genome sequencer junior
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Genome Sequencer JuniorAplicaciones de Pirosecuenciación Masiva en Biovigilancia de Virus y Microorganismos Emergentes
Roche Diagnostics México, Mayo 2011
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Ejemplos de enfermedades re-emergentes
Resistencia de patógenos.
Tipos de virus
• “El agente etiológico de ~50% de los casos de encefalitis no es encontrado.”
• “La infección aguda del tracto respiratorio es la primer causa de mortalidad y morbilidad en niños en US, causa 2 millones de muertes anuales . Es detectado el agente causal solo en el 30-60 % de los casos,
• “...solo en estados unidos , las enfermedades entéricas resultan en la hospitalización del cerca de 500,000 adultos y 160,000 niños anualmente. El 40 % de los casos no se encuentra el agente causal.”
• “... 5,000 muertes anuales de recién nacidos son atribuidas a infecciones sin conocer el agente causal. “
Descubrimiento de agente patogénicos
• Factores Virales :
– Resistencia Viral
– Mutaciones
• Factores del huésped:
– Nutrición
– Factores genéticos
• Factores Ambientales:
– Calidad en el cuidado
– Reporte real (salud)
– Densidad poblacional
• Factores microbianos:
– Co-infecciones
Posibles Causas del incremento de patogenicidad
Pandemia H1N1 2009
Primer caso: Mexico, 4 Abril 2009
Estatus al 27 Septiembre 2009
N= sobre 343,298Muertes= 4,108(Vaillant et al, 2009)
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Pirosecuenciación Masiva
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Historia.
Origen del nombre.
Muestra inicial y procesamiento:
ADN Genómico, BACs, amplicones, cDNA
Generación de adaptadores A/B.
Flanquean fragmentos de ADN de cadena sencilla.
Formación de microreactores de emulsión:
esferas, fragmentos & reactivos de PCR en agua/aceite.
Amplificación clonal.
Toma lugar en las esferas en los microreactores.
Secuenciación.
Nebulización.
Generación de pequeños fragmentos.
PCR en emulsión
Rompimiento de
emulsión
Secuención
1 esfera
1 lectura
(x 1,000,000)
1 fragmento
Preparación de librería
Extracción de muestra
Pirosecuenciación masiva paralela.
Descripción general.
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Un nucleótido complementario a su secuencia blanco genera una señal de luz.PicoTiterPlate Pozos
Fotones son
capturados por la
cámaraFlujo de
reactivos
La imagen de
secuenciación es creada.Secuenciación por
síntesis
Bases (TACG) son fluidas secuencialmente y
siempre en el mismo orden (200 veces) a
través de la PicoTiterPlate durante una corrida
de secuenciación.
La señal de luz es registrada por
la cámara CCD.
La fuerza de la señal es proporcional al
número de nucleótidos incorporados.
Pirosecuenciación masiva paralela.
Secuenciación por síntesis.
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GS Mapa Referencia
GS Ensamble De novo
GS Analizador de Amplicones
Variantes
Captura de
imagen
Procesamiento
de imagen
Procesamiento de señal
T
A
G
C
T
2. Normalización de datos.
3. Transformación de datos
(flujograma).
1. Dirección del flujo de
datos.
Secuencia clave = TCAG señal para calibración.
1-mer
2-mer
3-mer
4-merTACG
Pirosecuenciación masiva paralela.
Análisis de datos.
1 fragmento
1 lectura
1 pozo1 perla
Preparación de librería PCR en emulsión(Amplificación clonal)
Cargado y deposición de perlas en pozos de la PTP
Corrida de secuenciación Procesamiento de datos (Generación de
flujogramas)
Pirosecuenciación masiva paralela.
Flujo de trabajo: resumen.
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1
10
100
1,000
10,000
2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012
Pltfrm Servicio/Producción
Secuenciador Personal
Avance tecnológico
y mucho más!
