upland and lowland rice varieties. Plant production science 3:437-445.

Lafitte H., M. Champoux, G. McLaren and J. O’Toole. 2001. Rice root morphological traits are related to isozyme group and adaptation. Field Crops Research 71:57-70.

Lipka A.E., F. Tian, Q. Wang, J. Peiffer, M. Li, P.J. Bradbury, M.A. Gore, E.S. Buckler and Z. Zhang. 2012. GAPIT: genome association and prediction integrated tool. Bioinformatics 28:2397-2399.

Lynch J.P. 2011. Root phenes for enhanced soil exploration and phosphorus acquisition: tools for future crops. Plant Physiol 156:1041-9. DOI: 10.1104/pp.111.175414.

Materechera S., A. Alston, J. Kirby and A. Dexter. 1992. Influence of root diameter on the penetration of seminal roots into a compacted subsoil. Plant and Soil 144:297-303.

Parlanti S., N.P. Kudahettige, L. Lombardi, A. Mensuali-Sodi, A. Alpi, P. Perata and C. Pucciariello. 2011. Distinct mechanisms for aerenchyma formation in leaf sheaths of rice genotypes displaying a quiescence or escape strategy for flooding tolerance. Ann Bot 107:1335-43. DOI: 10.1093/aob/mcr086.

Przywara G. and W. Stępniewski. 2000. Influence of flooding and different temperatures of the soil on gas-filled porosity of pea, maize and winter wheat roots. development 7:15.

Ray J., L. Yu, S. McCouch, M. Champoux, G. Wang and H. Nguyen. 1996. Mapping quantitative trait loci associated with root penetration ability in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 92:627-636.

Richards R. and J. Passioura. 1989. A breeding program to reduce the diameter of the major xylem vessel in the seminal roots of wheat and its effect on grain yield in rain-fed environments. Crop and Pasture Science 40:943-950.

Sperry J. and N. Saliendra. 1994. Intra‐and inter‐plant variation in xylem cavitation in Betula occidentalis. Plant, Cell & Environment 17:1233-1241.

Suralta R.R. and A. Yamauchi. 2008. Root growth, aerenchyma development, and oxygen transport in rice genotypes subjected to drought and waterlogging. Environmental and Experimental Botany 64:75-82. DOI: 10.1016/j.envexpbot.2008.01.004.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Tyree M.T., S.D. Davis and H. Cochard. 1994. Biophysical perspectives of xylem evolution: Is there a tradeoff of hydraulic efficiency for vulnerability to dysfunction. International Association of Wood Anatomists Journal 14:335-360.

Uga Y., K. Ebana, J. Abe, S. Morita, K. Okuno and M. Yano. 2009. Variation in root morphology and anatomy among accessions of cultivated rice (Oryza sativa L.) with different genetic backgrounds. Breeding Science 59:87-93.

Uga Y., K. Okuno and M. Yano. 2008. QTLs underlying natural variation in stele and xylem structures of rice root. Breeding Science 58:7-14.

Yoshida S., D. Forno, J. Cock and K. Gomez. 1976. Routine procedure for growing rice plants in culture solution. Laboratory manual for physiological studies of rice:61-66.

Yu J., G. Pressoir, W. Briggs, V. Bi, M. Yamasaki, J. Doebley, M. McMullen, B. Gaut, D. Nielsen and J. Holland. 2006. A unified mixed-model method for association mapping that accounts for multiple levels of relatedness. Nature genetics 38:203-208.

Zhao K., M.J. Aranzana, S. Kim, C. Lister, C. Shindo, C. Tang, C. Toomajian, H. Zheng, C. Dean and P.Marjoram. 2007. An Arabidopsis example of association mapping in structured samples. PLoS Genetics 3:e4.

Zhao K., C.W. Tung, G.C. Eizenga, M.H. Wright, M.L. Ali, A.H. Price, G.J. Norton, M.R. Islam, A. Reynolds, J. Mezey, A.M. McClung, C.D. Bustamante and S.R. McCouch. 2011. Genome-wide association mapping reveals a rich genetic architecture of complex traits in Oryza sativa. Nat Commun 2:467. DOI: 10.1038/ncomms1467

Zhu J., K.M. Brown and J.P. Lynch. 2010. Root cortical aerenchyma improves the drought tolerance of maize (Zea mays L.). Plant Cell Environ 33:740-9.