GS 2020 MB
GS FLX100 MB
GS FLX Titanium500 MB
GS Junior35 MB
GS FLX Titanium 1k1 GB
GS Junior Atlantis
100 250 350 800
Longitud de lectura promedio
0
1,000,000
Tiempo (año)
Fluidos
PTP
Escala PTP
Opt. flujo
Cámara/PTP/Fluidos
Lecturas / corridaRendimiento (Mb) / corrida
500,000
100,000
Evolución del concepto de secuenciación 454.
Cada sistema enfocado a distintos perfiles.
1 1 1 4
No. instrumentos instalados (7)
Secuenciador Personal : GS Junior
Proyectos medianos/pequeños
MÁS CON MENOS TAMAÑO…
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Subsistema
Óptico
Subsistema
de Fluidos
Subsistema
Computacional
Genome Sequencer Junior
Componentes del equipo.
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Día 3 Análisis de
datos
Día 2Secuenciación
Día 1 Preparación de
muestra
Genome Sequencer Junior
Flujo de trabajo: una solución integral para el análisis de muestras.
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Aplicaciones del GS Junior GS Junior en Investigación: Transición hacia Diagnóstico
Viruses
Bacteria
Hongo
Enfermedades Humanas
Susceptibilidad ejemplo.:
Biomercadores de Cáncer:
Pulmón, mama ,
Próstata, Colon
Glioblastoma
Detección de Mutaciones y Genotipo
HIV: Resistencia ,
tropismo,
integración
HBV, HCV
HPV, HSV
Oncologia
EGFR, IgH, p53, BRCA1
Bacteria 16S
Secuenciación
Expresión de genes
Identificación de patógenos
Ebola, Influenza, etc…
Descubrimiento de trancritos
biomarcadores:
Obesidad, Diabetes,
Cáncer
Metagenomica
microRNA biomarcadores
SAGE/CAGE
Genotipicación HLA
Sequence Capture
Chromo-Loci
Diabetes,
Cardiomiopatia familiar
Gene-Loci
PKD, BRCA1, EGFR
CTFR, HLA
Exones asociados a Tumores
Aplicaciones del GS Junior
Secuenciación de Genoma
completo
• Genomas completos de novo:
Genómica comparativa, algunos ejemplos.
La longitud de lectura es importante !
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Lecturas alineadasLecturas alineadas
Lecturas alineadas
Lecturas de secuenciación
Secuencia consenso (Contig)Contig
Contig
Ensamble
• Metagenómica:
Organismo 1
Organismo 2
Organismo 3
Lectura larga
Metagenoma X
Lectura corta Cuál organismo?
• Poblaciones y variantes:
Variante 1
Variante 2
Variante 3
Población X
Lectura larga
Lectura corta Cuál variante?
Resistencia
• Recombinación y rearreglos:
Genotipo 1
Genotipo 2
Genotipo 3
Lectura larga
Muestra X
Lectura corta Cuál genotipo?
Patogenicidad
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Influenza
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El virus de influenza (A/H1N1).
Organización del genoma.
~13.5 Kb
8 Genes:
Genoma AH1N1:
3’UTR5’UTR
PB2 PB1 PA HA NP NA M1/M2
NS1/NS2
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El virus de influenza (A/H1N1).
Estructura del virión y proteínas codificantes.
Nucleoproteína
Proteínas estructurales
(Interacción hospedero, regulación replicación y transcripción)
Proteínas accesorias y enzimas virales
HemaglutininaTranscriptasa
NS3NS1
Neuroamidasa
PB2 HA
NS1/NS2
PB1
PA
Transcriptasa: endonucleasa
Transcriptasa: proteasa
NP
NA
Proteína(s) de matriz
reconocimiento de CAP del mARN.
elongación del ARN
receptor (ac. N-acetilneuroaminico) / fusión a
membrana.
importe nuclear de ARN.
liberación del virus.
M1 - interacción con vRNP / exporte nuclear de ARN / gemación viral
M2 - ensamble y desenvoltura del virus.
NS1 - antagonista interferón (IFN)
NS2 - exporte nuclear del ARN M1/M2
PB1, PB2, PA
HA
NP
NAM1M2
NS2
NS1
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El virus de influenza porcina (A/N1N1).
Antecedentes.
Métodos de diagnóstico actuales/convencionales:
1778 pb 1413 pb
3’UTR5’UTR
PB2 PB1 PA HA NP NA M1/M2
NS1/NS2
1027 pb
regiones parciales (< 200 pb)
0 1 13
Kb
2 3 4 6 7 8 10 11 1295
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El virus de influenza porcina (A/H1N1).
Distribución global: casos confirmados y muertes reportadas.
http://www.broadinstitute.org/annotation/viral/Dengue/
¿Tipos y variantes en México?
¿Resistencia?
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 1.
Amplificación segmentos específicos (PCR):
F R
Oligos específicos
MID
AB
Purificación, mezcla y dilución de amplicones
Proceso de secuenciación
(emPCR y secuenciación de amplicones)
Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs
3’UTR5’UTR
PB2 PB1 PA HA NP NA M1/M2
NS1/NS2
0 1 13
Kb
2 3 4 6 7 8 10 11 1295
Chan et al., (2006). Journal of Virological Methods. 136: 38-43.
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 2.
Proceso de secuenciación
(emPCR y secuenciación de amplicones)
Amplificación segmentos específicos (PCR):
F R
Oligos específicos
BOligos universalesMID
A
Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs
Purificación, mezcla y dilución de amplicones
3’UTR5’UTR
PB2 PB1 PA HA NP NA M1/M2
NS1/NS2
0 1 13
Kb
2 3 4 6 7 8 10 11 1295
Chan et al., (2006). Journal of Virological Methods. 136: 38-43.
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 3 (genomas completos).
Amplificación de genomas completos: Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.
uniRT-F uniRT-R
3’UTR5’UTR
PB2 PB1 PA HA NP NA
NS1/NS2
0 1 13
Kb
2 3 4 6 7 8 10 11 1295
M1/M2
cADN (sstDNA)
Chan et al., (2006). Journal of Virological Methods. 136: 38-43.
18 cepas de virus de influenza A (subtipos H1N1 y H3N2) colectadas entre 1996-2004 (período de 9 años).
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 3 (genomas completos).
Amplificación de genomas completos:
Nebulización
(longitud compatible c/GS Junior)
Proceso de secuenciación
(Preparación de librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)
Ligación de adaptadores MID
(caseros ó provenientes del Kit)
Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.
uniRT-F
uniRT-R
3’UTR5’UTR
PB2 PB1 PA HA NP NA
NS1/NS2
M1/M2
cADN (dstDNA)
Chan et al., (2006). Journal of Virological Methods. 136: 38-43.
M PB2 PB1 PA HA NP NA MP NS -
300020003500
1000
500
pb
M
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Influenza/Resistencia
Hasta 10 %Hasta 1.0 %
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GS Junior
Ventajas de plataforma masiva
Detección y sensibilidad
PyroMark – Pirosecuenciación NO Masiva
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VIH
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El virus de la Immunodeficiencia Humana (VIH).
Estructura del genoma.
9.719 Kb
Genoma del VIH-1:
9 Genes:
Proteínas estructurales comunes (genes gag, pol y env)
Proteínas reguladoras (genes tat y rev)
Proteínas accesorias (genes vpu, vpr, vif y nef)
gag pol env
vif vpr rev vpu tat nef
revtat5’-LTR 3’-LTR
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El virus de la Immunodeficiencia Humana (VIH).
Estructura del virión y proteínas codificantes.
9 Genes:
gag pol env
vif vpr rev vpu tat nef
revtat5’-LTR 3’-LTR
2000 pb 2900 pb 1800 pb
p53 p160 gp160
gp120 gp41p17 p24 p7/9 p6
3 Precursores:
10 Proteínas:
enzimas virales
extracelular
Proteínas estructurales (núcleo)
intracelular
Proteínas estructurales (cubierta)
p31/32p66/55 p15p10
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El virus de Immunodeficiencia Humana (VIH).