Zimmermann M.H. 1983. Xylem structure and the ascent of sap. Springer-Verlag.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Table

1 An

alysis

of va

rianc

e (AN

OVA)

table s

howin

g F an

d P va

lues fo

r the e

ffects

of ge

notyp

e, sub

-popu

lation

, and

replic

ation o

n roo

t ana

tomica

l tra

its in

336 O

. sati

va ac

cessi

ons u

sed in

this stu

dy.

Abbre

viation

De

scrip

tion

Geno

type

Sub-p

opula

tion

Repli

catio

n F

P F

P F

P RX

SA

Root

cross-

secti

on ar

ea, m

m2 16

.003

<0.00

1 11

5.989

<0

.001

0.833

0.4

35

AA

Total

aeren

chym

a area

, mm2

14.89

3 <0

.001

103.6

76

<0.00

1 0.1

60

0.852

MX

V Nu

mber

of me

ta-xyl

em ve

ssels

9.640

<0

.001

139.7

80

<0.00

1 0.6

86

0.504

MX

A Me

dian m

eta-xy

lem ve

ssel a

rea, m

m2 5.9

06

<0.00

1 77

.055

<0.00

1 1.0

60

0.347

Table

2 Su

mmary

of m

ean a

nd st

anda

rd de

viation

(SD)

value

s for

root a

natom

ical tr

aits de

tected

in ea

ch su

b-pop

ulation

. Diffe

rent le

tters

indica

te sig

nifica

nt dif

feren

ces a

mong

sub-p

opula

tions

by th

e Dun

can’s

Multi

ple Ra

nge T

est (D

MRT)

at P<

0.05.

AUS =

aus;

IND =

indica

; TRJ

= tro

pical

japon

ica; T

EJ =

tempe

rate j

apon

ica; A

ROMA

TIC =

aroma

tic; A

DMIX=

admix

ture.

The r

ice di

versity

pane

l con

sists

of 52

aus,

67

indica

, 11 a

romati

c, 76

temp

erate

japon

ica, 8

0 trop

ical ja

ponic

a, an

d 50 a

dmixe

d acc

ession

s.

Varia

bles

AUS

IND

TRJ

TEJ

AROM

ATIC

ADMI

X Me

an

SD

Mean

SD

Me

an

SD

Mean

SD

Me

an

SD

Mean

SD

RX

SA

1.018

0.1

86bc

0.8

38

0.169

d 1.1

57

0.207

a 0.8

96

0.179

cd

1.077

0.3

24ab

1.0

59

0.182

ab

AA

0.407

0.1

01bc

0.3

46

0.089

c 0.5

04

0.104

a 0.3

61

0.120

bc

0.388

0.0

81bc

0.4

29

0.096

b MX

V 6.0

61

0.616

b 5.0

44

0.568

c 6.8

12

1.11a

5.0

46

0.694

c 5.8

03

0.631

b 6.0

23

1.098

b MX

A 0.0

0178

0.0

0048

bc

0.001

39

0.000

35d

0.002

08

0.000

52a

0.001

43

0.000

34d

0.001

53

0.000

37cd

0.0

0185

0.0

0035

ab

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Table

3 S

umma

ry of

signifi

cant

assoc

iation

s be

tween

gen

etic m

arkers

and

root

anato

mical

traits,

listin

g the

asso

ciated

trait,

SNP

nam

e, ch

romoso

me, p

osition

, P va

lue, a

dditiv

e con

tributio

n to t

he ph

enoty

pe, a

nd br

oad-s

ense

herita

bility (

h B2 ).

Trait

SNP N

ame

Chrom

osome

Po

sition

P v

alue

Addit

ive Ef

fect

h B2 Ro

ot cro

ss-se

ction a

rea (m

m2 ) id1

0098

30

1 14

8121

45

1.01E

-05

0.088

0.8

826

Aeren

chym

a area

(mm2 )

id200

7602

2

1943

9265

6.4

4E-05

-0.

031

0.874

1

id200

7562

2

1934

5017

6.5

2E-05

0.0

32

id200

7538

2

1925

7864

8.3

5E-05

0.0

32

id900

2411

9

7873

780

5.79E

-05

0.044

Numb

er of

meta-

xylem

vesse

ls id2

0074

27

2 18

6458

76

9.15E

-05

-0.33

0 0.8

121

id4

0020

13

4 46

8905

7 2.0

8E-06

0.5

45

id400

2031

4

4737

102

6.24E

-05

-0.44

7

id1

0004

371

10

1586

1545

9.7

0E-07

-0.