Antecedentes.
Métodos de diagnóstico actuales/convencionales:
2000 pb 2900 pb 1800 pb
gag pol env
vif vpr rev vpu tat nef
revtat5’-LTR 3’-LTR
0 1 2 3 4 6 7 8 9.795
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El virus de la Immunodeficiencia Humana (VIH).
Distribución geográfica.
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 1.
Amplificación segmentos específicos (PCR):
R F
Oligos específicos
MID
A BMID
Proceso de secuenciación
(emPCR y secuenciación de amplicones)HIV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.
Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs
gag pol env
vif vpr rev vpu tat nef
revtat5’-LTR 3’-LTR
Kb
0 1 2 3 4 6 7 8 9.795
Purificación, mezcla y dilución de amplicones
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 2.
Proceso de secuenciación
(emPCR y secuenciación de amplicones)
Amplificación segmentos específicos (PCR):
R F
Oligos específicos
BMID
Oligos universalesMID
A
HIV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.
Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs
gag pol env
vif vpr rev vpu tat nef
revtat5’-LTR 3’-LTR
Kb
0 1 2 3 4 6 7 8 9.795
Purificación, mezcla y dilución de amplicones
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 3 (genomas completos).
Síntesis de ds-cADN (RT-PCR):
Nebulización
(longitud compatible c/GS Junior)
Proceso de secuenciación
(Prep. librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)
Ligación de adaptadores MID
(caseros ó provenientes del Kit)
Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.
gag pol env
vif vpr rev vpu tat nef
revtat5’-LTR 3’-LTR
~9.7 Kb
msf12b nefyn05 UNINEF7’
Nadai et al., 2008. PLoS One. 3(1): e1420Bruselles et al., 2009. AIDS Res Hum Retro. 25(9): 937.
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157 454 1232Proteasa Transcriptasa Reversa
cADNs
amplicones
coverage profile
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300
position
# re
ads
§ Futuro: Dependiendo del patrón de resistencia , los fármacos prescritos pueden modificarse.
VIH – Detección efectiva de mutaciones de baja frecuencia que confieren resistencia a drogas al nivel del 1.0%.Estrategia. Wang et al., (2008). Genome Research. 17(8): 1195-1201.
Secuencia referencia
Cob
ertu
ra
Frec
uenc
iade
no-
pare
ados
A C G T CoberturaRuptura
Mutación Frecuencia Tipo
C984A 2.70% D177ET990G 5.80% no Δ C993A 2.30% no Δ C993T 2.20% no Δ A995G 1.00% Y181CT996C 0.90% no Δ
C1002T 0.50% no Δ T1012C 0.40% no Δ
D177E: polimorfismo comun(20% del clado de viruses B)
VIH – Detección efectiva de mutaciones de baja frecuencia que confieren resistencia a drogas al nivel del 1.0%.Resultados.
www.roche-applied-science.comWang et al., (2008). Genome Research. 17(8): 1195-1201.
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HPV
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El virus de Papiloma Humano (VPH).
Organización del genoma.
7.908 / 7.857 Kb
8 Genes:
Genoma VPH tipo 16/18:
E6
E1
E2
L2
L1 LCR
E7
E5
E4
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El virus de Papiloma Humano (VPH).
Estructura del virión y proteínas codificantes.
Subunidad menor
Subunidad mayor
Proteínas estructurales (cápside)
E6
E1
E2
E7
E5
E4
L2
L1
Transformación e
inmortalización celular
Regulación replicación y
transcripción
Helicasa/ATPasa
vATPasa - EGFR
p53 - CBP/p300
pRB
Proteínas accesorias y enzimas virales
Proteínas de cápside (L1/L2)
Histonas
ADN genómico
Ensamble y liberación de viriones
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El virus de Papiloma Humano (VPH).
Antecedentes.
Métodos actuales/convencionales:
E6
E1
E2
L2
L1 URR
E4
E5
MY09/11
GP5+/6+
SPF1/2
450 pb
150 pb
65 pb
Genotipo (Variabilidad
Genética)Diagnóstico
El criterio de clasificación de los HPV se basa en la secuencia nucleotídica del gen viral L1
que codifica para la proteína principal de la cápside4 y es una región altamente
conservada; así, se establece un nuevo tipo viral cuando éste difiere en más de un 10%
con la L1 de los tipos conocidos; un subtipo si esta divergencia oscila entre 2 y 10% y
una variante intratípica cuando la divergencia es menor al 2%.
E7
0 1 2 3 4 5 6 7 7.9
Kb
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El virus de Papiloma Humano (VPH).
Antecedentes.
Listado de ensayos/métodos moleculares utilizados para la genotipificación de VPH:
Método Código Blanco
Cuantitativo
In-house real-time PCR IHRT E6, E7, E6E7, L1
Cualitativo
HPV Amplicor (Roche molecular diagnostics, USA) AM L1
Clinical arrays papillomavirus human (Genomica, ES) CA L1
GP5þ/6þPCR (detection by enzyme immunoassay [EIA], Luminex, or Reverse Line Probe) GP L1
Hybrid Capture Version 2 (Digene Corporation, USA) HC Genoma completo
Other in-house qualitative PCR IHQ E7, L1
Linear array HPV genotyping test (Roche molecular diagnostics, USA) LA L1
MY09-MY11 PCR southern/dot blot MY L1
PGMY09-PGMY11 PCR (detection by EIA or dot blot) PGMY L1
SPF10 PCR-reverse line probe SPF L1
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 1.
Amplificación segmentos específicos (PCR):
F R
Oligos específicos
MID
AB
Purificación, mezcla y dilución de amplicones
Proceso de secuenciación
(emPCR y secuenciación de amplicones)
Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs
HPV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.
E6
E1
E2
L2
L1 LCR
MY09/11
560 pb
E4
E5
E7
L1
0 1 2 3 4 5 6 7 7.9
Kb
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 2.
Proceso de secuenciación
(emPCR y secuenciación de amplicones)
Amplificación segmentos específicos (PCR):
F R
Oligos específicos
BOligos universalesMID
A
HPV Sequence Database. URL: http://www.hiv.lanl.gov/.
Necesario el diseño de oligos y estandarización de PCRs
Purificación, mezcla y dilución de amplicones
E6
E1
E2
L2
L1 LCR
MY09/11
560 pb
E4
E5
E7
L1
0 1 2 3 4 5 6 7 7.9
Kb
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 3 (genomas completos).
Amplificación de genomas completos:
Nebulización
(longitud compatible c/GS Junior)
Proceso de secuenciación
(Prep. de librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)
Ligación de adaptadores MID
(caseros ó provenientes del Kit)
Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.
Stewart et al., 1995. Genome Res. 5: 79.
MY11 MY09
Genoma VPH
Sitio de restricción (HindIII para CP141)
450 pb
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Esquema de trabajo.
Preparación de la muestra: Estrategia 3 (genomas completos).
Amplificación de genomas completos:
Nebulización
(longitud compatible c/GS Junior)
Proceso de secuenciación
(Prep. de librería, emPCR y secuenciación ‘shotgun’)
Ligación de adaptadores MID
(caseros ó provenientes del Kit)
Nota: Es importante considerar proporción de material genético humano.
Stewart et al., 1995. Genome Res. 5: 79.
~8 Kb
LPCR A LPCR B
MY11 MY09
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Detección de microorganismo
Emergentes
• La metagenómica es el estudio del contenido genómico de una muestra de organismos obtenida de un hábitat específico.
• Es un novedoso y prometedor enfoque que permite analizar los genomas de todos los microorganismos de un nicho ecológico, incluidos
los que no pueden cultivarse, que son la gran mayoría.