670

id100

0430

5 10

15

7659

37

2.03E

-05

0.607

id1

2007

213

12

2180

9458

8.6

3E-05

0.2

41

id120

0722

6 12

21

8368

87

8.96E

-05

-0.27

6

Meta-

xylem

vesse

l area

(mm2 )

id501

3826

5

2802

9809

8.6

3E-05

-0.

0002

4 0.7

106

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Fig. 1 Image of rice root cross-section showing aerenchyma lacunae, epidermis, endodermis,

cortex, stele and xylem vessels.

indica tropical japonica aus

Fig. 2 Representative images of root cross-sections showing phenotypic difference in stele root

anatomical triats.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Fig. 3

Gen

ome-w

ide as

sociati

on st

udy o

f root

cross-

section

area

(RXS

A) ac

ross 3

36 O

. sati

va ac

cessi

ons.

Freq

uenc

y distr

ibution

of ro

ot an

atomic

al tra

its ac

ross 3

36 O

. sati

va ac

cessi

ons (

left pa

nel).

Man

hatta

n plots

resul

ting fro

m the

GWA

S resu

lts for

root

anato

mical

traits

(right

pane

l). Th

e red

horizo

ntal lin

e dep

icts th

e sign

ifican

t thres

hold

(P ≤

10-4 ).

The X

axis s

hows

the S

NPs o

n eac

h chro

mosom

e, y a

xis is

the –lo

g 10 (P

-Value

) for

the a

ssocia

tion. Bure

au of

Rice

Res

earch

and D

evelo

pmen

t


Fig. 4

Gen

ome-w

ide as

sociati

on st

udy o

f aere

nchym

a area

(AA)

acros

s 336

O. s

ativa

acce

ssion

s. Fr

eque

ncy d

istribu

tion of

root

anato

mical

traits

acros

s 336

O. s

ativa

acce

ssion

s (left

pane

l). M

anha

ttan p

lots re

sulting

from

the G

WAS r

esults

for ro

ot an

atomic

al tra

its (rig

ht pa

nel).

The r

ed

horizo

ntal lin

e dep

icts th

e sign

ifican

t thres

hold

(P ≤

10-4 ).

The X

axis s

hows

the S

NPs o

n eac

h chro

mosom

e, y a

xis is

the –l

og10

(P-Va

lue) fo

r the

assoc

iation

.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Fig. 5

Gen

ome-w

ide as

sociati

on st

udy o

f num

ber o

f meta

-xylem

vesse

ls (M

XV) a

cross

336 O

. sati

va ac

cessi

ons.

Freq

uenc

y distr

ibution

of ro

ot an

atomic

al tra

its ac

ross 3

36 O

. sati

va ac

cessi

ons (

left pa

nel).

Man

hatta

n plots

resul

ting fro

m the

GWA

S resu

lts for

root

anato

mical

traits

(right

pane

l). Th

e red

horizo

ntal lin

e dep

icts th

e sign

ifican

t thres

hold

(P ≤

10-4 ).

The X

axis

shows

the S

NPs o

n eac

h chro

mosom

e, y a

xis is

the –

log10

(P-Va

lue) fo

r the a

ssocia

tion.

Bureau

of R

ice R

esea

rch an

d Dev

elopm

ent


Fig. 6

Gen

ome-w

ide as

sociati

on st

udy o

f meta

-xylem

vesse

l area

(MXA

) acro

ss 33

6 O. s

ativa

acce

ssion

s. Fr

eque

ncy d

istribu

tion of

root

anato

mical

traits

acros

s 336

O. s

ativa

acce

ssion

s (left

pane

l). M

anha

ttan p

lots re

sulting

from

the G

WAS r

esults

for ro

ot an

atomic

al tra

its (rig

ht pa

nel).

The

red ho

rizonta

l line d

epicts

the s

ignific

ant th

resho

ld (P ≤

10-4 ).

The X

axis s

hows

the S

NPs o

n eac

h chro

mosom

e, y a

xis is

the –lo

g 10 (P

-Value

) for

the a

ssocia

tion. Bure

au of

Rice

Res

earch

and D

evelo

pmen

t

genome-wide association study of root anatomical traits in rice...

Documents