¿Qué es la Metagenómica?
• La metagenómica humana esta formada por un compuesto entre genes de Homo sapiens y genes que se encuentran presentes en el
genoma de trillones de microbios que colonizan nuestro cuerpo.
• Se piensa que el número total de genes microbianos en nuestro cuerpo excede el de genes humanos en una proporción de 1000 a 1. Esto
significa, que el genoma dentro de nuestro intestino -EL MICROBIOMA – puede albergar 1000 veces más genes que nuestro propio
genoma, y dotarnos con características que afortunadamente, no hemos tenido que desarrollar nosotros mismos
¿Qué es la Metagenómica Humana?
• El microbioma humano es el conjunto de los genomas de todos los microorganismos presentes en el cuerpo humano.
• Este microbioma está casi inexplorado. Es esencial que los científicos entiendan cómo los microorganismos interactúan con el cuerpo
humano al promover la salud o al provocar enfermedades.
• Este nuevo concepto tiene el potencial de transformar los enfoques con los que se entiende la salud humana, así como la prevención,
diagnóstico y tratamiento de una amplia gama de enfermedades.
¿Qué es la Microbioma Humano?
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Proyecto del Microbioma Humano.
Identificación de la diversidad microbiana asociada al paisaje metabólico y genético humano.Iniciativa del Instituto Nacional de Salud (NIH) para llegar a las entrañas de la epidemiología de muchas enfermedades humanas…
Infección y Cáncer
Uno de cada 5 tipos de cáncer pueden ser atribuidos a algún agente
infeccioso. Las neoplasias relacionadas a infecciones son:
•Cáncer de Estomago Helicobacter pylori,
•Cáncer Hígado Virus de hepatitis B y C
•Cáncer de Cervix, Virus del Papiloma Virus
•Carcinoma nasofaríngeo Epstein-Barr
•Tipos de linfomas, herpes humano virus-8
La carga de la infección relacionada con el cáncer sigue siendo
subestimado en todo el mundo, además la asociación con agentes de
nuevas infecciones aun no ha sido explorado.
Proyecto del Microbioma Humano.
Infección y Cáncer
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Comparación con bases de datos disponibles públicamente:
Base de datos ‘semilla‘: http://www.theseed.or g/wiki/Main_Page
(BLASTX, E-value<0.001) http://metagenomi cs.nmpdr.org/
NCBI non-redundant Clusters of Orthologs (COG).
- Identificación de grupos ortologos no-redundantes
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).
- Determinación de rutas de senalización
Bases de datos públicas 16 S
- Filtrado de secuencias 16 S
Aislamiento de ADN
Fragmentos de escopetazo ‘shotgun’Protocolo estándar de nebul ización
Amplicones 16 S rARNProtocolo oligos 16 S
Metagenómica y diversidad microbiana.
Esquema de trabajo.
400
100
75
ROCHE 454 GS
FLX Titanium
GS JuniorPlataformas de secuenciación de
segunda generación
100 bp 200 bp 300 bp 400 bp0 bp
Longitud de lectura
Otras plataformas
Plataformas de secuenciación de segunda generación.
La longitud de lectura es importante!
Región repetida > 1,000 pb
Región repetida > 600 pb, < 1,000 pb
Región repetida > 400 pb, < 600 pb
Región repetida > 50 pb, < 400 pb
Secuenciación capilar
Secuenciación 454 (Lecturas largas)
Competencia (Lecturas cortas)
Blanco
Rep
etid
osEn
sam
ble
Con
tigs
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El problema con la longitud de lectura.
Ensamble de novo: resolución de regiones repetidas.
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Análisis de metagenomas.
La longitud de lectura es importante !
Ambiente
§ Miles de diferentes especies
Aislamiento de AD
N del am
biente y
secuenciación tipo ‘shotgun’
Lecturas Largas Microlecturas
Blast:
Mapa único
Blast:
Complementa con todo
Difícil identificación
Herramientas de análisis.
GS Reference Mapper Software.
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Reference Sequence
Herramientas de análisis.
GS DeNovo Assembler Software.
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Metagenomica
Detección de patógenos no conocidos
• Conocer el perfil de DNA circulante en individuos sanos
• Infección oculta por HBV se puede detectar en un solo
individuo.
Perfil de DNA circulante en individuos sanosBeck et al. Clinical Chem January, 2009
“Secuenciación masiva de ácidos nucleicos de suero puede ser una herramienta muy poderosa para detectar agentes
infecciosos en adultos…, y en recién nacidos.”
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> Curso clínico
Donador: Individuo de sexo masculino de 57 anos de edad que murió de un desangrado talámico 10 días después de haber pasado 3 meses en la región rural de Yugoslavia.
#ID Edad (anos)
Diagnóstico Órgano Fecha de transplante Curso clínico
1 64 hepatitis C cirrosis hígado 12/4/2006 fiebre, encefalopatíamuerte (día 30)
2 63 enfermedad poliquística rinón 12/4/2006 fiebre, CNS, rechazo de injertomuerte (día 36)
3 44 enfermedad poliquística rinón 12/4/2006 fiebre, CNS, rechazo de injertomuerte (día 29)
Arenavirus – Detección de nuevo virus en un grupo de enfermedades fatales asociadas a transplante.Introducción. Palacios et al., (2008). New England Journal of Medicine. 358: 991-998.
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ESQUEMA DE TRABAJO: aislamiento de ARN - RT & DOP-PCR - secuenciación de cADN.
• La comparación de secuencia con LCMV, identifica al virus como un nvo. arenavirus:
– El alineamiento de secuencia es muy pobre; el segmento pareado continuo más largo es de tan solo 14 nt.– El alineamiento de la secuencia traducida (proteína) es casi completo: arenavirus y LCMV se encuentran
filogenéticamente relacionados.
traducción
Query:LMCV:Query:LMCV:
Query:LMCV:
→ La longitud de lectura es crucial para proveer suficiente información para la correctaidentificación del arenavirus como una nueva especie viral.
Arenavirus – Detección de nuevo virus en un grupo de enfermedades fatales asociadas a transplante.Estrategia y resultados.
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Metagenómica y diversidad microbiana.
Microbioma de intestino con incrementada capacidad para cosechar energía asociado a obesidad.
Secuenciación tipo escopetazo (‘shotgun’) de microbiomas delintestino distal.
§ Ratones y voluntarios humanos: obesos vs. delgados.
Análisis taxonómico de microbiomas.§ Alineamiento (BLAST) genomas microbianos no-redundantes y
secuencias 16S.§ Firmas genéticas ambientales, se definen como lecturas
asignadas a:- grupos ortologos no-redundantes (COG)- rutas de senalización implicadas (KEGG).
Cambios de microflora§ Mayor abundancia relativa bacterias Firmicutas vs. Bacterioides§ Incrementada capacidad para cosechar energía de la dieta.
La obesidad es trasmisible§ La colonización de ratones delgados libres de gérmenes con la
microbiota procedente de ratones obesos provoca un mayorincremento de la grasa corporal total.
§La microbiota del intestino es un factor adicional que puedecontribuir a la obesidad.
Turnbaugh et al., (2006). Nature. 444: 1027-1031.
• Identificación de diversidad y abundancia microbiana, analiza la expresión de genes en comunidades microbianas no cultivables.
• Analiza de forma rápida y precisa brotes virales por secuenciación de fragmentos amplificados a partir de preparaciones de RNA viral de individuos infectados.
• Detección de genomas minoritarios en infecciones vírales e identificación de cuasiespecies.
• Caracteriza mutaciones que pueden estar implicadas en resistencia a fármacos antivirales y en la evasión a la respuesta inmune del huésped.
Identificación de diversidad y abundancia microbiana
Innovación para tu salud